CN105012702B - 外用生肤油在制备预防或治疗糖尿病性末梢循环障碍及足溃疡的药物中的应用 - Google Patents

外用生肤油在制备预防或治疗糖尿病性末梢循环障碍及足溃疡的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物新适应症技术领域，具体公开了一种外用生肤油在制备预防或治疗糖尿病性末梢循环障碍及足溃疡的药物中的应用。外用生肤油可有效改善糖尿病足溃疡早期末梢循环障碍引起的足部低温，使足底疼痛阈值恢复到正常水平，并且加快糖尿病足溃疡创面修复，缩短创面愈合时间。糖尿病大鼠足溃疡创面经外用生肤油治疗35天后创面面积由（51.3±3.5 mm2）减小到（4.0±0.1 mm2），创面基本愈合，皮肤红润、干燥，表面光滑；苏木精‑伊红（HE）染色结果表明，外用生肤油组及外用生肤油+二甲双胍组的大鼠足部创面皮肤组织结构较为完整，创缘处胶原纤维排列较整齐，创面组织的炎性细胞浸润明显降低。

Description

外用生肤油在制备预防或治疗糖尿病性末梢循环障碍及足溃 疡的药物中的应用
技术领域
本发明涉及药物新适应症技术领域，具体涉及一种外用生肤油在制备预防或治疗糖尿病性末梢循环障碍及足溃疡的药物中的应用。
背景技术
糖尿病足溃疡是糖尿病的严重并发症之一。糖尿病足溃疡早期末梢循环障碍引起的临床体征为下肢皮温降低，痛觉及压力觉等感觉迟钝或丧失。当外界施加不恰当压力易导致足部创伤，引起组织溃破，最终导致溃疡的发生(糖尿病足溃疡的危险因素与治疗进展.中国全科医学,2013,16:3159–3163)。糖尿病足溃疡创面难愈是一直是临床研究的关注重点(Vincent Falanga.Wound healing and its impairment in the diabeticfoot.Lancet.2005，366:1736–1743)。
目前临床西医针对糖尿病足溃疡，分内科及外科治疗。内科治疗采取服用旨在改善以糖代谢异常为基础的多种代谢紊乱、改善微循环，抗感染等药物，可在一定程度上为糖尿病的治疗创造条件，防治其它并发症(糖尿病足溃疡内科治疗进展.中国全科学,2009,12:1019-1021)。对于病情严重且内科治疗效果不好者，则要使用外科手段。外科治疗通常包括清创术、血管重建、神经病变手术、血管腔内介入治疗、干细胞移植术甚至是截肢。外科治疗能在一定程度上改善患者的痛苦，提高生活质量、降低截肢率，甚至是挽救生命，但是也要求患者能耐受麻醉和手术打击，同时外科治疗要求临床上做到多学科协作，即首先评估患者全身状况，做出术中术后的抢救预案，术后给予药物调整以减少死亡。并且手术还存在并发症、预后较差、手术费用高等难题(糖尿病足溃疡治疗进展.实用医院临床杂志,2014,11:10-13)。
传统的中医药多采用辩证论治的内服保守疗法及局部外治。中医外治主要考虑利用外用药进行局部改善创面微循环、抗炎、抑制氧化应激等多样化的组合，减轻疼痛，并解决由于肢体末端血液循环差因而全身药物不能到达的弊端，多靶点治疗促进糖尿病足溃疡愈合。中医针对糖尿病足溃疡的外治方法很多，但其预防相关研究却很少(中医治疗糖尿病足的研究进展.职业与健康,2011,27:2788-2789)，而且遗憾的是目前没有一种有效的中药或西药既能够治疗深度烧烫伤又有效地治疗糖尿病足溃疡。
申请人前期研制并公开了由黄芩、大黄、黄芪、黄柏、黄连、地榆、地黄、白芷、白薇、白芨、当归、紫草、乳香、没药、冰片等十五种中药浸于麻油而制备成的外用生肤油(一种治疗烧烫伤的外用生肤油及其制备方法和应用.中国发明专利.专利号ZL 201210426168.X)，并证实了该外用生肤油治疗烧烫伤，可有效预防伤后创面感染，促进成纤维细胞、血管内皮细胞的增殖和迁移，诱导产生新生血管，加速创面愈合，缩短创面愈合时间，Ⅰ～Ⅱ度烧烫伤仅需10～12天可痊愈，家兔Ⅲ度烧烫伤需20～25天可痊愈。家兔Ⅲ度烧烫伤经外用生肤油治疗22天后创面由6cm2减小到0.1cm2，创面平整且光滑柔软，新生毛发正常；创面表皮修复完整，真皮层有致密毛囊形成，与正常皮肤组织几乎无差别。我们的研究结果表明外用生肤油具有益气活血、祛瘀生肌之功效，能促进Ⅲ度烧伤创面快速愈合(三黄外用生肤油对兔Ⅲ度烫伤创面的作用.中华烧伤杂志,2013,29:50–54)，但未涉及其能否改善糖尿病性末梢循环障碍，甚至治疗糖尿病足溃疡的作用及其药理机制。
发明内容
针对上述现有技术中的治疗烧烫伤的外用生肤油适应症窄的问题，本发明的第一个目的在于提供了一种外用生肤油在制备预防或治疗糖尿病性末梢循环障碍的药物中的应用。
