ES2322985T3 - Formulaciones que comprenden ingredientes activos atrapados y sus usos. - Google Patents
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Abstract
Una formulación inyectable que comprende un ingrediente activo atrapado, que comprende un azúcar aminado como ingrediente activo para el tratamiento intraarticular de una enfermedad o estado en animales o humanos.
Description
Formulaciones que comprenden ingredientes
activos atrapados y sus usos.
Esta invención está relacionada en general con
el campo de las formulaciones que comprenden ingredientes activos
atrapados, tales como azúcares aminados, y de sus usos y más
específicamente con las formulaciones intraarticulares inyectables
que contienen N-acetil glucosamina.
La osteoartritis (OA) es un trastorno común de
las articulaciones con un impacto social significativo (Lawrence
et al, (1998) Arthritis Rheum. 41:778; Gabriel et
al., (1997) J. Rheumatol. 24:719; March et al.;
(1997) Baillieres Clin. Rheumatol. 11:817). Los tipos de
medicamentos utilizados para el tratamiento de la OA incluyen
acetaminofenos, fármacos antiinflamatorios no esteroides (NSAIDS),
corticosteroides intraarticulares inyectables y ácido hialurónico.
Estos fármacos proporcionan principalmente alivio del dolor, pero no
se ha demostrado todavía que consigan una remisión verdadera de la
enfermedad, mediante la ralentización o la detención de la
progresión de la enfermedad (Altman et al., (1998)
Osteoarthritis Cartilage 6 Suppl. A:22; Hochberg et
al. ; (1995) Arthritis Rheum. 38:1535; Hochberg et
al,; (1995) Arthritis Rheum. 38:1541).
Muchos tipos de artritis se tratan inicialmente
con NSAIDS, algunas veces junto con otros analgésicos. Cuando la
enfermedad no se controla adecuadamente con estos agentes, pueden
utilizarse fármacos antireumáticos que modifican la enfermedad (que
inducen la remisión), tales como las sales de oro,
D-penicilamina, agentes
anti-malaria, y agentes citotóxicos. En última
instancia, pueden administrarse glucocorticoides, por vía sistémica
o intraarticular. Sin embargo, ninguno de estos fármacos resulta
significativamente eficaz para lograr la remisión verdadera de la
enfermedad en la mayoría de los pacientes.
Bohne describió el uso de la glucosamina (GA)
para tratar OA (Bohne (1969) Med. Welt 30:1668). Desde
entonces, la GA ha ganado popularidad, y ahora se emplea comúnmente
para tratar a los pacientes con OA. Se considera que las sales de
GA (sulfato y cloruro) tienen propiedades condroprotectoras o que
modifican la enfermedad (Altman et al., (1998)
Osteoarthritis Cartilage 6 Suppl. A:22 ; Lozada et
al., (1997) Bull. Rheum. Dis. 46:5; Mevorach et
al., (1994) Isr. J. Med Sci. 30:928), y se propusieron
originariamente para promover la reparación del cartílago dañado.
Diversos estudios han demostrado que el cartílago de pacientes con
OA se caracteriza por una regeneración acelerada de los componentes
de la matriz del cartílago y por una reparación inadecuada (Inerot
et al., (1978) Biochem. J. 169:143; Dieppe et
al., (1995) Acta Orthop. Scand. (Suppl.266) 66:1). Se ha
demostrado que la GA proporciona actividad antiinflamatoria por
varios mecanismos distintos. Por ejemplo, se demostró que la GA
proporciona una actividad antiinflamatoria al inducir el incremento
de la síntesis de glicosaminoglicano.
El incremento de la síntesis de
glicosaminoglicano inducido por GA representa un proceso metabólico
complejo, con varios mecanismos intermedios potenciales, como
introducir GA directamente en la ruta de la hexosamina e impedir el
control de la retroalimentación negativa de la
uridin-difosfato-n-acetil-\beta-D-glucosamina
(Kornferld et al., (1964) Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 52:371) e incrementar la producción del TGF\alpha1
(Kolm-Litty et al., (1998) J. Clin.
Invest. (101:160). Recientemente, se ha descrito un nuevo
mecanismo de condroprotección mediado por GA, que implica la
inhibición de la actividad agrecanasa en explantos de cartílago
bovino y en células de condrosarcoma de rata (Sandy et al.,
(1998) Biochem. J. 335 (Pt 1):59) mediante la supresión de
las proteínas unidas al glucosil fosfatidil inositol (Sandy et
al., (1999) Arch. Biochem. Biophys. 367:258).
La GA puede inhibir episodios de fosforilación
en la cascada de señalización de la
interleuquina-1\beta
(IL-1\beta), proporcionando actividad
antiinflamatoria. Se demostró que uno de los productos finales de
la ruta de la hexosamina, la
UDP-N-acetil-\beta-D-glucosamina,
participa en el proceso dinámico de la
O-glicosilación de proteínas, que utiliza restos de
serina y treonina como sitios de anclaje. (Haltiwanger et
al., (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 231:237).
Potencialmente, la O-glicosilación de restos de
serina puede competir con la fosforilación de los mismos restos,
dando como resultado la alteración de las cascadas de transducción
de señales intracelulares. (Chou et al., (1995) Proc.
Natl. Acad. Sci. EEUU 92:4417).
Se sabe que la IL-1\beta
induce la producción de óxido nítrico (NO) en cultivos de
condrocitos articulares humanos (Geng et al., (1995) J.
Cell. Physiol. 163:545). La inducción mediada por
IL-1\beta de determinados mediadores de la
inflamación, que incluyen el NO, la enzima
ciclo-oxigenasa-2
(COX-2) y la interleuquina-6
(IL-6), está asociada con la translocación de los
dímeros del factor nuclear de transcripción \kappaB
(NF-\kappaB) del citoplasma al núcleo, donde se
unen a genes diana y regulan su transcripción. (Chu et al.,
(1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 248:871; Newton et
al., (1997) FEBS Lett. 418:135 ; Parikh et al.,
(1997) J: Sur. Res. 69:139). El proceso de activación de
NF-\kappaB depende de la fosforilación de dos
serinas (Ser-32 y Ser-36) en la
proteína inhibidora de \kappaB\alpha (I\kappaB\alpha) en el
dominio regulador N-terminal de la proteína
inhibidora de \kappaB\beta (I\kappaB\beta) (Karin (1999)
J. Biol. Chem. 274:27339).
Los mecanismos antiinflamatorios, además del
incremento de la síntesis de glicosaminoglicano inducido por GA,
pueden contribuir también a las actividades
anti-artríticas de la GA. La GA mostró actividad
antiinflamatoria y protegió a las ratas contra el edema en las
patas inducido por bradiquinina, serotonina e histamina (Setnikar
et al., (1991) Arzneim-Forsch./Drug
Res. 41:157). La GA también protegió a los animales contra
serositis inducida por carragenina, contra peritonitis de rata
inducida por formalina y contra peritonitis de ratón inducida por
ácido acético (Setnikar et al., (1991)
Arzneim-Forsch./Drug Res. 41:157). La GA no
suprimió a la ciclooxigenasa o a las enzimas proteolíticas en la
pata inflamada de rata, pero suprimió la generación de superóxido y
las actividades de las enzimas lisosomales en el hígado de rata
(Setnikar et al., (1991)
Arzneim-Forsch./Drug Res. 41:157).
La GA administrada oralmente también expresa una
actividad antiinflamatoria en artritis de rata inducida por caolín
o coadyuvantes (Setnikar et al., (1991)
Arzneim-Forsch./Drug Res. 41:542). Sin
embargo, las actividades anti-exudativa y
anti-inflamatoria de la GA fueron más bajas cuando
se administraron oralmente, si se comparan con las actividades
correspondientes del ácido acetilsalicílico o de la indometacina
administrados oralmente.
Varias patentes están relacionadas con el uso de
GA y N-acetil glucosamina (GlcNAc) en el tratamiento
de condiciones artríticas específicas. La patente de EE.UU. Nº
3.683.076 (Rovati) describe el uso de sales de GA para el
tratamiento de OA y de artritis reumatoide; la patente de EE.UU. Nº
4.870.061 (Speck) describe el uso de GlcNAc para tratar
enfermedades articulares degenerativas por administración por vía
bucal; la patente de EE.UU Nº 5.840.715 y la patente de EE.UU. Nº
6.136.795 (ambas de Florio) describen el uso del sulfato de GlcNAc
como complemento nutricional en un régimen dietético para
proporcionar alivio contra la artritis.
Adicionalmente, la patente de EE.UU. 4.801.619
(Lindblad) describe una preparación de ácido hialurónico para
administración intraarticular en el tratamiento de artropatía
esteroidea y degeneración progresiva de cartílago causada por la
degradación de proteoglicano.
La presente invención se refiere a una
formulación inyectable según las reivindicaciones 1,9 y 12, un uso
de una cantidad eficaz terapéuticamente de un azúcar aminado
atrapado según las reivindicaciones 13 y 17, y un uso de una
cantidad eficaz terapéuticamente de N-acetil
glucosamina según la reivindicación 20.
En particular, la invención se refiere a las
propiedades antiinflamatorias y condroprotectoras de la glucosamina
(GA) y de la N-acetil glucosamina (GlcNAc). Según
esta realización, GA y GlcNAc muestran sus propiedades
antiinflamatorias y condroprotectoras al interferir con la expresión
génica inducible por citoquinas en los condrocitos.
