CN112641924A

CN112641924A - 一种治疗甲状腺癌的药物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN112641924A
Application number: CN202011591685.3A
Authority: CN
Inventors: 王磊; 贾春宝; 吕美丽; 王思璀; 刘琳
Original assignee: Heilongjiang University of Chinese Medicine
Current assignee: Heilongjiang University of Chinese Medicine
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2020-12-29
Publication date: 2021-04-13
Anticipated expiration: 2040-12-29
Also published as: CN112641924B

Abstract

本发明涉及一种治疗甲状腺癌的药物及其制备方法和用途，其具有来源于螺旋藻的活性多肽。本发明通过研究发现，来源于螺旋藻的特定活性多肽可用于诱导再分化低/失分化甲状腺癌以用于¹³¹碘的治疗，为甲状腺癌、特别是碘难治性甲状腺癌的治疗提供了新的选择。

Description

一种治疗甲状腺癌的药物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种治疗甲状腺癌的药物及其制备方法和用途。

背景技术

甲状腺癌是目前临床最常见的内分泌系统恶性肿瘤，约占整个临床肿瘤的1％，一般预后较好。甲状腺癌的主要治疗手段有手术切除、放射性碘治疗、TSH抑制等，其中放射性碘在国外应用很广，在国内也越来越受重视。但是，有部份低分化和失分化甲状腺癌因为失去了甲状腺细胞特有的功能和特性，如钠/碘同向转运体(Sodium/IodideSymporter，NIS)表达下降，摄碘降低甚至不摄取碘，因而不能应用放射性碘治疗。

在组织学上,甲状腺癌可以分类为滤泡上皮细胞起源的乳头状癌(PapillaryThyroidCarcinoma,PTC)、滤泡状癌(FollicularThyroidCarcinoma,FTC)和未分化癌(AnaplasticThyroidCarcinoma,ATC)，以及来源于滤泡旁C细胞的甲状腺髓样癌(MedullaryThyroidCarcinoma,MTC)。目前，甲状腺癌的主要治疗方法有外科手术、术后放射性碘治疗和促甲状腺激素抑制治疗。传统化疗药物对甲状腺癌疗效甚微。大多数PTC和FTC分化程度较高，患者经过外科手术、术后放射性碘治疗和促甲状腺激素抑制治疗后预后良好，可长期生存。但是，临床中仍有一部分患者出现病情进展。在这些进展性局部晚期或转移性分化型甲状腺癌病灶中，有20％-50％的病灶表现出失分化的特点，病灶失去摄碘功能而无法从131I治疗手段中获益，临床上称为放射性碘难治性分化型甲状腺癌(Radioiodine-RefractoryDifferentiatedThyroidCancer,RR-DTC)。此类患者的平均生存期仅为3-5年，10年生存率为10％。ATC是恶性程度最高的甲状腺癌，侵袭性强，缺乏有效的治疗方法，是致死率极高的恶性肿瘤，患者诊断后的生存时间短暂。MTC源自甲状腺滤泡旁C细胞，放射性碘治疗无效，预后较大部分分化型甲状腺癌差。鉴于分化程度较差的PTC和FTC、ATC和MTC均对目前常规的甲状腺癌治疗方法反应欠佳、预后不良，因此统称为放射性碘难治性甲状腺癌。积极寻求难治性甲状腺癌的治疗新策略对提高甲状腺癌的疗效、改善患者的生存率及生活质量具有特殊的重要性和迫切性。

海洋环境复杂多变，其高盐、高压、低温、寡营养等独特条件赋予了海洋生物某些优良的特性。许多研究表明，生物活性肽，尤其是海洋来源的生物活性肽具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌、降压、降血糖等多种作用。而近年来，海洋来源的天然生物抗肿瘤肽也取得一定的进展，成为抗肿瘤药物和保健品开发的重要来源。

螺旋藻(Spirulina)是人类迄今为止所发现的最优质的纯天然蛋白质食品源，其蛋白质含量高达50-70％，由18种氨基酸组成，包含人体全部8种必需氨基酸，且配比合理。其丰富的蛋白质和氨基酸为开发螺旋藻生物活性肽提供了良好的物质基础。利用酶解手段将螺旋藻蛋白进行非变性水解，不仅能提高螺旋藻蛋白的溶解性和体内吸收利用率，还能获取具有特殊生理功能的生物活性肽。目前已有报道从螺旋藻蛋白酶解物中成功提取到抗氧化肽、ACE抑制肽、抑菌肽等，但将从螺旋藻蛋白酶解物中获得的活性用于甲状腺癌、特别是碘难治性甲状腺癌的研究尚未被报道。

