CN1179749C

CN1179749C - 肿瘤特异性转移因子的制备方法

Info

Publication number: CN1179749C
Application number: CNB031145434A
Authority: CN
Inventors: 王国华; 苏成芝; 杨安钢; 张沥; 药立波; 毛积芳; 王方; 金明; 刘新平; 王成济; 陈苏民; 陈南春; 赵忠良; 柴玉波
Original assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Current assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2003-03-17
Filing date: 2003-03-17
Publication date: 2004-12-15
Anticipated expiration: 2023-03-17
Also published as: CN1438030A

Abstract

肿瘤特异性转移因子的制备方法，其特征在于包括制备抗原、免疫动物及制备肿瘤特异性转移因子。本品取材于经肿瘤抗原免疫的动物脏器，主要成分为小分子多肽、氨基酸及核苷酸等，不含球蛋白、也不会引起过敏，具有转移细胞信息，介导细胞免疫反应，特异性地抑制和杀伤相应的肿瘤细胞，是目前预防和治疗恶性肿瘤的一个安全有效实用的方法。

Description

肿瘤特异性转移因子的制备方法

一.技术领域：

本发明涉及生物技术，特别是涉及一种肿瘤特异性转移因子的制备方法。

二.背景技术：

迄今为止，医学界普遍采用外科手术的方法来治疗绝大多数恶性肿瘤。然而，由于肿瘤发生的隐匿性和发展的侵袭性，半数以上肿瘤患者在确诊之初实际上已出现了瘤细胞的远处转移或亚临床转移灶，患者最终还是被癌魔夺去了生命。如何控制术后复发，消灭亚临床转移灶，克服放疗对扩散性病灶的无效作用，减轻化疗对机体免疫功能抑制带来的不良影响，成为世纪性一大课题。继常规的手术、放疗、化疗之后，肿瘤的生物治疗已成为肿瘤治疗的新模式，肿瘤生物治疗的主体是肿瘤免疫治疗，它的作用机制：一是诱导肿瘤细胞自身生长的停滞或凋亡，二是激活机体内具有抗肿瘤特异性和细胞毒活性的T细胞的产生，达到特异性杀伤肿瘤的目的。然而，肿瘤不仅是系统性疾病，也是全身性疾病，肿瘤的治疗除手术和放疗等局部治疗外，还必须进行全身治疗。从目前国际发展状况来看，肿瘤主动特异性免疫治疗显示了更为良好的临床应用前景。用肿瘤特异性转移因子来治疗肿瘤正是基于上述的作用机理，肿瘤特异性转移因子能激活细胞毒活性的T细胞的产生及细胞因子的分泌，重建、修复及调动机体免疫功能，主动特异性地激发机体对肿瘤细胞的体液免疫和细胞免疫能力，特异性抑制、杀伤相应的肿瘤细胞，对手术切除原发灶患者具有控制转移、消除残余癌细胞的作用，达到治疗恶性肿瘤的目的。对淋巴细胞的特异性激活和对肿瘤细胞的专一性抑制和杀伤作用的共同存在是肿瘤特异性转移因子的治疗依据及特点，使得肿瘤特异性转移因子成为一种安全有效主动特异性免疫治疗理想的药物。对比文件“用MTT-LAI方法鉴定人胃癌特异性转移因子的免疫活性”(《免疫学杂志》1994年第十卷第三期)公开了一种活性检测方法，在该方法中公开了一种转移因子的制备方法，但该方法只是一种常规的制备方法，产品的收获量和抗肿瘤活性均较低。

三.发明内容：

本发明的目的在于提供一种肿瘤特异性转移因子的制备方法，利用肿瘤特异性转移因子对肿瘤细胞的专一性抑制和杀伤作用的特点，采用生物技术制成高效、特异的抗肿瘤药物，提高了产品收获量和抗肿瘤活性。

为达到上述目的，本发明采用的的技术方案的制备方法由以下几个步骤组成：

A.制备抗原：制备所需的原料为癌症患者的癌组织，制备过程为：匀浆后，以5000～10000转/分钟的速度离心20～60分钟后，弃沉淀，再以8000～12000转/分钟的速度离心20～60分钟，最后收上清液除菌，定性定量，分装保存；

B.动物免疫：免疫过程为：采取腹股沟、颈背、腹腔等多点皮下注射，共8～12点，每周免疫1次，共免疫4次，首次免疫和第二次免疫采用抗原加佐剂；第三、四次免疫只用抗原。

C.制备肿瘤特异性转移因子：将经癌细胞抗原免疫的动物脾脏、淋巴结绞碎，匀浆后，冻融：冻结温度为-20～-70℃，融化温度为20～30℃，冻融2～5次，最后低温透析，定量定性，无菌分装。