En un aspecto particular de la presente
invención, las formulaciones de GlcNAc mostraron sorprendentemente
efectos analgésicos inesperados en mamíferos. Las propiedades
analgésicas de las formulaciones de la invención las hacen útiles
para tratar, por ejemplo, la osteoartritis (OA) o la artritis
reumatoide (RA) en un paciente que necesite ese tratamiento.
En una realización del método, la invención
proporciona un método que incluye administrar al paciente una
composición que contiene una cantidad eficaz terapéuticamente de
GlcNAc, sola o en combinación con un fármaco antiinflamatorio o con
un inhibidor de hexoaminidasa. Los métodos adecuados para
administrar las formulaciones de la presente invención incluyen,
pero no se limitan a, métodos intraarticulares, tópicos o
intramusculares. En un aspecto en el que las formulaciones se
inyectan intraarticularmente, el encapsulado o el atrapado de
GlcNAc (como en liposomas) modifica favorablemente la disponibilidad
y el perfil farmacodinámico de la GlcNAc inyectada de forma
intraarticular.
La Figura 1 muestra la liberación en función del
tiempo de [^{3}H]GlcNAc atrapada en distintas formulaciones
liposómicas según una realización de la presente invención.
La Figura 2 ilustra la liberación en función del
tiempo de [^{3}H] atrapado en distintas formulaciones liposómicas
al fluido sinovial de tres pacientes con artritis reumatoide
(RA).
La Figura 3 ilustra la liberación en función
del tiempo de [^{3}H]GlcNAc atrapada en distintas
formulaciones liposómicas al fluido sinovial de tres pacientes con
osteoartritis (OA).
La Figura 4 ilustra la retención en función del
tiempo de GlcNAc en articulaciones de rodilla de rata después de una
administración intraarticular única de GlcNAc en una disolución
salina normal (control) comparada con una administración
intraarticular única y GlcNAc atrapada en una formulación liposomal
que comprende DSPC/Chol.
La Figura 5 ilustra la retención en función del
tiempo de GlcNAc en articulaciones de rodilla de rata después de una
administración intraarticular única de GlcNAc atrapada en una
formulación liposomal que comprende DSPC/Chol/
DSPE.
DSPE.
La Figura 6 ilustra una respuesta al dolor
(basada en las puntuaciones de dolor que se definen en la presente
memoria) de las ratas en función de la bradiquinina administrada
por vía intraarticular.
\newpage
La Figura 7 ilustra un efecto analgésico de la
GlcNAc cuando se administra intraarticularmente (IA) en una
formulación liposomal que comprende DSPE comparado con la GlcNAc en
una disolución salina y con una disolución salina.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la presente invención y su
utilización en la presente memoria, se definen los siguientes
términos y abreviaturas con los siguientes significados, a menos que
se indique explícitamente lo contrario. Estas explicaciones se
proponen solamente a modo de ejemplo. No están destinadas a limitar
los términos que están descritos o a los que se hace referencia en
toda la memoria. Estas explicaciones están más bien destinadas a
incluir algunos aspectos y/o ejemplos adicionales de los términos
que se describen y se reivindican en la presente memoria.
\global\parskip0.900000\baselineskip
En la presente memoria se utilizan las
siguientes abreviaturas:
Chol = colesterol;
DMEM = Medio Eagle modificado de Dulbecco;
DSPC = diestearoil
L-\alpha-fosfatidilcolina;
DSPE = diestearoil
L-\alpha-fosfatidil-etanolamina;
DSPE-Con= diestearoil
L-\alpha-fosfatidil-etanolamina
conjugada con polietilenglicol
DSPG = diestearoil
L-\alpha-fosfatidil-DL-glicerol;
DPPS = dipalmitoil
L-\alpha-fosfatidil-L-serina;
ERK = quinasa regulada por señales
extracelulares;
GA = glucosamina;
GAGs = glicosaminoglicanos;
GlcNAc =
N-acetilglucosamina;
HA = ácido hialurónico;
IL-1\beta =
interleuquina-1\beta;
IL-6 =
interleuquina-6;
iNOS = sintasa de óxido nítrico inducible;
MAP = proteína activada por mitógeno;
MHA = agar de
Mueller-Hinton;
MLV = vesícula multilamelar
NSAID = fármaco
anti-inflamatorio no esteroideo;
OA = osteoartritis;
PBS = disolución salina tamponada con
fosfato
PEG = polietilenglicol;
PMSF = fluoruro de fenilmetilsulfonilo;
RA = artritis reumatoide
SUV = vesícula unilamelar pequeña
TFA = ácido trifluoroacético; y
TNF\alpha = factor de necrosis tumoral.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El término "ingrediente activo" se refiere
a una cantidad eficaz terapéuticamente de un fármaco o de su
formulación. Los ingredientes activos preferidos de la presente
invención son los azúcares aminados, tales como GlcNAc y GA.
El término "gel de alginato" se refiere a
polímeros de polisacáridos naturales que comprenden restos de ácido
\beta-D-manurónico y de ácido
\alpha-L-gulurónico con enlaces
1,4 en proporciones variables. El alginato es capaz de formar geles
estables, especialmente en presencia de determinados cationes
divalentes, tales como calcio, bario y estroncio.
El término "azúcar aminado" se refiere a
cualquier azúcar natural o sintético en el que uno o más átomos de
carbono están substituidos por un grupo amino (-NH_{2}) en lugar
de por un grupo hidroxilo (-OH). Esta substitución puede ocurrir
sin tener en cuenta la orientación o configuración de los carbonos
asimétricos que están presentes en el azúcar. A menos que se
indique lo contrario, el término "azúcar aminado" se refiere a
cualquier anómero (\alpha o \beta) de un azúcar aminado cíclico.
Los azúcares aminados pueden estar N-acilados, en
los que un átomo de hidrogeno de un grupo amino se substituye por un
resto acilo (-COR donde R= alquilo inferior). Según una realización
preferida de la invención, R= metilo (-CH_{3}).
El término "artritis" se refiere a
cualquier enfermedad específica caracterizada por la inflamación de
las articulaciones, aunque la etiología de la inflamación puede
diferir en las diferentes afecciones. Las enfermedades artríticas
relativamente comunes incluyen artritis reumatoide, artritis
juvenil, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica y
osteoartritis. También se las denomina "enfermedades articulares
degenerativas".
Los términos "cartílago articular" o
"cartílago" se refieren a una sustancia que cubre los extremos
de los huesos y que forma las superficies de las articulaciones. El
cartílago puede soportar las fuerzas de compresión y crea una
superficie de fricción baja para que una articulación se deslice. El
cartílago articular comprende las células denominadas condrocitos y
una matriz que comprende proteínas y azúcares aminados.
El término "degradación del cartílago" se
refiere a la degradación de los tejidos que comprenden el cartílago.
Esta degradación es característica de la artritis.
El término "quitina" se refiere a (poli)
GlcNA con enlaces \beta-1,4. La quitina se
encuentra por toda la naturaleza, por ejemplo en los exoesqueletos
de insectos y crustáceos.
El término "quitosano" se refiere a quitina
desacilada, o (poli) N-glucosamina con enlaces
\beta-1,4.
El término "condrocito" se refiere a las
células que se encuentran en el cartílago articular. Los condrocitos
producen colágeno, una proteína gelatinosa, y proteoglicanos, que
son glicanos de glucosamina unidos a proteínas (también denominados
mucopolisacáridos).
El término "conjugado" se refiere a la
combinación de dos o más moléculas distintas que están unidas
químicamente. Un ejemplo de un conjugado en la presente invención
es el "DSPE-Con", donde DSPE corresponde a
diestearoil-fosfatidil-etanolamina
conjugada con polietilenglicol, en este caso por medio de un enlace
éster. Otros enlaces característicos de los conjugados según la
presente invención incluyen, pero no están limitados a, amidas,
acetales, tioacetales, ésteres y tioésteres, o cualquier otro
enlace formado principalmente al tratar un componente carbonilo
reactivo con un nucleófilo.
Los términos "COX-1" y
"COX-2" se refieren a dos enzimas
ciclo-oxigenasas relacionadas estructuralmente, pero
distintas funcionalmente. La COX-1 tiene una
función homeostática y su inhibición es indeseable. La
COX-2 es una enzima inducible cuya presencia aumenta
en respuesta a la inflamación.
El término "eficacia de encapsulado" se
refiere a la cantidad de un compuesto o de un ingrediente activo
incluido, incorporado, cargado, asociado, unido o atrapado de otro
modo en liposomas, microesferas, nanopartículas, o similares. En
general, el "rendimiento" se expresa como porcentaje de
encapsulado del ingrediente activo.
El término "atrapado" o "encapsulado"
se refiere a cualquier método de formulación de un ingrediente
activo, que confina, secuestra, o inhibe de otro modo la disolución
libre de un ingrediente activo en una disolución o en una fase
sólida. Los ejemplos preferidos de atrapado o encapsulado de
ingredientes activos incluyen, pero no están limitados a
formulación en liposomas, microesferas, o nanopartículas, por
ejemplo, nanopartículas lípido-sólido.
