CN103239451A

CN103239451A - 吡咯并喹啉醌在治疗和/或预防肝纤维化中的应用

Info

Publication number: CN103239451A
Application number: CN2012100303471A
Authority: CN
Inventors: 张颂文; 阮元元; 贾冬威; 顾建新; 恽小婧; 孙琳琳; 周蕾
Original assignee: SHANGHAI MEDICINE BIOTIC SCIENCE RESEARCH CENTRE Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI MEDICINE BIOTIC SCIENCE RESEARCH CENTRE Co Ltd; ShanghaiMed Co Ltd
Priority date: 2012-02-10
Filing date: 2012-02-10
Publication date: 2013-08-14

Abstract

本发明涉及吡咯并喹啉醌在治疗和/或预防肝纤维化中的应用。本发明提供了吡咯并喹啉醌活性物质在制备治疗和/或预防对象肝纤维化或其相关症状或相关疾病的组合物中的应用，还提供了含有吡咯并喹啉醌的保健品组合物或药物组合物。本发明的吡咯并喹啉醌能够提高肝脏组织的抗氧化能力，抑制α-平滑肌肌动蛋白和I型胶原的表达，缓解肝脏的炎症反应，并且能够拮抗转化生长因子-β对肝脏星状细胞的诱导分化和促进激活作用。因此，吡咯并喹啉醌在预防和/或治疗肝纤维化的形成和发展中具有良好的应用前景。

Description

吡咯并喹啉醌在治疗和/或预防肝纤维化中的应用

技术领域

本发明涉及疾病预防和/或治疗领域。更具体的说，本发明涉及吡咯并喹啉醌在治疗和/或预防肝纤维化中的应用。

背景技术

肝硬化是我国的常见病，也是危害人类健康和生命的主要疾病之一。其起病隐匿，并发症严重，愈后较差，临床上缺乏有效的治疗手段。

肝纤维化是肝硬化的前期病变，其病因有很多，在临床上多见有病毒性肝炎、酒精肝肝炎、脂肪肝和自身免疫性疾病等。

慢性肝病绝大多数都有肝纤维化，其中25％～40％最终发展为肝硬化乃至肝癌。肝纤维化是慢性肝病晚期的组织学变化，是一种在炎症因子持续作用下渐进的病理过程。肝纤维化是由于肝脏细胞外基质特别是胶原的异常过度沉积，形成纤维隔，肝脏原有结构被破坏，引发肝纤维化。肝纤维化是一个涉及多种细胞和细胞因子的动态变化过程。细胞因子与肝内细胞及细胞外基质构成一个庞大的网络系统，调控着肝纤维化的发生发展。在肝纤维化中起决定性作用的是肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)，肝星状细胞的激活及其介导的细胞外基质的大量堆积是肝纤维化发病的中心事件。

肝纤维化常可引起诸如如下的症状：(1)疲乏、无力，此肝纤维化临床表现为早期常见症状之一；(2)食欲减退，这往往是最早症状，有时伴恶心、呕吐；(3)慢性消化不良症状、腹胀气、便秘或腹泻、肝区隐痛等，临床上部分患者无明显的慢性肝病史，肝纤维化临床表现原因不明出现上述消化不良症状；(4)慢性胃炎，许多慢性肝炎患者出现反酸、嗳气、呃逆、上腹部隐痛及上腹饱胀等胃区症状；(5)肝纤维化引起的出血、慢性肝炎，由于肝功能减退影响凝血酶原及其他凝血因子的合成，肝纤维化临床表现常出现蜘蛛痣、鼻衄、牙龈出血、皮肤和粘膜有紫斑或出血点。

此外，肝纤维化易并发感染性(例如慢性乙型丙型和丁型病毒性肝炎血吸虫病等)、先天性代谢缺陷(例如肝豆状核变性血色病α1-抗胰蛋白酶缺乏症等)及化学毒物性(例如慢性酒精性肝病慢性的药物性肝病)及自身免疫性肝炎原发性、胆汁性肝硬化和原发性、硬化性胆管炎等。所以预防和治疗肝纤维化对其并发疾病的控制具有重要的意义。

正是由于肝纤维化发病机理的复杂性、病程的漫长以及并发症状和疾病的严重性，目前对于肝纤维化的治疗，除了针对病因和常规的保肝、抗炎治疗外，还包括促星状细胞凋亡，抑制星状细胞的激活及增殖，促进细胞外基质的降解等方法。然而，目前已有的药物在临床上对于肝纤维化的治疗效果并不理想。因此，本领域迫切需要开发出针对肝纤维化的安全有效的药物和保健品。

吡咯并喹啉醌(Pyrroloquinoline Quinone，PQQ)是最早从微生物中发现的小分子化合物，在高等真核生物体内也有存在。PQQ呈红褐色粉末状，是一种水溶性化合物，其存在于我们的日常饮食中，并广泛分布于人体各组织器官，并在母乳中存在。PQQ的分子式如下：

PQQ是细菌中多种重要酶类的辅基，能影响呼吸链功能和体内自由基的水平。研究表明，PQQ缺乏的小鼠生长缓慢，生殖能力差，并且容易产生关节炎症，可能是体内必需的维生素之一。

研究证实，PQQ是一种对人体健康非常有利的物质。纯化的PQQ减少鸡胚发育过程中糖皮质激素诱导的白内障形成，可能是通过恢复谷胱甘肽水平从而降低对皮质激素的反应性来发挥作用。PQQ直接氧化受体的NMDA氧化还原位点，保护细胞免受NMDA毒性影响，从而防止脑部缺血缺氧，避免动物模型发生严重的休克。同时，PQQ还可以保护心脏防止心肌缺血及心肌梗死。

然而，在本发明之前，本领域从未对PQQ活性物质对肝纤维化及其相关症状和/或疾病的预防和/和治疗作用做出研究。

发明内容

本发明的目的之一正是提供吡咯并喹啉醌活性物质在制备治疗和/或预防对象肝纤维化或其症状的组合物中的应用。本发明的另一目的是提供一种可安全、有效地预防和/和治疗肝纤维化的组合物。