本发明的第二个目的在于提供了一种外用生肤油在制备预防或治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用。
进一步，本发明还提供了外用生物油联合二甲双胍在制备预防或治疗糖尿病性末梢循环障碍的药物中的应用以及在制备预防或治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用。
所述外用生肤油为专利号为ZL201210426168.X的中国专利、授权公告号为CN102895526 B的授权公告文本中权利要求1中所述外用生肤油，优选为说明书中实施例1-5所制备的生肤油1、生肤油2、生肤油3、生肤油4和/或生肤油5。
本发明的发明构思如下：
高血糖、脂代谢紊乱等多种诱因使糖尿病患者的下肢易发生血管病变，导致远心肢端缺血、缺氧及营养障碍，引起局部皮肤温度降低，常伴发神经病变使得痛温觉减弱甚至消失，而易使皮肤受损伤，继发感染，形成糖尿病性并发症足溃疡。综合因素导致的足部溃疡使得创面愈合处于病理条件，打破了正常生理条件下的皮肤修复过程，使得创面经久不愈。目前，其主要的病理机制虽未完全阐明，但创面局部微血管形成及功能障碍以及创面持续慢性炎症、神经病变等是该疾患的重要病理表现。而且这一类慢性溃疡的病理修复与正常生理条件的烧烫伤的创面修复也存在巨大差异(SingerAJ,Clark RA.Cutaneous woundhealing.N Engl J Med 1999,341:738–746)，更使得其成为临床研究关注的难点和重点。
由于引起糖尿病足溃疡的因素众多，其本身的治疗也非常复杂，因此针对溃疡的发生若及时采取预防措施，可减缓糖尿病足症状，从而减少溃疡的发生，改善患者的下肢运动功能，有效提高糖尿病足的治愈率，降低致残率。针对糖尿病足溃疡的中医外治方法很多，但其预防相关研究却很少。而且遗憾的是，根据专利及相关的研究论文等文献查阅，目前尚未见一种有效的中药或西药既能够治疗深度烧烫伤，又能兼备预防及治疗糖尿病足溃疡的作用。
本申请人前期研究证实了外用生肤油治疗烧烫伤，可有效预防伤后创面感染，促进成纤维细胞、血管内皮细胞的增殖和迁移，诱导产生新生血管，加速深度烧伤创面愈合，促进无瘢痕修复，缩短创面愈合时间。尽管该药方各成分药物的功效可通过传统中医药理论来解释外用生肤油具有益气活血、祛瘀生肌之功效，却无法预测其能否对预防以及治疗糖尿病足溃疡这类慢性溃疡也具有良好的疗效。因此，我们后期对外用生肤油防治糖尿病性末梢循环障碍及足溃疡进行了大量的科学实验研究，通过建立糖尿病性末梢循环障碍模型以及糖尿病足溃疡模型，研究外用生肤油给药对相应病症的治疗作用。研究结果表明给药后外用生肤油既能明显恢复糖尿病足溃疡早期末梢循环障碍，又能促进糖尿病足溃疡皮肤再生，加速创面愈合。
为了实现第一个目的，本发明采用了如下技术措施：
利用糖尿病模型大鼠，联合低温处理(模拟临床冻伤类刺激对糖尿病患者皮肤的伤害)诱发糖尿病性末梢循环障碍的症状。对足底涂抹外用生肤油剂量为0.15ml/cm2，1次/天，连续3周。研究外用生肤油改善大鼠足部低温、痛觉迟钝的作用。
为了实现第二个目的，本发明采用了如下技术措施：
利用糖尿病模型大鼠，采用沸腾的水蒸汽烫伤(模拟临床烫伤类刺激对糖尿病患者皮肤的伤害)建立足溃疡模型。对创面涂抹外用生肤油剂量为0.15ml/cm2，1次/天，连续35天行大体观察。取足溃疡模型中所有大鼠足底创面制作石蜡切片(厚度为4μm)。部分切片HE染色后行组织形态学观察；部分切片用于环氧化酶2(COX-2)、血管内皮生长因子(VEGF)多克隆抗体进行免疫组织化学染色。采用NuanceTM Fx多光谱显微成像系统(美国CRI公司)对相应蛋白的表达进行定量分析。研究外用生肤油对糖尿病足溃疡的治疗作用。
采用平板滤纸片法，滤纸片直径5.0mm，灭菌干燥后备用。取500μl金黄色葡萄球菌或大肠杆菌悬液涂于平板上。将滤纸片加20μl低(以麻油为溶媒稀释为原浓度的5％)、中(以麻油为溶媒稀释为原浓度的10％)、高(以麻油为溶媒稀释为原浓度的20％)剂量外用生肤油药物，以麻油为对照药，以头孢拉定(8mg/mL)为阳性对照药，用无菌镊子取含药滤片贴放于平板表面。37℃培养24h后测量记录抑菌环直径。研究外用生肤油的抑菌活力。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
1、研究结果表明给药后外用生肤油能有效发挥其益气活血之作用，明显恢复糖尿病足溃疡早期末梢循环障碍导致的足部低温及痛阈高值至正常水平，达到了改善糖尿病性末梢循环障碍的作用。本发明中外用生肤油防治糖尿病性末梢循环障碍及足溃疡具有以下优势：①药物成本低；②局部给药、使用方便；③足溃疡创面愈合时间缩短、愈合效果更佳。