El término "glicosaminoglicano" se refiere
a moléculas largas de heteropolisacáridos que contienen unidades de
disacáridos repetidas. Las unidades de disacáridos pueden comprender
dos azúcares aminados modificados: N-acetil
galactosamina o GlcNAc y un ácido urónico como glucuronato o
iduronato. Entre otras funciones los GAGs sirven como un fluido
lubricante en las articulaciones. Los GAGs específicos de
significación fisiológica son el ácido hialurónico, el sulfato de
dermatano, el sulfato de condroitín, la heparina, el sulfato de
heparina, y el sulfato de queratan.
El término "hexosamina" se refiere a
cualquier azúcar aminado de un polihidroxi alcohol de seis carbonos
que contiene ya sea un grupo aldehído o un grupo cetona. El término
hexosamina comprende aldosas, desoxialdosas y cetosas, sin tener
en cuenta la orientación o la configuración de los enlaces de los
carbonos asimétricos. Los azúcares aminados preferidos son las 2-,
3-, 5-, o 6-desoxicetosas, preferiblemente
desoxiamino azúcares tales como, por ejemplo, GA, manosamina y
galactosamina. Mas preferentemente, los azúcares aminados están
N-acilados y se seleccionan entre desoxiacilamino
azúcares, tales como, por ejemplo GlcNAc, N-acetil
manosamina, y N-acetil galactosamina.
El término "hexosaminidasa" se refiere a
cualquier enzima glicosidasa que hidroliza total o parcialmente la
quitina o el quitosano en sus unidades estructurales de los
monosacáridos correspondientes, por ejemplo, GlcNAc y GA. Como
ejemplo de estas enzimas se incluye
beta-D-glucosamidinasa tipo exo,
beta-N-acetilhexoamidinasa,
quitosanasa, quitinasa, lisozima, etc.
El término "ácido hialurónico" se refiere
a un mucopolisacárido natural que comprende subunidades alternantes
de ácido glucurónico y de glucosamina. El ácido hialurónico es un
polisacárido lineal (polímero biológico de cadena larga) formado
por unidades repetidas de disacáridos que consisten en ácido
D-glucurónico y
N-acetil-D-glucosamina
unidos por enlaces glicosídicos \beta (1-3) y
\beta (1-4). El ácido hialurónico esta disponible
comercialmente en varios intervalos de peso molecular en un
intervalo que va de aproximadamente 50.000 Daltons a aproximadamente
8 x 10^{6} Daltons. El ácido hialurónico esta también disponible
como sal de sodio y es una sustancia seca, altamente purificada. El
hialuronato de sodio puede conservarse con una variedad de
conservantes conocidos en la técnica, que incluyen, pero no están
limitados a, ésteres de ácido benzoico substituidos con un alquilo,
alcoholes, conjugados, combinaciones o sus mezclas.
El término "hialuronano" se refiere a un
polímero de moléculas repetidas de N-acetil
glucosamina y de ácido glucurónico.
El término "IL-1\beta" se
refiere a la interleuquina-1\beta, un
inmunomodulador intermediario en una amplia gama de respuestas
inmunes e inflamatorias, que incluyen la activación de las células B
y T.
El término "IL-6" se
refiere a la interleuquina-6, una citoquina
multifuncional que se produce en una gran variedad de células. La
IL-6 funciona como reguladora de la respuesta
inmune, de las reacciones de fase aguda y de la hematopoyesis.
El término "iminociclitol" se refiere a una
imina análoga de un azúcar y es un inhibidor de la
hexosamidinasa.
El término "artropatía inflamatoria" se
refiere a todo el repertorio de enfermedades debilitantes y
dolorosas y al que veces se hace referencia simplemente como
enfermedad reumática. De las diversas formas de artropatía
inflamatoria, la osteoartritis (a la que también se hace referencia
como osteoartrósis) y la artritis reumatoide son las más comunes.
Otras formas reconocidas de artropatía inflamatoria incluyen
espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, seudogota,
Síndrome de Reiter o artritis secundaria a enfermedades del tejido
conectivo.
El término "formulación inyectable" se
refiere a las composiciones inyectables estériles preparadas como
una disolución líquida o una suspensión. Pueden prepararse también
las formas sólidas adecuadas para la disolución, o la suspensión,
en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también
puede estar emulsionada o el ingrediente activo atrapado. Una
formulación inyectable puede comprender también una variedad de
conservantes conocidos en la técnica, que incluyen, pero no están
limitados a, ésteres del ácido benzoico substituidos con alquilo,
alcoholes, conjugados, combinaciones o sus mezclas.
El término "intraarticular" se refiere al
un método de administrar un fármaco directamente a una articulación.
Las vías tradicionales de administración de fármacos, como por
ejemplo, la administración oral, intravenosa o intramuscular,
dependen de la perfusión vascular de la sinovia para llevar el
fármaco a la articulación. Esto es ineficaz porque la transferencia
transsinovial de moléculas pequeñas desde los capilares sinoviales
al espacio articular tiene lugar generalmente por difusión pasiva,
que resulta menos eficaz a medida que se aumenta el tamaño de la
molécula diana. Por lo tanto, el acceso de las moléculas dirigidas,
por ejemplo GA, al espacio articular se restringe sustancialmente.
La inyección intraarticular de fármacos evita estas
limitaciones.
El término "liposoma" se refiere a
vesículas que se forman espontáneamente cuando, por ejemplo, los
fosfolípidos se dispersan en agua o en un medio acuoso, y como
resultado de la interacción hidrófila de grupos de cabezas de
lípidos con agua y creación de sistemas uni-y
multilamelares (vesículas) que asemejan membranas biológicas. En un
liposoma unilamelar, una estructura de doble capa toma una forma
esférica hueca con los lados polares orientados hacia un
compartimento de agua interno y hacia la masa de agua externa. Se
conocen diversos métodos aceptables de formación de liposomas en la
técnica. En general, las vesículas de doble capa concéntrica
multilamelares se forman con capas de agua que separan dos capas de
lípidos. Esta estructura de tipo cebolla se conoce como vesícula
multilamelar (MLV). Se pueden formar vesículas unilamelares mas
pequeñas (SUVs) por sonicación o por extrusión de MLVs en
condiciones adecuadas. Los liposomas pueden formularse con Chol para
añadir estabilidad y pueden incluir otros materiales, tales como
lípidos neutros, y modificadores de superficie, tales como
compuestos cargados positiva o negativamente. Los liposomas
preferidos son las cápsulas esféricas pequeñas unilamelares de
doble capa. Los liposomas pueden encapsular fármacos tanto lipófilos
como hidrófilos. Cuando se preparan con métodos adecuados, pueden
liberar un fármaco de forma prolongada. Además, no hay toxicidad
asociada a fosfolípidos. Diversos fosfolípidos naturales y
sintéticos están disponibles comercialmente para la preparación de
liposomas. Algunos ejemplos, no limitantes, conocidos en la técnica
y descritos por sus acrónimos incluyen, DSPC, DSPE,
DSPE-Con, DSPG y DPPS.
\newpage
El término "microesfera" se refiere a un
vehículo polimérico utilizado para atrapar o para encapsular los
ingredientes activos de la invención. Las formulaciones basadas en
microesferas permiten que la dosificación y la regulación del
fármaco se adapten según las necesidades, mediante la elección y la
formulación de diversas combinaciones de ingrediente
activo/polímero. La dosis total del medicamento y la cinética de
liberación son variables que pueden ser ajustadas. Por ejemplo,
variando la proporción del copolímero y el peso molecular del
copolímero, se pueden optimizar los parámetros de liberación del
fármaco. Los sistemas basados en micro esferas pueden aumentar
también la vida útil de los ingredientes activos. El uso de
microesferas que comprenden copolímeros
láctido-glicólido en sus formulaciones ofrece
ciertas ventajas tales como biocompatibilidad y biodegradabilidad.
La micro esferas pueden prepararse por ejemplo, por procesado,
mecanizado, molido, triturado o extruido según procedimientos
conocidos en la técnica.
El término "porcentaje de fármaco
encapsulado" se refiere a la relación entre (1) la cantidad de
ingrediente activo que va a ser encapsulado en la formulación final
del liposoma y (2) la cantidad total de ingrediente activo que va a
ser encapsulado, utilizado en el proceso de preparación de la
formulación previa al encapsulado, esta proporción se multiplica por
100.
Los términos "farmacéuticamente aceptable"
o "farmacológicamente aceptable" se refieren a formulaciones
que no producen una reacción adversa, alérgica o perjudicial cuando
se administran a un mamífero adecuadamente, (por ejemplo por un
medico o un veterinario).
El término "vehículo polimérico" se refiere
al ácido hialurónico, polietilenglicol, copolímeros de
polietilenglicol y de poli (ácido láctico/ácido glicólico),
copolímeros de poli (etilenglicol-\gamma-(DL-ácido
láctico-co-ácido glicólico), geles de alginato,
quitosanos, o a sus sales farmacéuticamente aceptables.
Los términos "polietilenglicol" y PEG se
refieren a un polímetro hidrosoluble que comprende subunidades
OH-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}H. El PEG puede tener extremos
protegidos con grupos alquilo.
El término "nanopartículas
sólido-lípido" se refiere a un vehículo para la
liberación de fármacos. Las nanopartículas
sólido-lípido son soluciones sólidas de fármacos en
una matriz lipídica. Los diámetros de las partículas son típicamente
inferiores a 1 \mum y las partículas están usualmente
monodispersas.
