CN1224390C - 含吡咯并喹啉醌的治疗和预防脂肪肝的药物组合物 - Google Patents
含吡咯并喹啉醌的治疗和预防脂肪肝的药物组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及在哺乳动物特别是人和温血动物中，治疗和预防脂肪肝的药物组合物。它含有(1)安全有效量的吡咯并喹啉醌和/或其药学上可接受的盐和/或酯作为活性成分，以及(2)药学上可接受的载体。该组合物对脂肪肝有显著的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域，更具体地，涉及在哺乳动物特别是人和温血动物中，治疗和预防脂肪肝的药物组合物。该组合物包含吡咯并喹啉醌(或其盐、酯)作为活性成分。
背景技术
脂肪肝(fatty liver)系一种多病因引起肝细胞内脂质蓄积过多的病理状态。在不同的病因下，蓄积在肝内的脂类可以是甘油三酯、磷脂、糖脂或固醇酯。在脂肪肝，特别是脂肪性肝炎和肝纤维化的发生发展过程中，机体的免疫状态、营养因素、遗传背景、生活方式以及年龄和性别等均起相当重要的作用，应视为脂肪肝发病的条件因素。总结如下：
| 营养性因素化学性致病因素内分泌代谢因素生物性致病因素遗传因素精神、心理和社会因素 | 营养不良、肥胖症、全胃肠外营养、机体内驱脂物质缺乏。工业毒物、药物、酒精糖尿病、高血脂症、妊娠期出现的脂肪肝病毒和细菌等病原微生物主要通过遗传物质基因的突变或染色体的畸变直接致病。现代化的工作环境，多坐少动的生活方式，高脂肪、高热量的饮食结构以及生活懒散等因素与脂肪肝的发生有关 |
脂肪肝的流行状况如下：文献报道脂肪肝的患病率范围颇大，与诊断脂肪肝所采用的方法以及检查对象不同有很大关系.近年来，随着B型超声技术的进步和广泛应用，以B超作为无创伤手段开展对健康人群脂肪肝普查的报道愈来愈多。我国近年来对B超进行了一系列调查。例如上海对某一高校教师普查，脂肪肝的发病率8.8％；北京地区对4个单位1051位职工的B超普查结果为11％；浙江省杭州市对包括工厂、机关、研究所和医院7个单位3015位职工的普查结果为5.2％，其中男性为7.06％，女性为3.23％。由此可见，在我国脂肪肝的发病率还是较高的，特别是在大中型城市中尤为明显。
脂肪肝的临床表现如下：临床上根据起病缓急，可将脂肪肝分为慢性和急性两大类，后者较少。通常我们所说的脂肪肝主要指由肥胖、糖尿病和酒精等因素所致的慢性脂肪肝。病理上多表现为大泡性肝脂肪变性，在发达地区已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。起病隐匿，病程漫长，一般多呈良性经过，在较长时期内肝组织病理学常无明显变化，但部分病例亦可发展为纤维化及肝硬化。
与其他慢性肝病一样，慢性脂肪肝临床表现轻微，且无特征，常在健康体检或因其他疾病进行肝脏影像学检查时发现。若出现症状，则以肝肿大最常见，且肝肿大的程度与其病情轻重并不一致。部分慢性脂肪肝患者在病程中，有食欲减退、恶心、乏力、肝区疼痛、腹胀，以及右上腹压迫感。
目前，对于脂肪肝的药物治疗的现状如下：
单纯性脂肪肝是脂肪性肝病的早期阶段，通过早期处理促进肝内脂肪消退和防治并发症的发生，可明显改善脂肪肝患者的预后和生活质量。临床及实验表明，药物治疗对于促进肝内脂肪及其伴随炎症的消退，以及阻止其向肝纤维化肝硬化发展有积极意义。
然而，至今尚无防治脂肪性肝炎的有效药物。现有去脂保肝药物主要用于伴随肝功能损伤和(或)症状明显的非酒精性脂肪肝和酒精行肝病患者的辅助治疗，主要有以下一些：
| 常用去脂药物胆碱蛋氨酸维生素氨基酸制剂水飞蓟素 | 有前景的去脂药物肉毒碱乳清酸碱雄去氧胆酸 | 抗氧化剂牛磺酸还原型谷胱甘肽S-腺苷甲硫氨酸Matadoxine | 有争议的去脂药物前列腺素E马洛替酯 |
然而，这些防治脂肪肝的药物尚不能取得令人满意的效果，因此，本领域迫切需要开发新型安全有效的脂肪肝治疗和预防药物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种治疗和预防脂肪肝的药物组合物，它含有(1)安全有效量的吡咯并喹啉醌和/或其药学上可接受的盐和/或酯作为活性成分，以及(2)药学上可接受的载体。
在本发明的第一方面，提供吡咯并喹啉醌或其药学上可接受的盐和/或酯的用途，它被用于制备治疗和预防脂肪肝的药物。
