CN108117589B - 一种低值鱼抗氧化肽的分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于海洋化学领域，具体涉及一种低值鱼抗氧化肽的分离纯化方法及分离获得低值鱼抗氧化肽。将经蛋白酶酶解的低值鱼酶解液依次经不同分子量超滤膜进行超滤、凝胶色谱层析和高效液相色谱层析分离纯化，所得组分即为含低值鱼抗氧化肽组分；其中，各步处理后均测定各个组分的抗氧化活性,将抗氧化活性最高的组分进行下一步的处理。本发明提供了一种系统的准确的分离纯化低值鱼抗氧化肽的技术，获得了氨基酸序列明确的低值鱼抗氧化肽，且与初始酶解液相比，目标肽段的抗氧化活性显著提高。

Description

一种低值鱼抗氧化肽的分离纯化方法
技术领域
本发明属于海洋化学领域，具体涉及一种低值鱼抗氧化肽的分离纯化方法及分离获得低值鱼抗氧化肽。
背景技术
随着捕捞业技术的发展和国际竞争水平的增加，致使鱼类大量消耗，进而造成全世界大部分可利用鱼类的过度开发和消亡。此外，随着人口增加和人类倾向于对健康有益的海产品的消费观念的提升，增加了对鱼类和水产品的供求。然而在目标鱼种被过度开发利用的同时，很多没有商业价值的非目标鱼种，即低值鱼的加工仍没有得到很好的开发和利用，大部分作为动物饲料和肥料，或者废弃物丢弃，而这些鱼类资源原本可以通过配方和深加工，变为一系列高附加值的海产品。因此，实现低值鱼的高值化利用是目前亟待解决的问题。
海洋生物活性肽是近几年来的研究重点，能够潜在的影响人类健康和降低疾病风险，已引起了广泛的关注。海洋生物活性肽因为其结构特性、氨基酸组成和序列不同，而具有广泛的生物活性，包括抗氧化活性，抗高血压活性，抗菌活性，抗炎活性和抗血栓活性等，其中抗氧化活性因其与人类疾病和衰老密切相关而得到广泛关注。寻找天然安全的抗氧化剂，以更好的应用于食品工业和医药领域显得尤为迫切。
此外，海洋生物活性肽的活性与其氨基酸组成和序列结构密切相关，因此，探讨海洋生物活性肽的分离和纯化显得尤为重要。本专利旨在分离纯化低值鱼抗氧化肽，确定其氨基酸序列，这对于低值鱼的高值化利用是非常有意义的。
发明内容
本发明的目的是提供一种低值鱼抗氧化肽的分离纯化方法及分离获得低值鱼抗氧化肽。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种低值鱼抗氧化肽的分离纯化方法，将经蛋白酶酶解的低值鱼酶解液依次经不同分子量超滤膜进行超滤、凝胶色谱层析和高效液相色谱层析分离纯化，所得组分即为含低值鱼抗氧化肽组分；其中，各步处理后均测定各个组分的抗氧化活性,将抗氧化活性最高的组分进行下一步的处理。
进一步的说
1)将经蛋白酶解的低值鱼酶解液，经1000Da－10000Da不同分子量超滤膜进行超滤，得到不同截留分子量的酶解液，对获得的酶液进行抗氧化活性的测定，将抗氧化活性最高的组分经凝胶色谱层析柱分离，以双蒸水作为洗脱液，流速为0.3mL/min－0.6mL/min，收集各洗脱峰，并经紫外检测器检测220nm和280nm处各样品的出峰，再经抗氧化活性检测，确定抗氧化活性最高的洗脱峰，待用；
2)将上述层析处理后抗氧化活性最高的洗脱峰经高效液相色谱层析分离纯化，以5％－40％乙腈进行梯度洗脱，流速为5mL/min－10mL/min，收集洗脱峰，并经紫外检测器检测220nm和280nmnm处各样品出峰，再经抗氧化活性的检测，确定抗氧化活性最高组分即为低值鱼抗氧化肽。
所述抗氧化活性的测定可通过羟自由基清除能力测定，DPPH自由基清除能力测定，超氧自由基清除能力测定，还原能力测定，以及细胞抗氧化活性测定等等。
所述低值鱼为鲐鱼，鲱鱼，鳀鱼，鳟鱼，沙丁鱼等价格低廉且未被充分利用的小型鱼类。
所述低值鱼为鲐鱼时，经分离获得高活性高纯度的低值鱼活性肽的氨基酸序列为：七肽LDIQKEV或八肽TAAIVNTA。
一种高抗氧化活性的低值鱼活性肽，鲐鱼高抗氧化性活性肽为LDIQKEV或TAAIVNTA。