在本发明的第一方面中，提供了吡咯并喹啉醌活性物质在制备治疗和/或预防对象肝纤维化或其相关症状或相关疾病的组合物中的应用。

在本发明的一个实施方式中，所述肝纤维化相关疾病包括肝纤维化进行到晚期所导致的肝硬化，所述肝纤维化的相关症状(如并发症)或相关疾病选自下组：肝纤维化所导致的肝肾综合症、肝纤维化所导致的肝功能代谢障碍、肝纤维化导致的原发性腹膜炎、肝纤维化导致的自身免疫性肝炎、肝纤维化导致的原发性硬化性胆管炎、肝纤维化导致的腹水、肝纤维化导致的上消化道静脉曲张出血以及肝纤维化导致的肝性脑病。

在本发明的另一个实施方式中，所述肝纤维化相关症状是：肝星状细胞的激活、肝星状细胞的激活介导的细胞外基质堆积、血清转氨酶水平增高、肝脏组织炎症反应。

在本发明的另一个实施方式中，所述组合物为保健品组合物或药物组合物。

在本发明的另一个实施方式中，所述对象是哺乳动物。在一个优选例中，所述哺乳动物是人。

在本发明的另一个实施方式中，所述吡咯并喹啉醌活性物质占所述组合物总重量的0.001-99.9wt％。

在一个优选例中，所述吡咯并喹啉醌活性物质占组合物总重量的1-95wt％，优选5-90wt％，更优选10-80wt％。

在本发明的另一个实施方式中，所述组合物的剂型包括：片剂、粉末剂、注射剂、颗粒剂、糖浆、胶囊、溶液剂、栓剂或药膏。

在一个优选例中，所述组合物为单位剂型或多剂型，其中吡咯并喹啉醌活性物质的含量为0.01-1000mg/剂，优选0.1-500mg/剂，更优选0.1-100mg/剂。

在另一个优选例中，吡咯并喹啉醌活性物质在组合物中的含量为0.01-1000mg，优选0.1-500mg，更优选0.1-100mg。

在另一优选例中，以0.001-10mg/kg体重，较佳地0.01-5mg/kg体重，优选0.01-1mg/kg体重给予所述组合物。

在本发明的另一个实施方式中，所述组合物还包含治疗和/或预防肝纤维化或其症状的其它活性物质。

在一个优选例中，所述治疗和/或预防肝纤维化或其症状的其它活性物质选自：抗病毒药物(如干扰素-α、拉米夫定、阿德福韦和利巴韦林)、抗炎药物(如糖皮质激素，重组人白介素10)、抗氧化药物(如水飞蓟素和维生素E)、抑制肝星状细胞分化激活药物(如依马替尼及其类似物、索拉菲尼等)、血管紧张素转换酶抑制剂等。

在本发明的第二方面中，提供了一种组合物，其含有：

(1)有效量的吡咯并喹啉醌活性物质；

(2)治疗和/或预防肝纤维化或其相关症状或相关疾病的其它活性物质；以及

(3)药学上可接受的载体。

在一个优选例中，所述吡咯并喹啉醌活性物质占组合物总重量的0.001-99.9wt％，优选1-95wt％，较优选为5-90wt％，更优选10-80wt％。

在另一个优选例中，所述治疗和/或预防肝纤维化或其症状的其它活性物质为选自下组的一种或多种物质：抗病毒药物(如干扰素-α、拉米夫定、阿德福韦和利巴韦林)、抗炎药物(如糖皮质激素，重组人白介素10)、抗氧化药物(如水飞蓟素和维生素E)、抑制肝星状细胞分化激活药物(如依马替尼及其类似物、索拉菲尼等)、血管紧张素转换酶抑制剂等。

在本发明的另一个实施方式中，所述组合物是保健品组合物或药物组合物。

在本发明的另一个实施方式中，组分(1)和组分(2)的重量比为 0.01∶100～100∶0.01.

在一个优选例中，组分(1)和组分(2)的重量比为1∶50～50∶1，更优选1∶10～10∶1。

在本发明的第三方面中，提供了一种预防和/或治疗对象肝纤维化或其相关症状或相关疾病的方法，所述方法包括给予所述对象吡咯并喹啉醌活性物质或包含所述活性物质的组合物。

在本发明的一个实施方式中，所述肝纤维化包括肝纤维化进行到晚期所导致的肝硬化，所述肝纤维化的相关症状或相关疾病选自下组：肝纤维化所导致的肝肾综合症、肝纤维化所导致的肝功能代谢障碍、肝纤维化导致的原发性腹膜炎、肝纤维化导致的自身免疫性肝炎、肝纤维化导致的原发性硬化性胆管炎、肝纤维化导致的腹水、肝纤维化导致的上消化道静脉曲张出血以及肝纤维化导致的肝性脑病。

在本发明的另一个实施方式中，所述组合物为保健品组合物或药物组合物。在本发明的另一个实施方式中，所述对象是哺乳动物。在一个优选例中，所述哺乳动物是人。

在本发明的另一个实施方式中，所述吡咯并喹啉醌活性物质占所述组合物总重量的0.001-99.9wt％。优选1-95wt％，更优选5-90wt％，再优选10-80wt％。

在本发明的另一个实施方式中，所述方法还包括给予治疗和/或预防肝纤维化或其相关症状或相关疾病的其它活性物质。

在一个优选例中，所述治疗和/或预防肝纤维化或其相关症状或相关疾病的其它活性物质选自：抗病毒药物(如干扰素-α、拉米夫定、阿德福韦和利巴韦林)、抗炎药物(如糖皮质激素，重组人白介素10)、抗氧化药物(如水飞蓟素和维生素E)、抑制肝星状细胞分化激活药物(如依马替尼及其类似物、索拉菲尼等)、血管紧张素转换酶抑制剂等。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A-1C：PQQ预处理抑制硫代乙酰胺(TAA)介导的小鼠肝脏组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和胶原的表达上调：

图1A：组织学检测PQQ对TAA介导的小鼠肝脏组织中α-SMA和胶原表达上调的影响；

图1B：Western-blot检测PQQ对TAA介导的小鼠肝脏组织中α-SMA和胶原表达上调的影响；

图1C：实时RT-PCR检测PQQ对TAA介导的小鼠肝脏组织中α-SMA、胶原和TGF-β表达上调的影响。

小鼠随机分为4组，正常组标注为“N”(10只)；模型组标注为“M”(10只)、PQQ低剂量组标注为“L”(10只)、PQQ高剂量组标注为“H”(10只)。

图2：PQQ预处理降低TAA处理的小鼠血清中的转氨酶水平：使用转氨酶检测试剂盒检测PQQ对TAA处理的小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的影响。其中，纵坐标中的“U/L”表示单位每升。