2、基于目前中药复方制剂治疗糖尿病足溃疡机制不明而影响其在临床推广的现状，本发明对外用生肤油治疗糖尿病足溃疡的机制进行了研究。实验结果表明，外用生肤油针对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)及大肠杆菌(革兰氏阴性菌)均具有明显的抑制作用，又可通过下调糖尿病大鼠创伤诱导的环氧酶-2(COX-2)过度表达，降低创面皮肤炎性反应，同时上调糖尿病大鼠创伤诱导的血管内皮生长因子(VEGF)低表达，促进患部皮肤的血管重建，促进糖尿病足溃疡皮肤再生，加速创面愈合。
附图说明
图1为实施例1的大鼠OGTT的时间-血糖关系图。
大鼠腹腔链脲佐菌素(STZ，腹腔注射30mg/kg)注射3周后，行大鼠口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。与对照组相比，糖负荷后所有注射STZ的大鼠在各时间点血糖值均显著性升高(P值均小于0.001)，糖负荷2h后糖尿病组血糖值(13.8±0.7mmol/L)大于11.1mmol/L且显著性高于对照组(4.5±0.5mmol/L)，表明糖尿病模型建立成功。注：与相应时间点的对照组相比，***P<0.001。
图2为实施例2中大鼠的足温测量图。A：给药第3周红外测温仪测量的各组大鼠足温示意图；B：各组大鼠足部温度变化图。
给药治疗后，外用生肤油2能明显改善糖尿病大鼠足部低温状态，而其与二甲双胍的合用效果最为显著，并在联合给药的第3周时(23.3±0.2℃)基本恢复至对照组(23.4±0.2℃)水平。从图中可以看出，生肤油促进糖尿病大鼠的足部温度恢复至正常水平。注：与相应时间点的对照组相比，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05；与相应时间点的无治疗组相比，##P<0.01，#P<0.05。
图3为实施例3中大鼠足底热痛阈值测量图。
给药治疗3周后，外用生肤油组(27.9±1.3s)糖尿病大鼠足底痛阈高值水平明显降低，同样外用生肤油+二甲双胍组的联合用药效果(26.4±1.6s)最为显著。连续3周的检测期间，既无外用生肤油、也无二甲双胍等药物治疗的糖尿病大鼠的热痛阈值基本保持在高值水平(29.4±2.1s、31.7±2.8s、31.0±2.1s)。可看出生肤油4降低了糖尿病大鼠足底的热痛阈值。注：与相应时间点的对照组相比，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。
图4为实施例4中生肤油5促进糖尿病足溃疡各组大鼠创面愈合(大体观察图)。
烫伤后第3天，各组创面皮肤均呈现水肿，创缘局部稍有红润，组间无明显差异。伤后第7天，各组创面面积扩大，红肿明显，形成结痂，所有糖尿病大鼠的创面局部均出现创部肿胀、脓性分泌物；对照组创面颜色深红，边缘肿、硬；给予外用生肤油、二甲双胍等药物治疗的大鼠足部创面颜色暗红，创缘结痂开始脱落。伤后第21天，外用生肤油组和外用生肤油+二甲双胍组的大鼠足部创面结痂基本脱落，创面皮肤红润光滑；二甲双胍组大鼠足部创面结痂尚未脱落，创缘皮肤颜色暗红且较硬。伤后第35天，与对照组相同，外用生肤油组及外用生肤油+二甲双胍组的大鼠足部创面皮肤肿胀消失，创面基本愈合，皮肤红润、干燥，表面光滑。图中标尺为0.5cm。
图5为实施例5中生肤油1促进糖尿病足溃疡大鼠创面皮肤再生的组织HE染色图。
伤后第35天，与对照组相同，外用生肤油组大鼠足部皮肤结构较为完整，创缘处胶原纤维排列较整齐；与未给予药物治疗的糖尿病大鼠相同，仅予以二甲双胍治疗的大鼠创面宽而深，真皮层可见大量炎性细胞浸润。图为Nikon Eclipse50i显微镜20倍物镜下拍摄的图片，标尺为50μm。
图6为实施例6中外用生肤油(生肤油1)下调糖尿病大鼠足溃疡的创面皮肤组织中COX-2的表达(创面组织免疫组织化学染色)的示意图。A：创面组织COX-2的免疫组织化学染色图及多光谱显微成像系统提取所拍摄的Unmixed病理图片中DAB着色部分图片；B：COX-2表达的定量图。
伤后第35天，与对照组(100.0±14.2％)相比，糖尿病大鼠足溃疡皮肤组织中COX-2蛋白表达水平显著性过表达(222.6±51.6％)。给予外用生肤油或联合二甲双胍治疗后，足溃疡皮肤组织中COX-2表达均明显下调(91.5±17.0％、108.8±7.0％)，而给予二甲双胍单独治疗(136.8±10.0％)对糖尿病足溃疡皮肤组织中COX-2表达的诱导无明显影响。注：图A，COX-2的免疫组织化学染色图及多光谱显微成像系统提取所拍摄的Unmixed病理图片中DAB着色部分图片。图B，大鼠创面组织中COX-2蛋白的多光谱定量图。图中标尺为100μm。*P<0.05。