所述的高抗氧化性的低值鱼活性肽的获得方法，将经蛋白酶酶解的低值鱼酶解液依次经不同分子量超滤膜进行超滤、凝胶色谱层析和高效液相色谱层析分离纯化，所得组分即为含低值鱼抗氧化肽组分；其中，各步处理后均测定各个组分的抗氧化活性,将抗氧化活性最高的组分进行下一步的处理。
进一步的说
1)将经蛋白酶解的低值鱼酶解液，经1000Da－10000Da不同分子量超滤膜进行超滤，得到不同截留分子量的酶解液，对获得的酶液进行抗氧化活性的测定，将抗氧化活性最高的组分经凝胶色谱层析柱分离，以双蒸水作为洗脱液，流速为0.3mL/min－0.6mL/min，收集各洗脱峰，并经紫外检测器检测220nm处各样品出峰，再经抗氧化活性检测，确定抗氧化活性最高的洗脱峰，待用；
2)将上述层析处理后抗氧化活性最高的洗脱峰经高效液相色谱层析分离纯化，以5％－40％乙腈进行梯度洗脱，流速为5mL/min－10mL/min，收集洗脱峰，并经紫外检测器检测220nm处各样品出峰，再经抗氧化活性的检测，获得抗氧化活性最高组分即为低值鱼抗氧化性的七肽和八肽。
本发明具有以下优点：
1.本发明提供的分离纯化方法，能够制得纯度高，活性强，分子量小的低值鱼抗氧化活性肽，与最初酶解液相比，其抗氧化活性显著提高。
2.本发明得到的序列明确的低值鱼抗氧化活性肽，具有较高的商业价值，是对海洋生物资源在医药和食品领域实现高值化利用的重要补充。
附图说明
图1为本发明实施例提供的鲐鱼抗氧化肽经凝胶色谱层析分离谱图及各组分的抗氧化活性比较。
图2为本发明实施例提供的鲐鱼抗氧化肽经高效液相色谱层析分离谱图及各组分的抗氧化活性比较。
图3为本发明实施例提供的鲐鱼分离获得抗氧化活性七肽LDIQKEV结构鉴定质谱图。
图4为本发明实施例提供的鲐鱼分离获得抗氧化活性八肽TAAIVNTA结构鉴定质谱图。
具体实施例
下面通过实施例对本方面方案作进一步说明：
实施例1：
以鲐鱼作为原材料经绞碎，加入去离子水置于恒温水浴43.72℃中经搅拌保温5min，再调节pH值到7.26；而后加入中性蛋白酶1203U/g进行酶解反应4.53h后，将酶解液置于100℃沸水中灭活10min，然后4℃下18000×g离心10min，收集上清液，即低值鱼活性肽酶解液MPH。将制备的低值鱼活性肽酶解液分别经截留分子量为3500Da和10000Da的超滤膜进行超滤，得到不同组分的酶解液。经细胞抗氧化活性检测上述截留得到的不同组分酶解液，得到抗氧化活性最高的组分MPH-III，即分子量<3500Da，冷冻干燥，将干燥后样品上样到凝胶色谱层析柱SephadexG-25，经双蒸水洗脱，流速为0.5mL/min，并用紫外检测器检测220nm处样品出峰，自动收集器每10min收集一管洗脱液，合并样品峰，冷冻干燥，得到五个组分。通过细胞抗氧化活性检测各组分的抗氧化性活性，将抗氧化活性最高的组分MPH-III-2经高效液相色谱层析柱
Figure BDA0001579249020000031
peptide BEH C18进一步分离纯化，流动相为5％－20％的乙腈梯度洗脱，洗脱流速为5mL/min，洗脱时间为40min，用紫外检测器检测220nm处样品出峰，收集样品峰，冷冻干燥，得到六个组分。通过细胞抗氧化活性检测各组分的抗氧化活性，抗氧化活性最高的组分MPH-III-2-6，通过质谱确定其氨基酸序列分别为：七肽LDIQKEV和八肽TAAIVNTA，即为鲐鱼的抗氧化肽，其抗氧化活性分别为65.57％和70.84％，显著高于初始酶解液的抗氧化活性53.65％。
实施例2：
以鲱鱼作为原材料经绞碎，加入去离子水置于恒温水浴35℃中经搅拌保温10min，再调节pH值到7.28；而后加入胰蛋白酶，加酶量为1357U/g进行酶解反应7h后，将酶解液置于100℃沸水中灭活10min，然后4℃下18000×g离心10min，收集上清液，即低值鱼活性肽酶解液。将制备的低值鱼活性肽酶解液分别经截留分子量为3500Da和10000Da的超滤膜进行超滤，得到不同组分的酶解液。经细胞抗氧化活性检测上述截留得到的不同组分酶解液，得到抗氧化活性最高的组分，即分子量<3500Da，冷冻干燥，将干燥后样品上样到凝胶色谱层析柱SephadexG-25，经双蒸水洗脱，流速为0.5mL/min，并用紫外检测器检测220nm处样品出峰，自动收集器每10min收集一管洗脱液，合并样品峰，冷冻干燥，得到九个组分。通过细胞抗氧化活性检测各组分的抗氧化性活性，将抗氧化活性最高的组分经高效液相色谱层析柱