较佳地，所述药物含有(1)安全有效量的吡咯并喹啉醌和/或其药学上可接受的盐和/或酯作为活性成分，以及(2)药学上可接受的载体。
在一优选例中，所述活性成分的含量为0.01％-99％。
在另一优选例中，所述活性成分的含量为0.1％-90％。
在另一优选例中，所述药物还含有选自下组的物质：维生素、人体必需的金属离子，或其混合物。
在另一优选例中，所述的吡咯并喹啉醌是人工合成的或重组(微生物发酵，包括基因重组)产生的。
在本发明的第二方面，提供了一种保健食品，它含有为0.001％-50％的吡咯并喹啉醌或其药学上可接受的盐。
更佳地，所述的保健食品含有0.01％-10％的吡咯并喹啉醌或其药学上可接受的盐。
本发明还提供了吡咯并喹啉醌或其药学上可接受的盐和/或酯在制备预防脂肪肝的保健食品中的用途。
本发明还提供了吡咯并喹啉醌或其药学上可接受的盐和/或酯在制备减少肝脏的脂肪空泡的药物或保健食品中的用途。
附图说明
图1显示了FPLC方法鉴定PQQ标准品和纯化的PQQ产品的结果。
图2A-2D是施用不同剂量的PQQ后小鼠肝脏切片的染色照片。
具体实施方式
在本发明中，使用如下定义：
本文中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的药物组合物。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本文中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。
本文中，术语“安全有效量”指按本发明的方式使用时足以获得需要的治疗反应而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的成分的量。显然，具体的“安全有效量”因各种因素而异，如受治疗的特殊病情、患者的身体条件、受治疗的哺乳动物的种类、疗程、同时进行的治疗的种类(如果有的话)、所应用的具体制剂和化合物或其衍生物的结构。
本文中，“活性成分”包括吡咯并喹啉醌及其药学上可接受的盐和酯。代表性的盐包括(但并不限于)：氯化钠、碘化钾、氯化钾。代表性的酯包括(但并不限于)：吡咯并喹啉醌与各种氨基酸、甲酰胺等形成的酯。
本文中，“药物载体”是用于将吡咯并喹啉醌传送给动物或人的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体，可根据给药方式而选择的。
本文中，“脂肪肝”指哺乳动物中多种病因引起肝细胞内脂质蓄积过多的病理状态
本发明的本发明人经过多年研究，意外地发现吡咯并喹啉醌(一种已知化合物)可以明显地减低动物体脂肪肝的脂肪含量，从而有效地预防和治疗脂肪肝。在此基础上完成了本发明。
吡咯并喹啉醌的分子量为330，其结构式如下：
吡咯并喹啉醌最早是从微生物中发现的，它的晶体结构和化学合成都已经解决。目前已发现，高等真核生物体内也有吡咯并喹啉醌存在。吡咯并喹啉醌是细菌中多种重要酶类的辅基，并能影响呼吸链功能与体内自由基水平。在研究中发现吡咯并喹啉醌缺乏的小鼠生长缓慢，生殖能力差，并容易产生关节炎症，因此有人认为吡咯并喹啉醌是体内必需的营养物质之一。
在本发明之前，吡咯并喹啉醌被认为具有如下4种主要生理功能：(1)抗氧化；(2)对毒素引起的肝损伤起防护作用；(3)加快对乙醇的降解；(4)促神经生长作用。
研究表明，吡咯并喹呤醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)具有良好的降低肝脏中脂肪含量的功能。在用纯化吡咯并喹啉醌治疗脂肪肝小鼠模型实验中，也观察到显著的疗效。
用于本发明的吡咯并喹啉醌可以是天然的，非天然的。较佳地，所述的吡咯并喹啉醌是人工合成的或发酵(微生物发酵，包括基因重组)产生的。
国际上，吡咯并喹啉醌主要以化学方法合成，一般以酪氨酸分子作为碳和氮的骨架，通过一个dopaquinone的中间体，经一系列反应得到吡咯并喹啉醌[Hendrickson and deVries，1982，J.Org.Chem.47：1148-1150；Gainor andWeinreb，1982，J.Org.Chem.47：2833-2837；Buchi et al.，1985，J.Am.Chem.Soc.107：5555-5556；Gainor and Weinreb，1982，J.Org.Chem.46：4317-4319]。然而，这些化学合成的方法存在步骤多、成本高、反应副产物不易分离等技术问题。