图3A-3C：PQQ预处理提高TAA处理的小鼠肝脏中的抗氧化能力：使用酶活性检测试剂盒检测PQQ对TAA处理的小鼠肝脏组织中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)活性的影响。其中，纵坐标中的“mgprot”表示每毫克蛋白。

图4：PQQ预处理抑制TGF-β介导的原代小鼠星状细胞中α-SMA和胶原的表达上调：Western-blot检测不同剂量PQQ对TGF-β介导的原代小鼠星状细胞中α-SMA和胶原表达上调的影响。

图5A-5B：PQQ预处理抑制TGF-β介导的原代小鼠星状细胞中p38信号通路的激活：

图5A：Western-blot检测不同剂量PQQ对TGF-β介导的原代小鼠星状细胞中p38信号通路活化的影响；

图5B：Western-blot检测PQQ对TGF-β介导的原代小鼠星状细胞中ERK和JNK信号通路活化的影响。

图6：PQQ预处理抑制TAA介导的小鼠肝脏组织炎症反应：实时RT-PCR检测PQQ对TAA介导的小鼠肝脏组织中TGF-β、IL-6、IL-1和TNF-α等炎症因子表达上调的影响。

图7：PQQ治疗能够抑制硫代乙酰胺(TAA)介导的小鼠肝脏组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和胶原的表达上调：实时RT-PCR检测PQQ治疗后对TAA介导的小鼠肝脏组织中α-SMA和胶原表达上调的影响。

图8：PQQ治疗能够降低TAA处理的小鼠血清中的转氨酶水平：使用转氨酶检测试剂盒检测PQQ治疗后对TAA处理的小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的影响。其中，纵坐标中的“U/L”表示单位每升。

图9：PQQ治疗能够抑制TAA介导的小鼠肝脏组织炎症反应：实时RT-PCR检测PQQ治疗后对TAA介导的小鼠肝脏组织中TGF-β1、IL-6、IL-1和TNF-α等炎症因子表达上调的影响。

具体实施方式

本发明基于如下研究结果：吡咯并喹啉醌能够提高肝脏组织的抗氧化能力，抑制α-平滑肌肌动蛋白和I型胶原的表达，缓解肝脏的炎症反应，并且能够拮抗转化生长因子-β对肝脏星状细胞的诱导分化和促进激活作用，其作用甚至显著优于常用保肝药物(例如水飞蓟素)。因此，PQQ在预防和/或治疗肝纤维化的形成和发展中有很好的应用价值，由此可用于肝纤维化及其相关症状或疾病的预防和/或治疗。

相关定义

本文中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本文中，术语“有效量”指按本发明的方式使用时足以获得需要的效果而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的成分的量。显然，具体的“有效量”因各种因素而异，如所需给予的对象的年龄、病况等。

吡咯并喹啉醌(PQQ)的结构与已知功能

本文中，术语“吡咯并喹啉醌”或“PQQ”指吡咯并喹啉醌或其盐或酯，代表性的盐包括(但并不限于)：钠盐、钾盐、锌盐等；代表性的酯包括(但并不限于)：PQQ与盐酸、硫酸、柠檬酸、乙酸、苹果酸或磷酸等所成的酯。本文中，术语“PQQ活性物质”或“吡咯并喹啉醌活性物质”可互换使用，都包括吡咯并喹啉醌、PQQ的保健品学、生理学或药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物、异构体或其它衍生物形式、或它们的混合物。术语“PQQ衍生物”是指含有吡咯并喹啉醌作为主要结构或通过吡咯并喹啉醌的代谢获得的产物，只要其还具有吡咯并喹啉醌在本发明中的功效。

如背景技术部分中所述：PQQ存在于日常饮食中，并广泛分布于人体各组织器官，并在母乳中存在。并且，其还被确认为是氧化还原反应的一种辅酶，具有维生素活性，可能是一种新型的B族维生素。

因此，PQQ对人体而言是一种天然化合物，无毒副作用，保证了其用药安全性。并且，通过补充PQQ来预防和/或治疗肝纤维化，还可同时产生保护神经系统等积极作用。

不限于机理，PQQ可能通过多种主要机理来预防和/或治疗肝纤维化：①提高肝脏组织抗氧化能力；②抑制α-平滑肌肌动蛋白和I型胶原的表达；③抑制炎症因子TGF-β、IL-6、IL-1和TNF-α的表达，缓解肝脏炎症反应；④拮抗转化生长因子-β对肝脏星状细胞的诱导分化和促进激活作用。

肝纤维化及其相关症状或相关疾病

如本文所用，术语“肝纤维化”是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程。该术语中包括肝纤维化的轻度形式和重度形式，后者中存在肝小叶结构改建、假小叶及结节，也称为肝硬化。

如本文所用，术语“肝纤维化的相关症状或相关疾病”是指因肝纤维化引起的各种症状或疾病，这些症状或疾病的发生和发展与肝纤维化密切相关，并可通过肝纤维化的预防和/或治疗得到缓解和/或消除。

在本发明中，肝纤维化的相关症状或相关疾病包括但不限于肝纤维化所导致或相关的：疲乏、无力；食欲减退，恶心、呕吐；慢性消化不良症状，如腹胀气、便秘或腹泻、肝区隐痛；慢性胃炎，如反酸、嗳气、呃逆、上腹部隐痛及上腹饱胀等胃区症状；出血、慢性肝炎，例如蜘蛛痣、鼻衄、牙龈出血、皮肤和粘膜有紫斑或出血点等；肝纤维化的并发感染性，例如慢性乙型丙型和丁型病毒性肝炎血吸虫病等；先天性代谢缺陷，例如肝豆状核变性血色病α1-抗胰蛋白酶缺乏症等；化学毒物性(例如慢性酒精性肝病慢性的药物性肝病)及自身免疫性肝炎原发性、胆汁性肝硬化和原发性、硬化性胆管炎等。