Los procesos para preparar nanopartículas
sólido-lípido pueden evitar el uso de disolventes
orgánicos y el uso de homogenizadores convencionales o de alta
presión y particularmente de excipientes adecuados. Debido a la
matriz lipídica, las nanopartículas sólido-lípido
pueden también estabilizar agentes químicamente sensibles. El uso
de nanopartículas sólido-lípido como sistema de
liberación controlada es adecuado especialmente para las
aplicaciones tópicas de ingredientes activos.
El término "lesión deportiva" se refiere a
cualquier estado doloroso o debilitante que está relacionado u
ocasionado por un esfuerzo o lesión acaecida durante una práctica
deportiva. Cuando se desarrolla una artritis como resultado de
lesiones, por ejemplo lesiones deportivas, generalmente se denomina
osteoartritis "secundaria". La degradación del cartílago como
consecuencia de lesiones deportivas puede ser provocada por una
lesión traumática. Además, también están incluidas otras
indicaciones en las que hay daño del cartílago, como las que son
resultado de otras lesiones o de enfermedades degenerativas.
El término "liberación prolongada" se
refiere al periodo de tiempo durante el cual un fármaco es liberado
para su disponibilidad, o está disponible de otra forma para su
absorción fisiológica. Los periodos de liberación prolongada pueden
estar precedidos por un periodo de inducción durante el cual se
libera poco o nada de fármaco, o puede ser bifásico, comprendiendo
un periodo de tiempo inicial durante el cual se libera algo fármaco
y un segundo periodo de tiempo durante el cual se libera el fármaco
adicional. Por el contrario el término "liberación continua"
se utiliza únicamente para describir un perfil de liberación que
resulta ser monofásico, con un perfil de liberación en el tiempo
curvo, no pronunciado. El experto en la materia apreciará que el
perfil de liberación puede corresponder incluso a un perfil de
liberación en el tiempo exponencial o logarítmico.
El término "fluido sinovial" se refiere a
una sustancia viscosa, normalmente de color pajizo que se encuentra
en pequeñas cantidades en articulaciones, bolsas o envolturas de los
tendones. El fluido sinovial comprende ácido hialurónico, un
polisacárido que tiene un peso molecular en un intervalo de
100.000-10.000.000 Daltons. El ácido hialurónico es
relativamente no comprimible y es capaz de desplazar cantidades
significativas de agua, propiedades que ayudan a hacer del fluido
sinovial un lubricante excelente y un absorbente de impactos en las
articulaciones.
El término "cantidad eficaz
terapéuticamente" se refiere a la cantidad de una sustancia
activa biológicamente necesaria para inducir un efecto
farmacológico deseado. La cantidad puede variar mucho según la
eficacia de cada sustancia activa específica; según la edad, peso,
y respuesta del individuo; así como según la naturaleza y la
gravedad de los síntomas del individuo. Por consiguiente, no hay
limitación crítica superior o inferior en relación con la cantidad
de sustancia activa. Los expertos en la materia pueden determinar
fácilmente una cantidad eficaz terapéuticamente para ser utilizada
en la presente invención.
El término "TNF\alpha" se refiere al
factor de necrosis tumoral, una citoquina implicada en la
patogénesis de la artritis reumatoide humana.
La presente invención se refiere a la actividad
anti-inflamatoria mediada por GA y GlcNAc. En
consecuencia, la siguiente discusión detalla los experimentos
diseñados para determinar el origen de las propiedades
condro-protectoras y
anti-inflamatorias de la GlncNAc. Algunos de estos
experimentos están descritos en la solicitud de patente provisional
de EE.UU Nº de serie 60/280.351, solicitada el 29 de marzo de 2001,
que se incorpora en su totalidad como referencia en esta
invención.
Para investigar si la GlcNAc suprime la
actividad enzimática de la NO sintasa inducible (iNOS) o la
expresión de la proteína correspondiente, se analizó el efecto de
la GlcNAc en la expresión de ambas, tanto de la proteína iNOS
(Western Immunoblot) y como del ARNm de iNOS (Northern Blot). Se
encontró que la GlcNAc inhibía fuertemente la expresión tanto de
iNOS como de la proteína. Además, se encontró que tanto GA como
GlcNAc suprimían la producción de NO iniciada por
IL-1\beta. Tanto GA como GlcNAc inhiben la
producción de oxido nítrico (NO) inducida por TNF\alpha y por
IL-1\beta en condrocitos articulares de humanos
sanos.
Para analizar la especificidad del azúcar en el
fenómeno descubierto, se compararon los efectos de glucosa, ácido
glucurónico, N-acetilmanosamina,
N-acetil galactosamina, GlcNAc y GA en la producción
de NO inducida por IL-1\beta. Cuando se
utilizaron a una concentración 10 mM, solamente GlcNAc y
N-acetil galactosamina demostraron una actividad
inhibitoria. Otros varios monosacáridos, incluyendo glucosa, ácido
glucurónico y N-acetil manosamina no inhibieron la
producción de ácido nítrico (NO) inducida por
IL-1\beta y TNF\alpha. Además, los polímeros de
GlcNAc, incluyendo los dímeros y trímeros de GlcNAc no expresaron
actividad inhibitoria de la producción de NO inducida por
IL-1\beta según el ensayo y no afectaron a la
producción de NO.
Se cree que la supresión de la producción de NO
inducida por IL-1\beta observada está asociada con
la inhibición del ARNm de la sintasa inducible por NO (iNOS) y con
la expresión de la proteína. Además, la GlcNAc suprime también la
producción de COX-2 y de IL-6
inducida por IL-1\beta. Se estudió el efecto de la
GlcNAc en la expresión de COX-2 en cultivos de
condrocitos articulares humanos estimulados con
IL-1\beta. Los resultados de los experimentos
demostraron que la GlcNAc inhibía la expresión de la proteína
COX-2 medida en una inmunotransferencia Western y
del ARNm de COX-2 medido en una transferencia
Northern. En contraste con COX-2, GlcNAc no afectó
a la expresión de la proteína COX-1 expresada de
manera constitutiva. Además de NO y COX-2, GLcNAc
inhiben la producción de IL-6 en cultivos de
condrocitos articulares humanos estimulados con
IL-1\beta. Las diferencias fueron
estadísticamente significativas (p<0.001). Por lo tanto, GlcNAc
suprime varios productos de la inflamación inducibles por
IL-1\beta, pero no inhibe las moléculas expresadas
de manera constitutiva.
Para determinar si la supresión de la
producción, mediada por GlcNAc, de IL-6,
COX-2 y NO inducidas por
IL-1\beta, depende de la inhibición de la
activación de NF-\kappaB, se estudió la
translocación nuclear de NF-\kappaB en los
condrocitos estimulados solamente con IL-1\beta,
en comparación con los condrocitos estimulados con
IL-1\beta y tratados con GlcNAc. Los resultados de
los experimentos demostraron que la GlcNAc no afectaba a la
translocación nuclear del NF-\kappaB inducida por
IL-1\beta. La inhibición, mediada por GlcNAc, de
la respuesta de los condrocitos humanos a la
IL-1\beta, no estaba asociada con la disminución
de la activación de las MAP quinasas (JNK, ERK y p38) o con la
activación del factor de transcripción
NF-\kappaB.
La señal intracelular de la ruta de la
IL-1\beta tiene como resultado la activación de
varias proteínas quinasas, incluyendo MAP quinasas (Geng et
al., (1996) J. Clin. Invest. 98:2425:30). Los restos de
GlcNAc participan en el proceso dinámico de la
O-glicosidación de proteínas, que utiliza restos de
serina como sitios de anclaje. Por lo tanto, al competir por los
mismos sitios de unión, los restos O-glicosilo
podrían disminuir la eficacia de la fosforilación de la serina y,
por lo tanto, interferir en la transducción de la señal. Para
tratar este mecanismo potencial, se analizó el efecto de la GlcNAc
en la activación de la MAP quinasa (ERK, INK y p38) en condrocitos
inducidos por IL-1\beta. Los resultados de estos
experimentos demostraron que la GlcNAc no inhibe la activación de
las MAPs quinasas ERK, INK y p38.
La GlcNAc no suprimió todas las respuestas
inducidas por IL-1\beta en los condrocitos. Por
ejemplo, no suprimió el aumento de la secreción de hexosaminidasa
mediada por IL-1\beta. Además, era sinérgica con
IL-1\beta en la inducción de TGF\alpha1. En
conjunto, estos descubrimientos sugieren que la GlcNAc inhibe
selectivamente la expresión de los genes inducidos por citoquinas y
la producción de determinados mediadores
pro-inflamatorios.
Los resultados de los experimentos demostraron
que tanto GA como GLcNAc inhibían apreciablemente la producción de
NO en el intervalo milimolar inferior; sin embargo, a
concentraciones por debajo de 1 mM no eran eficaces. Este intervalo
de concentración es similar al descrito previamente para el
incremento de la producción del TGF\alpha inducido por GA en
cultivos de células mesangiales porcinas (Kolm-Litty
et al., (1998) J. Clin. Invest. 101:160). Una mejor
actividad antiinflamatoria a concentraciones mas altas de GA y de
GlcNAc puede reflejar una competencia entre estos azúcares y la
glucosa del medio de cultivo, para entrar en la célula por medio de
las moléculas transportadoras de glucosa (Rauchman et al.,
(1992) Biochim. Biophys. Act. 1111:231). Las concentraciones
terapéuticas de los azúcares aminados, que pueden alcanzarse en
humanos por una administración oral de GA a la dosis aceptada de
1.500 mg al día, son muy inferiores a las utilizadas en la presente
publicación. Por lo tanto, los datos in vitro respecto a los
mecanismos antiinflamatorios de las actividades de GlcNAc y GA no
pueden ser aplicados directamente para explicar la eficacia
terapéutica de GA en pacientes con OA.