另一种获得吡咯并喹啉醌的常用方法是利用嗜甲醇细菌本身能合成吡咯并喹啉醌，通过发酵和分离的方法获得吡咯并喹啉醌。
A.剂量
在本发明中，对吡咯并喹啉醌的剂量没有特别限制，可用任何合适的剂量。载体的类型以及数量也可以很不相同，这取决于温血动物或人的种类、体重、和待治疗的脂肪肝症状等。一般，合适的含量是吡咯并喹啉醌占药物组合物总重量的0.01％-99％，较佳地0.1-90％。在治疗脂肪肝时，PQQ的有效剂量范围通常为0.01-50毫克/千克·天或更高，较佳地为0.1-5毫克/千克·天。
剂量单元包括一种PQQ化合物，或者该PQQ化合物与其他治疗脂肪肝的化合物所形成的混合物。剂量单元还可含有稀释剂、填充剂、载体等。剂量单位是固体或凝胶形式，如丸剂、片剂、胶囊等，或者是液体形式，它们适合口服给药、直肠给药、局部给药或肠胃外给药、或者静脉内给药。
B.剂型
本发明的经口给药的固体组合物可采用片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂等形式。这些固体组合物中混合了1种或1种以上的活性物质和至少1种惰性稀释剂，例如，乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、羟丙基纤维素、微晶纤维素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、果胶、硅铝酸镁、铝酸镁。还可按照常用方法使组合物中含有除了惰性稀释剂之外的添加剂，例如，硬脂酸镁等润滑剂、纤维素乙醇酸钙等崩解剂、乳糖等稳定剂、谷氨酸或天冬氨酸等助溶剂。如是片剂或丸剂，还可根据需要，在其外部包裹上蔗糖、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯等糖衣或胃溶性、肠溶性薄膜。
经口给药的液体组合物包括药剂上允许的乳浊剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂、酏剂等，通常使用的惰性稀释剂包括精制水、乙醇。该组合物中除了惰性稀释剂之外，还可包含湿润剂、悬浮剂等助剂，甜味剂、矫味剂、芳香剂和防腐剂。
非经口给药的注射剂包括无菌水性或非水性溶液剂、悬浮剂和乳浊剂。水性溶液剂和悬浮剂中包含注射剂用蒸馏水及生理盐水。非水溶性溶液剂和悬浮剂中包含丙二醇，聚乙二醇，可可脂、橄榄油、蓖麻油等植物油，乙醇等醇类，阿拉伯胶、吐温80(商品名)等。这些组合物中还可包含等渗剂、防腐剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定剂(例如，乳糖)、助溶剂(例如，谷氨酸、天冬氨酸)。用滤菌膜过滤上述组合物，再配合使用灭菌剂就可达到无菌的目的。然后，利用上述组合物制得无菌的固体组合物，在使用前用水或无菌注射用溶剂溶解就可加以利用。
可用于配制本发明口服剂型的、具体的药学上可接受的载体和赋形剂例子，在美国专利No.3,903,297(1975年9月2日授予Robert)中有描述。用于制造本发明的有用剂型的技术和组合物，在下列文献中有描述：7种现代制剂(7ModernPharmaceutics)。第9和10章(Banker & Rhodes编辑，1979)；Lieberman等人，药物剂型：片剂(Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets)(1981)；和Ansel，药物剂型导论(Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms)2版(1976)。
C.治疗方法
治疗方法可以是，治疗具体的脂肪肝病症的任何合适有效方法。治疗可以是口服给药、直肠给药、局部给药、肠胃外给药、静脉内给药。施用有效量药物的方法还取决于待治疗的脂肪肝程度。据信，通过与合适的载体、其他治疗脂肪肝的化合物或方便给药的稀释剂一起配制，并通过静脉内、皮下或肌内给药的肠胃外治疗方法，是将化合物施用于温血动物的优选方法。
本发明的吡咯并喹啉醌还可与其他治疗脂肪肝的药物以及辅助治疗性物质联用，以进一步提供治疗效果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
吡咯并喹啉醌检测方法的建立
