CN103833857B

CN103833857B - 一种重组融合蛋白hIFNγ-MAP30及制备方法和应用

Info

Publication number: CN103833857B
Application number: CN201410099350.8A
Authority: CN
Inventors: 孟小林; 徐进平; 孟明翔; 王健; 潘娟
Original assignee: HUBEI TAIYANGHONG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HUBEI TAIYANGHONG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-03-18
Filing date: 2014-03-18
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2034-03-18
Also published as: CN103833857A

Abstract

本发明公开了一种重组融合蛋白hIFNγ-MAP30及制备方法和应用，将hIFNγ和MAP30通过连接肽连在一起，构建了一种可表达hIFNγ-MAP30融合蛋白的基因工程菌，大肠杆菌<i>Escherichia？coli？</i>BL21(DE3)–pET-15b-hIFNγ-MAP30，CCTCC？NO:M2013545。本发明利用大肠杆菌系统生产hIFNγ-MAP30，所得到的hIFNγ-MAP30融合蛋白不仅表达量大，操作简单，成本低，也具有加强单独干扰素γ和单独苦瓜蛋白MAP30的抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用。同时大肠杆菌是非致病性微生物，不存在散毒的危险。

Description

一种重组融合蛋白hIFNγ-MAP30及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因生物工程技术领域，具体涉及一种重组融合蛋白hIFNγ-MAP30，同时还涉及一种重组融合蛋白hIFNγ-MAP30的制备方法，还涉及一种能表达重组融合蛋白hIFNγ-MAP30的基因工程菌株，还涉及一种重组融合蛋白hIFNγ-MAP30在抗细菌、抗病毒中的应用。

技术背景

随着生活水平的提高和人类寿命的延长，恶性肿瘤和心血管疾病已经成为威胁人类健康的主要疾病。早在1994年，我国城市恶性肿瘤死亡率居各类死因之首。2007年，全世界死于恶性肿瘤的人口数为750万。病毒感染也是困扰人类，影响人类健康的重大难题之一。如何有效治疗肿瘤，防治病毒感染迫不及待。

干扰素是组织培养的细胞或动物在没有活性的病毒或其他化学物质的作用下，产生的由细胞自己的基因编码的一种小分子量蛋白，这种蛋白具有对抗该种外源分子的作用。

人类干扰素γ是含有166个氨基酸的分泌型糖蛋白，其中有23个氨基酸是疏水的信号肽序列，并在N-端具有糖基化位点。干扰素γ在溶液中以二聚体的形式存在，两个二聚体的大小在21-24kD之间。每个亚基含有六个螺旋，这六个螺旋占据整个结构的62％，不含β折叠。干扰素γ的主要生理功能是调节免疫和诱发炎症反应，几乎参与了免疫和炎症反应的所有过程。

第一：干扰素γ可以刺激机体的防御系统和抗病原菌的功能。其能通过上调Fc-g-RI，一种高亲和性的IgG信号受体的表达来促进骨髓形成细胞中骨髓细胞的分化。它同样能够激活成熟的粒细胞释放抗体依赖性的细胞毒素，同时募集中性粒细胞，使他们上调细胞趋化因子和黏着分子的表达，促进超氧化物歧化酶的产生。第二：干扰素γ是主要的巨噬细胞活化因子，通过使T细胞活化巨噬细胞来杀伤病源微生物。同时提高巨噬细胞对抗肿瘤和抑制寄生虫的能力。第三：干扰素γ可以加强淋巴细胞的抗肿瘤细胞毒性。其与细胞毒性细胞CD4和CD8相互作用，抑制肿瘤生长。第四：干扰素γ可以提高一型MHC的表达，并使很多细胞表达第二型MHC。干扰素γ通过活化第二类CD4+辅助性T细胞来扩展免疫应答的识别范围。在体内实验中，干扰素γ可以通过细胞免疫和体液免疫来增加免疫识别能力。第五：干扰素γ作用于T淋巴细胞，促进CD4+T细胞向Th1细胞分化。而Th1参与细胞内的致病菌的清除。第六：干扰素γ可以控制B细胞的分化。它既可以提高，也可以降低B细胞对免疫的应答。在免疫应答的后期，干扰素γ可以促进免疫球蛋白的分泌。在病毒感染的过程中，干扰素γ可以介导IgG2a免疫球蛋白转化成B细胞。第七：干扰素γ在提高一型HLA和二型HLA表达在细胞表面发挥了重要作用。另外，干扰素γ可以使细胞膜表面发生改变，这直接导致了病毒难以吸附和附着在细胞表面。第八：干扰素γ促进细胞内ferment-oligoadenilat合成酶的合成。而oligoadenilat的多聚体能活化单子叶植物的内切酶，从而促进了mRNA和rRNA的降解，导致被病毒感染的细胞内的物质合成受到抑制。