更具体而言，所述肝纤维化包括肝纤维化进行到晚期所导致的肝硬化，所述肝纤维化的相关症状或相关疾病包括但不限于：肝纤维化所导致的肝肾综合症、肝纤维化所导致的肝功能代谢障碍、肝纤维化导致的原发性腹膜炎、肝纤维化导致的自身免疫性肝炎、肝纤维化导致的原发性硬化性胆管炎、肝纤维化导致的腹水、肝纤维化导致的上消化道静脉曲张出血以及肝纤维化导致的肝性脑病。在一个实施方式中，本发明的组合物还可用于预防或治疗肝纤维化相关的：肝星状细胞的激活、肝星状细胞的激活介导的细胞外基质堆积、血清转氨酶水平增高、肝脏组织炎症反应。

应理解，本发明的PQQ活性物质或其组合物不仅可治疗和/或预防肝纤维化，还可通过治疗和/或预防肝纤维化达到缓解和/或控制、甚至治愈肝纤维化相关症状或相关疾病的目的。

组合物

本发明提供了一种组合物，其包含：(a)吡咯并喹啉醌、其药学上或生理学上可接受的盐和/或酯；以及(b)药学上或生理学上可接受的载体。

本发明中的组合物可为保健品或药品，其可用于有效预防和/或治疗肝纤维化。通常，当所述组合物为保健品时，其中所含的PQQ剂量要低于药物组合物。

如本文所用，术语“药学上或生理学上可接受的载体”指用于保健品或药物制剂的载体，包括各种赋形剂和稀释剂，它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有或没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。例如，药学上可接受的载体详细记载于《雷明顿药物科学》(Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)。

在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

本发明的组合物中活性物质(a)占组合物总重量的0.001-99.9wt％；优选为组合物总重量的1-95wt％，较优选为5-90wt％，更优选10-80wt％。余量为载体以及其它添加剂等物质。

本发明的组合物中包含有效量的PQQ、其药学上或生理学上可接受的盐和/或酯。在一个优选例中，所述组合物为单位剂型或多剂型，其中吡咯并喹啉醌活性物质的含量为0.01-1000mg/剂，优选0.1-500mg/剂，更优选0.1-100mg/剂。吡咯并喹啉醌活性物质在组合物中的含量为0.01-1000mg，优选0.1-500mg，更优选0.1-100mg。

在本发明的另一优选实施方式中，所述组合物为单位剂型或多剂型。如本文所用，术语“单位剂型”是指为了服用或使用方便，将本发明的组合物制备成单次服用或使用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。

在本发明的另一个优选例中，每天施用1-6剂本发明的组合物，优选施用1-3剂；在高剂量时优选每天服用1剂。在本发明的一个优选例中，每天给对象施用0.001～10mg/kg体重的本发明组合物，优选0.01～5mg/kg体重，更优选0.01～1mg/kg体重。

应理解，所用活性物质的有效剂量可随需预防或治疗的对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师或营养师可以判断的范围内。

本发明的组合物，可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液、溶液剂或糖浆剂)或其它合适的形式。

药盒或保健盒

本发明还提供了一种药盒或保健盒，其中含有：(A)装有有效量吡咯并喹啉醌、其药学上或生理学上可接受的盐和/或酯的容器；和任选的，(B)装有有效量其它预防或治疗肝纤维化的物质的容器，所述其它预防或治疗肝纤维化的物质包括但不限于：抗病毒药物(如干扰素-α、拉米夫定、阿德福韦和利巴韦林)、抗炎药物(如糖皮质激素，重组人白介素10)、抗氧化药物(如水飞蓟素和维生素E)、抑制肝星状细胞分化激活药物(如依马替尼及其类似物、索拉菲尼等)、血管紧张素转换酶抑制剂等，优选维生素E。所述药盒或保健盒用于改善肝脏氧化还原平衡、减少肝脏炎症因子的产生，从而预防或治疗肝脏炎性疾病，优选用于预防或治疗肝纤维化。

如本文所用，术语“保健盒”是指装有可对对象提供具有保健作用的活性物质PQQ的容器的组合，其可作为保健品提供给需要的对象。

施用方式

本发明的组合物、药盒或保健盒可以通过常规途径施用，其中包括(但并不限于)：口服、喷涂、鼻腔内、或透皮等途径。优选口服或注射施用。组合物形式应与施用方式相匹配。本发明组合物的施用量，按活性物质PQQ重量计，通常为每天约0.001～10mgPQQ/kg体重，较佳地约0.01～5mgPQQ/kg体重，优选0.01～1mgPQQ/kg体重。

本发明的组合物、药盒或保健盒可直接使用，也可与其它预防或治疗肝纤维化的物质(如0.0005-0.1克/kg体重/天；优选0.001-0.05克/kg体重/天)联合或组合使用。这些物质包括但不限于：抗病毒药物(如干扰素-α、拉米夫定、阿德福韦和利巴韦林)、抗炎药物(如糖皮质激素，重组人白介素10)、抗氧化药物(如水飞蓟素和维生素E)、抑制肝星状细胞分化激活药物(如依马替尼及其类似物、索拉菲尼等)、血管紧张素转换酶抑制剂等。

本发明的组合物还可与除药物治疗外的其它常用于治疗或预防肝纤维化的方法或手段相结合。这些方法或手段包括但不限于：手术治疗、针灸、合理膳食等。

当这些物质或方法与PQQ组合或联合施用时，优选具有优于分别单独给予这些物质或方法的效果。

本发明的优点

本发明的优点包括但不限于：

(a)首次发现了PQQ能够抑制提高肝脏组织的抗氧化能力，抑制α-平滑肌肌动蛋白和I型胶原的表达，缓解肝脏的炎症反应，并且能够拮抗转化生长因子-β对肝脏星状细胞的诱导分化和促进激活作用，从而可用于有效预防或治疗肝纤维化及其相关症状或疾病，其效果甚至优于常用保肝药物(例如水飞蓟素)；

(b)PQQ在生物体内存在，是天然的化合物，对人体无毒副作用，因此使用PQQ预防或治疗肝纤维化具有高安全性；

(c)PQQ的添加还可补充了体内的内源性吡咯并喹啉醌，缓解了体内因吡咯并喹啉醌的缺乏所引起的症状。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另有说明，细胞培育的条件为37℃，5％CO₂。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.PQQ预处理抑制TAA引起的小鼠肝脏组织中α-SMA和胶原的表达上调

为了检测PQQ是否对硫代乙酰胺(TAA)造成的肝纤维化具有保护作用，发明人首先构建TAA小鼠肝纤维化模型，并用不同剂量PQQ进行灌胃治疗，并观察 PQQ对TAA造成的肝纤维化病理形态学及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达分布情况的影响。