在本发明中，使用NBT显色法与FPLC两种方法检测吡咯并喹啉醌含量。
NBT方法利用吡咯并喹啉醌在碱性溶液中使NBT(氯化硝基四氮唑蓝)化学显色的性质，可定量地检测混合物中吡咯并喹啉醌的含量(可检测到10ng以上的吡咯并喹啉醌)。
具体操作如下：待测吡咯并喹啉醌样品或标准品加入含25ul牛血清白蛋白(40mg/ml)400ul水，每份样品加入1.6ml测活缓冲液(NBT+1.6M甘氨酸缓冲液)，混匀。避光37摄氏度保温45分钟，测定530纳米处的光吸收值。据此做标准曲线，计算待测样品中吡咯并喹啉醌的含量。
FPLC法利用吡咯并喹啉醌在FPLC-Q柱中特异性的洗脱位置与峰面积测定吡咯并喹啉醌的存在与含量。将待测样品或标准品10-100ul上样于FPLC上RESOURE-Q的高效离子交换层析柱上，经A液洗去未结合的成分后，以20倍柱体积的量，进行由A液到B液的梯度洗脱(A液：20mM Tris-HCl，pH8.0，B液：含1M NaCl的A液)，吡咯并喹啉醌这种物质是在B液含量达到21-25％时被洗脱出来。根据标准和待测样品此位置吸收峰的面积，计算出待测样品中吡咯并喹啉醌的含量。
实施例2
吡咯并喹啉醌的制备
A、吡咯并喹啉醌的发酵
获得吡咯并喹啉醌的常用方法是利用嗜甲醇细菌本身能合成吡咯并喹啉醌，通过发酵和分离的方法获得吡咯并喹啉醌。可以直接使用Methylophagathalassica(ATCC#33145)等菌株，也可使用PQQ产量进一步提供的改良菌株。具体方法如下。
Methylophaga thalassica(ATCC#33145)，通过改变甲醇浓度(0.1-7％)，筛选出一菌株，PQQ的表达量由0.5mg/L达到2.0mg/L，将此菌株命名为GCpqq303。
摸索了多种表达条件下，GCpqq303菌株小量表达吡咯并喹啉醌产量的变化，主要包括：a)培养时间；b)培养基中铁离子含量；c)培养基中镁离子含量等对小量表达产量的影响。具体参数对PQQ产量的影响参见表1。最终确定表达条件为：培养基(0.3％(NH4)2SO4，0.14％KH2PO4，0.3％Na2HPO4，0.01％MgSO4，0.05％FeCl3，0.8％甲醇)，30摄氏度培养14天。进行三次以上小量表达，获得的表达量约3～4mg/L。
表1培养条件各参数对微生物发酵PQQ产量的影响
| 培养时间(天) | PQQ产量(mg/L) | FeCl3含量(％) | PQQ产量(mg/L) | MgSO4含量(％) | PQQ产量(mg/L) |
| 1-7 | ≈0 | 0 | 0.04 | 0 | 0.07 |
| 8 | 0.3 | 0.005 | 0.1 | 0.005 | 1.22 |
| 9 | 0.7 | 0.01 | 1.4 | 0.01 | 3.81 |
| 10 | 1.2 | 0.03 | 2.14 | 0.02 | 2.09 |
| 11 | 1.56 | 0.05 | 3.18 | 0.05 | 1.65 |
| 12 | 1.87 | 0.1 | 1.87 | 0.1 | 0.87 |
| 13 | 2.11 | ||||
| 14 | 2.12 | ||||
| 15 | 2.04 |
实验是在基本培养基的基础上添加或减少某些成分进行的，基本培养基的组成为：0.3％(NH4)2SO4，0.14％KH2PO4，0.3％Na2HPO4，0.02％MgSO4，0.03％FeCl3，0.8％甲醇。培养14天测定铁和镁离子对PQQ产量的影响。
B.吡咯并喹啉醌的纯化
发酵液上清经煮沸，离心过滤后吸附于FPLC-Q柱上，并经盐梯度洗脱，收集活性峰。获得的吡咯并喹啉醌经FPLC法检测(见图1)，纯度在90％以上，得率为56％。
实施例3
吡咯并喹啉醌对酒精性脂肪肝的治疗和预防作用
昆明小鼠分为10组，每组12只，雌雄各半，平均体重为25克。分组情况见下表，其中具体实验方法描述如下：酒精灌胃为酒精浓度为56％的白酒0.25ml/天·只，进行15天，建成小鼠急性酒精性脂肪肝模型。PQQ分为治疗组和预防组，其中治疗组是在脂肪肝模型建成后以灌胃或腹腔注射给药进行治疗，进行30天；预防组是在酒精灌胃建立脂肪肝的同时灌胃给药PQQ，进行30天，测定PQQ对脂肪肝的预防作用。
动物试验结束后，取小鼠血和肝脏，测定血液中的ALT(丙氨酸转移酶)、GLU(葡萄糖)、GOT(天门冬氨酸转氨酶)、BUN(尿素)和CRF(肌酸酐)。小鼠肝脏经石蜡切片，以苏木精曙(伊)红(HE)染色，观察小鼠肝脏中脂肪空泡的形成，确定脂肪肝的严重程度。