目前，将干扰素γ用于治疗各类恶性肿瘤的实验室研究广泛展开，已有的实验证明：干扰素γ具有抑制肿瘤细胞的增殖作用。将干扰素γ连接pET系统中或构建在腺病毒中，并通过大肠杆菌表达干扰素γ已被广泛研究。而干扰素γ也已被用于治疗包括癌症、肺结核、骨硬化病、硬皮病等各种疾病。

核糖体失活蛋白是一类能够以催化的方式使核糖体不可逆失活的蛋白质，主要分为三类。

苦瓜是中国本土生长的一种药用植物，从其种子和果实中分离得到的活性物质在中国被用作抗病毒和抗肿瘤和增强机体免疫力的药物。MAP30是来源于苦瓜的一种属于一型核糖体失活蛋白的生物活性物质。

MAP30的氨基酸序列表明其共有286个氨基酸组成，含有前导肽，前导肽含有23个氨基酸，含有N端糖基化位点。MAP30的三维空间结构含有8个α螺旋和9个β折叠，大部分都位于蛋白质多肽链的C端和N端。

已有的科研成果表明：MAP30通过能抑制HIV-1整合酶活性，破坏DNA的拓扑结构，切割60S核糖体亚基28SrRNA上的特殊核苷酸位点A4324的腺嘌呤和核糖之间的糖苷键这三种方式行使其抗病毒、抗肿瘤、抗菌的生物学功能。进一步的研究表明：MAP30在抑制HIV-1的繁殖过程中，对人类精子活力没有影响。

利用各种工程菌，包括大肠杆菌，巴斯德毕赤酵母表达MAP30已见报道，其表达纯化的MAP30具有抑制乙肝病毒、胃癌细胞、金黄色葡萄球菌的功能。然而，目前在国内外还未见有将hIFNγ、苦瓜素MAP30蛋白基因进行融合克隆、表达并进行双功能检测的报道。

本发明将hIFNγ、苦瓜蛋白MAP30，两者构建成融合蛋白，并在hIFNγ和MAP30之间插入连接肽，连接肽为3Gly6His，这样的设计即保证了干扰素γ和苦瓜蛋白MAP30基因融合翻译形成的蛋白质在空间上的重叠与空间位阻尽可能的小，减少两个蛋白因为过于接近而错误折叠，而6个组氨酸标签也便于表达得到的蛋白通过Ni柱进行纯化。hIFNγ、苦瓜蛋白MAP30虽然为来自不同物种，核苷酸和氨基酸序列都不相同的两个不同的蛋白，但他们有相似的功能。本发明所得到的hIFNγ-MAP30融合蛋白使hIFNγ和MAP30具协同作用，加强单独干扰素γ和单独苦瓜蛋白MAP30的抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用，其抗VSV活力单位为1.5×10⁴IU/mL。

本发明的目的在于：提供一种大肠杆菌基因工程菌株，该菌株可以表达人类干扰素γ(hIFNγ)、苦瓜蛋白MAP30基因工程融合蛋白hIFNγ-MAP30。其优点是：即发挥干扰素间接抗病源微生物的作用，有可发挥苦瓜蛋白MAP30的直接抗病源微生物的作用，在功能上起到互补的双重功效。该工程菌表达量大，易于工业化生产，成本低，安全性好。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种hIFNγ-MAP30融合蛋白，其序列为SEQIDNO.2所示，该融合蛋白保持了hIFNγ和MAP30各自的生物学功能，具有直接和间接抗菌，抗病毒，抗肿瘤等多重生物学功效，可广泛用于人和动物抗病原微生物和抗肿瘤的治疗。

本发明的另一个目的是在于提供了一种hIFNγ-MAP30融合蛋白的制备方法，使用EscherichiacoliBL21（DE3）pET-15b-hIFNγ-MAP30工程菌大量表达该融合蛋白，并使用镍柱纯化，方法简单，易行，适于大规模生产。

本发明还有一个目的是提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，大肠埃希氏菌EscherichiacoliBL21（DE3）pET-15b-hIFNγ-MAP30，F^-ompThsdS_B(r_B ^-m_B ^-)galdcm(DE3)（以下简称为大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)–pET-15b-hIFNγ-MAP30），CCTCCNO:M2013545。该菌株可以表达hIFNγ-MAP30融合蛋白。表达量大且可溶，易于工业化生产，成本低，安全性好。

本发明还有一个目的是在于提供了一种重组融合蛋白hIFNγ-MAP30在制备抗病毒药物中的应用，通过VSV侵染细胞实验证明融合蛋白hIFNγ-MAP30具有抗病毒功能。

本发明的最后一个目的是在于提供了一种重组融合蛋白hIFNγ-MAP30在制备抑制细菌生长药物中的应用。通过牛津杯实验证明基因工程融合蛋白hIFNγ-MAP30具有抑制金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，溶藻弧菌的繁殖。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