\newpage
Cuando se utiliza a concentraciones equimolares,
la GlcNAc demuestra una inhibición de la producción de NO más
fuerte que la GA. El efecto inhibitorio máximo de la GlcNAc se
observó a una concentración de 20 mM; las concentraciones
inferiores a 1 mM fueron insuficientes para la supresión de la
producción de NO. La IC_{50} para GlcNAc era de 4,1 \pm 1,3 mM,
la IC_{50} para GA era de 14,9 \pm 2,1 mM, (p<0.01). Ni GA,
ni GlnNAc en dosis superiores a 20 mM afectaron la viabilidad
celular según se midió con el ensayo de MTT (Park et al.,
(1987) Cancer Res. 47:5875).
Sin limitarse a una teoría en particular, un
posible mecanismo para la inhibición mediada por GlcNAc de la
respuesta de IL-1\beta, es una inhibición mediada
por N-acetil glucoamina, de episodios de
fosforilación de la cascada de señalización de la
IL-1\beta. Se demostró la participación de uno de
los productos finales de la ruta de la hexosamina, la
UDP-N-acetil-\beta-D-glucosamina,
en el proceso dinámico de la O-glicosilación de las
proteínas, que utiliza restos de serina o treonina como sitios de
anclaje (Haltiwanger et al., (1997) Biochem. Biophys.
Res. Commun. 231:237). Potencialmente, la
O-glicosilación de restos de serina puede competir
con la fosforilación de los mismos restos, dando como resultado la
alteración de las cascadas de transducción de señales
intracelulares. (Chou et al., (1995) Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU. 92:4417). Para tratar esta posibilidad, se analizó
el efecto de la GlcNAc en la activación de la MAP quinasa (ERK, JNK,
y p38), y en la translocación nuclear del
NF-\kappaB en los condrocitos estimulados por
IL-1\beta. La activación de estas MAP quinasas y
del NF-\kappaB son episodios centrales en la
respuesta de los condrocitos a la IL-1\beta y a
las citoquinas relacionadas. Los resultados de los experimentos
revelaron que la GLcNAc medible no inhibió la activación de las
MAPs quinasas (ERK,JNK y p38) inducidas por
IL-1\beta, o la translocación nuclear de
NF-\kappaB.
Para resumir, el presente estudio fue el primero
en examinar el efecto de GA y GLcNAc en la respuesta de los
condrocitos humanos a la estimulación con
IL-1\beta, y describe un mecanismo nuevo de la
actividad antiinflamatoria mediada por GLcNAc. Los resultados de
nuestros experimentos indican claramente que GA, y en un mayor
grado, GLcNAc son capaces de inhibir la producción de NO inducida
por IL-1\beta en cultivos de condrocitos
articulares humanos. El efecto de los azúcares en la producción de
NO es especifico ya que varios otros monosacáridos, incluida
glucosa, ácido glucurónico y
N-acetil-manosamina no expresan esta
actividad. Además, se demostró que los polímeros de GlcNAc,
incluyendo el dímero y el trímero, tampoco afectan a la producción
de NO. La supresión observada de la producción de NO inducida por
IL-1\beta, es la consecuencia de la inhibición de
la proteína iNOS y de la expresión del ARNm. Además de su actividad
inhibitoria de NO, la GlcNAc también inhibió la producción de
COX-2 e IL-6 inducidas por
IL-1\beta. La expresión de COX-1,
sin embargo, no estuvo afectada por GlcNAc.
Una realización de la presente invención
proporciona métodos para el tratamiento de OA (o tipos de artropatía
inflamatoria), lesiones deportivas, o degradación del cartílago, en
un paciente que necesita de ese tratamiento. El método incluye la
etapa de administrar a un paciente una composición que contiene una
cantidad eficaz terapéuticamente de GlcNAc sola o en combinación
con al menos algún otro fármaco antiinflamatorio o un inhibidor de
la hexoaminidasa, en la que los fármacos antiinflamatorios y los
inhibidores son conocidos en la técnica. Otras realizaciones
adicionales de la presente invención implican formulaciones
adecuadas para la administración intraarticular, tópica, o
intramuscular. De manera ventajosa, las formulaciones pueden
administrarse eficazmente de manera intraarticular.
La preparación de la composición farmacológica
que contiene ingredientes activos disueltos o dispersos no está
limitada necesariamente en base a la formulación. Tales
composiciones pueden prepararse como disoluciones inyectables bien
como soluciones líquidas o como suspensiones. Sin embargo, pueden
prepararse también formas sólidas adecuadas para la disolución, o
para la resuspensión, en un líquido, antes de su uso. La preparación
también puede estar emulsionada.
El ingrediente activo puede estar mezclado con
excipientes que sean farmacéuticamente aceptables y compatibles con
el ingrediente activo y en cantidades adecuadas para su uso en los
métodos terapéuticos descritos en la presente invención. Los
excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, disolución salina,
dextrosa, glicerol, etanol o similares y sus combinaciones. Además,
si se desea, la composición puede contener cantidades menores de
sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o
emulsionantes, agentes tamponadores de pH y similares, que
incrementen la eficacia del ingrediente activo.
Las composiciones de la presente invención
pueden incluir las sales aceptables farmacéuticamente de estos
componentes. La sales aceptables farmacéuticamente incluyen las
sales de adición de ácido (formadas con cualquier grupo amino
libre) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo,
ácidos clorhídrico o fosfórico, sulfúrico, etc.) o con ácidos
orgánicos como acético, tartárico, mandélico y similares. Las sales
formadas con los grupos carboxilos libres presentes en los
glucoglicanos pueden también derivar de bases inorgánicas como,
por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o
férrico, y de bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina,
2-aminoetanol, histidina, procaína y similares. Se
prefieren especialmente las sales de TFA y de HCl.
Otra realización de la presente invención es una
formulación mejorada para el ingrediente activo, la GlcNAc. El
encapsulado o atrapado de GlcNAc en liposomas o en otros agentes de
atrapado modifica su perfil fármaco dinámico cuando se inyecta de
forma intraarticular. Por ejemplo, las soluciones acuosas de GlcNAc
administradas de forma intraarticular se salen rápidamente de las
articulaciones de rodilla de rata. Por el contrario, la GlcNAc
formulada en liposomas queda retenida en las articulaciones de
rodilla de rata después de la administración intraarticular según
la invención. En otra realización de la invención, se demostró que
una formulación liposomal de GlcNAc presentaba efectos analgésicos
inesperados en un mamífero con un dolor inducido por bradiquidina.
Se demostró que la GlcNAc por si sola, sin formulación liposomal
tenia pequeños efectos analgésicos, aunque insignificantes
estadísticamente.
La invención se describe más adelante con más
detalle mediante los ejemplos siguientes. Sin embargo, se entiende
que la presente invención no se limita a estos ejemplos.
Se obtuvo cartílago normal de los servicios de
autopsia y bancos de tejidos de San Diego, Orange County y San
Antonio. El cartílago articular se cultivó a partir de cóndilos
femorales y de mesetas tibiales. Todas las muestras de tejidos se
clasificaron según la escala de Mankin modificada (Mankin et
al., (1971) J: Bone Joint Surg Am. 53:23), y solo se
utilizó el cartílago sin evidencia de OA, como fuente de
condrocitos. El intervalo entre la muerte y el tiempo en el que se
cultivó el cartílago a partir de esas articulaciones de rodilla en
el laboratorio, fue de al menos de 24 horas y de 96 horas como
máximo. Las virutas de cartílago se cultivaron en los bancos de
tejidos durante 24 horas post mortem, se dispusieron en un
medio de cultivo de tejidos (DMEM, FBS al 10%, Penicilina,
Estreptomicina) y se enviaron al laboratorio a 4ºC. Este tejido fue
procesado en el laboratorio en las 24 horas posteriores al
cultivo.
Se adquirió GA, GlcNAc, glucosa, ácido
glucurónico, y N-acetil manosamina de Sigma (St.
Louis, MO). El dímero de N-acetil glucoamina
(N,N'-diacetil quitobiosa) y el trímero de
N-acetil glucoamina
(N,N',N''-triacetil quitotriosa) se adquirieron de
TRC (Toronto, Canada).
El equipo y los animales utilizados en los
estudios de formulación estaban disponibles comercialmente: El baño
de agua circulante (Huber), la bomba de vacío (Gast manufacturing
Inc, Modelo DOA-P104-BN), el
contador de centelleo multiuso (Beckman coulter,
LCS-6500), el concentrador SpeedVac (Savant, Modelo
DNA-230). Las ratas Wistar (macho,
200-250 g.) utilizadas en el experimento con ratas
se obtuvieron del Centro de Animales de Laboratorio de Singapur.
