ES2636646B1 - NUEVOS VEHÍCULOS PARA LA TRANSFECCIÓN DE miRNAs - Google Patents

Abstract

Nuevos vehículos para la transfección de miRNAs.#La presente invención se refiere a una nanopartícula que comprende (i) entre un 60% y un 99% en peso, con respecto al peso total de la nanopartícula, de un éster de sorbitán; (ii) una sustancia cargada positivamente; y (iii) un miRNA; a sus métodos de fabricación, y sus usos, especialmente en usos terapéuticos, como el tratamiento del cáncer.

Description

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NUEVOS VEHICULOS PARA LA TRANSFECCION DE miRNAs

DESCRIPCION CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a nuevos sistemas que comprenden miRNAs para su aplicacion en los campos farmaceutico, cosmetico o nutricional, entre otros. Estos sistemas permiten la administracion mas eficiente de distintos miRNAs, por ejemplo, en aplicaciones para el tratamiento del cancer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Los microRNAs, tambien comunmente denominados miRNAs, son secuencias cortas de RNA que tienen la capacidad de interferir en procesos celulares. Esta capacidad ha despertado el interes en su potencial para aplicaciones medicas, cosmeticas o nutricionales, entre otras. Se ha podido comprobar el potencial de muchos de estos miRNAs en ensayos biologicos, y hasta la fecha se han identificado aproximadamente un millar de estas sustancias naturales con potencial en diversas aplicaciones.

Hasta el momento, el principal problema para su uso es su corta vida cuando son administrados. Los miRNAs son especialmente sensibles al ataque de exonucleasas y tienen una semivida de minutos en el medio biologico. Esto ha disparado el interes por la busqueda de medios de administracion que permitan transportar los miRNAs de forma eficaz, evitando su rapida degradacion in vivo.

Una de las primeras estrategias contempladas fue la modificacion estructural de los miRNAs. Una de las variaciones mas extendidas ha sido la modificacion del grupo 2'-OH de la ribosa (Wu SY, Yang X, Gharpure KM, Hatakeyama H, Egli M, et al. (2014) 2'-OMe-phosphorodithioate-modified siRNAs show increased loading into the RISC complex and enhanced anti-tumour activity. Nat Commun 5: 3459.). Ejemplos de estas modificaciones son la sustitucion en esta posicion por 2'-fluoro, 2'-O-metil o 2'-O-metoximetil, solo por mencionar algunos ejemplos. Otra estrategia seguida ha sido el uso de vectores virales, por ejemplo, lentivirus o adenovirus, tal y como se explica en Kasar S, Salerno E, Yuan Y, Underbayev C, Vollenweider D, et al. (2012) Systemic in vivo lentiviral delivery of miR-15a/16 reduces malignancy in the NZB de novo mouse model of chronic lymphocytic leukemia. Genes Im mun 13: 109-119; o en Brandt MR, Kirste AG, Pozzuto T, Schubert S, Kandolf R, et al. (2013) Adenovirus vector-mediated RNA interference for the inhibition of human parvovirus B19 replication. Virus Res 176: 155-160. Sin embargo, y pese a que se han modificado geneticamente para eliminar su carga virulenta, la seguridad de estos vectores siempre despierta preocupacion.

El campo de la oncologia es donde posiblemente los miRNAs han recibido mas atencion hasta el momento. Este interes deriva del descubrimiento de que los miRNAs estan desregulados en tejidos cancerosos y los tejidos que los rodean, y en la habilidad de los miRNAs para regular multiples genes (por ejemplo, los siRNA son especificos y permiten la accion sobre un unico gen), ya que se pueden unir a multiples RNA mensajeros (mRNA) (GARZON, R., MARCUCCI, G. and CROCE, C.M., 2010. Targeting microRNAs in cancer: rationale, strategies and challenges. Nature reviews.Drug discovery, 9(10), pp. 775-789).

Un ejemplo es el caso del cancer colorectal y la metastasis de higado, una de sus regiones mas frecuentes de metastasis. Las celulas endoteliales sinusoidales del higado (LSECs) juegan un papel clave en el desarrollo y regulacion de la metastasis de higado. Se ha encontrado que algunos miRNAs (miR-20a; miR-29 y miR-652) estan desregulados en las LSECs, y la recuperacion de sus niveles normales se presenta como una alternativa terapeutica prometedora.

En vista del potencial de los miRNAs y sus dificultades en la administracion, se ha probado la utilizacion de vectores no virales, por ejemplo, liposomas, peptidos, anticuerpos y otros ligandos, como el quitosano. Asi, se ha buscado la mejora en la transfeccion de diferentes miRNAs con los agentes habituales como, por ejemplo, los de la familia lipofectamine® (DOTAP, DOTMA o DOPE) o Smarticles® (derivados amfotericos). Por ejemplo, el miR- 34a se encuentra ahora en fases clinicas en forma de liposomas Smarticles® para el tratamiento del cancer de higado, y el miR-16 en forma de nanoparticulas de EnGeneIC (minicell; EP2386640) para el tratamiento de mesotelioma pleural maligno. Esta situacion contrasta con la de medicamentos basados en siRNAs, otra familia diferente de RNAs que tienen doble cadena, los cuales no estan encontrando tantos problemas en la busqueda de vehiculos adecuados para su transfeccion, y para los cuales existen ya multitud de ensayos clinicos en marcha.

Dado el reciente interes despertado por los miRNAs como agentes terapeuticos, existe una necesidad en encontrar y desarrollar nuevos vehiculos para una administracion mas efectiva (LAM, J.K., CHOW, M.Y., ZHANG, Y. and LEUNG, S.W., 2015. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Molecular therapy.Nucleic acids, 4, pp. e252). Sin embargo, los esfuerzos en el caso de los miRNAs se esta viendo especialmente dificultados por ser moleculas de naturaleza hidrofilica, alto peso molecular y carga negativa, que impiden su paso a traves de la membrana celular.

El uso de vectores no virales mencionados arriba reduce estos problemas, sin embargo, especialmente en el caso de sistemas nanometricos, crea otras dificultades. El sistema reticuloendotelial (RES) absorbe rapidamente los sistemas nanometricos, y es la causa de la escasa estabilidad in vivo (y por tanto, escasa eficacia) de muchos de ellos (RINKENAUER, A.C., PRESS, A.T., RAASCH, M., PIETSCH, C., SCHWEIZER, S., SCHWORER, S., RUDOLPH, K.L., MOSIG, A., BAUER, M., TRAEGER, A. y SCHUBERT, U.S., 2015. Comparison of the uptake of methacrylate-based nanoparticles in static and dynamic in vitro systems as well as in

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vivo. Journal of controlled release : o fficial journal of the Controlled Release Society, 216, pp. 158-168; SADAUSKAS, E., WALLIN, H., STOLTENBERG, M., VOGEL, U., DOERING, P., LARSEN, A. y DANSCHER, G., 2007. Kupffer cells are central in the removal of nanoparticles from the organism. Particle and fibre toxicology, 4, pp. 10). El RES comprende celulas fagocitarias como los monocitos o los macrofagos, por ejemplo, las celulas de Kupffer. Aunque es generalmente aceptado que existe una correlacion entre la carga superficial positiva de la nanoparticula y una menor absorcion por parte de las celulas fagocitarias, no se conoce con exactitud que factores influyen en esta absorcion, lo que dificulta la prediccion sobre el tipo de sistemas nanometricos que tendran una estabilidad adecuada in vivo.

El desarrollo de vehiculos con propiedades mejoradas para la administracion de miRNAs resulta por tanto de gran interes.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invention resuelve los problemas mencionados anteriormente descritos, mejorando la estabilidad de los miRNAs in vivo. Los investigadores han podidio comprobar que los sistemas de la presente invencion mejoran sorprendentemente el transporte in vivo de los miRNA, y su eficacia se ve sorprendentemente incrementada. Se ha podido comprobar que evita su degradacion por parte del RES, y en particular evita la fagocitacion por parte de las celulas de Kupffer.

Por tanto, un primer aspecto de la invencion es una nanoparticula que comprende (i) entre un 60% y un 99% en peso, con respecto al peso total de la nanoparticula, de un ester de sorbitan; (ii) una sustancia cargada positivamente; y (iii) un miRNA.

La estabilidad de estos sistemas y la mejora en la transfection de miRNAs que aportan hacen las nanoparticulas de la invencion adecuadas para, por ejemplo, aplicaciones en el ambito de la farmacia, la cosmetica o la nutrition.

Un aspecto adicional es el uso de una nanoparticula de la invencion para la preparation de un medicamento. Tambien es un aspecto adicional una nanoparticula de la invencion para su uso como medicamento.