造模及用药剂量：

动物分组及给药：

健康BALB/c小鼠，雄性，4-6周龄，购自中科院上海实验动物中心。将小鼠随机分为4组，正常组(图中标注为“N”，10只)、模型组(图中标注为“M”，10只)、PQQ低剂量组(图中标注为“L”，10只)、PQQ高剂量组(图中标注为“H”，10只)，水飞蓟素组(图中标注为“S”，10只)。

模型组、PQQ低剂量组、PQQ高剂量组、水飞蓟素组分别给予TAA腹腔注射，并同时给予PQQ或水飞蓟素各剂量灌胃，模型组给予双蒸水灌胃。正常组小鼠同时给予双蒸水腹腔注射及灌胃。8周后，处死全部小鼠。

样品的采集处理：

小鼠采用摘眼球取血，所采血液收集于Eppendorf管，室温静置4小时，3000rpm离心10min，分离血清，-80℃保存备用。

小鼠脱颈椎处死后，打开腹腔，摘取肝脏，于肝右叶切取0.5cm×0.5cm大小肝组织2块于4℃多聚甲醛固定，用于病理标本制备；其余肝组织以Eppendorf管分装后液氮速冻，-80℃保存备用。

I.肝纤维化病理形态学研究的实验方法、结果与分析：

切片和烤片：石蜡包埋组织5μm连续切片，贴于APES处理过的载玻片上，60℃(于电热恒温干燥箱内，下同)烤片6-8h。

HE染色：脱蜡至水：烤片1h，二甲苯I 10min→二甲苯II 10min→无水酒精I 3min→无水酒精II 2min→95％酒精2min→85％酒精2min→70％酒精2min→自来水反复清洗→苏朩精染液15min→自来水反复清洗→盐酸酒精分化 3秒→自来水反复清洗至细胞核变蓝为止(镜检)→伊红2～3秒→95％酒精I1min→95％酒精II 1min→无水酒精I 1min→无水酒精II 1min→滴一滴中性树脂，盖片镜检。

天狼星红染色：脱蜡至水：烤片1h，然后依次放入以下配好的溶液当中：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min→无水酒精I 3min→无水酒精II 2min→95％酒精2min→85％酒精2min→70％酒精2min→自来水反复清洗→甩干，擦边→滴加天狼星红染液一滴，置湿盒37℃，20min→无水酒精分化→二甲苯I一下→二甲苯II一下→滴一滴中性树脂，盖片镜检。

免疫组化：

脱蜡、水化组织切片：二甲苯15min×3次→无水乙醇10min×2次→95％乙醇5min×2次→80％乙醇5min→70％乙醇5min→自来水冲洗片刻→ddH₂O作用5min。TBST冲洗3min×3次。

阻断内源性过氧化物酶：3％H₂O₂-甲醇37℃(于恒温培养箱内，下同)孵育40min，TBST冲洗3min×3次。

抗原修复：高压锅内加适量水置电炉上煮沸，将切片浸入装有0.01M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)的烧杯中，放入高压锅内，加热至喷气，维持3min。取出切片使其自然冷却至室温，TBST冲洗3min×3次。

封闭：擦去多余水分，滴加封闭血清，室温孵育2h，不洗。甩去切片上的血清，滴加一抗，室温孵育1h后4℃过夜。使用一抗同型IgG作为阴性对照。TBST冲洗3min×3次。擦去多余水分，滴加聚合物辅助剂(Polymer Helper)，37℃孵育20min。TBST冲洗3min×3次。擦去多余水分，HRP标记的二抗，37℃孵育30min。TBST冲洗3min×3次。

显色：将切片浸入DAB工作液中2～5min，同时在显微镜下观察控制显色程度，待出现阳性反应，则置流水下冲洗及时终止反应。

衬染：苏木素复染30s～2min，流水冲洗，1％盐酸-乙醇分化，流水冲洗。

脱水：70％乙醇3min→80％乙醇3min→95％乙醇5min→无水乙醇5min→二甲苯8min×2次。

封片：中性树脂封固。

一抗所用到抗α-SMA抗体购自Sigma公司。

实验结果与分析：

如图1A所示：HE染色显示，模型组小鼠肝内正常肝小叶结构丧失，肝细胞呈水样变性或脂肪变性，增生的纤维组织将原来的肝小叶分割，包绕正常肝小叶，形成大小不等的假小叶，纤维间隔内有大量成纤维细胞和炎性细胞浸润，排列较为紊乱。与模型组相比，PQQ组纤维结缔组织疏松，纤细，不连续，纤维束内的成纤维细胞减少，纤维化程度有所改善并呈剂量依赖性。

天狼星红染色显示，模型组肝组织胶原纤维弥漫性增生并由汇管区向肝小叶组织内伸展，分割包绕肝组织，形成明显的纤维间隔，正常肝小叶结构消失形成假小叶。PQQ组肝内纤维间隔变窄不连续，无完整假小叶结构，且呈剂量依赖性改善。水飞蓟素组炎细胞浸润情况、假小叶形成及纤维化程度与模型组相比也有一定程度的改善。

免疫组化显示，模型组α-SMA主要分布于肝纤维间隔区域，且表达量较高。PQQ组α-SMA分布于不完整的纤维间隔处，表达量明显减少。

II.PQQ对肝纤维化模型中α-SMA和胶原的表达影响的研究方法、结果与分析

研究者接下来检测PQQ对肝纤维化模型中α-SMA和胶原的表达的影响。

RIPA组织裂解液：

50mM Tris HCl，pH 7.5，150mM NaCl，0.1％Nonidet P-40(乙基苯基聚乙二醇P-40)，5mM EDTA，5mM EGTA，15mM MgCl₂，60mM β-磷酸甘油，0.1mM原钒酸钠，0.1mM NaF，0.1mM苯甲酰胺，10μg/ml抑肽酶，10μg/ml亮肽素，1mMPMSF，以上所有试剂均按比例溶于150mM NaCl溶液中。