图7为实施例7中实验结果图。A：创面组织VEGF的免疫组织化学染色图及多光谱显微成像系统提取所拍摄的Unmixed病理图片中DAB着色部分图片；B：VEGF表达的定量图。
给予外用生肤油1治疗的糖尿病大鼠足溃疡组织中血管内皮生长因子VEGF明显上调(142.8±5.9％、119.8±5.9％)。单独给予二甲双胍治疗对糖尿病足溃疡皮肤组织中VEGF表达的促进无显著性影响(94.2±17.9％)。注：图A，大鼠创面组织中VEGF的免疫组织化学染色图及多光谱显微成像系统提取所拍摄的Unmixed病理图片中DAB着色部分图片。图B，大鼠创面组织中VEGF蛋白的多光谱定量图。图中标尺为100μm。*P<0.05，**P<0.01。
具体实施方式
下面申请人将结合具体的实施例对本发明的应用做进一步的详细说明。应理解，以下内容不应以任何方式对本发明的保护范围加以限制。
申请人对外用生肤油防治糖尿病性末梢循环障碍及足溃疡的作用进行了系列、大量的科学实验验证，确认该制剂单独使用及联合二甲双胍用药均能有效改善糖尿病性末梢循环障碍引起的皮温下降以及痛觉迟钝，并通过下调患部皮肤组织中COX-2表达，降低创面皮肤炎性反应的同时，上调患部皮肤组织中VEGF表达，促进患部皮肤的血管重建，加速糖尿病足溃疡皮肤再生和创面愈合。同时，外用生肤油对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)及大肠杆菌(革兰氏阴性菌)具有明显的抑制作用。
实施例1糖尿病大鼠模型的建立
受试动物为SPF级Wistar雄性大鼠50只(由湖北省疾病预防控制中心提供)，体重150-180g，自由饮水饮食，饲养间室温保持在25±1℃，明暗周期为12小时。
1.糖尿病性大鼠模型制备
待大鼠适应环境1周后，随机选取40只作为糖尿病组，10只作为对照组。糖尿病组大鼠腹腔注射30mg/kg链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司；以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配置成10mg/ml的溶液，pH 4.2)，对照组腹腔注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。3周后尾静脉采血测定口服葡萄糖耐量，糖尿病大鼠模型的标准为：糖负荷2h的血糖值＞11.1mmol/L。
2.大鼠口服葡萄糖耐量(OGTT)试验
STZ诱导3周后，大鼠禁食不禁水12h，尾静脉采血测定空腹血糖，记为口服葡萄糖耐量试验(OGTT试验)0min的血糖值，随后各组大鼠口服2g/kg的葡萄糖溶液，测15、30、60、90、120min的血糖值，作OGTT的时间-血糖关系图。
3.实验结果
OGTT的时间-血糖关系图见图1。与对照组相比，糖负荷后所有注射STZ的大鼠即糖尿病大鼠在各时间点血糖值均显著性升高(P值均小于0.001)，糖负荷2h后糖尿病组血糖值(13.8±0.7mmol/L)大于11.1mmol/L且显著性高于对照组(4.5±0.5mmol/L)，表明本研究所需的糖尿病模型建立成功。
实施例2外用生肤油恢复糖尿病性末梢循环障碍大鼠的足部温度
外用生肤油(采用专利号为ZL201210426168.X的中国专利、授权公告号为CN102895526 B的授权公告文本中实施例1制备的生肤油1或实施例2制备的生肤油2，以下直接称生肤油1或生肤油2)改善糖尿病性末梢循环障碍，恢复糖尿病大鼠的足部温度。
动物：受试SPF级Wistar雄性大鼠50只(由湖北省疾病预防控制中心提供)，体重150-180g，自由饮水饮食，饲养间室温保持在25±1℃，明暗周期为12小时。
1.糖尿病性末梢循环障碍模型制备及给药
按照实施例1所描述的方法一样进行分组并建立糖尿病模型，腹腔注射30mg/kg链脲佐菌素(STZ)诱导3周后，将所有大鼠放置于冰水表面的不锈钢盆平面行走，通过低温诱导加速其末梢循环障碍，每天10min，持续2周后停止低温处置。STZ诱导后第9周，将糖尿病组大鼠随机均分为4组：无治疗组、二甲双胍组、外用生肤油组、外用生肤油+二甲双胍组，并分组给药。二甲双胍片以蒸馏水为媒介溶解，灌胃剂量200mg/kg；外用生肤油(生肤油1或生肤油2，相应组一半数量大鼠涂抹生肤油1，一半数量大鼠涂抹生肤油2)在创面涂抹剂量为0.15ml/cm2；其它组以等量生理盐水灌胃、等量麻油涂抹为对照，所有组1次/天，连续3周。
2.大鼠足部温度的测定