Un aspecto adicional es el uso de una nanoparticula de la invencion para la fabrication de un medicamento para el tratamiento de una indication que se selecciona del grupo que consiste en cancer, diabetes y enfermedades neurodegenerativas. Tambien es un aspecto una nanoparticula de la invencion para su uso en el tratamiento de una indicacion que se selecciona del grupo que consiste en cancer, diabetes y enfermedades neurodegenerativas.

Otra de las ventajas de la invencion es que las nanoparticulas son de facil preparacion, y la incorporation de los miRNAs se puede realizar de forma simultanea a la formation de la propia nanoparticula o en una etapa posterior de incubation, dependiendo de la naturaleza de los componentes, proporcionando asi flexibilidad a su preparacion. Asi, un aspecto adicional de la invencion es un procedimiento para la preparacion de una nanoparticula de la invencion que comprende (i) la etapa de anadir una solution organica que comprende un disolvente organico y un ester de sorbitan sobre una solucion acuosa; en donde dicha solucion organica o dicha solucion acuosa o ambas comprenden una sustancia cargada positivamente; y (ii) la etapa de evaporar disolvente organico y agua; y (iii) la etapa opcional de incubar la nanoparticula resultante de la etapa (ii) en presencia de otras sustancias; en donde un miRNA se incorpora (a) durante la etapa (i) como parte de la solucion acuosa, (b) en la etapa de incubacion (iii), o en ambas etapas (i) y (ii).

Un aspecto adicional de la invencion es una composition farmaceutica que comprende la nanoparticula de la invencion y un excipiente farmaceuticamente aceptable.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Gel de electroforesis que confirma la existencia de una asociacion efectiva entre un miRNA y las nanoparticulas. A: banda correspondiente al miR-20a libre (5 |jg/ml). B: banda en la que no se observa miR-20a libre, correspondiente al SP80-OA-CS-miR-20a (50 |jg/ml miR-20a).

Figura 2. Demostracion del efecto terapeutico in vivo. Regulation clinica de la metastasis de higado mediante el uso de nanoparticulas segun la invencion SP80-OA-CS-miR-20a. Se inyectaron en ratones lineas celulares de cancer colorectal murino c26 (200.000 celulas/animal). Los animales se trataron a partir del dia 3 tras la inoculation del tumor, y subsiguientemente cada 3 dias hasta el dia 21. En el dia 21 los animales se sacrificaron y sus higados se procesaron para el analisis histologico. Los ratones se separaron en 5 grupos de tratamiento. El grupo 1 se trato con placebo (glucosa); el grupo 2 (segun la invencion) con SP80-OA-CS-miRNA-20a; el grupo 3 con miRNA-20a libre, sin ningun vehiculo especifico; el grupo 4 con una nanoparticula SP80-OA-CS asociada a un miRControl (un miRNA que no ataca ninguna diana); el grupo 5 con nanoparticulas SP80-OA-CS sin ningun miRNA. La evaluation macroscopica de los higados confirmo el efecto terapeutico en terminos de regulacion clinica en los animales tratados con SP80-OA-CS-miRNA-20a (grupo 2).

Figure 3. Demostracion del efecto terapeutico in vivo. Analisis histologico. Se tineron con hematoxilin-eosin secciones de los higados evaluados en la figura 2, y se cuantifico bajo el microscopio el area ocupada por el tumor. Los distintos grupos se relacionaron con el grupo control (grupo 1 tratado con placebo) mediante el test-T. Las diferencias estadisticas significativas (p < 0,05) se marcan con *. Tambien se comparo el grupo 2 (tratados con SP80-OA-CS-miRNA-20a) con el grupo 5 (tratados con SP80-OA-CS sin miRNA) y su diferencia estadistica significativa (p < 0.05) indicada con +.

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DESCRIPCION DETALLADA

Definiciones

Para la nomenclatura de las nanoparticulas de la invencion se utiliza la formula [ester de sorbitan]-[sustancia cargada positivamente]. Si la nanoparticula tiene otros componentes, por ejemplo, una sustancia cargada negativamente, se indica a continuacion separado por un guion. En algunos caso se indica al final el nombre del miRNA utilizado. Ademas se utilizan las siguientes abreviaturas:

SP80: se entiende como Span-80®. El span-80® es una sustancia que resulta de esterificar el sorbitan con acido c/s-9-octadecenoico (comunmente conocido como acido oleico):, es decir, una molecula con la siguiente formula:

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Span-80®

OA: oleilamina, es decir, (Z)-octadec-9-enilamina.

CS: sulfato de condroitina. Su estructura y propiedades se explica abajo con mayor detalle.

HA: acido hialuronico. Su estructura y propiedades se explica abajo con mayor detalle.

Asi, por ejemplo, una nanoparticula que se abrevia SP80-OA-HA-miR-20a, sera una que incorpora Span-80®, oleilamina, acido hialuronico y miR-20a, preparada de acuerdo con los procedimientos descritos aqui.

En el presente documento se ha seguido para los miRNAs su nomenclatura estandar. Se ha utilizado el prefijo “miR-” seguido por un guion y un numero. De acuerdo con la nomenclatura estandar el prefijo “miR” con “R” mayuscula se reserva para los miRNAs maduros, mientras que el prefijo “mir-“ con “r” minuscula suele reservarse para los pre-miRNAs, y el prefijo “MIR” para el gen que los codifica. Para los propositos de la presente invencion, el prefijo “miR-“ los incluye todos, los miRNAs maduros, los pre-miRNAs y los genes que los codifican. Tras el numero algunos miRNAs incorporan una letra que permite distinguir miRNAs con secuencias muy similares.

Se entiende por “alquilo” una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que no contiene ninguna instauracion, de 1 a 40 atomos de carbono a menos que se indique lo contrario, opcionalmente sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados entre -ORb, -SRb, -NRaRb, -C(O)Rb, -CO2Rb, -C(O)NRaRb, -NRaC(O)Rb, NRaC(O)ORb, -NRaC(O)NRaRb, -CF3, -OCF3; donde Ra y Rb se seleccionan independientemente entre hidrogeno, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 y alquinilo C2-C6.

Se entiende por “alquenilo” una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que contiene al menos un doble enlace, de 2 a 40 atomos de carbono a menos que se indique lo contrario, opcionalmente sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados entre -ORb, -SRb, -NRaRb, -C(O)Rb, -CO2Rb, -C(O)NRaRb, - NRaC(O)Rb, -NRaC(O)ORb, -NRaC(O)NRaRb, -CF3, -OCF3; donde Ra y Rb se seleccionan independientemente entre hidrogeno, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6y alquinilo C2-C6.

Se entiende por “alquinilo” una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que contiene al menos un triple enlace, de 2 a 40 atomos de carbono a menos que se indique lo contrario, opcionalmente sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados entre -ORb, -SRb, -NRaRb, -C(O)Rb, -CO2Rb, -C(O)NRaRb, - NRaC(O)Rb, -NRaC(O)ORb, -NRaC(O)NRaRb, -CF3, -OCF3; donde Ra y Rb se seleccionan independientemente entre hidrogeno, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6y alquinilo C2-C6.

Salvo que se indique lo contrario, los porcentajes en peso que se indican en el presente texto se calculan con referencia a la suma de todos los componentes anadidos a la mezcla en la formation de la nanoparticula, con exception de los disolventes. Por ejemplo, para una nanoparticula SP80-OA-HA-miR-20a, el porcentaje en peso de SP80 seran los gramos de SP80 anadidos para la preparation de la nanoparticula, multiplicado por cien, y dividido entre la suma de gramos de SP80, OA, HA y miR-20a anadidos para la preparacion de la nanoparticula. Cuando se utiliza la particula “un” o “una” se debe entender como “al menos un(a)” o “un(a) o mas”. Por ejemplo, “un miRNA” indica que el numero de miRNAs presentes es al menos 1, pero que pueden existir mezclas de 2 o mas miRNAs.

Componentes de las nanoparticulas de la invencion

Las nanoparticulas de la invencion comprenden esteres de sorbitan. El sorbitan esta constituido por una mezcla de anhidridos ciclicos del sorbitol, como, por ejemplo, el 1,4-anhidrosorbitol, 1,5-anhidrosorbitol y 1,4,3,6- dianhidrosorbitol. Los esteres de sorbitan se consideran tensioactivos no ionicos debido a que contienen dos regiones localizadas, una de naturaleza hidrofila y otra hidrofoba.