发明内容

本发明是为了解决上述不足，提供了一种用于甲状腺癌、特别是碘难治性甲状腺癌的药物及其制备方法和用途。具体而言，为了实现本发明的目的，本发明拟采用如下的技术方案：

本发明一方面涉及一种甲状腺癌的药物，其特征在于其具有来源于螺旋藻的活性多肽。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的活性多肽具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列或者为SEQ ID NO.1的氨基酸序列；任选地，包含或者不包含其它活性成分。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的药物中还包括独立包装的¹³¹碘放射性成分。

在本发明的一个优选实施方式中，所述药物中的活性多肽为注射制剂。

本发明另一方面还涉及本发明药物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将螺旋藻干粉溶于蒸馏水中，制成螺旋藻悬浮液，利用超声结合反复冻融法进行破壁处理；

(2)将步骤(1)得到的螺旋藻液离心，收集上清液，将上清液用50％饱和NH₄SO₄进行盐析纯化；

(3)将步骤(2)盐析后得到的螺旋藻液冷冻离心；，收集沉淀，用浓度为0.005M，pH为6.86的磷酸盐缓冲液溶解，于4℃下透析，脱盐后进行真空冷冻干燥，得到螺旋藻蛋白；

(4)取步骤(3)得到的螺旋藻蛋白配置成2％(w/w)的蛋白液，加入碱性蛋白酶，使酶与底物浓度比为4％(w/w)，调节温度至37℃，pH为10下酶解；然后调节pH至7.0，按照3％(w/w)的酶底比加入胰蛋白酶酶解；再按照4％(w/w)的酶底比加入胰凝乳蛋白酶，酶解；酶解完毕后水浴灭酶，冷却至室温，离心后取上清液；

(5)取步骤(4)得到的酶解液，依次用截留分子量分别为1.5KD以及500D的超滤膜过滤，从而获得分子量大小范围为0.5-1.5KD的螺旋藻蛋白酶解液；

(6)取步骤(5)得到酶解液进行葡聚糖凝胶SephadexG-15柱层析分离，得到目标活性多肽；

(7)将所得到的活性多肽制备成药物。

在本发明的制备方法中，所述活性肽通过固相合成法得到。

本发明另一方面还涉及上述药物的用途，所述药物用于制备治疗甲状腺癌的药物。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的甲状腺癌是指碘难治性甲状腺癌

有益效果

本发明通过研究发现，来源于螺旋藻的特定活性多肽可用于诱导再分化低/失分化甲状腺癌以用于¹³¹碘的治疗，为甲状腺癌、特别是碘难治性甲状腺癌的治疗提供了新的选择。

附图说明

图1为示出采用本发明的活性多肽处理后的甲状腺癌细胞活性的影响的示意图。

图2为示出本发明的药物治疗碘难治性甲状腺癌21d后的各组荷瘤裸鼠肿瘤体积的变化的图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1：制备活性多肽

(1)将50g螺旋藻干粉溶于蒸馏水中，制成螺旋藻悬浮液，利用超声结合反复冻融法进行破壁处理。

(2)将步骤(1)得到的螺旋藻液离心(-4℃，8000r/min离心20min)收集上清液，将上清液用50％饱和NH₄SO₄进行盐析纯化。

(3)将步骤(2)盐析后得到的螺旋藻液冷冻离心(10000r/min离心20min)，收集沉淀，用浓度为0.005M，pH为6.86的磷酸盐缓冲液溶解，于4℃下透析，透析终点用BaCl₂进行检测。脱盐后进行真空冷冻干燥，得到螺旋藻蛋白。

(4)取步骤(3)得到的螺旋藻蛋白配置成2％(w/w)的蛋白液，加入碱性蛋白酶，使酶与底物浓度比为4％(w/w)，调节温度至37℃，pH为10，酶解1h。然后调节pH至7.0，按照3％(w/w)的酶底比加入胰蛋白酶酶解2h。再按照4％(w/w)的酶底比加入胰凝乳蛋白酶，酶解2h。该过程中使用0.05mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在pH±0.05之间。酶解完毕后80℃水浴中灭酶15min，冷却至室温，8000r/min，离心30min后取上清液。

(5)取步骤(4)得到的酶解液，依次用截留分子量分别为1.5KD以及500D的超滤膜过滤(CO₂的压力为0.10MPa的室温下)，从而获得分子量大小范围为0.5-1.5KD的螺旋藻蛋白酶解液。

(6)取步骤(5)得到酶解液进行葡聚糖凝胶SephadexG-15柱层析，柱体积为150mL，上样量为1mL，上样浓度为150mg/mL，流动相为水，流速为0.40mL/min，每8min收集一管，总共收集160管，按照出峰的时间顺序，收集得到5个多肽组分，其中以丰度最高的第3组分作为测序和药物活性研究对象。经过测序，第三组分活性多肽的氨基酸序列为Ala-Ser-His-Arg-Leu-Ala-Thr-Gly-Asp(C→N)。