本发明的技术要点之一是表达基因工程重组融合蛋白hIFNγ-MAP30的大肠杆菌基因工程菌株的构建及诱导表达。

一种大肠杆菌基因工程菌株EscherichiacoliBL21(DE3)–pET-15b-hIFNγ-MAP30，其制备步骤如下：

1.hIFNγ-MAP30融合基因的制备：

1）hIFNγ基因的制备：

根据GenBank:NM_000619.2,获得hIFNγ基因的序列，委托生物公司合成，其序列为SEQIDNO.3所示

干扰素-γ引物设计：

干扰素-γup：

5'CATGCCATGGGCCAGGACCCATATGTAAAAGAAGCA3'

干扰素-γdown1：

5'ATGGTGTCCGCCTCCCTGGGATGCTCTTCGACC3'

干扰素-γdown2：

5'GTTAACATCGTGATGATGATGATGGTGTCCGCCTCCCTG3'

PCR扩增：其上游引物为干扰素γup：5'CATGCCATGGGCCAGGACCCATATGTAAAAGAAGCA3'；干扰素-γdown1：5'ATGGTGTCCGCCTCCCTGGGATGCTCTTCGACC3'，用KOD-plus-Neo为扩增酶，57.5℃退火，扩增30个循环，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物.得到hIFNγ基因，其序列为SEQIDNO.3所示。

2）hIFNγ基因和接头GGAGGCGGACACCATCATCATCATCAC序列的制备：

扩增hIFNγ基因和接头序列GGAGGCGGACACCATCATCATCATCAC并且形成与苦瓜蛋白MAP30重合的21个碱基。取步骤1）PCR的产物1μL为模板进行这一轮PCR，引物为干扰素-γup，干扰素-γdown2，57.5℃退火，扩增30个循环，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物。

3）MAP30基因的制备：

人工合成MAP30基因，其序列为SEQIDNO.4所示。

苦瓜蛋白引物MAP30up：

5'CATCATCATCACGATGTTAACTTCGATTTGTCGACTGC3'

苦瓜蛋白引物MAP30down:

5'CCGCTCGAGTTAATTCACAACAGATTCCCCAAGG3'

PCR扩增：用KOD-plus-Neo为扩增酶，55.5℃退火，扩增30个循环，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物.得到MAP30基因，其序列为SEQIDNO.4所示。

4）hIFNγ-MAP30融合基因的制备：

重叠延伸PCR，其PCR体系中不含引物，以回收得到的hIFNγ基因和接头序列GGAGGCGGACACCATCATCATCATCAC，MAP30序列为模板，用KOD-plus-Neo为扩增酶，48℃退火，扩增15个循环，得到全长的中间有GGAGGCGGACACCATCATCATCATCAC接头的hIFNγ-MAP30融合基因。

最后一轮PCR为普通PCR，扩增全长的中间有GGAGGCGGACACCATCATCATCATCAC接头序列的hIFNγ-MAP30融合基因，其上游引物为干扰素γup：5'CATGCCATGGGCCAGGACCCATATGTAAAAGAAGCA3'；下游引物为：苦瓜蛋白MAP30down:5'CCGCTCGAGTTAATTCACAACAGATTCCCCAAGG3'，用KOD-plus-Neo为扩增酶，56.5℃退火，扩增30个循环，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物，命名为hIFNγ-MAP30，其序列为SEQIDNO.1所示。

2.pMD18-T-hIFNγ-MAP30的制备：

将得到全长PCR产物hIFNγ-MAP30，克隆到pMD18-T载体中，将连接体系静置在16℃水浴中，1h后转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落用碱裂解法提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序。得到的阳性克隆子即为包含hIFNγ-MAP30基因的大肠杆菌，用于基因的增殖和保藏，提取质粒为pMD18-T-hIFNγ-MAP30。

3.融合基因表达载体的构建：

首先双酶切pMD18-T-hIFNγ-MAP30和质粒pET-15b，胶回收含hIFNγ-MAP30基因的片段和开环pET-15b片段，22℃连接一小时后转化到感受态EscherichiacoliBL21(DE3)中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达hIFNγ-MAP30的大肠杆菌基因工程菌株。申请人于2013年11月4日将该菌送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址：中国武汉武汉大学，分类命名：大肠埃希氏菌EscherichiacoliBL21（DE3）pET-15b-hIFNγ-MAP30，F^-ompThsdS_B(r_B ^-m_B ^-)galdcm(DE3)，CCTCCNO:M2013545。

通过上述方法获得了一种大肠杆菌基因工程菌，大肠埃希氏菌EscherichiacoliBL21（DE3）pET-15b-hIFNγ-MAP30，F^-ompThsdS_B(r_B ^-m_B ^-)galdcm(DE3)，它具有如下特征：最适生长温度为37℃，菌落边缘整齐，表面有光泽、呈灰色。EscherichiacoliBL21(DE3)以T7RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区域整合于BL21的染色体上。