Se entiende por “esteres de sorbitan” los derivados esterificados del sorbitan donde los grupos ester poseen un sustituyente seleccionado de entre alquilo, alquenilo y alquinilo. Los esteres de sorbitan incluyen derivados en los que uno, dos, tres o cuatro grupos hidroxilo estan esterificados, e incluso incluyen derivados esterificados en los que una molecula de ester esta presente por cada dos moleculas de sorbitan (en cuyo caso se nombran con el prefijo “sesqui-“). Asi, por ejemplo, el monooleato de sorbitan es el ester de sorbitan resultado de la esterification

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de un grupo hidroxilo con el acido oleico; el trioleato de sorbitan es el ester de sorbitan resultante de la esterificacion de tres grupos hidroxilo del sorbitan con el acido oleico.

Existen muchos tipos distintos de esteres de sorbitan atendiendo al numero de hidroxilos esterificados, la estructura del ester, la mezcla de anhidrosorbitol, y otros factores. El experto en la materia puede elegir entre distintos tipos dentro del ambito de la invencion y no esta limitado a un tipo especifico.

Esteres de sorbitan comunmente utilizados son, por ejemplo, los comercializados con el nombre Span® (sin bloques de polioxietileno) o Tween® (con bloques de polioxietileno). Por mencionar algunos ejemplos, esteres de sorbitan de la familia Span® comunes pueden ser el Span-80® (monooleato de sorbitan), el Span-20® (monolaurato de sorbitan), el Span-40® (monopalmitato de sorbitan), el Span-65 (triestearato de sorbitan), o el Span-85® (trioleato de sorbitan). Esteres de sorbitan de la familias Tween® comunes son el Tween® 20 (Polioxietilensorbitan monolaurato), Tween® 40 (Polioxietilensorbitan monopalmitato), Tween® 60 (Polioxietilensorbitan monoestearato) o Tween® 80 (Polioxietilensorbitan monooleato).

La formacion de las nanoparticulas de la invencion puede comprender mezclas de dos o mas esteres de sorbitan diferentes. Por ejemplo, una mezcla de un ester de sorbitan sin bloques de polioxietileno con otro ester de sorbitan con bloques de polioxietileno. En la preparacion de las nanoparticulas de la invencion el experto en la materia puede elegir pues diversos esteres de sorbitan para combinar con la sustancia cargada positivamente, y a modo de ejemplo, se puede seleccionar del grupo que comprende monooleato de sorbitan, dioleato de sorbitan, trioleato de sorbitan, sesqui-oleato de sorbitan, monolaurato de sorbitan, dilaurato de sorbitan, trilaurato de sorbitan, sesqui-laurato de sorbitan, monoestearato de sorbitan, diestearato de sorbitan, triestearato de sorbitan, sesqui-estearato de sorbitan, monopalmitato de sorbitan, dipalmitato de sorbitan, tripalmitato de sorbitan, sesqui-palmitato de sorbitan y combinaciones de los mismos.

Teniendo en cuenta que dichos esteres de sorbitan opcionalmente comprenden bloques de polioxietileno, el ester de sorbitan utilizado en las nanoparticulas de la invencion puede ser un compuesto de formula I

cada uno de R5, R6, R7y R8 se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, -(C=O)- alquilo C1-C40, -(C=O)-alquenilo C2-C40, -(C=O)-alquinilo C2-C40, con la condicion de que al menos uno de R5, R6, R7y R8 no es -H; y

cada uno de a, b, c y d es independientemente un numero entre 0 y 100.

Aquellos mas habituales son los comercialmente disponibles y suelen corresponder a un alquilo lineal que comprende entre 2 y 20 atomos de carbono, por ejemplo, uno con 9, 11, 13, 15 o 17 atomos de carbono, o a un grupo alquenilo lineal que comprende entre 4 y 25 atomos de carbono. Asi, un ejemplo puede ser un grupo alquenilo de formula -(CH2)n-CH=CH-(CH2)m-CH3, en donde n es un numero entero comprendido entre 1 y 10, y m es un numero entero comprendido entre 1 y 10. Uno habitualmente utilizado aquel en el que n es 7 y m es 7, correspondiente al acido oleico. Como se puede ver, los bloques de polioxietileno son opcionales, y cada uno de a, b, c y d pueden ser 0. En el caso de incluir dichos bloques de polioxietileno, la suma de a, b, c y d puede ser, por ejemplo, de entre 10 y 50 o o de entre 10 y 30 o de entre 15 y 30. Por ejemplo, en el caso del Tween® 80 (Polioxietilensorbitan monooleato) a, b, c y d suman 20.

De acuerdo con una realization preferida, R6, R7y R8 son -H. Es decir, se trata de un monoester de sorbitan, por ejemplo, uno que se selecciona del grupo que consiste en monooleato de sorbitan, monolaurato de sorbitan, monoestearato de sorbitan, monopalmitato de sorbitan, y combinaciones de los mismos. Este grupo de monoesteres de sorbitan puede representarse mediante la formula II

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R

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Formula I

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R5 se selecciona del grupo que consiste en -(C=O)-alquilo C1-C40 y -(C=O)-alquenilo C2-C40; y b es un numero entre 0 y 100, preferiblemente 0.

De nuevo, se prefiere uno en donde R5 es un alquenilo de la formula -(CH2)n-CH=CH-(CH2)m-CH3, en donde n es un numero entero comprendido entre 1 y 10, y m es un numero entero comprendido entre 1 y 10.

La proporcion de esteres de sorbitan en las nanoparticulas se situa entre el 60% y el 99% en peso con respecto al peso total de la nanoparticula. Proporciones tipicas en las que se encuentran los esteres de sorbitan son entre el 80% y el 98% en peso con respecto al peso total de la nanoparticula, por ejemplo, entre el 85% y el 95%. La proporcion de los esteres de sorbitan suele ser mayor del 87% en peso con respecto al peso total de la nanoparticula.

Otro componente esencial de la invencion es la inclusion de una sustancia cargada positivamente. En el contexto de la presente invencion, se entiende por “sustancia cargada positivamente” aquella molecula dotada de carga electrica positiva. En el campo de la presente invencion se utilizan estas sustancias para modular las propiedades de las particulas formadas, y el experto en la materia tiene a su disposicion una amplia variedad de las mismas. Estas sustancias se discuten ampliamente en numerosos libros de referenda, por ejemplo, en “Dekker Encyclopedia of Nanoscience and Nanotechnology, Volumen 4”, James A. Schwarz, Cristian I. Contescu, Karol Putyera, Editor: Marcel Dekker, 2004, o en “Encyclopedia of Polymer Science and Technology, Concise”, Herman F. Mark, tercera edicion, Editor: Wiley, 2007. Ejemplos no-limitativos son las sales de amonio, polimeros cationicos y las aminas grasas o lipofilicas.

El polimero cationico puede seleccionarse del grupo que consiste en protamina, poliglutamico, dextrano cationizado, Pululano cationizado, poliaminoacidos, proteinas cationizadas, y sus sales. Los poliaminoacidos son otra familia de sustancias cargadas positivamente que se pueden utilizar en las nanoparticulas de la invencion y que pueden seleccionarse del grupo que consiste en polilisina y poliarginina. Las proteinas cationizadas pueden seleccionarse del grupo que consiste en gelatina, albumina, colageno, atelocolageno, y sus derivados cationizados.

Las sales de amonio pueden ser sustancias que comprenden un grupo amonio o amina unido a uno, dos o tres restos que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C40, alquenilo C2-C40, alquinilo C2-C40, por ejemplo, seleccionadas del grupo que consiste en bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB) y cloruro de benzalconio (BZC). La amina grasa puede ser oleilamina. Sustancias cargadas positivamente adecuadas para la presente invencion pueden ser las sales de amonio o las aminas grasas, por ejemplo CTAB, BZC, oleilamina o mezclas de las mismas. Asi, dicha sustancia cargada positivamente puede tener la formula (R10)p (R11)(R12)NR9, en donde

cada uno de R10, R11 y R12 se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, alquilo C1- C4, alquenilo C2-C4, alquinilo C2-C4, y fenilalquilo C7-C15;

R9 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C40, alquenilo C2-C40, alquinilo C2-C40; p es 0 o 1;

y en donde tambien comprende un contraanion en el caso en el que p es 1. Cual es el contraanion no es critico y puede ser, por ejemplo, un halogenuro (F-, Cl-, Br- o I-).

La sustancia cargada negativamente se puede anadir en proporciones que van desde el 1% hasta el 39% en peso con respecto al peso total de las nanoparticulas. Cantidades preferidas oscilan entre el 2% y 20%, tipicamente entre el 3% y el 12% o entre el 2% y 9% o entre el 3% y el 8%, en peso con respecto al peso total de la nanoparticula.