在室温条件下采用红外测温仪(见图2A)测定末梢循环障碍实验中所有大鼠在给药前(按给药第0周算)、给药后第1、2、3周的足部温度。
3.实验结果
大鼠足部温度测定结果见图2B。给药治疗前，糖尿病大鼠足部温度(无治疗组为21.7±0.1℃、二甲双胍组为21.7±0.2℃、生肤油组为21.2±0.2℃、生肤油+二甲双胍组为21.5±0.2℃)均明显低于对照组(23.2±0.2℃，P值均小于0.05)。给药治疗后，外用生肤油(生肤油1或生肤油2)能明显改善糖尿病大鼠足部低温状态，而其与二甲双胍的合用效果最为显著，并在联合给药的第3周时(23.2±0.2℃或23.3±0.2℃，分别为生肤油1、生肤油2的实验结果)基本恢复至对照组(23.4±0.2℃)水平。
实施例3外用生肤油降低糖尿病性末梢循环障碍大鼠足底的热痛阈值
外用生肤油(采用专利号为ZL201210426168.X的中国专利、授权公告号为CN102895526 B的授权公告文本中实施例3制备的生肤油3或实施例4制备的生肤油4，以下直接称生肤油3或生肤油4)改善糖尿病性末梢循环障碍，恢复糖尿病大鼠足底的热痛阈值。
动物：受试SPF级Wistar雄性大鼠50只(由湖北省疾病预防控制中心提供)，体重150-180g，自由饮水饮食，饲养间室温保持在25±1℃，明暗周期为12小时。
1.糖尿病性末梢循环障碍模型制备及给药
按照实施例1所描述的方法一样进行分组并建立糖尿病模型。腹腔注射30mg/kg链脲佐菌素(STZ)诱导3周后，将所有大鼠放置于冰水表面的不锈钢盆平面行走，通过低温加速诱导其末梢循环障碍，每天持续处理10分钟，连续两周后停止低温处置。STZ诱导后第9周，将糖尿病组大鼠随机均分为4组：无治疗组、二甲双胍组、外用生肤油组、外用生肤油+二甲双胍组，并分组给药。二甲双胍片以蒸馏水为媒介溶解，灌胃剂量200mg/kg；外用生肤油(生肤油3或生肤油4，相应组一半数量大鼠涂抹生肤油3，一半数量大鼠涂抹生肤油4)在创面涂抹剂量为0.15ml/cm2；其它组以等量生理盐水灌胃、等量麻油涂抹为对照，所有组1次/天，连续3周。
2.大鼠足底热痛阈值的测定
在室温条件下采用足底测试仪测定末梢循环障碍实验中所有大鼠在给药前(按给药第0周算)、给药后1、2、3周的足底热痛阈值。
3.实验结果
大鼠足底热痛阈值测量结果见图3。给药前，糖尿病大鼠的热痛阈值(无治疗组为33.1±2.6s、二甲双胍组为34.1±2.4s、生肤油组为33.3±5.0s、生肤油+二甲双胍组32.1±2.3s)均明显高于对照组(21.3±1.5s，P值均小于0.05)。给药治疗3周后，外用生肤油(28.1±1.4s或27.9±1.3s，分别为生肤油3、生肤油4的实验结果)降低了糖尿病大鼠的足底痛阈高值水平，而其与二甲双胍的联合用药效果(26.3±1.5s或26.4±1.6s)最为显著。连续3周的检测期间，不给予药物治疗的糖尿病大鼠的热痛阈值基本保持在高值水平(29.4±2.1s、31.7±2.8s、31.0±2.1s)。
实施例4外用生肤油促进糖尿病足溃疡创面修复
外用生肤油(采用专利号为ZL201210426168.X的中国专利、授权公告号为CN102895526 B的授权公告文本中实施例5制备的生肤油5，以下直接称生肤油5)促进糖尿病足溃疡创面愈合。
动物：受试SPF级Wistar雄性大鼠50只(由湖北省疾病预防控制中心提供)，体质量150-180g，自由饮水饮食，饲养间室温保持在25±1℃，明暗周期为12小时。
1.糖尿病足溃疡模型制备及给药
按照实施例1所描述的方法一样进行分组并建立糖尿病模型。腹腔注射30mg/kg链脲佐菌素(STZ)诱导后第9周，采用沸腾的水蒸汽于每只大鼠足底行5秒烫伤(面积为37mm2)，烫伤即刻(第0天)至第35天给予相应药物处理。动物的分组及给药方式与剂量同上实施例2和3的方法。
2.大鼠足底创面大体观察
采用Sonyα300单反相机拍摄并记录糖尿病足溃疡实验中所有大鼠在伤后3、7、21、35天的创面，运用Adobe Photoshop 7.0软件通过统计创面图选区像素数目计算面积的原理计算创面面积的变化。
3.实验结果
大鼠足部大体观察见图4。烫伤后第3天，各组创面皮肤均呈现水肿，创缘局部稍有红润，组间无明显差异。伤后第7天，各组创面面积扩大，红肿明显，形成结痂，所有糖尿病大鼠的创面局部均出现创部肿胀、脓性分泌物；对照组创面颜色深红，边缘肿、硬；给予外用生肤油、二甲双胍等药物治疗的大鼠足部创面颜色暗红，创缘结痂开始脱落。伤后第21天，外用生肤油组和外用生肤油+二甲双胍组的大鼠足部创面结痂基本脱落，创面皮肤红润光滑；二甲双胍组大鼠足部创面结痂尚未脱落，创缘皮肤颜色暗红且较硬。伤后第35天，与对照组相同，外用生肤油组及外用生肤油+二甲双胍组的大鼠足部创面皮肤肿胀消失，创面基本愈合，皮肤红润、干燥，表面光滑；与未给予药物治疗的糖尿病大鼠相同，仅予以二甲双胍治疗的大鼠足部创面皮肤依然肿胀，创缘皮肤较硬，创面结痂尚未完全脱落，创面宽而深。