一种基因工程融合蛋白hIFNγ-MAP3的制备方法，其步骤是：

将重组基因工程菌株EscherichiacoliBL21(DE3)-pET-15b-hIFNγ-MAP30的单菌落接种到20mL新鲜液体LB（含终浓度为的10ug/mL氨苄青霉素）培养基中。37℃300rpm摇床培养过夜。将2mL过夜培养物分别同时接种到200mL2×YT（含终浓度为的10ug/mL氨苄青霉素）培养基。37℃200rpm摇床培养至OD600为0.6时(约3小时)加入终浓度为0.5mmol/LIPTG，37℃诱导5h后，离心12000g，1min收集菌体，用10mMPBS(pH8.0)重悬超声波破碎，离心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。扩大培养，超声波破碎后，离心(8000g，4℃，40min)收集上清。融合蛋白hIFNγ-MAP30通过包涵体变性、复性、透析、浓缩后得到用SDS-PAGE检测蛋白纯化结果。得到纯化的hIFNγ-MAP30蛋白。

一种重组融合蛋白hIFNγ-MAP30在制备抗病毒药物中的应用，其应用过程是：通过VSV侵染细胞实验证明融合蛋白hIFNγ-MAP30具有抗病毒功能。

一种重组融合蛋白hIFNγ-MAP30在制备抑制细菌生长药物中的应用，其应用过程是：通过牛津杯实验证明基因工程融合蛋白hIFNγ-MAP30具有抑制金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，溶藻弧菌的繁殖。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.纵观国际人类IFNγ的市场，目前已有注射用重组人干扰素γ的药物，但是还没有单独的MAP30药物的生产，以及将这两个蛋白hIFNγ和MAP30通过连接肽连在在一起，以融合蛋白的方式进行表达，用EscherichiacoliBL21(DE3)–pET-15b-hIFNγ-MAP30表达出的hIFNγ-MAP30重组蛋白，可以增加单一MAP30蛋白或单一hIFNγ蛋白的抗病毒、抗肿瘤、抗菌生物学活性。

2.本发明在生产和使用中无环境污染危险，属于绿色的生物制品，利于环保。

3.本发明利用大肠杆菌系统生产hIFNγ-MAP30，大肠杆菌是非致病性微生物，不存在散毒的危险。本发明中的hIFNγ-MAP30属于基因工程蛋白质，在环境中很容易降解。

4.本发明利用大肠杆菌表达hIFNγ-MAP30融合蛋白，得到一种可以大规模生产hIFNγ-MAP30的工艺方法。由EscherichiacoliBL21(DE3)-pET-15b-hIFNγ-MAP30所得到的hIFNγ-MAP30融合蛋白不仅表达量大，操作简单，成本低，也具有加强单独干扰素γ和单独苦瓜蛋白MAP30的抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用。

附图说明

图1为一种hIFNγ-MAP30融合基因的pMD18-T载体的制备示意图。

图2为一种重组表达质粒pET-15b-hIFNγ-MAP30的构建过程示意图。

图3为一种重组表达质粒pET-15b-hIFNγ-MAP30的酶切和PCR鉴定示意图。

泳道1：MarkerD2000。

泳道2：hIFNγ-MAP30基因重叠PCR产物，碱基数为1269bp。

泳道3：重组表达质粒pET-15b-hIFNγ-MAP30NcoI/XhoI双酶切产物。

泳道4：重组表达质粒pET-15b-hIFNγ-MAP30NcoI单酶切产物。

泳道5：重组表达质粒pET-15b-hIFNγ-MAP30XhoI单酶切产物。

泳道6：重组表达质粒pET-15b-hIFNγ-MAP30未切。

泳道7：MarkerIV。

图4为EscherichiacoliBL21(DE3)-pET-15b-hIFNγ-MAP30表达的hIFNγ-MAP30SDS-PAGE鉴定示意图。

泳道1：Marker

泳道2：为EscherichiacoliBL21(DE3)-pET-15b-hIFNγ-MAP30未经诱导上清。

泳道3：为EscherichiacoliBL21(DE3)-pET-15b-hIFNγ-MAP30未诱导沉淀。

泳道4：为EscherichiacoliBL21(DE3)-pET-15b-hIFNγ-MAP30诱导上清。

泳道5：为EscherichiacoliBL21(DE3)-pET-15b-hIFNγ-MAP30诱导沉淀。

图5为纯化后的hIFNγ-MAP30SDS-PAGE鉴定示意图。

图6为干扰素-γ苦瓜蛋白MAP30对金黄色葡萄球菌的抑制作用示意图。

图7为干扰素-γ苦瓜蛋白MAP30对BL21(DE3)的抑制作用示意图。

图8为干扰素-γ苦瓜蛋白MAP30对Rosetta的抑制作用示意图。

图9为干扰素-γ苦瓜蛋白MAP30对Origami的抑制作用示意图。

图10为干扰素-γ和苦瓜蛋白MAP30对溶藻弧菌的抑制作用示意图。

具体实施方式：

本发明所用试剂，如无特别说明，均购自武汉意源生物有限公司。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术。