Los condrocitos se aislaron del cartílago
mediante digestión con colagenasa y se mantuvieron en cultivos
monocapa continuos en DMEM que contiene suero de feto bovino (FBS)
al 10%. La viabilidad de las células después del aislamiento del
condrocito por digestión de cartílago normal con colagenasa fue
>95%. Este nivel se mantuvo durante al menos 96 horas post
mortem. Los estudios sobre los efectos de la
IL-1 como una respuesta catabólica, no mostraron
cambios aparentes en función de las variaciones en el tiempo entre
la muerte y el procesado de los tejidos, cuando se midió la
liberación de oxido nítrico y de IL-6. Los
experimentos descritos se efectuaron con células primarias o de
primer pase.
Se dispusieron 40.000 células de condrocitos por
cada pocillo en placas de 96 pocillos en presencia de FBS al 1%.
Después de 48 horas, se cambio el medio, y las células se
estimularon con IL-1\beta (Sigma) a una
concentración de 5 ng/ml durante 24 horas. La producción de NO fue
detectada como acumulación de NO_{2} en los sobrenadantes del
cultivo por la reacción de Griess descrita en otros documentos
(Heval et al., (1994) Methods Enzymol. 233:250). Se
midió la IL-6 de los sobrenadantes del cultivo con
ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN) según el protocolo del
proveedor.
Se prepararon extractos de células completas a
partir de 3 x 106 condrocitos estimulados, como se describió
anteriormente, por lisis de las células en la placa en un tampón de
lisado enfriado en hielo (TrisHCl 10 mM pH 7,6, NaCl 158 mM, EDTA 1
mM, SDS al 0,1%, Triton X-100 al 1% 111 g/ml de
leupeptina, 1 \mug/ml de aprotinina, y PMSF 0,5 mM), que se
añadió inmediatamente antes de utilizarse. Los lisados se
transfirieron a tubos Eppendorf y se centrifugaron a 20.000 g
durante 30 minutos a 4ºC. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos
nuevos, y se determinó la concentración de proteína por el ensayo
de Bradford. Se separaron cantidades similares de proteína por SDS
PAGE al 10% y se transfirieron a un filtro de nitrocelulosa
(Schleicher & Schuell, Keene, NH) por electrotransferencia. El
filtro se bloqueó durante la noche con una disolución de leche en
polvo/TBS-T al 5% y posteriormente además se incubó
con uno de los siguientes anticuerpos: anti-iNOS
(C-19, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz,
CA), anti-COX-2 (Cayman Chemical,
Ann Arbor, MI), anti-COX-1
(H-3, Santa Cruz Biotechnology, Inc.),
anti-fosfo-JNK (phosphoThr 183/Tyr
185, New England Biolabs, Inc. Beverly, MA),
anti-fosfo-p38MAP
(phospho-Thr 80/Tyr 182, New England Biolabs, Inc.)
o anti-fosfo-ERK
(phospho-Thr 180/Tyr 182 New England Biolabs, Inc.)
durante 2 horas. Las membranas se lavaron tres veces con
TBS-T y posteriormente se incubaron con anticuerpos
secundarios adecuados marcados con peroxidasa de rábano picante en
una disolución de leche en polvo/TBS-T al 5% y se
revelaron usando el sistema ECL (Amersham, Arlington Heights,
IL).
Se aisló el ARN total de 2 X 106 condrocitos
estimulados utilizando el reactivo STAT-60
(Tel-Test, Friendswood, TX). El ARN para cada
muestra se cuantificó fotométricamente, y se separaron 5 \mug en
agarosa al 1,2%, en geles de formaldehido al 6%. Después de la
electroforesis, los geles se fotografiaron, y el ARN se transfirió
a membranas de nailon de HybondN (BRL, Baithesburg, MD) por
transferencia capilar. Las membranas se secaron con aire y se
incubaron durante 2 horas a 80ºC. Se llevo a cabo la hibridación
previa durante dos horas a 60ºC in 5 x SCC, EDTA 1mM, SDS al 0,2% y
5 x disolución de Denhardt. Se añadió la sonda marcada
radioactivamente y se llevó a cabo la hibridación durante la noche
a 60ºC. Después de la hibridación, se aclararon los filtros dos
veces con 2 x SSC, SDS al 0,1%, se lavaron una vez con 2 x SCC, SDS
al 0,1% a 60ºC y una vez con 0,2 x SCC, SDS al 0,1% a 60ºC. Las
membranas se taparon con un envoltorio de plástico y se expusieron
con una pantalla intensificadora durante 12 horas a -70ºC. Las
sondas utilizadas para la hibridación se prepararon como se
describió anteriormente. (Geng et al., (1993) J.
Immunolog. 151:6692; Geller et al., (1993) Proc. Natl.
Acad. Sci. EE.UU. 90:3491).
Los extractos de proteínas nucleares se
prepararon de la siguiente manera: 2 x 10^{6} condrocitos fueron
estimulados como se indicó anteriormente. Las células se cultivaron
por tripsinización, se lavaron una vez con PBS enfriado con hielo y
se lisaron en un tampón Tris-HCl 10 mM pH 7,5 que
contiene MgCl_{2} 2 mM, NaCl 140 mM, DTT 0,5 mM, Triton
X-100 al 0,05% , PMSF 0,5 mM, 1 \mug/ml de
leupeptina y 1 \mug/ml de aprotinina. Los núcleos se
fragmentaron, se suspendieron de nuevo en tampón de HEPES 20 mM pH
7,9, que contiene glicerol al 25%, NaCl 420 mM, MgCl_{2} 1,5 mM,
EDTA 0,2 mM, DTT 0,5 mM, PMFS 0,5 mM, 1 \mug/ml de leupeptina y 1
\mug/ml de aprotinina y se rotó a 4ºC durante 30 minutos. Después
de eliminar los restos nucleares por centrifugación, se determinó
la concentración de proteínas del lisado por el ensayo de Bradford.
Se incubaron cantidades iguales de extractos celulares (2 \mug)
durante 15 minutos a temperatura ambiente con
poli-(dI-dC)poli-(dI-dC)
(0,1 mg/ml), BSA (1mg/ml), 1x 1O_{s} recuentos de
oligodesoxinucleótidos de doble cadena con marcaje radioactivo que
contienen el sitio de unión al ADN consenso de
NF-\kappaB (secuencia: 5'
GATCGAGGGGACTTTCCCTAGC-3') en un tampón de HEPES 20
mM pH 7,9 que contiene glicerol al 10%, NaCl 420 mM, MgCl_{2}, 1,5
mM, EDTA 0,2 mM, DTT 0,5 mM, PMSF 0,5 mM. Para los experimentos de
competencia se añadieron a las reacciones de unión
oligodesoxinucleótidos de NF-\kappaB sin marcar u
oligodesoxinucleótidos que contienen la secuencia consenso de
Oct-1 con un exceso molar de 100 veces, 10 minutos
antes de añadir el oligodesoxinucleótido de
NF-\kappaB marcado radiactivamente. Las
reacciones de unión se cargaron en un gel de poliacrilamina nativa
TGE al 6% (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, glicina 380 mM,
EDTA 2 mM) y se llevó a cabo una electroforesis durante 2 horas a
4ºC. Después los geles se secaron y se expusieron de 16 a 48 horas
con una pantalla intensificadora a -80ºC. Se realizó el análisis
estadístico de los datos generados con el programa StatMost 32 para
Windows (Dataxiom Software Inc., Los Angeles, CA).
Los siguientes fosfolípidos y conjugados de
fosfolípidos están disponibles comercialmente. Se proporcionan los
nombres comerciales, seguidos de nombre del vendedor y del número de
producto, junto con el acrónimo entre paréntesis:
diestearoil
L-\alpha-fosfatidilcolina (Sigma
P6517, DSPC), distearoil
L-\alpha-fosfatidil-etanolamina
(Sigma P3531, DSPE), diestearoil
L-\alpha-fosfatidil-etanolamina
conjugada con metoxipolietilenglicol (Sigma P7840,
DSPE-Con), diestearoil
L-\alpha-fosfatidil-DL-glicerol
(Sigma P9524, DSPG), dipalmitoil
L-\alpha-fosfatidil-L-serina
(Sigma P1185, DPPS), colesterol (Sigma C8667, Chol),
N-acetil glucosamina (Sigma A8625, GlcNAc).
Se adquirió N-glucosamina
tritiada,
N-acetil-D-[1-^{3}H]
glucosamina de Amersham Pharmacia Biotech, Código TRK376, actividad
específica de 18,6 mCi/mg, pureza radioquímica de 97,4%). Los
disolventes y reactivos, cloroformo (Sigma,
C-2432), metanol (Merck, calidad HPLC), disolvente
de tejidos NCS-II (Amersham Pharmacia Biotech,
Código NNCS502), cóctel de centelleo (Amersham Pharmacia Biotech,
Código BSC-NA), se utilizaron tal y como se
recibieron a no ser que se especifique lo contrario.
Se disolvieron 33 \mumol de DSPC y 33 \mumol
de Chol (u otras composiciones, véase la Tabla 1 más adelante) en 3
ml de una disolución de cloroformo:metanol (95:5, v/v) en un matraz
Erlenmeyer de 100-ml. El disolvente orgánico se
evaporó al vacío (600 mm Hg) a temperatura ambiente. Después de
eliminar las últimas trazas visibles del disolvente, se continuó
haciendo vacío por lo menos durante otros 30 minutos.