Un componente opcional de las nanoparticulas de la invencion es una sustancia cargada negativamente. Estas sustancias son conocidas por el experto en la materia y en el caso de la presente invencion se prefieren aquellas capaces de formar una capa de recubrimiento en la nanoparticula. La familia de sustancias cargadas negativamente puede ser de acuerdo con la presente invencion un polimero anionico, entendiendo polimero anionico un polimero con una carga negativa.

Los investigadores han comprobado que la incorporation de una o mas sustancias cargadas negativamente proporcionan ventajas sorprendentes. En contra de lo que cabria esperar de un sistema con una carga superficial negativa, soportan los ataques del RES (no se observo fagocitacion por las celulas de Kupffer) y las nanoparticulas mejoran la capacidad de transfection del miRNA transportado. Esto es contrario a las

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observaciones descritas en la literatura en la que se establece una correlacion positiva entre la carga negativa y una mayor fagocitacion por las celulas de Kupffer.

Los polimeros anionicos son preferiblemente polisacaridos. Existe una gran variedad de estos polisacaridos a disposicion del experto en la materia, y que se utilizan frecuentemente en este campo. Una variedad preferida son aquellos que contienen un grupo carboxilo (-COOH) o sulfato (-SO3H) en el monomero que se repite. Se han mostrado especialmente adecuados para la presente invencion aquellos polisacaridos que tienen al menos un acido glucuronico en la estructura que se repite. Por ejemplo, dicha sustancia cargada negativamente puede comprender un polisacarido cuya unidad repetitiva tiene la formula [X-Y-(Z)n] en donde n es 0 o 1; X, Y y Z se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en monosacaridos, disacaridos y polisacaridos; con la condicion de que al menos uno de X, Y y Z comprende un azucar acido y en donde los grupos X, Y y Z se unen entre si a traves de enlaces -O-glucosidicos. De acuerdo con una realizacion de la invencion, dicho azucar acido se selecciona del grupo formado por los acidos aldonicos, acidos ulosonicos, acidos uronicos, acidos aldaricos y mezclas de los mismos. Por ejemplo, Y puede comprender un azucar acido, por ejemplo, un acido uronico. Un ejemplo no limitativo de dicho acido uronico puede ser uno de la formula III

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Formula III

en donde

cada uno de R1, R2 y R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, -O-, -

OR4, N(H)-R4 y -O-SO3, con la condicion de que al menos uno de R1, R2 y R3 sea -O-,

en donde los -O- forman los enlaces glucosidicos, y

en donde R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C4, alquenilo C2-C4, alquinilo C2-

C4, -(C=O)-alquilo C1-C4, -(C=O)-alquenilo C2-C4, -(C=O)-alquinilo C2-C4.

Ejemplos no limitativos de sustancias cargadas negativamente que tienen esta formula se seleccionan del grupo que consiste en acido hialuronico, sulfato de condroitina y goma xantana.

Las sustancias cargadas negativamente que pueden incorporarse a las nanoparticulas de la presente invencion tambien pueden ser aquellas que se seleccionan del grupo que consiste en acido hialuronico, acido colominico, polisialico, condroitina, queratano, dextranos, heparina, carragenanos, furceleranos, alginatos, agar agar, glucomanano, goma gelano, goma garrofin, goma guar, goma tragacanto, goma arabiga, goma xantano, goma karaya, pectinas, celulosas, almidones, sus sales, fragmentos, derivados y mezclas de los mismos.

El hialuronano es un polimero lineal que comprende la repetition de una estructura de disacarido formada por la adicion alterna de acido D-glucuronico y D-N-acetilglucosamina, unidos alternando enlaces beta-1,4 y beta-1,3 glucosidicos. En el contexto de la presente invencion, se puede emplear acido hialuronico con un amplio intervalo de pesos moleculares. El acido hialuronico de elevado peso molecular es comercialmente disponible, mientras que el de peso molecular inferior puede obtenerse mediante la fragmentation del acido hialuronico de elevado peso molecular, utilizando, por ejemplo, una enzima hialuronidasa. El termino “hialuronico, acido hialuronico, hialuronano” tal como se utiliza en la presente description incluye o bien el acido hialuronico o bien una base conjugada del mismo (hialuronato). Esta base conjugada puede ser una sal alcalina del acido hialuronico que incluyen sales inorganicas tales como, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminio y litio, sales organicas tales como sales de aminoacidos basicos a pH neutro, preferiblemente dichas sales son farmaceuticamente aceptables. En una realizacion preferida de la invencion, la sal alcalina es la sal de sodio del acido hialuronico.

La familia de los acidos polisialicos, termino que incluye al acido colominico, se encuentra integrada por polimeros lineales constituidos por residuos de acido N-acetilneuraminico (Neu5Ac; tambien conocido como acido sialico), un constituyente natural de celulas y tejidos, unidos por enlaces glicosidicos a-(2^8). Cada residuo de acido N-acetilneuraminico posee un grupo carboxilo, responsable de la carga negativa del acido colominico. Se trata de un material biocompatible y biodegradable, no inmunogenico, cuyos productos de degradation no son toxicos (Gregoriadis G et al. Cell. Mol. Life Sci. 2000, 57, 1964-1969).

El sulfato de dextrano es un glucano (polisacarido) complejo constituido por unidades de moleculas de glucosa, cada una de las cuales contiene aproximadamente dos grupos sulfato. El sulfato de dextrano se prepara mediante sulfatacion de dextrano y posterior purification mediante procedimientos de sobra conocidos por un experto en la materia.

La heparina es una sustancia de origen natural de la familia de los glicosaminoglicanos cuya estructura quimica comprende la repeticion de unidades monomericas disacaridas de acido 2-O sulfo--L-iduronico y 2-deoxi-2- sulfamido--D-glucopiranosil-6-O-sulfato. En el contexto de la presente invencion, es posible emplear tanto la heparina fraccionada como la no fraccionada. La heparina tradicional o no fraccionada se distingue claramente de la heparina fraccionada o de bajo peso molecular. La primera de ellas es una sustancia natural presente en

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todos los vertebrados. Ambos tipos de heparina se pueden utilizar en forma de base libre o en forma de sal, como por ejemplo su sal sodica o calcica. La heparina fraccionada o de bajo peso molecular se produce por despolimerizacion quimica o enzimatica de heparinas convencionales. Ejemplos de este tipo de heparinas son enoxaparina, parnaparina, dalteparina y nadroparina, asi como sus sales tales como las sales de sodio y calcio. Los derivados de heparina tambien pueden ser empleados en la composicion de los sistema nanoparticulares de la presente invencion. Estos derivados son conocidos en el estado de la tecnica y se originan como consecuencia de la reactividad de los diferentes grupos funcionales presentes en la molecula. Asi, heparinas N- acetiladas, O-descarboxiladas, oxidadas o reducidas son ampliamente conocidas.

El sulfato de condroitina es un glucosaminoglucano (GAG) sulfatado compuesto por una cadena de azucares alternados. Se encuentra normalmente unido a proteinas como parte de un proteoglucano. En el contexto de la presente invencion, el termino “sulfato de condroitina” incluye todos sus diferentes isomeros y derivados, asi como combinaciones de los mismos. Por ejemplo, se selecciona entre las siguientes sustancias y combinaciones de las mismas, resumidas en la formula IV

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- sulfato de condroitina A que esta sulfatado predominantemente en el carbono 4 del azucar N- acetilgalactosamina (GalNAc) y que tambien se conoce como sulfato de 4-condroitina (R13=H, R14=SOaH y R15=H)

- sulfato de condroitina B que se denomina tambien sulfato de dermatano. Esta sustancia esta compuesta por unidades de repeticion lineales que contienen N-acetilgalactosamina y o bien acido L- iduronico o bien acido glucuronico, y cada disacarido puede estar sulfatado una vez o sulfatado dos veces. Esta presente mayoritariamente en la piel, pero tambien se encuentra en vasos sanguineos, valvulas cardiacas, tendones y pulmones.

- sulfato de condroitina C que esta sulfatado predominantemente en el carbono 6 del azucar GalNAc y que se conoce tambien como sulfato de 6-condroitina (R13=SO3H, R14=H y R15=H);

- sulfato de condroitina D que esta sulfatado predominantemente en el carbono 2 del acido glucuronico y en el carbono 6 del azucar GalNAc y se conoce tambien como sulfato de 2,6-condroitina (R13=SO3H, R14=H y R15= SO3H);

- sulfato de condroitina E que esta sulfatado predominantemente en los carbonos 4 y 6 del azucar GalNAc y se conoce tambien como sulfato de 4,6-condroitina (R13=SO3H, R14= SO3H y R15=H); y

en donde “e” representa el numero de repeticiones del monomero, es decir, su grado de polimerizacion.