Figure BDA0001579249020000041
peptide BEH C18进一步分离纯化流动相为5％－30％的乙腈梯度洗脱，洗脱流速为5mL/min，洗脱时间为48min，用紫外检测器检测220nm处样品出峰，收集样品峰，冷冻干燥，得到五个组分。通过细胞抗氧化活性检测各冷冻干燥后组分的抗氧化活性，抗氧化活性最高的组分即为鲱鱼的抗氧化组分，可以进一步的通过质谱确定其氨基酸序列。
实施例3：
以鳀鱼作为原材料经绞碎，加入去离子水置于恒温水浴40℃中经搅拌保温8min，再调节pH值到6.5；而后加入中性蛋白酶1400U/g进行酶解反应7h后，将酶解液置于100℃沸水中灭活10min，然后4℃下18000×g离心10min，收集上清液，即低值鱼活性肽酶解液。将制备的低值鱼活性肽酶解液分别经截留分子量为1000Da和5000Da的超滤膜进行超滤，得到不同组分的酶解液。通过细胞抗氧化活性检测上述截留得到不同组分酶解液的抗氧化活性，将抗氧化活性最高的组分，即分子量<1000Da，冷冻干燥，将干燥后样品上样到凝胶色谱层析柱SephadexG-15，经双蒸水洗脱，流速为0.4mL/min，并用紫外检测器检测220nm处样品出峰，自动收集器每10min收集一管洗脱液，合并样品峰，冷冻干燥，通过细胞抗氧化活性检测冷冻干燥后各组分的抗氧化性活性，将抗氧化活性最高的组分经高效液相色谱层析柱YMC-Pack ODS-AQ进一步分离纯化，流动相为5％－30％的乙腈梯度洗脱，洗脱流速为3mL/min，洗脱时间为38min，用紫外检测器检测220nm处样品出峰，收集样品峰，冷冻干燥，通过细胞抗氧化活性检测各冷冻干燥后组分的抗氧化活性，抗氧化活性最高的组分即为该鱼的抗氧化组分，可以进一步的通过质谱确定其氨基酸序列。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种低值鱼抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于： 低值鱼为鲐鱼时，经分离获得高活性高纯度的低值鱼活性肽的氨基酸序列为：七肽LDIQKEV或八肽TAAIVNTA；
分离方法为：
1）以鲐鱼作为原材料经绞碎，加入去离子水置于恒温水浴43.72℃中经搅拌保温5min，再调节pH值到7.26；而后加入中性蛋白酶1203 U/g进行酶解反应4.53 h后，将酶解液置于100℃沸水中灭活10min，然后4℃下18000×g离心10min，收集上清液，即低值鱼活性肽酶解液 MPH；
2）将经蛋白酶解的低值鱼酶解液，经3500 Da和10000 Da的分子量超滤膜进行超滤，得到不同截留分子量的酶解液，对获得的酶液进行抗氧化活性的测定，将抗氧化活性最高的组分经凝胶色谱层析柱SephadexG-25分离，以双蒸水作为洗脱液，流速为0.5 mL/min，收集各洗脱峰，并经紫外检测器检测220 nm处样品的出峰，再经抗氧化活性检测，确定抗氧化活性最高的洗脱峰，待用；
3）将上述层析处理后抗氧化活性最高的洗脱峰经高效液相色谱层析柱XBridge®peptide BEH C18分离纯化，以5 %－20 %乙腈进行梯度洗脱，流速为5 mL/min，收集洗脱峰，并经紫外检测器检测220 nm处样品出峰，再经抗氧化活性的检测，获得抗氧化活性最高组分即为低值鱼抗氧化肽。
2.一种高抗氧化活性的低值鱼活性肽，其特征在于：鲐鱼高抗氧化性活性肽为LDIQKEV或TAAIVNTA。
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