四、具体实施方式

本发明的具体实施步骤为：

1.制备抗原：

取手术切下的新鲜癌标本，用1～3倍体积的匀浆液，匀浆分散，匀浆液条件是：0.9％NaCL、20mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)-1mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)(PH7.4)，或20mmol/L三羟甲基氨基甲烷·盐酸(Tris·HCl)缓冲液(PH7.4)；离心：5000～10000转/分钟、20～60分钟，弃沉淀；再离心：收上清，离心：8000～12000转/分钟、20～60分钟，收上清除菌，定性定量，分装保存。

2.免疫动物：

选择符合规定之健康山羊，每只重约20Kg，采取腹股沟、颈背、腹腔等多点皮下注射，共8～12点，每周免疫1次，共免疫4次。首次免疫抗原10～30毫克/次，加等量完全福氏佐剂；第2次免疫：抗原10～30毫克/次，加等量不完全福氏佐剂；第3、4次免疫：单用抗原50～100毫克/次。用皮试法检查山羊的致敏状态。

3.制备肿瘤特异性转移因子：

将经肿瘤抗原免疫的山羊脾脏、淋巴结处理干净，绞碎匀浆，冻于-20～-70℃低温下并于20～30℃温度下融化、如此反复冻融2～5次，对生理盐水透析(5000～14000D透析袋)、在温度2～10℃条件下，收透析外液，无菌抽滤，定性定量，并做生物活性检测，分装。

本发明的特点：1.制备过程采用二次离心，可提高抗原的纯度；2.配制的匀浆液利于抗原的释放溶解及保护抗原的完整性；3.免疫的次数及用量既可保证肿瘤特异性转移因子的质量又能提高其产量；4.透析条件能提高肿瘤特异性转移因子的纯度。

本发明的优点：肿瘤特异性转移因子本身不具免疫原性，可长期反复注射，使用安全、效果明显，是目前预防和治疗恶性肿瘤的一个安全有效实用的新方法新技术，具有广泛的市场应用前景及一定的社会价值。且对于消化系统肿瘤、肺癌、肾癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤、颅内易复发性肿瘤等均有较好疗效。

本发明的实施例：

1.制备抗原：收集手术切下的新鲜癌标本，剔除癌灶周围的正常组织，以PH7.4，20mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)-1mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)缓冲液清洗、浸泡、匀浆分散，在4℃、7000转/分钟条件下离心30分钟；收上清，再次在4℃、12000转/分钟条件下离心50分钟，收上清液除菌，留少部分测蛋白量，分装，-20℃冻存备用。

2.免疫动物：选择符合《实验动物管理规程》山羊，每只20公斤，采用腹股沟、颈背、腹腔等多点皮下注射，共8～12点、每点0.5毫升，每周免疫1次，共免疫四次。首次免疫取20毫克/次癌抗原加等量完全福氏佐剂：第二次免疫取20毫克/次癌抗原加等量不完全福氏佐剂；后二次免疫用80毫克/次癌抗原。用皮试法检查山羊的致敏状态。

3.制备肿瘤特异性转移因子：取经免疫的山羊脾脏、淋巴结，剪除包膜、脂肪、纤维组织、用灭菌生理盐水反复洗涤后剪碎，匀浆，-70℃至30℃反复冻融5次，镜检破碎细胞达90％以上，离心弃沉淀取上清液，收上清液装透析袋4℃生理盐水透析30～40小时，透析袋分子量5000D以下，收透析外液过滤除菌，以最高吸收峰处(251nm)8.0abs为1个肿瘤特异性转移因子单位(单位/毫升)，按生物制品分装规程分装，每支2毫升含2单位。

肿瘤特异性转移因子成品检定：

外观：无异物无沉淀无色或淡黄色透明、澄清的液体

无菌试验：按2000年版二部《中国药典》附录XIH检查，应符合规定。

PH值：PH 6.0～7.2，依2000年版二部《中国药典》附录VIH检查，应符合规定。

多肽含量：Folin—酚法，1.0～1.5毫克/毫升

核糖含量：3.5-二羟甲苯比色法0.6～0.7毫克/毫升

E₂₅₂±2nm：有特征吸收峰

E₂₅₀nm、1cm：15～18

E_260/200nm：E_260/280＝2.0～2.3

蛋白质：取本品2毫升加20％磺基水杨酸2毫升振摇，不得产生浑浊

热源：按2000年版二部《中国药典》附录XIE检查，应符合规定

过敏试验：取体重250～350克的健康豚鼠5只，连续次隔日腹腔注射本品0.5毫升，放置2周后，再自股静脉注射本品1.0毫升，注射后15分钟内，观察动物不得有连续次干咳、连续3次前爪抓鼻、明显竖毛、四肢发软、躺卧、呼吸困难、痉挛、虚脱及死亡等现象。