El termino “sulfato de condroitina” tambien incluye sales organicas e inorganicas del mismo. Generalmente, tales sales se preparan, por ejemplo, mediante reaccion de la forma basica de este compuesto con una cantidad estequiometrica del acido apropiado en agua o en un disolvente organico o en una mezcla de los dos. Generalmente, se prefieren medios no acuosos tales como eter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Ejemplos de sales inorganicas incluyen, sales de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminio y litio, y las sales organicas incluyen, por ejemplo, sales de etilendiamina, etanolamina, N,N-dialquileno- etanolamina, trietanolamina, glucamina y aminoacidos basicos. Preferiblemente las sales son farmaceuticamente aceptables.

El sulfato de queratano es un glucosaminoglicano sulfatado similar al sulfato de condroitina en el que el grupo sulfato se encuentra en el glucuronico. Concretamente, se encuentra constituido por galactosa y GlcNAc-6- sulfato, unidos mediante un enlace (3-1,4.

La carragenina o carragenano esta formada por unidades de galactosa y/o de anhidrogalactosa, sulfatadas o no, unidas por enlaces alternos -1,3 y -1,4. Dependiendo del grado de sulfatacion, de las posiciones de los grupos sulfato y de la presencia de grupos de anhidrogalactosa se distinguen varios tipos de carragenano, todos incluidos en el ambito de la presente invencion.

El glucomanano es un polisacarido soluble en agua de origen natural. La estructura quimica de este compuesto consiste en una cadena polimerica lineal con una pequena proporcion de ramificaciones. En concreto, esta formado por unidades de D-manosa y D-glucosa unidas por enlaces -1,4 en una proporcion de 1.6:1, respectivamente. En una realizacion particular de la invencion, el glucomanano empleado es un derivado de

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glucomanano con carga negativa seleccionado entre los derivados fosforilados, carboximetil y dicarboxi- glucomananos.

La goma gelano es un polisacarido soluble en agua de origen natural. La estructura quimica de este compuesto consiste en una cadena polimerica formada por unidades de a-L-ramnosio, p-Dacido glucuronico y dos unidades de p-D-glucosa. El poKmero puede encontrarse en forma parcialmente acetilada. Dependiendo de su grado de acetilacion, la goma gelano proporciona geles con propiedades mecanicas distintas. En el contexto de la presente invencion, el termino “goma gelano” incluye todos sus diferentes derivados, asi como combinaciones de los mismos.

Sin querer estar limitado por la teoria, pensamos que las nanoparticulas de la invencion son estructuras solidas homogeneas en las que los miRNAs son adsorbidos. Esto es contrario a los sistemas utilizados para transportas miRNAs que se han venido utilizando hasta ahora. Como ya se ha mencionado arriba, los que se estan utilizando ahora para la realization de ensayos clinicos de miRNAs utilizan liposomas o vesiculas, es decir, estructuras de bicapa lipidica que encierran en su interior una fase acuosa. Los miRNAs quedan unidos a la estructura solida que forman los esteres de sorbitol y la sustancia cargada positivamente.

El tamano medio de las nanoparticulas de la invencion es de entre 1 y 999 nanometros. Y pueden tener un potencial negativo o positivo, dependiendo de los componentes anadidos, por ejemplo, si comprenden o no una sustancia cargada negativamente, o de la concentration del o de los miRNA(s) anadido(s). De acuerdo con una realizacion preferida, la nanoparticula de la invencion tienen un potencial positivo comprendido entre +1 y +100 mV. De acuerdo con otra realizacion preferida, la nanoparticula de la invencion tienen un potencial negativo comprendido entre -25 y -40 mV.

Las nanoparticulas de la invencion pueden incluir otras sustancias auxiliares, por ejemplo, un derivado de oxido de etileno, un compuesto en el que se repite una unidad -CH2CH2O-. Dicho derivado de oxido de etileno puede ser un compuesto de formula R16O[CH2-CH2-O]f-C(H)(R17)(R18), en donde R17 es un grupo carbonilo o hidrogeno; R18 es un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo, de entre 2 a 24 atomos de carbono; R16 es hidrogeno o un grupo alquilo de entre 1 a 6 atomos de carbono; f es un valor de entre 1 y 100, por ejemplo, entre 1 y 50, o entre 1 y 24. Ejemplos de derivados de oxido de etileno, sin limitarse a estos, son polietilenglicol dodecil eter (Brij 30), polietilenglicol hexadecil eter (Brij 56), polietilenglicol 2-octadecil eter (Brij 72), polietilenglicol 8-octadecil eter (Brij 78), polietilenglicol 8-estearato (Myrj 45), 2-hidroxietil octadecanoato (Myrj 52), monoestearato de etilen glicol.

Los derivados de oxido de etileno se pueden incorporar en proporciones que varian entre el 0,1% y el 20% en peso con respecto al peso total de la nanoparticula. Dependiendo de las aplicaciones, las proporciones pueden variar y ser de, por ejemplo, entre el 0,1% y el 15% o entre el 5% y el 15% o entre el 7 y el 13% en peso, con respecto al peso total de la nanoparticula.

Aplicaciones y miRNAs

El otro componente esencial de las nanoparticulas de la invencion es un miRNA o una mezcla de miRNAs, los cuales se suelen encontrar en proporciones por debajo del 25% en peso con respecto al peso total de la nanoparticula. La proportion en la que se encuentran en cada caso puede ajustarse y puede ser, por ejemplo de entre 0,01 y 10% o entre 0,2% y 3% en peso con respecto al peso total de la nanoparticula. Los miRNAs que se utilizan en las nanoparticulas de la invencion son moleculas de RNA que tipicamente comprenden entre 5 y 30 bases o entre 15 y 25 bases.

Los miRNAs tienen multiples aplicaciones, y por tanto tambien las nanoparticulas de la invencion, por ejemplo, en el campo farmaceutico, cosmetico o de la nutrition. Asi, por ejemplo, se estudia en la actualidad la aplicacion terapeutica de diversos miRNAs en campos como el cancer (miRNA-20a, miR-29, miR-652 miR-34a, miR-16), la diabetes o las enfermedades neurodegenerativas. Uno de los campos en los que mas se ha desarrollado el uso de los miRNAs es el del cancer. Por tanto, una realizacion preferida son las nanoparticulas de la invencion para su uso en el tratamiento de un cancer que se selecciona del grupo que consiste en colorectal, mesotelioma pleural maligno, de higado, pancreas, colon y las metastasis hepatica y de pulmon.

El termino “tratamiento” o “tratar” en el presente documento significa administrar las nanoparticulas de la invencion para prevenir, reducir o eliminar uno o mas de los sintomas o causas o efectos (metastasis) de una enfermedad o condition. Tambien abarca la prevention, reduction o elimination de las secuelas de dicha enfermedad o condicion, o de los efectos secundarios o adversos provocados por otra medicacion utilizada. Tambien abarca la administration para mantener la salud en sujetos en riesgo de padecer dicha enfermedad. El termino “reducir” se entiende como cualquier mejora en la situation del paciente, bien medido por parametros subjetivos (por ejemplo, perception del paciente) u objetivos (medicion de parametros fisiologicos, bioquimicos, histopatologicos, microbiologicos-analiticos).

Por ejemplo, las nanoparticulas de la invencion para su uso en el tratamiento de la metastasis de higado es una realizacion de la invencion, y se ha podido comprobar que permiten reducir o eliminar la metastasis y los efectos dicha metatesis de higado que acompana muchas veces al cancer colorectal, lo cual tambien constituye una realizacion de la invencion. En una realizacion las nanoparticulas de la invencion comprenden miR-20a, miR-29, miR-652 o mezclas de las mismas, preferiblemente miRNA-20a, para su uso en el tratamiento del cancer colorectal y/o su metastasis de higado asociado.

Otro aspecto de la invencion es un metodo para el tratamiento de un individuo en necesidad de tratamiento que comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de nanoparticulas de la invencion. En el sentido utilizado en esta description “cantidad terapeuticamente eficaz” se refiere a la cantidad de principio activo

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calculada para producir el efecto deseado y estara determinada generalmente, entre otros motivos, por las propias caracteristicas del principio activo utilizado y el efecto terapeutico que va a obtenerse. En una realizacion particular, la dosis de principio activo administrada a un sujeto para el tratamiento o la profilaxis de los estados mencionados anteriormente esta en el intervalo de 10-10 a 1010 mg/kg de peso corporal, normalmente entre 10-3 y 103 mg/kg o entre 10-2 y 50 mg/Kg de peso corporal.