实施例2：活性多肽对不同种类甲状腺癌细胞活性的影响

(1)乳头状甲状腺癌(PTC)细胞株BCPAP，滤泡状甲状腺癌(FTC)细胞株WRO，滤泡状甲状腺癌失分化细胞株FTC-133，未分化甲状腺癌细胞株SW1636均购自ATCC，其中，BCPA和SW1636细胞用RPMI1640完全培养基培养，FTC-133细胞用DMEM/F12完全培养基培养，WRO细胞用加有NaHCO₃的WRO细胞专用培养基培养。细胞养于细胞培养瓶中，当细胞密度达到80-90％时予以传代，其方法为：去掉培养基，用PBS洗2次，加入0.5mL胰酶消化1分钟左右，等到细胞将要完全变圆时，弃掉胰酶，加入2mL培养液终止消化，按照1:4-1:6的比例传代至T25细胞培养瓶中，再补充培养基至5mL，置于37℃、100％湿度和5％CO₂培养箱孵育，取对数生长期的细胞进行实验。

(2)将细胞接种于96孔板，每组设6个复孔，37℃、5％CO₂培养箱中孵育。细胞贴壁后，弃掉旧培基，其中24孔加入新配培养基(200μL每孔)作为阴性对照组，另外72孔分别加入含有低剂量(10mg/L)活性多肽的培养基(200μL每孔)、中剂量(20mg/L)活性多肽的培养基(200μL每孔)以及高剂量(30mg/L)活性多肽的培养基(200μL每孔)。培养箱中继续孵育48h，48h后弃掉旧培基，加新配培养基(100μL/孔)和CCK-8试剂(10μL/孔)，培养箱中孵育0.5h；450nm波长下用酶标仪检测各孔的OD值，计算细胞活性(以阴性对照组活性为100％进行比较)。

如图1所示，与阴性对照组相比，活性多肽低剂量组、中剂量组和高剂量组均可显著降低乳头状甲状腺癌(PTC)细胞株BCPAP、滤泡状甲状腺癌(FTC)细胞株WRO、滤泡状甲状腺癌失分化细胞株FTC-133以及未分化甲状腺癌细胞株SW1636的细胞活性。这一结果表明，本发明所制备的活性多肽可诱导碘难治性甲状腺癌发生细胞死亡。

实施例3：活性多肽治疗碘难治性甲状腺癌的动物实验

选取周龄为4-5周BALB/c裸鼠，皮下接种约10⁷个FTC-133细胞，建立甲状腺癌移植瘤模型，待肿瘤体积达到100-200mm³时，随机分为2组，每天分别腹腔注射生理盐水和活性多肽(10mg/kg)。每3天监测一次荷瘤裸鼠体重和肿瘤体积大小，连续监测21d。统计结果如图2所示，与对照组相比，治疗组肿瘤体积的增长受到了明显的抑制，具有统计学意义。这些结果进一步表明，本发明的活性多肽有望治疗碘难治性甲状腺癌。

实施例4：活性多肽诱导低分化甲状腺癌患者用于放射性131碘治疗临床病例

病例介绍，患者，女，45岁，2016年体检时发现左甲状腺结节，2017年黑龙江中医院大学附属第一中医医院门诊，B超疑甲状腺癌，在本院行甲状腺双叶切除+颈淋巴结清扫术。术后病理：甲状腺右叶乳头状癌转移。

2017年6月和2018年1月分别给予150和120mCi¹³¹碘治疗，¹³¹I显像未见肺部浓聚。2018年3月注射活性多肽冻干粉，每周注射1次，连续12周，2018年6月再次120mCi¹³¹碘治疗，¹³¹I显像示双肺弥漫性放射性浓聚，¹³¹碘治疗后，2018年12月¹³¹I显像示双肺无明显放射性浓聚。上述治疗过程表明，经活性多肽诱导，转移灶明显增加对碘的摄取。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

序列表

<110> 黑龙江中医药大学

<120> 一种治疗甲状腺癌的药物及其制备方法和用途

<130> CP2020243

<141> 2020-12-29

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 螺旋藻(Spirulina)

<400> 1

Ala Ser His Arg Leu Ala Thr Gly Asp

1 5

Claims

1.一种甲状腺癌的药物，其特征在于，其具有来源于螺旋藻的活性多肽。

2.根据权利要求1所述的药物，所述的活性多肽具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列或者为SEQ ID NO.1的氨基酸序列；任选地，包含或者不包含其它活性成分。

3.根据权利要求2所述的药物，所述的药物中还包括独立包装的¹³¹碘放射性成分。

4.根据权利要求2所述的药物，所述药物中的活性多肽为注射制剂。

5.权利要求1-4任意一项所述的药物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(7)将所得到的活性多肽制备成药物。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，所述活性肽通过固相合成法得到。

7.权利要求1-4任意一项所述药物的用途，所述药物用于制备治疗甲状腺癌的药物。

8.根据权利要求7所述的用途，所述的甲状腺癌是指碘难治性甲状腺癌。