实施例1：

hIFNγ-MAP30融合基因的制备

1.hIFNγ-MAP30融合基因的制备：

1）hIFNγ基因的制备：

设计引物

干扰素-γ引物设计：

干扰素-γup：

5'CATGCCATGGGCCAGGACCCATATGTAAAAGAAGCA3'

干扰素-γdown1：

5'ATGGTGTCCGCCTCCCTGGGATGCTCTTCGACC3'

干扰素-γdown2：

5'GTTAACATCGTGATGATGATGATGGTGTCCGCCTCCCTG3'

扩增干扰素-γ并进行部分延伸的PCR产物，按照下表添加PCR体系

按照下表所示程序进行扩增，30个循环。

得到hIFNγ基因，其序列为SEQIDNO.3所示。

2）hIFNγ基因和接头GGAGGCGGACACCATCATCATCATCAC序列的制备：

扩增hIFNγ基因和接头序列GGAGGCGGACACCATCATCATCATCAC并且形成与苦瓜蛋白MAP30重合的21个碱基。取步骤1）PCR的产物1μL为模板进行这一轮PCR，PCR的体系和参数如下表所示

3）MAP30基因的制备：

人工合成MAP30基因，其序列为SEQIDNO.4所示。

苦瓜蛋白MAP30引物设计：

苦瓜蛋白MAP30up：

5'CATCATCATCACGATGTTAACTTCGATTTGTCGACTGC3'

苦瓜蛋白MAP30down:

5'CCGCTCGAGTTAATTCACAACAGATTCCCCAAGG3'。

按以下体系和条件进行PCR，扩增MAP30基因

4）hIFNγ-MAP30融合基因的制备：

PCR为重叠延伸PCR，其PCR体系中不含引物，以回收得到的hIFNγ基因和接头序列GGAGGCGGACACCATCATCATCATCAC，MAP30序列为模板，用KOD-plus-Neo为扩增酶，48℃退火，扩增15个循环，得到全长的中间有GGAGGCGGACACCATCATCATCATCAC接头的hIFNγ-MAP30融合基因。

实施例2：

融合基因表达载体的亚克隆

将得到全长PCR产物hIFNγ-MAP30的3′末端加“A”

反应体系如下所示：

72℃反应30min

将得到全长PCR产物hIFNγ-MAP30，克隆到从TaKaRa公司购买的pMD18-T载体中，连接反应体系如下所示：

试剂体积

SolutionI5ul

PCR+A产物4μL

pMD-18载体1ul

Total20ul

所述的SolutionI为pMD18-T连接Buffer，TaKaRa公司配套试剂盒

将连接体系静置在16℃水浴中，1h后转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落用碱裂解法提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序。得到的阳性克隆子即为包含hIFNγ-MAP30基因的大肠杆菌，用于基因的增殖和保藏，提取的质粒为pMD18-T-hIFNγ-MAP30。

实施例3：

融合基因表达载体的构建：

首先双酶切pMD18-T-hIFNγ-MAP30和质粒pET-15b，用美国NewEnglandBiolabs(NEB)公司生产的NcoI/XhoI进行双酶切反应，反应时间3h，反应温度37℃，具体双酶切反应如下所示：

所述的Buffer4为NEB公司内切酶套装中的试剂。

酶切结束后，取pMD18-T-hIFNγ-MAP30双酶切产物和开环pET-15b产物进行1％质量体积比的琼脂糖凝胶电泳，电压120V，电泳时间25min。电泳结束后，用凝胶成像系统照相，保存结果。然后进行DNA琼脂糖凝胶电泳和DNA回收。

将回收得到的hIFNγ-MAP30双酶切产物与pET-15b开环产物在22℃进行连接反应，连接时间为1h。连接反应体系如下所示：

反应1h之后，将连接体系放入65℃水浴锅中，保温10min，使T4DNA连接酶失活。

转化到大肠杆菌JM109感受态细胞，感受态细胞JM109按照实实施例4制备，挑取单菌落培养，用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含hIFNγ-MAP30基因的大肠杆菌，为EscherichiacoliJM109–pET-15b-hIFNγ-MAP30。

实施例4：

感受态细胞的制备及转化

氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞：其步骤是：

1.将大肠杆菌JM109接种在无抗生素的LB固体培养基上划线，37℃培养过夜。

2.挑取单菌落接种到10mLLB液体培养基中，37℃摇床300r/min培养过夜。

3.次日早上取200μL培养物，加入20mLLB液体培养基中，37℃摇床300r/min至OD600为0.6左右。

4.将20mL的菌液连带三角瓶一起放在冰上30min以上。

5.4℃，8000g离心30sec，倒出上清，晾干残液，各加入1mL的0.1MCaCl₂预冷溶液，轻轻吹打，重悬沉淀，冰浴30min以上。

6.4℃，8000g离心30sec，倒出上清后各加入100μL的0.1MCaCl₂冷溶液，轻轻振荡，重悬沉淀后得到的感受态细胞即可使用，该法制得的感受态细胞只能在一天内使用。