异常毒性：取体重17～20克的健康小白鼠5只，分别由尾静脉注射本品0.5毫升，72小时内不得有死亡；如有死亡时，应另取体重18～19克的小鼠10只复试，全部小鼠在72小时内不得有死亡。

急性毒性试验：小鼠40只，随机分成二组。一组肌肉注射20毫升/公斤受试药(分二次给药)，另一组一次性静脉注射30毫升/公斤受试药，受试药量分别相当于临床成人拟用剂量的250倍和375倍，连续观察7天。结果表明：40只小鼠全部存活，给药后亦未观察到明显的毒性反应。小鼠生长良好，饮食如常，体重增加，行为活动未见异常，毛色光滑。试验结束，将小鼠脱颈处死尸检，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等主要脏器，未见明显病理变化。

活性测定及结果：

E—玫瑰花结实验：取相同小试管4支，2支分别加入Hank’s液0.2毫升作对照管，另2支分别加供试液0.2毫升作测定管。每管加入淋巴细胞悬液0.1毫升，混匀，置37℃恒温水浴活化60分钟。取出，离心(200g，1 0分钟)，弃去上清液，加0.5％绵羊红细胞悬液0.1毫升，摇匀。置37℃温育10分钟，离心(100g，5分钟)，弃去上清液，将细胞轻轻水平旋转混匀，加固定液0.1毫升，轻轻混匀。置4℃冰箱15分钟。取出，每管取1滴分别置于载玻片上，用预先布匀染色液的盖玻片复盖于待染液滴上染色。用高倍镜镜检计数。凡淋巴细胞表面粘附4个以上绵羊红细胞者，即计算为玫瑰花结细胞的百分率，求出各组的平均值。结果：样品管的活性玫瑰花结百分率比对照管的活性玫瑰花结百分率提高10％以上。

MTT-LAI实验：实验分组：对照组为单加培养液、单加普通转移因子、单加肿瘤抗原及普通转移因子+肿瘤抗原；实验组为肿瘤特异性转移因子+相应肿瘤抗原。实验步骤：将小鼠脾淋巴细胞用含10％小牛血清的RPMI-1640液稀释成1×10⁶个/毫升，于96孔细胞培养板中每孔加入细胞液100微升。按实验分组向每孔再加入培养液或各样品。加样完毕，将孔板于37℃培养2.5小时，翻转孔板，弃去孔内上清。然后向各孔内加入180微升不含小牛血清的RPMI-1640液和20微升的MTT溶液(5毫克/毫升)，37℃再孵育4小时。离心(1000g，15分钟)微孔板，弃上清，每孔加入200微升二甲基亚砜以溶解细胞内形成的蓝色化合物(Formazan)，室温放置15分钟。于ELISA-reader DYNATECH MR4000 570nm比色。每组设复孔三份。粘附抑制指数按下式计算：

结果：肿瘤特异性转移因子+相应肿瘤抗原组的白细胞粘附抑制效应(LAI指数％)远高于其它各对照组(P＜0.01)，结果相差非常显著，提示肿瘤特异性转移因子转移的LAI效应是针对相应肿瘤抗原的。说明：肿瘤特异性转移因子+相应肿瘤抗原，如胃癌特异性转移因子+胃癌抗原、肺癌特异性转移因子+肺癌抗原、乳腺癌特异性转移因子+乳腺癌抗原等等。

Claims

1、肿瘤特异性转移因子的制备方法，包括制备抗原、动物免疫、制备肿瘤特异性转移因子等步骤，其特征在于，

2、根据权利要求1所述的肿瘤特异性转移因子的制备方法，其特征在于：匀浆液条件是：0.9％NaCL、20mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)-1mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)(PH7.4)，或20mmol/L三羟甲基氨基甲烷·盐酸(Tris·HCl)缓冲液(PH7.4)。

3、根据权利要求1所述的肿瘤特异性转移因子的制备方法，其特征在于：免疫条件是。首次免疫：抗原加等量完全福氏佐剂；第二次免疫：抗原加等量不完全福氏佐剂，抗原用量为10～30毫克/次；最后两次免疫：只用抗原，抗原用量为50～100毫克/次。

4、根据权利要求1所述的肿瘤特异性转移因子的制备方法，其特征在于：透析条件是：用5000～14000道尔顿透析袋，在温度2～10℃条件下进行。