| 组号 | 组名 | 说明 |
| 1 | 脂肪肝模型 | 酒精灌胃 |
| 2 | PQQ治疗组 | 脂肪肝模型，PQQ腹腔注射(5mg/kg·天) |
| 3 | PQQ治疗组 | 脂肪肝模型，PQQ腹腔注射(0.5mg/kg·天) |
| 4 | PQQ治疗组 | 脂肪肝模型，PQQ腹腔注射(0.1mg/kg·天) |
| 5 | PQQ治疗组 | 脂肪肝模型，PQQ灌胃给药(5mg/kg·天) |
| 6 | PQQ治疗组 | 脂肪肝模型，PQQ灌胃给药(0.5mg/kg·天) |
| 7 | PQQ治疗组 | 脂肪肝模型，PQQ灌胃给药(0.1mg/kg·天) |
| 8 | PQQ预防组 | PQQ灌胃给药(5mg/kg·天)同时酒精灌胃 |
| 9 | PQQ预防组 | PQQ灌胃给药(0.5mg/kg·天)同时酒精灌胃 |
| 10 | PQQ预防组 | PQQ灌胃给药(0.1mg/kg·天)同时酒精灌胃 |
结果发现，ALT、GLU、GOT、BUN和CRF在各组中没有明显变化(数据未给出)，说明各实验组小鼠的肝功能和肾功能保持正常。
各组小鼠肝脏切片染色后发现，急性酒精灌胃脂肪肝模型的肝细胞核周围有明显的脂肪空泡存在(图2A)，低剂量治疗组7效果不明显(图2B)。正常小鼠细胞核周围没有空泡(图2D)，在治疗组6中可以明显看到细胞核周围的空泡明显减少(图2C)，在其他各组中(组2、3、4、5、8、9、10)都发现有脂肪肝的明显缓解。说明PQQ对酒精性脂肪肝不仅有治疗作用而且有预防作用。
实施例4
吡咯并喹啉醌胶囊制法与剂量
处方：
吡咯并喹啉醌 1g
聚乙二醇400 200g
共制成1000个胶囊，每个胶囊内含主药1mg(即0.5％)。
先将吡咯并喹啉醌与1/8量的PEG400混合。用胶体磨粉碎，然后加入余量的PEG400混溶。另配明胶溶液备用。在室温相对湿度40％的条件下，胶囊是将药液与明胶在自动旋转轧囊机充分作用，然后在28摄氏度，相对湿度40％的条件下，干燥20小时后完成整个制备。
类似地，可制得胶囊中吡咯并喹啉醌含量可低至0.05％或更低，也高至5％或更高。在治疗脂肪肝时，PQQ的有效剂量范围通常为0.01-50毫克/千克·天，较佳地为0.1-5毫克/千克·天。
实施例5
保健食品(口服液)的制备
将PQQ、维生素和微量元素、必需氨基酸和水等原料配成口服液，其中PQQ含量为0.01％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.吡咯并喹啉醌或其药学上可接受的盐在制备治疗和预防脂肪肝的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物含有(1)安全有效量的吡咯并喹啉醌和/或其药学上可接受的盐和/或酯作为活性成分，以及(2)药学上可接受的载体。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述活性成分的含量为0.01％-99％。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述活性成分的含量为0.1％-90％。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物还含有选自下组的物质：维生素、人体必需的金属离子，或其混合物。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的吡咯并喹啉醌是人工合成的或重组产生的。
7.吡咯并喹啉醌或其药学上可接受的盐和/或酯在制备预防脂肪肝的保健食品中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的保健食品含有0.001％-50％的吡咯并喹啉醌或其药学上可接受的盐和/或酯。
9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的保健食品含有0.01％-10％的吡咯并喹啉醌或其药学上可接受的盐和/或酯。
10.吡咯并喹啉醌或其药学上可接受的盐和/或酯在制备减少肝脏的脂肪空泡的药物或保健食品中的用途。
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