连接产物转化大肠杆菌感受态细胞：其步骤是：

1.加实施例3连接反应后的产物10μL于100μLJM109大肠杆菌感受态细胞中，轻轻摇动，使其混合，冰浴30min以上后，42℃，热激90sec。

2.热激结束后，立即置于冰上2min。

3.等不含有任何抗生素的LB培养基冷却到50～60℃时，加入50μL100mg/μL的Amp轻轻摇晃，Amp的最终浓度为1mMol/L，使Amp在LB中分布均匀。

4.将加有Amp的LB培养基倒平皿，每皿大约15mL，使其自然凝固。

5.将110μL左右的菌液涂布在一个平皿上。

6.同时做阴性对照，即直接将制得的感受态细胞涂含有Amp的平板，观察JM109能否生长，以此判定感受态细胞是否污染。

7.37℃培养箱中，倒置培养15h左右。

由此法可以制备得到EscherichiacoliJM109-pET-15b-hIFNγ-MAP30单菌落。

实施例5：

工程菌EscherichiacoliBL21(DE3)–pET-15b-hIFNγ-MAP30的制备：

通过碱裂解法将pET-15b-hIFNγ-MAP30从EscherichiacoliJM109-pET-15b-hIFNγ-MAP30中提取得到，将质粒pET-15b-hIFNγ-MAP30转化到感受态EscherichiacoliBL21(DE3)中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达hIFNγ-MAP30的工程菌，申请人于2013年11月4日将该菌送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址：中国武汉武汉大学；分类命名：大肠埃希氏菌EscherichiacoliBL21（DE3）pET-15b-hIFNγ-MAP30，F^-ompThsdS_B(r_B ^-m_B ^-)galdcm(DE3)；保藏编号：CCTCCNO:M2013545。

实施例6：

基因工程融合蛋白hIFNγ-MAP30的制备：

用0.5％IPTG为诱导剂，诱导目的蛋白的表达，具体步骤如下：

1.20μLEscherichiacoliBL21(DE3)–pET-15b-hIFNγ-MAP30（OD₆₀₀=0.6）接种到20mL的LB(含Amp浓度为10mg/mL)培养基中，摇床37℃过夜，并设对照组（即接种普通包含pET-15b载体的EscherichiacoliBL21(DE3)）。

2.第二天，转接1％的EscherichiacoliBL21(DE3)–pET-15b-hIFNγ-MAP30到新的20mLLB培养基中，加入20μLAmp抗生素，也就是200μL过夜菌液接种到20mL2YT培养基中，摇菌37℃培养，300rpm。对照组同样操作。

3.摇菌2.5h后，实验组和对照组分别加IPTG诱导，IPTG终浓度为0.5mmol/L。

4.摇菌5h，37℃，300rpm培养。

5.5h后，结束发酵，取1.5mL的发酵液放入1.5mL的小EP中，常温离心，12000rpm，1min，将大肠杆菌离心沉淀下来。倒弃上清，用细胞裂解液重悬菌体。

6.用细胞破碎液重悬沉淀后，超声波破碎，工作时间3sec，间歇时间6sec，超声波功率400W，超声波全程时间1min，超声波破碎时样品应该放在冰上，以避免样品因为超声波破碎而产生过多的热量而导致蛋白质变性沉淀。

7.破碎结束后，4℃，12000rpm离心，1min，将沉淀离心下来。

8.取50μL上清，加入等体积2×SDS凝胶上样缓冲液制备样品，立刻混匀，防止沉淀产生。

9.其余上清倒弃，用50μL的水重悬细胞沉淀，加入等体积的2×SDS凝胶上样缓冲液制备样品，立刻混匀，防止沉淀产生。

10.将样品沸水浴5min左右。

9.用SDS-PAGE(12％)电泳。12％SDS-PAGE的配置各组分比例如下：

10.卸胶后，常温考马斯亮蓝进行SDS聚丙烯酰胺凝胶染色过夜。

11.第二天，将凝胶浸泡于水︰甲醇︰冰醋酸（5:4:1）溶液中，置平缓摇动的平台上脱色。脱色时间为4h左右，中间换一次洗脱液，直至背景脱干净为止。融合蛋白hIFNγ-MAP30的SDS-PAGE鉴定见附图4。

12.扩大培养，超声波破碎后，离心(8000g，4℃，40min)。融合蛋白hIFNγ-MAP30通过包涵体变性、复性、透析、浓缩后得到用SDS-PAGE检测蛋白纯化结果，得到纯化的hIFNγ-MAP30蛋白。