Por tanto, las nanoparticulas de la invencion pueden formar composiciones farmaceuticas junto con un excipiente farmaceuticamente aceptable. De hecho, se prefiere que todos los componentes sean farmaceuticamente aceptables. El termino “farmaceuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiologicamente tolerables y no producen normalmente una reaccion no deseada alergica o similar, tal como molestias gastricas, mareos y similares, cuando se administra a un ser humano. Preferiblemente, tal como se utiliza en el presente documento, el termino “farmaceuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o de un estado o enumerado en la Farmacopea de los EE.UU. u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales y mas particularmente en seres humanos.

El termino "excipiente" se refiere a un diluyente, adyuvante, o vehiculo con el que se administran las nanoparticulas de la invencion. Son sustancias que, por ejemplo, se anaden a los principios activos o a sus asociaciones para servirles de vehiculo, posibilitar su preparacion y estabilidad, modificar sus propiedades organolepticas o determinar las propiedades fisicoquimicas del medicamento y su biodisponibilidad. Tales vehiculos farmaceuticos pueden ser liquidos esteriles, tales como agua o aceites, incluyendo los de origen petrolifero, animal, vegetal o sintetico, tales como aceite de cacahuete aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y similares. Se emplean preferiblemente agua o soluciones salinas de disolucion acuosa y disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehiculos, particularmente para disoluciones inyectables. Se describen vehiculos farmaceuticos adecuados en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin.

La composicion farmaceutica o medicamento puede hallarse en cualquier forma adecuada para su administracion a humanos y/o animales, preferentemente humanos, incluyendo bebes, ninos y adultos y puede prepararse por procedimientos estandar conocidos por los expertos en la materia. El medicamento puede prepararse por procedimientos estandar conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, reflejado en “Pharmaceutics: The Science of Dosage Forms, segunda edicion, Aulton, M.E. (ed.) Churchill Livingstone, Edinburgo (2002); “Encyclopedia of Pharmaceutical Technology”, segunda edicion, Swarbrick, J. y Boylan J.C. (eds.), Marcel Dekker, Inc. Nueva York (2002); “Modern Pharmaceutics”, cuarta edicion, Banker G.S. y Rhodes C.T. (eds.) Marcel Dekker, Inc. Nueva York 2002 y “The Theory and Practice of Industrial Pharmacy”, Lachman L., Lieberman H. y Kanig J. (eds.), Lea & Febiger, Filadelfia (1986). Las descripciones respectivas se hallan incorporadas en este documento por referencia y forman parte de la descripcion. La composicion del medicamento puede variar dependiendo de la via de administracion. Ejemplos ilustrativos no limitantes de dichas formas farmaceuticas de administracion de la composicion farmaceutica de la invencion incluyen formulaciones orales o bucales (liquidas, disolucion, suspension, emulsion, gel, pasta, polvo, liofilizado oral, comprimidos, capsulas, pildoras, emulsiones); formulaciones sublinguales; formulaciones oftalmicas; formulaciones para el oido (oticas); formulaciones topicas; formulaciones nasales; formulaciones rectales; formulaciones vaginales; formulaciones intrauterinas; formulaciones para inhalacion o pulmonares; formulaciones parenterales, por ejemplo, formulacion inyectables, por ejemplo, para inyecciones intravenosas o para inyecciones subcutaneas.

Procedimiento de preparacion

Otra de las ventajas de la presente invencion es la facilidad con la que se preparan las nanoparticulas, procedimiento que no requiere inyeccion u homogeneizacion. En terminos generales el procedimiento comprende (i) la etapa de anadir una solucion organica que comprende un disolvente organico y un ester de sorbitan sobre una solucion acuosa; (ii) la etapa de evaporar el disolvente y el agua; y (iii) una etapa opcional de incubacion. La sustancia cargada positivamente puede incorporarse a la solucion organica o a la solucion acuosa. Por otro lado, el miRNA (o los miRNAs) se incorpora(n), bien durante la etapa (i) como parte de la solucion acuosa, bien en la etapa de incubacion (iii), o bien en ambas etapas (i) y (iii). En caso de que no se incorpore ningun miRNa durante la etapa (i), es necesario proceder a la incubacion (etapa (iii)) para incorporar el miRNAs (o los miRNAs).

Asi, una alternativa es un procedimiento que comprende (i) la etapa de anadir una solucion que comprende un disolvente organico, un ester de sorbitan y una sustancia cargada positivamente sobre una solucion acuosa que comprende un miRNA; y (ii) la etapa de evaporar el disolvente y el agua. Otra alternativa comprende (i) la etapa de anadir una solucion que comprende un disolvente organico, un ester de sorbitan y una sustancia cargada positivamente sobre una solucion acuosa; (ii) la etapa de evaporar el disolvente y el agua; y (iii) la etapa de incubar la nanoparticula resultante de la etapa (ii) en presencia de un miRNA. Procedimientos adecuados se describen, por ejemplo, en WO2013/068625.

A continuacion se hace una descripcion detallada que se complementara con los ejemplos.

La adicion de la fase organica se realiza preferiblemente bajo agitacion de la fase acuosa. Los componentes que adicionalmente puede comprender el sistema, como por ejemplo una sustancia cargada negativamente, pueden anadirse a la fase organica o a la fase acuosa, dependiendo de las caracteristicas de la sustancia que se incorpore al sistema. Asi, en una realizacion particular, la disolucion acuosa ademas comprende una sustancia cargada negativamente.

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Alternativamente, los componentes adicionales pueden incorporarse en una etapa posterior, por ejemplo, la etapa (iii) de incubacion de la dispersion de nanoparticulas formadas con una disolucion que comprende alguna de estas sustancias.

Alternativamente, es posible obtener nanoparticulas pegiladas o modificadas con derivados de oxido de etileno. Estas nanoparticulas pegiladas o modificadas con derivados de oxido de etileno se pueden preparar en una unica etapa y ademas tiene la ventaja de que no es necesario ninguna reaccion quimica a fin de anclar las cadenas de oxido de etileno a la superficie de las nanoparticulas. Asi, en otra realizacion particular la fase organica comprende ademas un derivado de oxido de etileno, por ejemplo, uno de formula R16O[CH2-CH2-O]f- C(H)(R17)(R18) como los descritos mas arriba.

Para la preparacion de las nanoparticulas de la invencion normalmente es preferible que el disolvente de la fase organica sea un solvente hidromiscible, por ejemplo, un alcohol alifatico, tal como el etanol, facil de evaporar, mas inocuo y estable frente a los componentes de las nanoparticulas.

Las concentraciones de los diferentes componentes no es critica. Por ejemplo, el ester de sorbitan se disuelve en la fase organica en una concentracion que puede ser de entre 0,1 y 10 mg/ml, o entre 2 y 7 mg/ml. Por otro lado, las sustancia cargada positivamente puede estar en una concentracion de entre 0,01 y 5,0 mg/mL, por ejemplo, entre 0,1 y 2,0 mg/mL preferiblemente entre 0,2 y 0,5 mg/mL. La sustancia cargada negativamente puede estar en una concentracion de entre 0,01 y 5,0 mg/mL, por ejemplo, entre 0,05 y 2,0 mg/mL preferiblemente entre 0,1 y 0,3 mg/mL.

La mezcla de las fases acuosas y organica puede hacerse a temperatura ambiente o bien calentando una o ambas fases.

Se ha comprobado que las nanoparticulas de la invencion aguantan sin degradacion la liofilizacion y otros procesos de deshidratacion. Por tanto, el procedimiento puede comprender una etapa adicional de deshidratacion total o parcial (liofilizacion o desecacion, respectivamente). De este modo es posible preservarlas durante su almacenamiento para que conserven sus caracteristicas iniciales y se reduzcan los volumenes de producto que van a manipularse. El proceso de liofilizacion o desecacion conduce, respectivamente, a un producto deshidratado total o parcialmente. En caso deshidratacion, el procedimiento comprende una etapa adicional en la que se regeneran las nanoparticulas deshidratadas parcialmente o liofilizadas. De este modo es posible deshidratar las nanoparticulas para obtener un producto mas estable durante el almacenamiento y posteriormente regenerar o recuperar las nanoparticulas mediante un proceso de re-suspension en un medio acuoso.

De este modo, un ultimo aspecto de la invencion se dirige a nanoparticulas obtenibles como se describio anteriormente.