实验方法：

称量0.5g肝组织，加入1ml RIPA组织裂解液，冰浴下玻璃匀浆器充分匀浆。

匀浆结束后100℃煮沸10～15min，离心取上清。蛋白定量，蛋白质印迹法(参考《分子克隆》)检测蛋白表达水平。

实验结果与分析：

如图1B所示，给予PQQ可以抑制肝纤维化模型中α-SMA和胶原的蛋白水平上调，并呈现出剂量依赖性。

III.纤维化肝脏中纤维化指标的mRNA水平变化的检测方法、结果与分析

发明人进一步进行了实时PCR实验，检测纤维化肝脏中纤维化指标的mRNA水平的变化。

组织RNA抽提：

使用Trizol试剂(Invitrogen公司)，按照Invitrogen公司RNA抽提方法进行操作。

RNA逆转录：

使用RNA PCR试剂盒(AMV)Ver.3.0(Takara Biotechnology，中国大连)，按照Takara公司该试剂盒说明书进行操作。

实时PCR检测：

使用ABI Stepone Plus实时荧光定量PCR扩增仪，按TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq II试剂盒说明书进行操作。

引物序列：

小鼠GAPDH

正向引物：GAGCGAGACCCCACTAACAT(SEQ ID NO.：1)

反向引物：TCTCCATGGTGGTGAAGACA(SEQ ID NO.：2)

小鼠胶原Iα1(Collagen Iα1)

正向引物：AGAGCATGACCGATGGATTC(SEQ ID NO.：3)

反向引物：CCTTCTTGAGGTTGCCAGTC(SEQ ID NO.：4)

小鼠α-SMA

正向引物：ATGAAGCCCAGAGCAAGAG(SEQ ID NO.：5)

反向引物：TTTCCATGTCGTCCCAGT(SEQ ID NO.：6)

小鼠TGF-β

正向引物：GCAACATGTGGAACTCTACCAG(SEQ ID NO.：7)

反向引物：CAGCCACTCAGGCGTATCA(SEQ ID NO.：8)

实验结果与分析：

实时PCR的结果如图1C所示，该结果表明，在纤维化肝脏中，PQQ可以极显著降低α-SMA、I型胶原、TGF-β的mRNA水平，该降低水平是PQQ剂量依赖性的，且其效果可与常规保肝药物水飞蓟素类似。

实施例2.PQQ预处理降低TAA处理的小鼠血清中的转氨酶水平

谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)是反应肝损伤的重要指标，本实施例中进一步验证了PQQ处理对小鼠血清ALT和AST的影响。

材料：

以下试剂盒均购自南京建成生物工程研究所：

谷草转氨酶(AST/GOT)测定试剂盒(赖氏法)

谷丙转氨酶(ALT/GPT)测定试剂盒(赖氏法)

实验方法：

与实施例1中是一批动物，分组给药方式与实施例1中相同。

各项指标检测方法依照南京建成检测试剂盒说明书进行操作。

实验结果分析：

如图2所示，PQQ预处理可以显著抑制TAA介导的谷草转氨酶(AST/GOT)水平的上调，同时抑制TAA介导的谷丙转氨酶(ALT/GPT)的上调，提示PQQ对于肝纤维化中肝功能障碍具有保护作用。

实施例3.PQQ预处理提高TAA处理的小鼠肝脏中的抗氧化能力

由于氧化应激在肝纤维化的发生过程中发挥着重要的作用，发明者进一步检测了PQQ处理对小鼠肝脏中的氧化还原相关指标的影响。

材料：

以下试剂盒均购自南京建成生物工程研究所：

过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(可见光法)；

丙二醛(MDA)测定试剂盒；

超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒。

实验方法：

与实施例1中是一批动物，分组给药方式与实施例1中相同。

匀浆：取组织块0.5g(即将实施例1中所取的小鼠肝组织以Eppendorf管分装后液氮速冻，在-80℃保存备用)，以1ml 0.86％的冷生理盐水作为匀浆介质，冰浴下在玻璃匀浆器中充分匀浆，匀浆液用低温离心机2000rpm/min左右离心10min，取上清液备用。

蛋白定量方法同实施例1。

实验结果分析：

如图3所示，PQQ处理可以显著抑制TAA介导的过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的下调，同时显著抑制TAA介导的丙二醛(MDA)活性的上调。

实施例4.PQQ预处理抑制TGF-β介导的原代小鼠星状细胞中α-SMA和胶原表达上调

发明者分离了小鼠原代星状细胞，并检测PQQ处理对TGF-β介导的α-SMA和胶原表达上调的影响。

前灌流液以及酶配制液的配方及配制

用NaOH调PH值至7.4，加双蒸水定容至1L，0.22μm滤膜过滤后，4℃保存。

链酶蛋白酶E(pronase E)液：

将链酶蛋白酶E 30mg先溶于50ml酶配制液(EB)中，37℃助溶，0.22um滤过，补充EB至总体积100ml。37℃水浴放置。

胶原酶液：

胶原酶30mg，先溶于50mlEB，37℃助溶，0.22um滤过，补充EB至总体积225ml。37℃水浴放置。

胶原酶/链酶蛋白酶E分散液：

胶原15mg，链酶蛋白酶E 15mg，先溶于50ml酶配制液(EB)中，37℃助溶，0.22um滤过，补充EB至总体积100ml。37℃水浴放置。

DNAse：

DNAse 5mg，溶于25mlEB中，0.22um过滤，4℃放置。

2×SDS细胞裂解液：

Tris 1.9376g，NaCl 3.5064g，EDTA 0.1169g，SDS 4g，加ddH₂O定容至200ml，用HCl调节pH值至7.4，常温保存备用。

1×SDS细胞裂解液：

50％2×SDS细胞裂解液，

5％β-巯基乙醇(Fluka)，

2％完全蛋白酶抑制剂(Roche)，

2％PhosSTOP磷酸酶抑制剂(Roche)

41％ddH₂O定容，-20℃保存备用。

实验方法：

该实验是分离正常BALB/c小鼠肝星状细胞，进行细胞水平的信号通路的检测。

1.小鼠原代肝星状细胞的分离和纯化

原位消化：将4只正常BALB/c小鼠麻醉后，仰卧固定，放于超净台上，用75％酒精消毒皮毛，U型剖开腹部，暴露门静脉，门静脉穿刺，退出针芯，固定留置针。开启恒流泵，5ml/min.前灌注液冲洗肝脏血液，迅速剪断下腔静脉放血，肝脏变为淡褐色。灌3min后，换链酶蛋白酶E，流量调整为3ml/min，消化经肝实质细胞。之后，灌注胶原酶，约20min后，肝脏软化，停止灌流。