Se añadieron al matraz 2 ml de GlcNAc en una
disolución de cloruro sódico al 0,85% (que contiene un total de
GlcNAc con 10 \muCi marcados y 5,38 mg sin marcar con una relación
molecular final entre sin marcar y marcada de 10.000 a 1). Se
mantuvo el matraz en un baño a 60ºC (las temperaturas para otras
composiciones se muestran en la Tabla 1) durante 5 minutos y el
lípido seco se suspendió por centrifugación vigorosa a 2.500 rpm
durante 1 minuto. Se permitió que los liposomas se reasociaran a la
misma temperatura durante 45 minutos. Entonces los liposomas
preparados se pipetearon en 4 tubos Eppendorf de 1,5 ml. Los
liposomas se secaron en vacío en un concentrador SpeedVac a 45ª C
durante 4-5 horas.
Se añadieron 50 \mul de agua destilada a los
liposomas secos en cada tubo Eppendorf. Se mantuvieron los tubos
Eppendorf en un baño de agua a 60ºC (las temperaturas para otras
composiciones se muestran en la Tabla 1) durante 5 minutos. Después
los liposomas se suspendieron por centrifugación a 2,500 rpm durante
1 minuto. La suspensión se dejo reposar a la misma temperatura
durante 45 minutos.
Después la GlcNAc sin encapsular se separó de
los liposomas y de la GlcNAc encapsulada en liposomas mediante
centrifugación durante 15 minutos a 20.000 G después de diluirla con
1 ml de NaCl al 0,85%. El mismo proceso se repitió dos veces más
con 1 ml de NaCl al 0,85% para eliminar el material sin atrapar. Las
formulaciones liposomales siguientes se prepararon según este
método:
(1) Una mezcla binaria que comprende DSPC y Chol
en una relación molar de 5:5;
(2) una mezcla ternaria que comprende DSPC, Chol
y DSPE en una relación molar de 5:5:1;
(3) una mezcla ternaria que comprende DSPC, Chol
y DSPE-Con en una relación molar de 5:5:1
(4) una mezcla ternaria que comprende DSPC, Chol
y DSPG en una relación molar de 5:5:1, y
(5) una mezcla ternaria que comprende DSPC, Chol
y DPPS en una relación molar de 5:5:1.
La cantidad de [^{3}H]GlcNAc en cada
formulación liposomal y en el sobrenadante correspondiente se
determinó por recuento por centelleo líquido. En resumen, se
disolvieron 10 \mul de la disolución de liposomas o sobrenadante
en 0,5 ml de disolvente de tejidos (Amersham NCS-II)
y se mezclaron con 15 \mul de ácido acético glaciar para eliminar
la posible quimioluminiscencia de fondo. Se mezcló el sobrenadante
o los liposomas con 4,5 ml de coctel de centelleo
(BCS-NA, Amersham). Se utilizó la radioactividad en
el sedimento del liposoma y en el sobrenadante para calcular la
eficacia del encapsulado para cada preparación liposomal.
La Tabla 1 muestra la eficacia de encapsulado de
GlcNAc en varias formulaciones liposomales. El rendimiento
representa la cantidad del compuesto incorporado, cargado, asociado,
ligado o unido de otra forma a los liposomas o a sus bicapas. En
general, el rendimiento se expresa como porcentaje de la cantidad
inicial. Como se muestra en la Tabla 1, la eficacia de encapsulado
de GlcNAc en liposomas es consistente. Los valores de rendimiento
de la Tabla 1 son valores representativos del porcentaje de
encapsulado (rendimiento). Se pueden obtener otros valores
(superiores o inferiores) según el tipo y la cantidad de lípidos
empleados, sin apartarse del espíritu de la invención.
Todos los procedimientos de preparación se
llevaron a cabo en condiciones estériles. Se comprobó la esterilidad
de los liposomas preparados utilizando una placa de agar para el
cultivo de bacterias. Se inocularon 5 \mul de liposomas en una
placa de agar y se cultivaron a 35ºC durante 3 días. Otros 5 \mul
de liposomas se inocularon en una placa de agar de MHA y se
cultivaron a temperatura ambiente durante 3 días. Todas ellas
mostraron que no había crecimiento de ningún organismo.
\vskip1.000000\baselineskip
100 \mul de GlcNAc encapsulados en liposomas
preparados de la forma indicada anteriormente fueron suspendidos en
3 ml de PBS 0,1 M (pH 7,4) en un tubo de centrifuga de 50 ml. Los
liposomas se incubaron en una incubadora agitadora a 60 rpm a 37ºC.
En momentos específicos diferentes, los liposomas se separaron por
centrifugación a 20.000 rpm durante 15 minutos. La liberación de
GlcNAc (actividad ^{3}H) al sobrenadante se midió por recuento
por centelleo líquido. Los sedimentos de liposomas se suspendieron
de nuevo en 3 ml de PBS nuevo y se incubaron en las mismas
condiciones. El porcentaje de liberación de la
[^{3}H]GlcNAc en función del tiempo para varios tipos de
liposomas se representa en la Figura 1.
La Figura 1 muestra un perfil cinético de la
liberación in vitro de [^{3}H] GlcNAc atrapada en
diferentes formulaciones liposomales en presencia de PBS 0,1 M, pH
7,4. La cantidad de [^{3}H] GlcNAc liberada de los liposomas se
midió en el sobrenadante y se calculó como el porcentaje liberado
del compuesto inicialmente atrapado.
La Figura 1 revela que la tasa de liberación de
[^{3}H] GlcNAc varía según el tipo de liposoma utilizado. En
estos experimentos, la formulación liposomal que emplea DSPE se
caracterizó por una velocidad de liberación inicial rápida seguida
de una velocidad de liberación más lenta en los últimos momentos.
Una formulación similar que incorpora DSPE conjugada con poli
etilenglicol muestra un comportamiento marcadamente diferente,
mostrando una liberación significativamente más lenta del fármaco
para un mismo momento específico que la formulación que no está
conjugada con PEG. Los liposomas que comprenden DSPC muestran una
tasa de liberación lenta, casi constante. Las otras formulaciones
parecen intermedias entre las de DSPE y las de DSPC.
También se llevó a cabo un estudio de liberación
in vitro en los fluidos sinoviales humanos de pacientes con
artritis inflamatoria y OA. 10 \mul de liposomas, preparados como
se describe en la presente memoria, se mezclaron con 90 \mul de
fluidos sinoviales humanos. Se incubaron en una incubadora agitadora
a 60 rpm y a 37ºC. En diferentes momentos específicos, los
liposomas se separaron añadiendo 300 \mul de disolución salina
normal y se centrifugaron a 20.000 G durante 15 minutos. Se añadió
el sobrenadante a 4 ml del coctel de centelleo líquido y se midió
la GlcNAc liberada [actividad ^{3}H] por recuento por centelleo
líquido. Los sedimentos de liposomas se suspendieron de nuevo en
90 \mul de fluidos sinoviales humanos de los mismos pacientes y
se incubaron en las mismas condiciones descritas anteriormente. En
la Figura 2 se representa el porcentaje de liberación de
[^{3}H]GlcNAc en función del tiempo para diversos tipos de
liposomas en presencia del fluido sinovial.
La Figura 2 muestra un perfil cinético de la
liberación in vitro de [^{3}H]GlcNAc atrapada en
formulaciones liposomales diferentes en el fluido sinovial de tres
pacientes con artritis reumatoide (RA). La cantidad de
[^{3}H]GlcNAc liberada de los liposomas se midió en el
sobrenadante y se calculó como el porcentaje liberado del compuesto
inicialmente atrapado. En la Figura 2, cada punto esta representado
como la desviación estándar media (\pm DS), n=4.
La Figura 3 muestra el perfil cinético de la
liberación in vitro de [^{3}H]GlcNAc atrapada en
formulaciones liposomales diferentes en el fluido sinovial de tres
pacientes con OA. La cantidad de [^{3}H]GlcNAc liberada de
los liposomas se midió en el sobrenadante y se calculó como el
porcentaje liberado del compuesto inicialmente atrapado. En la
Figura 3, las barras de error representan la desviación estándar
media (DS) para tres datos.
Diversas formulaciones liposomales basadas en
PC/Chol (1:1) o en DSPC/Chol/DSPE (5:5:1) prolongan la retención de
GlcNAc en las articulaciones de rodilla de rata después de la
administración intraarticular.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectaron 50 \mul de la disolución de
GlcNAc (2,69 mg/ml sin marcar, 5 \muCi/ml marcados, moléculas sin
marcar: moléculas marcadas 10.000:1) en las articulaciones de
rodilla de seis ratas. Estas ratas fueron sacrificadas (2
animales/momento específico) en los minutos 0 y 30, y 2 horas
después de la administración de la disolución de GlcNAc. A las
otras dos ratas se les inyectó disolución salina normal como
controles negativos. Se extirparon todas las articulaciones y se
homogeneizaron con 5 ml de suero disolución salina normal a 16.000
rpm durante 30 segundos aproximadamente. Se añadieron 100 \mul de
homogeneizado de tejidos a 500 \mul de disolvente de tejidos. La
disolución se incubó a 50ºC durante 16 horas, se mezcló con 30
\mul de ácido acético glacial y 5 ml del cóctel de centelleo
líquido. La actividad de la [^{3}H]GlcNAc se midió con un
contador de centelleo líquido.