Los componentes descritos arriba se pueden combinar para que en cada caso la nanoparticula de la invencion que resulta se adapte a la situacion concreta, y la presente invencion abarca distintas combinaciones de esteres de sorbitan, sustancias cargadas positivamente, miRNAs, asi como sustancias cargadas negativamente y otros componentes opcionales en caso de ser usados. Por ejemplo, una realizacion de la presente invencion es una nanoparticula que comprende (i) uno o mas miRNAs (por ejemplo, miR-20a, miR-29, miR-652 o mezclas de los mismos); (ii) un ester de sorbitan de formula I, tal y como se ha definido anteriormente; (iii) una sustancia cargada positivamente de formula (R10)p (R11)(R12)NR9, tal y como se ha descrito mas arriba; y (iv) un polisacarido cargado negativamente. En otra realizacion, la presente invencion comprende (i) uno o mas miRNAs (por ejemplo, miR-20a, miR-29, miR-652 o mezclas de los mismos); (ii) un ester de sorbitan de formula I, tal y como se ha definido anteriormente; (iii) una sustancia cargada positivamente que se selecciona del grupo que consiste en CTAB, BZC, oleilamina y mezclas de las mismas; y (iv) un polisacarido cargado negativamente. Otra realizacion de la presente invencion es una nanoparticula que comprende (i) uno o mas miRNAs; (ii) un ester de sorbitan de formula I, tal y como se ha definido anteriormente; (iii) una sustancia cargada positivamente de formula (R10)p (R11)(R12)NR9, tal y como se ha descrito mas arriba; y (iv) un polisacarido cargado negativamente en donde al menos uno de sus monomeros comprende un grupo -COOH o -SO3H.

Otra realizacion de la presente invencion es una nanoparticula que comprende (i) uno o mas miRNAs; (ii) un ester de sorbitan; (iii) una sustancia cargada positivamente; y (iv) un polisacarido cargado positivamente en donde al menos uno de sus monomeros comprende un grupo -COOH o -SO3H. Otra realizacion de la presente invencion es una nanoparticula que comprende (i) uno o mas miRNAs; (ii) un ester de sorbitan de formula I, tal y como se ha definido anteriormente; (iii) una sustancia cargada positivamente de formula (R10)p (R11)(R12)NR9, tal y como se ha descrito mas arriba; y (iv) un polisacarido cargado negativamente. Las anteriores combinaciones y otras que no se describen explicitamente forman tambien parte del ambito de proteccion.

Hay que tener en cuenta que, ademas del miRNA, las nanoparticulas de la invencion pueden comprender otros componentes como, por ejemplo, otros principios activos de interes, para lo cual bastaria con anadirlos, a la solucion organica o a la solucion acuosa o a ambas durante la preparacion de la nanoparticula. Tambien seria posible anadirlas durante la etapa adicional (iii) de incubacion.

EJEMPLOS

Para la descripcion de algunos de los siguientes ejemplos se hace referencia a resultados obtenidos mediante las siguientes tecnicas:

El tamano de las nanoparticulas se determino mediante la tecnica de espectroscopia de correlation fotonica (PCS) y usando un Zeta Sizer (Zeta Sizer, Nano Series, Nano-ZS, Malvern Instruments, R.U.), obteniendo el

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tamano medio de la poblacion y el indice de polidispersion del mismo. El procedimiento comprende diluir las muestras en agua Milli-Q a una proporcion 1:19. Cada analisis se llevo a cabo a 25°C con un angulo de deteccion de 173°.

El potencial zeta de las nanoparticulas se detecto mediante la tecnica de anemometria de dispersion de laser (LDA) usando un Zeta Sizer (Zeta Sizer, Nano series, Nano-ZS, Malvern Instruments, R.U.). El procedimiento comprende diluir las muestras en solucion de KCl milimolar.

La eficacia de la asociacion de los miRNAs con las nanoparticulas se determino mediante la tecnica de electroforesis en gel de agarosa. El procedimiento comprende preparar un gel de agarosa al 2% en tampon TAE (Tris-Acetato-EDTA, Tris 40 mM, acido acetico al 1%, EDTA 1 mM), pH 8 con SYBR®. Como sustancia de carga se uso tincion de gel de acidos nucleicos de oro y glicerol. Se aplico una diferencia de potencial de 25 mV durante 30 minutos y se uso miRNA libre como control.

Tal y como se usan en los siguientes ejemplos, se adquirieron los siguientes polimeros de diferentes establecimientos comerciales: acido hialuronico (Bioiberica, Espana), sulfato de condroitina (Calbiochem, EE.UU.). El Span® 80 y la oleilamina se adquirieron de Sigma (Espana). Los diferentes miRNAs usados se adquirieron de Exiqon (Dinamarca). Los demas productos indicados en los ejemplos a continuacion se adquirieron de Sigma (Espana).

Ejemplo 1: Prueba de concepto In vivo del efecto terapeutico en terminos de regulacion clinica de las metastasis hepaticas proporcionadas

Preparacion de nanoparticulas

Para la elaboration de las nanoparticulas, se preparo una solucion de monooleato de sorbitan (Span® 80, SP80) y oleilamina (OA) en 3 ml de etanol (fase organica) a una concentration de 6,6 y 0,33 mg/ml respectivamente. Despues, esta fase organica se anadio a 6 ml de una fase acuosa agitada que contenia sulfato de condroitina (CS) a una concentracion de 0,125 mg/ml, dando lugar de este modo a la formation espontanea de NPs. El etanol se retiro finalmente a presion reducida en un evaporador rotatorio. El miRNA se incluyo en la fase acuosa a una concentracion de 8,33 |jg/ml durante la elaboracion de las nanoparticulas. Para este proposito se selecciono miR-20a. Estas proporciones corresponden a porcentajes en peso con respecto al peso total de la nanoparticula de 91,67% de SP80, 4,63% de OA, 3,47% de CS y 0,23% de miR-20a.

Caracterizacion de las nanoparticulas

Se midio el tamano y potencial zeta de las nanoparticulas mediante espectroscopia de correlation fotonica (photon correlation spectroscopy) y anometria Doppler laser (laser Doppler anemometry), respectivamente.

Formulation

tamano (nm) Pdl Z, Potencial

SP80-OA-CS

115,9 ± 15,6 0,073 -37,5 ± 1,5

SP80-OA-CS-miR20 (50 pg/ml miR-20a)

144,1± 1,7 0,062 -31,9 ± 2,1

Tabla 1. Caracteristicas fisico-quimicas de las nanoparticulas de la invention

Eficiencia de la asociacion entre el miRNA y la nanoparticula

La eficiencia de la carga del microRNA a las nanoparticulas se confirmo mediante la tecnica de electroforesis en gel de agarosa, tal como se ilustra en la Figura 1.

Manejo de animales:

Todos los experimentos descritos en este trabajo se han llevado a cabo de acuerdo con las leyes espanolas y europeas relativas al cuidado de animales para experimentation. La manipulation de animales y los metodos experimentales de nuestro laboratorio se han analizado y aprobado por el Comite de Experimentacion Animal de la Universidad del Pais Vasco, Espana. Se llevaron a cabo todos los esfuerzos para minimizar el numero de animales empleados y su sufrimiento. Se obtuvieron ratones C57 BL/6NCrl (hembras, 8 semanas de edad) a traves de Charles River Laboratories Espana, S.A. Se alojo a los ratones en la Unidad de Recursos Biologicos de la Universidad del Pais Vasco y se los mantuvo en un ambiente de temperatura controlada (21 ± 1 °C), humedad relativa del 55 ± 5%, ciclo de luz/oscuridad de 08h00-20h00 y se les suministro alimento para raton convencional y agua ad libitum.

Modelo de metastasis hepatica y evaluacion clinica: Se desarrollo un modelo de metastasis hepatica inyectando en los ratones una linea celular de cancer colorrectal murino c26 (200.000 celulas/animal). Se anestesio a los animales con isofluorano (5% y 1,5% de mantenimiento) y se inyectaron las celulas en el bazo. Despues de la intervention se suturaron las incisiones. Se trato a los animales en el dia 3 despues de la inoculation del tumor y posteriormente cada 3 dias hasta el dia 21 con una dosis total de 25 pg de miRNA por animal. Los ratones se separaron en 5 grupos diferentes dependiendo del tratamiento. El grupo 1 se trato con placebo (glucosa); el grupo 2, segun la invencion, se trato con nanoparticulas de SP80-OA-CS asociadas con

5

10

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miR-20a con un marcador fluorescente (6-carboxifluorescema) (FAM); el grupo 3 se trato con miR-20a libre o desnudo (sin ningun vetnculo espedfico); el grupo 4 se trato con nanoparticulas de SP80-OA-CS asociadas con un miRControl (este miR no ataca a ningun mRNA); el grupo 5 se trato con las nanoparticulas SP80-OA-CS en blanco (sin mRNA asociado). En el dia 21 despues de la inoculacion se sacrifico a los animales y se observaron los higados y se procesaron posteriormente para analisis histologico.

Histologia:

Despues de la dislocacion cervical se extirparon rapidamente los Idgados y se fijaron en paraformaldehido (PFA al 4%) en PBS, durante toda la noche a 4°C. Los higados fijados se procesaron para su inclusion en parafina. Se montaron secciones seriadas de 10 pm de grosor en cinco series paralelas y se procesaron para hematoxilina- eosina. Se capturaron imagenes microscopicas en un microscopio Zeiss.