实施例7：

基因工程融合蛋白hIFNγ-MAP3的变性、复性、透析、浓缩

1.结束发酵后，常温离心，8000rpm，40min，将大肠杆菌离心沉淀下来。

2.称取菌体总重量，每1g菌体用30mL的细胞裂解液重悬，倒入超声波破碎杯中，超声波破碎，工作时间3sec，间歇时间6sec，超声波功率400W，超声时间20min。

3.破碎结束后，4℃，8000rpm离心，30min，将沉淀离心下来，倒弃上清。用包涵体洗涤液重悬细胞，沉淀和包涵体裂解液的比例是1:30，将洗涤液倒入超声波破碎杯内，超声破破碎洗涤，工作时间3sec，间歇时间6sec，超声波功率400W，超声时间15min。

4.洗涤结束后，4℃，8000rpm离心，30min，将沉淀离心下来，倒弃上清。用一定量的包涵体变性液重悬细胞沉淀，至4℃冰箱变性过夜。

5.第二天8000rpm，4℃离心30min，转移上清至一小烧杯，往小烧杯中加入大于两倍体积的包涵体复性液，混匀后，4℃复性过夜，离心的沉淀丢弃。

6.根据复性好的蛋白质溶液体积，剪一定长度的透析袋，将透析袋在含有0.1mmol/L的EDTA和0.1mmol/L的NaHCO₃中煮沸15min，以除去甘油和对蛋白质等有害的硫化物、重金属和一些能吸收紫外线的杂质。

7.将复性过夜的包涵体复性液8000rpm，4℃离心30min，将上清转移到27mm的透析袋中，透析袋的截留分子量是8000-14000，两端用夹子夹住，确定不漏后，放入2L透析液中。采用梯度透析方法，以减少由于蛋白质所在的环境变化发生剧烈改变而引起的蛋白质复性沉淀。透析液首先在3M尿素中透析4h，再换到2M尿素中透析4h，再换到1M尿素中透析4h，最后在不含尿素的溶液中进行透析。另外，透析液特别注意pH和盐离子浓度。pH要远离干扰素γ苦瓜蛋白MAP30融合蛋白的等电点，而盐离子浓度，经过摸索，在0.3mol/L的NaCl中不会透析形成沉淀。另外，透析袋中要预留1/3左右的体积，以防止透析过程中，水分子进入透析袋，使透析袋中的液体含量增加过多而将透析袋涨破。

8.透析结束后，将蛋白质溶液用聚乙二醇20000进行浓缩，浓缩在4℃条件下进行，注意不要浓缩过度，以防止形成蛋白质因为浓度过高而沉淀。

9将浓缩得到的蛋白质溶液每50μL一个小EP管分装，-20℃保存，不要反复冻融。

10.同时取纯化得到的蛋白质溶液进行SDS-PAGE电泳，检测是否纯化到了hIFNγ-MAP30融合蛋白。

图5，经浓缩后，融合蛋白蛋白浓度为405μg/mL，用于以下实施例。

实施例8：

VSV侵染细胞实验

1.MEM培养液：最低必须培养基，取MEM培养基粉末1袋，加水溶解并稀释至1000mL，加青霉素10⁵IU和链霉素10⁵IU，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，过0.22um滤膜除菌，4℃保存。

2.完全培养液：量取新生牛血清10mL，加MEM培养液90mL，混匀，4℃保存。

3.测定培养液：量取新生牛血清7mL，加MEM培养液93mL，混匀，4℃保存。

4.攻毒培养液：量取新生牛血清3mL，加MEM培养液97mL，混匀，4℃保存。

5.消化液：称取乙二胺四乙酸二钠0.2g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.152g，磷酸二氢钾0.2g，加水溶解并稀释至1000mL，121℃，15min灭菌。

6.染色液：称取结晶紫50mg，加无水乙醇20mL溶解后，加水稀释至100mL，即可用。

7.脱色液：量取无水乙醇50mL，醋酸0.1mL，加水稀释成100mL。

8.PBS称取氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g加水溶解并稀释至1000mL，121℃,15min灭菌。

9.标准品溶液的准备

取人干扰素生物学活性测定的国家标准品，按说明书复溶后，用测定培养液稀释至每1mL含1000IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共5个稀释度，每个稀释度做5个复孔，在无菌条件下操作。

10.使WISH细胞CCL-25(购自ATCC，CCL-25^TM)在培养基中铁壁生长，按(1:2)～(1:4)传代，每周传代2～3次，于完全培养液中生长。

11.轻摇WISH细胞，弃去培养基，用PBS洗2次后加消化液消化，显微镜下观察消化程度，可见显微镜下大部分细胞离散。

12.吸弃消化液，立即加入5mL10％的MEM培养液，终止消化反应，用10mL移液管将细胞吹散，显微镜下观察大部分细胞呈现单个细胞。

13.用完全培养基配制成每1mL含2.5×10⁵～3.5×10⁵个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100uL，于37℃，5％二氧化碳条件下培养4～6h。14.将配制完成的标准品溶液和待测样品（405μg/mL）移入接种WISH细胞的培养板中，每孔加入100uL，于37℃，5％二氧化碳条件下培养18～24h。