根据图4所示的皮肤创面计算伤后第3、7、21及35天所有大鼠的创面面积，得出各组创面面积于表1。据表1数据得知，伤后3天、7天，各组创面面积逐步扩大，且伤后7天各组创面面积均明显大于伤后3天，但同一时相点组间无显著性差异。伤后21天，除无治疗组外，各组创面均显著性缩小；外用生肤油组(10.6±0.1mm2，P<0.05)创面面积显著性小于无治疗组(76.7±1.2mm2)。伤后35天，各组创面继续缩小，但无治疗组创面面积依然最大(34.0±1.5mm2)。
表1 各组大鼠各时相点创面面积比较(mm2；n＝5)
注：与相应时间点的对照组相比，aP<0.05；与相应时间点的无治疗组相比，bP<0.05；与组内前一时相点比较，cP<0.05。
实施例5外用生肤油促进糖尿病足溃疡创面皮肤再生，加快创面修复
外用生肤油(采用专利号为ZL201210426168.X的中国专利、授权公告号为CN102895526 B的授权公告文本中实施例1制备的生肤油1，以下直接称生肤油1)促进糖尿病足溃疡创面皮肤再生，加快创面修复。
动物：受试SPF级Wistar雄性大鼠25只(由湖北省疾病预防控制中心提供)，体质量150-180g，自由饮水饮食，饲养间室温保持在25±1℃，明暗周期为12小时。
1.糖尿病足溃疡模型制备及给药
按照实施例1所描述的方法一样进行分组并建立糖尿病模型。腹腔注射30mg/kg链脲佐菌素(STZ)诱导后第9周，采用沸腾的水蒸汽于每只大鼠足底行5秒烫伤(面积为37mm2)，烫伤即刻(第0天)至第35天给予相应药物处理。将糖尿病组大鼠随机均分为4组：无治疗组、二甲双胍组、外用生肤油组、外用生肤油+二甲双胍组，并分组给药。二甲双胍片以蒸馏水为媒介溶解，灌胃剂量200mg/kg；外用生肤油在创面涂抹剂量为0.15ml/cm2；其它组以等量生理盐水灌胃、等量麻油涂抹为对照，所有组1次/天，连续35天。
2.大鼠足底创面组织病理学观察
足溃疡实验中所有大鼠在伤后第35天被麻醉处死。取各组大鼠足底创面处同等面积皮肤组织置于10％甲醛中固定24h，随后依次实施蒸馏水漂洗、梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片(厚度为4μm)。部分切片HE染色后，采用Nikon eclipse50i正置显微镜(20倍物镜)观察切片组织病理学变化。
3.实验结果
伤后第35天大鼠足部皮肤组织HE染色如图5。与对照组相同，外用生肤油组及外用生肤油+二甲双胍组的大鼠足部创面皮肤组织结构较为完整，创缘处胶原纤维排列较整齐，创面组织的炎性细胞浸润明显降低；与无药物治疗的糖尿病大鼠类似，二甲双胍治疗组的大鼠足部创面皮肤真皮层可见大量炎性细胞浸润。
实施例6外用生肤油下调糖尿病大鼠足溃疡的创面皮肤组织中COX-2的表达
基于目前很多中药复方制剂因防治糖尿病足溃疡的药理学机制不明，使其无法在临床上推广应用的现状，本发明对外用生肤油防治糖尿病足溃疡的机制进行了研究。目前糖尿病足溃疡创面难愈机制尚未完全阐明，但其主要的病理机制涉及创面局部微血管形成及功能障碍以及创面持续慢性炎症等(Evidengce for associated cutaneousmicroangiopathy in diabetic patients with neuropathic footulceration.Diabetes Care.2003,26:960–961)。有报道指出COX-2作为炎性因子参与了创面皮肤早期的修复过程(Futaqami A,Ishizaki M,Fukuda Y,et al.Wound healinginvolves induction of cyclooxygenase-2 expression in rat skin.LabInvest.2002,82:1503–1513)，但有关COX-2与糖尿病相关的慢性溃疡愈合的文献缺乏。因此，本实施例研究了外用生肤油(采用专利号为ZL201210426168.X的中国专利、授权公告号为CN 102895526 B的授权公告文本中实施例1制备的生肤油1，以下直接称生肤油1)对糖尿病大鼠足溃疡创面组织中COX-2过表达的抑制影响。
动物：受试SPF级Wistar雄性大鼠25只(由湖北省疾病预防控制中心提供)，体质量150-180g，自由饮水饮食，饲养间室温保持在25±1℃，明暗周期为12小时。
1.糖尿病足溃疡模型制备及给药