细胞分散：将肝脏取出，并剪碎，放入锥形瓶，瓶内有链酶蛋白酶E/胶原酶分散液，37度摇床摇匀，200转/分，摇30min。

细胞纯化：分散后的悬液通过二层纱布滤入2-3根50ml离心管，每管加入DNAse，500g离心7min，吸弃上清至细胞团块上1cm处，每管加DMEM 40ml及DNAse，悬浮细胞，离心洗涤3-4次至上清较清澈。最后一步离心前，将细胞合为一管，离心后，沉淀加培养液使之达到10ml，加3.85ml 36％Nycodenz，加DNAse充分混匀。小心在此混合液上铺一层培养液，4℃，1450g离心20min。垂直位取下离心管，仔细吸取培养液与细胞悬液间的细胞，加培养液后500g，7min离心两次，弃上清，以含10％胎牛血清的DMEM悬浮细胞，取90ul细胞悬液计数，紫外激发光观察有自发荧光细胞数占细胞总数90％-95％。

细胞以1×10⁶个/ml的浓度接种在直径100mm塑料培养皿里，在5％CO₂、95％潮湿空气的CO₂培养箱里培养，隔天换液。

2.细胞处理和检测

培养2天的原代星状细胞更换为无血清DMEM培养，同时无血清培液里加不同剂量PQQ(0.1、1、5或10μM)，12h后加5ng/ml TGF-β，24h后收获细胞。

将细胞用1ml PBS(pH＝7.4)冲洗三次，再加入1ml PBS，用细胞刮刀刮下细胞，收集细胞悬液于1.5ml Eppendorf管中；4℃4000rpm离心5min，尽弃上清，加入适量体积的1×SDS细胞裂解液，吹打均匀；100℃煮沸10-20min，离心取上清。蛋白定量，蛋白质印迹法(参考《分子克隆》)检测蛋白表达水平。

实验结果与分析：

如图4所示，采用PQQ处理可抑制TGF-β介导的原代小鼠星状细胞中α-SMA和胶原的表达上调，10μM PQQ的抑制效果尤为明显。

实施例5.PQQ预处理抑制TGF-β介导的原代小鼠星状细胞中p38信号通路的激活

以往文献报道(例如可参见：S.Tsukada，Journal of Biological Chemistry 280(2005)10055-10064；W.Lin，W.L.Tsai，R.X.Shao，G.Wu，L.F.Peng，L.L.Barlow，W.J.Chung，L.Zhang，H.Zhao，J.Y.Jang，R.T.Chung，Gastroenterology 138(2010)2509-2518，2518e2501)，MAPK/p38通路的激活在TGF-β促纤维化过程中发挥着重要作用；而MAPK/p38信号通路的激活也与细胞的氧化还原状态密切相关。因此，发明者检测了PQQ处理对TGF-β介导的MAPK/p38活化的影响。

实验方法：

小鼠原代肝星状细胞分离方法同实施例4。分离出的原代细胞培养2天后更换为无血清DMEM培养，同时无血清培液里加不同剂量PQQ(1、10、50或100μM)，12h后加5ng/ml TGF-β，2h后收获细胞。收获细胞及蛋白检测方法同实施例3。

实验结果与分析：

如图5A所示，PQQ呈剂量依赖性地抑制TGF-β介导的MAPK/p38活化。

如图5B所示，PQQ对MAPK/ERK和MAPK/JNK通路没有明显影响。该试验结果表明PQQ特异通过抑制MAPK/P38通路而影响肝星状细胞的激活，而非MAPK的其它通路。

实施例6.PQQ预处理抑制TAA介导的小鼠肝脏炎症反应

为了进一步验证PQQ对小鼠肝纤维化的保护作用是否与其抑制炎症因子的产生有关，发明者检测Balb/C小鼠腹腔注射TAA 3天后肝脏中细胞因子mRNA水平。PQQ与TAA同时给药，TAA：200mg/kg/次，PQQ低剂量组：0.3mg/kg/d，PQQ高剂量组：1mg/kg/d，水飞蓟素组：25mg/kg.TAA、PQQ及水飞蓟素，均每日给药一次，连续三天。

实验方法：

健康BALβ/c小鼠，雄性，4-6周龄，购自中科院上海实验动物中心。将小鼠随机分为4组，正常组(图中标注为“N”，5只)、模型组(图中标注为“M”，5只)、PQQ低剂量组(图中标注为“L”，5只)、水飞蓟素组(图中标注为“S”，5只)PQQ高剂量组(图中标注为“H”，5只)。

模型组、PQQ低剂量组、PQQ高剂量组，水飞蓟素组分别给予TAA腹腔注射，并同时给予PQQ各剂量灌胃，模型组给予双蒸水灌胃。正常组小鼠同时给予双蒸水腹腔注射及灌胃。3周后，处死全部小鼠。

组织RNA抽提、RNA逆转录及实时PCR检测方法同实施例1。

引物序列：

小鼠GAPDH

正向引物：GAGCGAGACCCCACTAACAT(SEQ ID NO.：1)

反向引物：TCTCCATGGTGGTGAAGACA(SEQ ID NO.：2)

小鼠IL-6

正向引物：TCCAGTTGCCTTCTTGGGAC(SEQ ID NO.：9)

反向引物：GTGTAATTAAGCCTCCGACTTG(SEQ ID NO.：10)

小鼠IL-1

正向引物：GCCCGTGTTGCTGAAGGA(SEQ ID NO.：11)

反向引物：ATAAGCAGCTGATGTGAAGTAGTTCTTAG(SEQ ID NO.：12)

小鼠TNF-α

正向引物：AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA(SEQ ID NO.：13)

反向引物：AGGTACAACCCATCGGCTGG(SEQ ID NO.：14)

小鼠TGF-β

正向引物：GCAACATGTGGAACTCTACCAG(SEQ ID NO.：7)

反向引物：CAGCCACTCAGGCGTATCA(SEQ ID NO.：8)

实验结果与分析：

如图6显示，PQQ处理显著或极显著抑制了TAA介导的各类炎症因子(TGF-β、IL-6、IL-1和TNF-α)的表达，其效果甚至可显著优于常规保肝药物水飞蓟素。

实施例7.PQQ治疗能够抑制TAA引起的小鼠肝脏组织中α-SMA和胶原的表达上调

为了检测PQQ是否对硫代乙酰胺(TAA)造成的肝纤维化具有治疗作用，发明人构建TAA小鼠肝纤维化模型，造模8周后，使用不同剂量PQQ进行灌胃治疗4周(治疗同时继续给予TAA)，并观察PQQ对TAA造成的肝纤维化病理形态学及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达分布情况的影响。