15.弃去细胞培养板中的上清液，加保存的水泡性口炎病毒(VSV)用攻毒培养液稀释至100CCID₅₀(半数细胞感染剂量)，每孔100ul，于37℃，5％二氧化碳条件下培养24h。

16.弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入染色液50ul，室温放置30min，用流水小心洗去染色液，并吸干残留水分。

17.每孔加入脱色液100ul，室温放置3～5分钟。混匀后，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm出测定吸光度，记录测定结果。同时设定只加病毒的阴性对照组和细胞空白对照组。

18.以保护半数(50％)细胞免受病毒损害的最高干扰素稀释度为1个干扰素活性单位。

结果显示：融合蛋白干扰素-γ苦瓜蛋白MAP30的抗病毒活力单位是1.5×10⁴IU/mL。

实施例9：

干扰素-γ苦瓜蛋白MAP30融合蛋白的抗菌实验

(1).前一天晚上分别接种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌Origami、大肠杆菌Rosetta到LB液体培养基中，其中金黄色葡萄球菌和BL21不加抗生素，Origami加卡那霉素和四环素，Rosetta加氯霉素，卡那霉素和四环素以及氯霉素的终浓度均为1mM/mL，溶藻弧菌用2216E液体培养基中。37℃摇床，300rpm，培养过夜。其中，溶藻弧菌培养时间为24h。

(2).第二天晚上，分别接种金黄色葡萄球菌、BL21(DE3)、Origami、Rosetta到不含有抗性的LB固体培养基上，各取50μL，用涂布棒均匀涂布在LB固体培养基上。溶藻弧菌也同样取50μL涂布在TCBS弧菌选择性培养基上。

(3).预先将一个培养基分成三部分，分别作为阳性对照，阴性对照和样品。

(4).用镊子取灭菌后的牛津杯，将其放置在培养基上相对位置，并加入阳性对照，阴性对照和样品。其中阳性对照为Amp，Amp的浓度是10mM/mL，滴加体积为20μL；阴性对照为菌的H₂O，滴加体积为50μL；样品浓度根据Bradford法测定的值为405μg/mL，滴加的量为150μL。共5个平板。

(5).正置固体平板培养基，37℃培养，其中金黄色葡萄球菌、BL21(DE3)、Origami、Rosett

a培养时间为12-16h，溶藻弧菌培养时间为24h。

(6).观察并测量抑菌圈大小，记录实验结果。

用纯化得到的干扰素-γ苦瓜蛋白MAP30融合蛋白进行抑菌试验，实验对象，包括金黄色葡萄球菌，溶藻弧菌，BL21(DE3)，Rosetta，Origami都出现了一定的抗菌性。具体实验结果如图6,7,8,9,10和表1所示，用抑菌圈的大小表示干扰素-γ苦瓜蛋白MAP30融合蛋白对不同微生物的抑菌效果。

表1干扰素-γ苦瓜蛋白MAP30对不同微生物的抑制作用

由表1可知，纯化得到的干扰素-γ苦瓜蛋白MAP30融合蛋白对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最为明显，而对大肠杆菌的各种菌株，BL21(DE3)、Rosetta、Origami等都有抑制，但是其抑制大肠杆菌的能力没有其抑制金黄色葡萄球菌的能力强，另外，其对溶藻弧菌也有一定的抑制作用。

SEQUENCELISTING

<110>湖北肽洋红生物工程有限公司

<120>一种重组融合蛋白hIFNγ-MAP30及制备方法和应用

<130>一种重组融合蛋白hIFNγ-MAP30及制备方法和应用

<160>4

<170>PatentInversion3.1

<210>1

<211>1251

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

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<212>PRT

<213>人工序列

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Claims

1.一种重组的基因，其序列为SEQIDNO.1所示。

2.权利要求1所述基因编码的蛋白，其序列为SEQIDNO.2所示。

3.一种表达权利要求2所述蛋白的工程菌株，其保藏编号为CCTCCNO:M2013545。

4.权利要求1所述的基因或权利要求2所述的蛋白在制备抑制溶藻弧菌生长药物中的应用。

5.权利要求1所述的基因或权利要求2所述的蛋白在制备抑制金黄色葡萄球菌生长药物中的应用。

6.权利要求1所述的基因或权利要求2所述的蛋白在制备抑制大肠杆菌生长药物中的应用。

7.权利要求1所述的基因或权利要求2所述的蛋白在制备抗水泡性口炎病毒药物中的应用。