按照实施例1所描述的方法一样进行分组并建立糖尿病模型。腹腔注射30mg/kg链脲佐菌素(STZ)诱导后第9周，采用沸腾的水蒸汽于每只大鼠足底行5秒烫伤(面积为37mm2)，烫伤即刻(第0天)至第35天给予相应药物处理。将糖尿病组大鼠随机均分为4组：无治疗组、二甲双胍组、外用生肤油组、外用生肤油+二甲双胍组，并分组给药。二甲双胍片以蒸馏水为媒介溶解，灌胃剂量200mg/kg；外用生肤油在创面涂抹剂量为0.15ml/cm2；其它组以等量生理盐水灌胃、等量麻油涂抹为对照，所有组1次/天，连续35天。
2.糖尿病足溃疡大鼠足底皮肤COX-2蛋白免疫组织化学染色及定量
足溃疡实验中所有大鼠在伤后第35天被麻醉处死。取各组大鼠足底创面处同等面积皮肤组织置于10％甲醛中固定24h，随后依次实施蒸馏水漂洗、梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片(厚度为4μm)。应用COX-2多克隆抗体进行免疫组织化学染色，于切片上滴加COX-2一抗，4℃孵育过夜，PBS漂洗后用辣根过氧化物酶标记的二抗37℃孵育30min，DAB显色，苏木精复染后封片。采用NuanceTM Fx多光谱显微成像系统提取病理图片中DAB着色部分进行相应蛋白表达的定量分析。
3.实验结果
创面组织中蛋白的免疫组织化学染色以及多光谱定量的结果见图6。伤后第35天，与对照组(100.0±14.2％)相比，糖尿病大鼠足溃疡皮肤组织中COX-2蛋白表达水平显著性过表达(222.6±51.6％)。给予外用生肤油治疗后，足溃疡皮肤组织中COX-2表达均明显下调(91.5±17.0％、108.8±7.0％)，而给予二甲双胍单独治疗(136.8±10.0％)对糖尿病足溃疡皮肤组织中COX-2表达的诱导无明显影响。
实施例7外用生肤油下调糖尿病大鼠足溃疡的创面皮肤组织中VEGF的表达
血管内皮细胞是创面愈合中主要的修复细胞之一(Angiogenicfactors.Science,1987,235:442–447)，而内源性生长因子VEGF，能够对血管内皮细胞产生强烈趋化作用和促分化作用，使其增殖、迁移，从而促进新生血管的形成，加速创面愈合(Effect of recombinant adeno-associated virus vector-mediated vascularendothelial growth factor gene transfer on wound healing after burninjury.Crit Care Med.2003,31:1017–1025)。因此，本实施例研究了外用生肤油(采用专利号为ZL201210426168.X的中国专利、授权公告号为CN 102895526 B的授权公告文本中实施例1制备的生肤油1，以下直接称生肤油1)对糖尿病大鼠足溃疡创面组织中VEGF低表达的上调影响。
动物：受试SPF级Wistar雄性大鼠25只(由湖北省疾病预防控制中心提供)，体质量150-180g，自由饮水饮食，饲养间室温保持在25±1℃，明暗周期为12小时。
1.糖尿病足溃疡模型制备及给药
按照实施例1所描述的方法一样进行分组并建立糖尿病模型。腹腔注射30mg/kg链脲佐菌素(STZ)诱导后第9周，采用沸腾的水蒸汽于每只大鼠足底行5秒烫伤(面积为37mm2)，烫伤即刻(第0天)至第35天给予相应药物处理。将糖尿病组大鼠随机均分为4组：无治疗组、二甲双胍组、外用生肤油组、外用生肤油+二甲双胍组，并分组给药。二甲双胍片以蒸馏水为媒介溶解，灌胃剂量200mg/kg；外用生肤油在创面涂抹剂量为0.15ml/cm2；其它组以等量生理盐水灌胃、等量麻油涂抹为对照，所有组1次/天，连续35天。
2.糖尿病足溃疡大鼠足底皮肤VEGF蛋白免疫组织化学染色及定量
足溃疡实验中所有大鼠在伤后第35天被麻醉处死。取各组大鼠足底创面处同等面积皮肤组织置于10％甲醛中固定24小时，随后依次实施蒸馏水漂洗、梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片(厚度为4μm)。部分切片应用VEGF多克隆抗体进行免疫组织化学染色，于切片上滴加VEGF一抗，4℃孵育过夜，PBS漂洗后用辣根过氧化物酶标记的二抗37℃孵育30分钟，DAB显色，苏木精复染后封片。采用NuanceTM Fx多光谱显微成像系统提取病理图片中DAB着色部分进行相应蛋白表达的定量分析。
3.实验结果