造模及用药剂量：

动物分组及给药：

健康BALB/c小鼠，雄性，4-6周龄，购自中科院上海实验动物中心。将小鼠随机分为4组，正常组(图中标注为“N”，10只)、模型组(图中标注为“M”，10只)、PQQ低剂量组(图中标注为“L”，10只)、PQQ高剂量组(图中标注为“H”，10只)和阳性对照组(使用水飞蓟素作为阳性对照，图中标注为“S”，10只)。

模型组、PQQ低剂量组、PQQ高剂量组分别给予TAA腹腔注射，并同时给予PQQ各剂量或水飞蓟素灌胃，模型组给予双蒸水灌胃。正常组小鼠同时给予双蒸水腹腔注射及灌胃。12周后，处死全部小鼠。

样品的采集处理：

纤维化肝脏中纤维化指标的mRNA水平变化的检测方法、结果与分析

发明人采用了实时PCR实验，检测纤维化肝脏中纤维化指标的mRNA水平的变化。

组织RNA抽提：

RNA逆转录：

实时PCR检测：

引物序列：

小鼠GAPDH

正向引物：GAGCGAGACCCCACTAACAT(SEQ ID NO.：1)

反向引物：TCTCCATGGTGGTGAAGACA(SEQ ID NO.：2)

小鼠胶原Iα1(Collagen Iα1)

正向引物：AGAGCATGACCGATGGATTC(SEQ ID NO.：3)

反向引物：CCTTCTTGAGGTTGCCAGTC(SEQ ID NO.：4)

小鼠α-SMA

正向引物：ATGAAGCCCAGAGCAAGAG(SEQ ID NO.：5)

反向引物：TTTCCATGTCGTCCCAGT(SEQ ID NO.：6)

实验结果与分析：

实时PCR的结果如图7所示，该结果表明，在纤维化肝脏中，PQQ可以极显著降低α-SMA和I型胶原的mRNA水平，且该降低水平是PQQ剂量依赖性的。提示PQQ对于肝纤维化具有治疗作用，且其效果甚至可显著优于常用护肝药物水飞蓟素。

实施例8.PQQ治疗能够降低TAA处理的小鼠血清中的转氨酶水平

为了进一步验证PQQ对小鼠肝纤维化中肝功能紊乱具有治疗作用，发明者检测Balb/C小鼠模型中血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平。

实验方法：

实验模型建立和血清样本收集同实施例7。

实验材料和血清中转氨酶检测方法同实施例2。

实验结果与分析：

如图8显示，PQQ处理可以显著抑制TAA介导的小鼠血清中谷草转氨酶(AST/GOT)和谷丙转氨酶(ALT/GPT)水平的上调，提示PQQ治疗对于肝纤维化中肝功能障碍具有保护作用，且其效果甚至可显著优于常用护肝药物水飞蓟素。

实施例9.PQQ治疗能够抑制TAA介导的小鼠肝脏组织炎症反应

为了进一步验证PQQ对小鼠肝纤维化的治疗作用是否与其抑制炎症因子的产生有关，发明者检测Balb/C小鼠肝脏组织中细胞因子mRNA水平。

实验方法：

实验模型建立和组织样本收集同实施例7。

组织RNA抽提、RNA逆转录及实时PCR检测方法同实施例1。

引物序列同实施例6。

实验结果与分析：

如图9显示，PQQ治疗显著抑制了TAA介导的各类炎症因子(TGF-β1、IL-6、IL-1和TNF-α)的表达，且其效果甚至可显著优于常用护肝药物水飞蓟素。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.吡咯并喹啉醌活性物质在制备治疗和/或预防对象肝纤维化或其相关症状或相关疾病的组合物中的应用，所述吡咯并喹啉醌活性物质选自：吡咯并喹啉醌、其药学上或生理学上可接受的盐和/或酯。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝纤维化相关疾病包括肝纤维化进行到晚期所导致的肝硬化。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝纤维化相关症状或相关疾病选自下组：

肝纤维化所导致的：肝肾综合症、肝纤维化所导致的肝功能代谢障碍、肝纤维化导致的原发性腹膜炎、肝纤维化导致的自身免疫性肝炎、肝纤维化导致的原发性硬化性胆管炎、肝纤维化导致的腹水、肝纤维化导致的上消化道静脉曲张出血以及肝纤维化导致的肝性脑病；

肝纤维化所导致的：疲乏、无力；食欲减退，恶心、呕吐；慢性消化不良症状，如腹胀气、便秘或腹泻、肝区隐痛；慢性胃炎，如反酸、嗳气、呃逆、上腹部隐痛及上腹饱胀等胃区症状；出血、慢性肝炎，例如蜘蛛痣、鼻衄、牙龈出血、皮肤和粘膜有紫斑或出血点等；肝纤维化的并发感染性，例如慢性乙型丙型和丁型病毒性肝炎血吸虫病等；先天性代谢缺陷，例如肝豆状核变性血色病α1-抗胰蛋白酶缺乏症等；化学毒物性(例如慢性酒精性肝病慢性的药物性肝病)及自身免疫性肝炎原发性、胆汁性肝硬化和原发性、硬化性胆管炎；

肝纤维化相关的：肝星状细胞的激活、肝星状细胞的激活介导的细胞外基质堆积、血清转氨酶水平增高、肝脏组织炎症反应。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物为保健品组合物或药物组合物。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述对象是哺乳动物。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述吡咯并喹啉醌活性物质在组合物中的含量为0.01-1000mg，优选0.1-500mg，更优选0.1-100mg。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物的剂型包括：片剂、粉末剂、注射剂、颗粒剂、糖浆、胶囊、溶液剂、栓剂或药膏。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物还包含治疗和/或预防肝纤维化或其相关症状或疾病的其它活性物质。

9.一种组合物，其含有：

(1)有效量的吡咯并喹啉醌活性物质；

(2)治疗和/或预防肝纤维化或其症状的其它活性物质；以及

(3)药学上可接受的载体。

10.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物是保健品组合物或药物组合物。