Se utilizaron catorce ratas para cada
formulación liposomal. Se inyectaron 50 \mul de liposomas
(preparados como se describe en la presente memoria, 1,13
\muCi/ml, la concentración de GlcNAc era de 0,61 mg/ml, moléculas
sin marcar/moléculas marcadas 10.000:1) en cada una de las
articulaciones de rodilla de doce ratas. A otras dos ratas se les
inyectaron 50 \mul de solución salina normal como controles
negativos. Los animales (dos ratas/momento específico) fueron
sacrificadas en momentos específicos correspondientes a los días 0,
1, 3, 7, 14, 21 y 28 posteriores a la administración de GlcNAc. Se
extirparon las articulaciones de rodilla y se determinó la
actividad de la [^{3}H]GlcNAc como se describe en la
presente memoria. Los resultados de este estudio, representados en
la Figura 4, demostraron una prolongación profunda de la semivida
intraarticular.
La Figura 4 muestra el perfil cinético de la
retención de GlcNAc en las articulaciones de rodilla de la rata
después de una administración única de GlcNAc atrapada en una
formulación liposomal que comprende DSPC/Chol = 5,5 (puntos y línea
de ajuste) o en una disolución salina normal (línea de puntos).
Cada punto representa la media \pm la DS, n=4. La semivida de la
disolución salina de GlcNAc en las articulaciones de rodilla de las
ratas fue muy rápida (4,1 minutos) y la línea pasa muy cerca del eje
de abscisas en la Figura 4). La semivida de la GlcNAc formulada en
lípidos en las articulaciones de las ratas fue de 173 horas. Sin la
formulación, la GlcNAc salió de la articulación de la rata
rápidamente después de que se administrase GlcNAc de forma
intraarticular.
La Figura 5 muestra el perfil cinético de la
retención de GlcNAc en las articulaciones de las ratas después de
una administración única intraarticular de GlcNAc atrapada en una
formulación liposomal que comprende DSPC/Chol DSPE = 5:5:1. Cada
punto representa la media \pm DS, n=4. Se observó una curva de
liberación bifásica para la formulación liposomal que se
corresponde con dos fases distintas de liberación. Las semividas
calculadas de la liberación de GlcNAc de esta formulación liposomal
en las articulaciones de las ratas fue de 4,8 horas y de 128 horas,
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
El propósito de este estudio era investigar el
efecto analgésico de la GlcNAc con o sin formulaciones liposomales,
inyectada de forma intraarticular en las articulaciones de ratas
Wistar. El dolor se indujo mediante la administración intraarticular
de bradiquinina. Se obtuvieron ratas Wistar macho adultas con un
intervalo de peso de 220 a 250 gramos del Centro de Animales de
Laboratorio, Universidad Nacional de Singapur. La bradiquinina y la
GlcNAc se adquirieron de Sigma. Los liposomas se prepararon como se
ha descrito anteriormente.
Se inyectó una disolución de 50 \mul de GlcNAc
o GlcNAc formulada en una suspensión de liposomas en una cavidad
articular de rata. Se suministró el mismo volumen de disolución
salina de forma intraarticular como control. Se administraron 50
\mul de bradiquinina (60 \mug/ml o a la concentración indicada)
de forma intraarticular en diferentes momentos específicos después
de la administración de GlcNAc.
Los cambios en la forma de andar causados por la
inyección intraarticular de bradiquinina se utilizaron para definir
el criterio de dolor de las ratas. Los métodos utilizados para
observar la respuesta al dolor se definen en la Tabla 2. Al grado de
dolor se le asignó una puntuación según el criterio de la Tabla
3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 6 muestra la respuesta de las ratas
según la dosis de bradiquinina después de la administración
intraarticular, como se describe en la presente memoria. Las
puntuaciones de dolor mayores están relacionadas con la cantidad de
bradiquinina inyectada.
La Figura 7 muestra los efectos analgésicos de
la GlcNAc tanto en disolución salina como atrapada en una
formulación liposomal. La GlcNAc se formuló en forma de liposomas
con una composición de lípidos DSPC/Chol/DSPE (5:5:1). La
formulación liposomal de GlcNAc mostró niveles de dolor inferiores
que demuestran los efectos analgésicos contra el dolor inducido por
bradiquinina en ratas Wistar. La GlcNAc por si sola, sin
formulación, mostró efectos analgésicos pequeños, pero sin
significación estadística.
Debe tenerse en cuenta que las etapas enumeradas
en cualesquiera de la reivindicaciones de métodos a continuación no
se realizaran necesariamente en el orden en el que están enumeradas.
Los expertos en la materia admitirán variaciones en el orden de
ejecución de las etapas enumeradas. Por ejemplo, en algunas
realizaciones, las etapas se pueden efectuar simultáneamente. Las
reivindicaciones adjuntas deberían estar basadas en estos
principios.
Claims (20)
-
\global\parskip0.950000\baselineskip
1. Una formulación inyectable que comprende un ingrediente activo atrapado, que comprende un azúcar aminado como ingrediente activo para el tratamiento intraarticular de una enfermedad o estado en animales o humanos. - 2. La formulación según la reivindicación 1, en la que dicho ingrediente activo es un azúcar aminado seleccionado entre N-acetil glucosamina, glucosamina, galactosamina, N-acetil galactosamina o iminociclitol y sus sales farmacéuticamente aceptables.
- 3. La formulación según la reivindicación 1, en la que dicho ingrediente activo está atrapado en liposomas.
- 4. La formulación según la reivindicación 1, en la que dicho ingrediente activo está atrapado en microesferas.
- 5. La formulación según la reivindicación 1, en la que dicho ingrediente activo está atrapado en nanopartículas sólido-lípido.
- 6. La formulación según la reivindicación 1, que comprende además uno o más vehículos excipientes poliméricos seleccionados entre el grupo que consiste en, ácido hialurónico, polietilenglicol, copolímeros de polietilenglicol y poli (ácido láctico/glicólico), copolímeros de poli (etilenglicol-\gamma-(DL-ácido láctico-ácido coglicólico), geles de alginato, quitinas y quitosanos.
- 7. La formulación según la reivindicación 6, en la que dicho ácido hialurónico tiene un peso molecular medio de aproximadamente 400 a aproximadamente 10.000.000 Daltons.
- 8. La formulación según la reivindicación 1, en la que la formulación es analgésica.
- 9. Una formulación inyectable que comprende, un azúcar aminado atrapado en liposomas, en la que dichos liposomas comprenden uno o mas lípidos seleccionados entre diestearoil L-\alpha-fosfatidilcolina, disteraroil L-\alpha-fosfatidil-etanolamina, diestearoil L-\alpha-fosfatidil-etanolnamina conjugada con metoxipolietilenglicol, diestearoil L-\alpha-fosfatidil-DL-glicerol, y dipalmitoil L-\alpha-fosfatidil-L-serina.
- 10. La formulación según la reivindicación 9, en la que dicho azúcar aminado se selecciona entre N-acetil glucosamina, glucosamina, galactosamina, N-acetil galactosamina o iminociclitol y sus sales farmacéuticamente aceptables.
- 11. La formulación según la reivindicación 9, en la que dichos liposomas son unilamelares o multilamelares, y tienen un diámetro medio de 100 nm o superior.
- 12. Una formulación inyectable para tratamiento intraarticular de la artritis que comprende, un azúcar aminado atrapado en microesferas, en la que dichas microesferas comprenden copolímeros de poli (ácido láctico-ácido glicólico) y sus sales farmacéuticamente aceptables.
- 13. Uso de una cantidad eficaz terapéuticamente de un azúcar aminado como una formulación de liberación controlada para la preparación de un medicamento para tratar artritis, lesiones deportivas relacionadas con el cartílago, o la degradación del cartílago; en el que dicha formulación de liberación controlada comprende al menos uno de liposomas, microesferas o nanopartículas sólido-lípido.
- 14. El uso según la reivindicación 13, que comprende además alivio del dolor.
- 15. El uso según la reivindicación 13, en el que dicha formulación se administra tópicamente en forma de gel, crema, loción o parche farmacéuticamente aceptables.
- 16. El uso según la reivindicación 13, en el que dicha la artritis es osteoartritis o artritis reumatoide.
- 17. Uso de una cantidad eficaz terapéuticamente de un azúcar aminado como una formulación liposomal para la preparación de un medicamento para tratar artritis en un mamífero.
- 18. El uso según la reivindicación 17, en el que la formulación liposomal comprende uno o mas lípidos seleccionados entre el grupo que consiste en diestearoil L-\alpha-fosfatidilcolina, distearoil L-\alpha-fosfatidil-etanolamina, diestearoil L-\alpha-fosfatidil-etanolamina conjugada con metoxipolietilenglicol, diestearoil L-\alpha-fosfatidil-DL-glicerol, dipalmitoil L-\alpha-fosfatidil-L-serina.
- 19. El uso según la reivindicación 17, en el que dicha formulación liposomal proporciona alivio del dolor.
- 20. Uso de una cantidad eficaz terapéuticamente de N-acetil glucosamina como una formulación liposomal, en la que dichos liposomas comprenden diestearoil L-\alpha-fosfatidilcolina, diestearoil L-\alpha-fosfatidil-etanolamina, diestearoil L-\alpha-fosfatidil-etanolamina conjugada con metoxipolietilenglicol, diestearoil L-\alpha-fosfatidil-DL-glicerol o dipalmitoil L-\alpha-fosfatidil-L-serina o cualquiera de sus combinaciones para la preparación de un medicamento para tratar artritis en un mamífero mediante inyección intraarticular.
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