创面组织中VEGF蛋白的免疫组织化学染色以及其蛋白表达水平的多光谱定量的结果见图7。伤后第35天，与对照组(100.0±11.3％)相比，糖尿病大鼠足溃疡皮肤组织中VEGF蛋白表达水平显著性表达下降(54.7±5.5％)。给予外用生肤油治疗的糖尿病大鼠足溃疡皮肤组织中血管内皮生长因子VEGF明显上调(142.8±5.9％、119.8±5.9％)，而给予二甲双胍单独治疗对糖尿病足溃疡皮肤组织中VEGF表达水平无显著性影响(94.2±17.9％)。
实施例8外用生肤油体外抑制的革兰氏阳性、阴性菌的生长
创面久治不愈的原因除了疾病本身因素外，往往与其反复细菌感染、炎症反应加重有关。有效控制感染、抑制创面细菌滋生是促进创面修复的一个重要环节(Woundhealing and its impairment in the diabetic foot.Lancet,2005,366:1736–1743)。因此，本实施例研究了外用生肤油(采用专利号为ZL201210426168.X的中国专利、授权公告号为CN 102895526 B的授权公告文本中实施例3制备的生肤油3或实施例5制备的生肤油5，以下直接称生肤油3或生肤油5)对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)和大肠杆菌(革兰氏阴性菌)生长的抑制作用。
1.金黄色葡萄球菌、大肠杆菌悬液制备
用液体培养基分别复苏由中国典型培养物保藏中心提供的金黄色葡萄球菌(ATCC25923，革兰氏阳性菌)和大肠杆菌(ATCC25922，革兰氏阴性菌)后培养，取培养至对数期细菌配成1.5×108个/毫升菌液，于15min内使用。液体培养基配比如下：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，双蒸水至1000mL，调pH至7.0～7.2，121℃灭菌20min后使用。
2.抑菌活力测定：采用平板滤纸片法，滤纸片直径5.0mm，灭菌干燥后备用。固体培养基配比如下：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂20.0g，双蒸水至1000mL，调pH至7.0～7.2，121℃灭菌20min后使用。每个直径90mm培养皿加入25mL固体培养基制成平板备用。取500μl细菌悬液涂于平板上。将滤纸片加20μl低(以麻油为溶媒稀释为原浓度的5％)、中(以麻油为溶媒稀释为原浓度的10％)、高(以麻油为溶媒稀释为原浓度的20％)剂量外用生肤油(生肤油3或生肤油5各平行试验3次)药物，以麻油为对照药，以头孢拉定(8mg/mL)为阳性对照药，用无菌镊子取含药滤片贴放于平板表面。各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。37℃培养24h后测量记录抑菌环直径。
3.实验结果
结果表明，低、中、高剂量的外用生肤油均对革兰氏阳性菌、阴性菌抑菌环直径均大于7mm，均表现出抑菌作用，以生肤油3的实验结果为例，见表2。
表2.生肤油3对革兰氏阳性、阴性菌生长的抑菌环大小。
注：与对照麻油组比较，*P<0.05，**P<0.01。

Claims (4)

1.外用生肤油在制备预防或治疗糖尿病性末梢循环障碍的药物中的应用，所述外用生肤油由以下重量份配比的原料制备而成：黄芩15-25重量份，大黄15～25重量份，黄芪15～25重量份，黄连15～25重量份，黄柏15～25重量份，当归10～15重量份，地榆10～15重量份，紫草10～15重量份，地黄6～10重量份，白芷6～10重量份，白薇6～10重量份，白芨6～10重量份，乳香10～15重量份，没药10～15重量份，冰片3～8重量份，麻油800-1000重量份；所述的外用生肤油的制备方法，其步骤如下：将麻油置入容器中，然后加入黄芩、大黄、 黄芪、黄连、黄柏、当归、地榆、紫草、地黄、白芷、白薇、白芨各药材粉末，搅拌均匀；浸泡3-10日后，搅拌加热，保持油温为55-65℃，1-2小时后离火，过滤去渣后，加入乳香和没药粉末，55-65℃搅拌5-30分钟，离火，过滤去渣，待油温降至30-40℃时，加入冰片，充分搅匀，冷却至室温，瓶装后密闭储存。
2.外用生肤油在制备预防或治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用；所述外用生肤油为权利要求1中所述的外用生肤油。
3.外用生肤油联合二甲双胍在制备预防或治疗糖尿病性末梢循环障碍的药物中的应用；所述外用生肤油为权利要求1中所述的外用生肤油。
4.外用生肤油联合二甲双胍在制备预防或治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用；所述外用生肤油为权利要求1中所述的外用生肤油。
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