Algunas secciones de higado se observaron 48 horas despues de la ultima inyeccion. Las secciones se incubaron con marcador de receptor anti-manosa y anticuerpo Alexa 593 anti-raton. El marcador verde del miR- 20a (FAM) se observo dentro de las celulas endoteliales marcadas en rojo, lo que confirma el ataque endotelial o la distribucion especifica a las celulas endoteliales sinusoides que proporcionan las nanoparticulas al miR-20a. Despues de la evaluation macroscopica de los higados, se confirmo el efecto terapeutico en terminos de regulation cKnica de las metastasis hepaticas en el grupo de animales tratados con SP80-OA-CS asociadas con miR-20a (Figura 2).

Las secciones de los higados de la Figura 2 se tineron con hematoxilina-eosina y se cuantifico el area ocupada por el tumor bajo el microscopio. Los diferentes grupos se relacionaron con el grupo de control (tratado con glucosa como placebo) usando del test-T. Las diferencias estadisticamente significativas (p < 0,05) se indicaron con un *. Asimismo, se compararon el grupo tratado con nanoparticulas de SP80-OA-CS asociadas con miR-20a y con nanoparticulas de SP80-OA-CS en blanco (sin mRNA asociado) y la diferencia estadisticamente significativa (p < 0,05) se indico con un +. Tal como puede apreciarse en la Figura 3, el area ocupada por el tumor fue sorprendentemente mas pequena en los ratones tratados con nanoparticulas de SP80-OA-CS asociadas con miR-20a (segun la invention) que en ratones tratados solo con miR-20a.

Esto confirma una mejora imposible de anticipar a priori de las nanoparticulas segun la invencion en la vehiculizacion de miRNAs in vivo. Mas aun, resulta sorprendente el efecto terapeutico proporcionado por estas nanoparticulas en terminos de regulacion clinica de metastasis hepaticas.

Ejemplo 2: Liofilizacion

Las nanoparticulas desarrolladas se evaluaron con exito respecto de su capacidad para mantener la asociacion al miRNA despues de un proceso de liofilizacion.

Claims (38)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Una nanoparticula que comprende (i) entre un 60% y un 99% en peso, con respecto al peso total de la nanoparticula, de un ester de sorbitan; (ii) una sustancia cargada positivamente; y (iii) un miRNA.
2. 2. La nanoparticula segun la reivindicacion 1, caracterizada por que dicha sustancia cargada positivamente comprende un grupo amonio o amina unido a uno, dos o tres restos que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C40, alquenilo C2-C40, alquinilo C2-C40.
3. 3. La nanoparticula segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que dicha sustancia cargada positivamente tiene la formula (R10)p (R11)(R12)NR9, en donde

   cada uno de R10, R11 y R12 se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, alquilo C1-

   C4, alquenilo C2-C4, alquinilo C2-C4, y fenilalquilo C7-C15;

   R9 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C40, alquenilo C2-C40, alquinilo C2-C40;

   p es 0 o 1;

   y en donde tambien comprende un contranion en el caso en el que p es 1.
4. 4. La nanoparticula segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que dicha sustancia cargada positivamente se selecciona del grupo que consiste en oleilamina, cloruro de benzalconio y bromuro de cetil trimetil amonio.
5. 5. La nanoparticula segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que dicho ester de sorbitan comprende un compuesto de formula I

   cada uno de R5, R6, R7y R8 se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, -(C=O)- alquilo C1-C40, -(C=O)-alquenilo C2-C40, -(C=O)-alquinilo C2-C40, con la condicion de que al menos uno de R5, R6, R7y R8 no es -H;

   cada uno de a, b, c y d es independientemente un numero entre 0 y 100.
6. 6. La nanoparticula segun la reivindicacion 5, caracterizada por que dicho grupo alquilo es lineal y comprende entre 2 y 20 atomos de carbono.
7. 7. La nanoparticula segun cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, caracterizada por que dicho grupo alquilo tiene 9, 11, 13, 15 o 17 atomos de carbono.
8. 8. La nanoparticula segun cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 o 7, caracterizada por que dicho grupo alquenilo es lineal y comprende entre 4 y 25 atomos de carbono.
9. 9. La nanoparticula segun cualquiera de las reivindicaciones 5, 6, 7 u 8, caracterizada por que dicho grupo alquenilo tiene la formula -(CH2)n-CH=CH-(CH2)m-CH3, en donde n es un numero entero comprendido entre 1 y 10, y m es un numero entero comprendido entre 1 y 10.
10. 10. La nanoparticula segun la reivindicacion 9, caracterizada por que n es 7 y m es 7.
11. 11. La nanoparticula segun cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, caracterizada por que a, b, c y d son 0.
12. 12. La nanoparticula segun cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, caracterizada por que la suma de a, b, c y

    d se encuentra entre 10 y 30.
13. 13. La nanoparticula segun cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, caracterizada por que R6, R7y R8 son -H.
14. 14. La nanoparticula segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que dicho ester de

    sorbitan tiene la formula II

    imagen1

    R

    8

    Formula I

    en donde

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    15

    20

    25

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    40
15. 15.
16. 16.
17. 17.
18. 18.
19. 19.
20. 20.
21. 21.
22. 22.

    imagen2

    en donde

    R5 se selecciona del grupo que consiste en -(C=O)-alquilo C1-C40 y -(C=O)-alquenilo C2-C40; y b es un numero entre 0 y 100.

    La nanoparticula segun la reivindicacion 14, caracterizada por que b es 0; y R5 tiene la formula -(CH2V CH=CH-(CH2)m-CH3, en donde n es un numero entero comprendido entre 1 y 10, y m es un numero entero comprendido entre 1 y 10.

    La nanoparticula segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que tiene un potencial positivo comprendido entre +1 y +100 mV.

    La nanoparticula segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizada por que comprende una sustancia cargada negativamente.

    La nanoparticula segun la reivindicacion 17, caracterizada por que dicha sustancia cargada negativamente comprende un polisacarido cuya unidad repetitiva tiene la formula [X-Y-(Z)n] en donde n es 0 o 1; X, Y y Z se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en monosacaridos, disacaridos y polisacaridos; con la condition de que al menos uno de X, Y y Z comprende un azucar acido y en donde los grupos X, Y y Z se unen entre si a traves de enlaces -O-glucosidicos.

    La nanoparticula segun la reivindicacion 18, caracterizada por que dicho azucar acido se selecciona del grupo formado por los acidos aldonicos, acidos ulosonicos, acidos uronicos, acidos aldaricos y mezclas de los mismos.

    La nanoparticula segun la reivindicacion 18, caracterizada por que Y comprende un azucar acido.

    La nanoparticula segun la reivindicacion 20, caracterizada por que Y comprende un acido uronico.

    La nanoparticula segun cualquiera de las reivindicaciones 19 o 21, caracterizada por que dicho acido uronico tiene la formula III

    imagen3

    Formula III

    en donde

    cada uno de R1, R2 y R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, -O-, - OR4, N(H)-R4 y -O-SO3, con la condicion de que al menos uno de R1, R2 y R3 sea -O-, en donde -O- es el atomo de oxigeno que forma el enlace glucosidico, y

    en donde R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C4, alquenilo C2-C4, alquinilo C2-C4, - (C=O)-alquilo C1-C4, -(C=O)-alquenilo C2-C4, -(C=O)-alquinilo C2-C4.
23. 23. La nanoparticula segun la reivindicacion 17, caracterizada por que dicha sustancia cargada negativamente es un polisacarido que comprende uno o mas grupos carboxilicos.
24. 24. La nanoparticula segun la reivindicacion 23, caracterizada por que dicha sustancia cargada negativamente comprende acido glucuronico en su estructura repetitiva.
25. 25. La nanoparticula segun cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, caracterizada por que dicha sustancia cargada negativamente se selecciona del grupo que consiste en acido hialuronico, sulfato de condroitina y goma xantana.
26. 26. La nanoparticula segun cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25, caracterizada por que tiene un potencial negativo comprendido entre -25 y -40 mV.

    5

    10

    15

    20

    25
27. 27. La nanoparticula segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho miRNA se selecciona del grupo que consiste en miR-20a, miR-29, miR-652 miR-34a, miR-16 y mezclas de los mismos.
28. 28. La nanoparticula segun la reivindicacion 27, caracterizada por que dicho miRNA es miR-20a.
29. 29. Una composition farmaceutica que comprende la nanoparticula tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
30. 30. Uso de la nanoparticula tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, para la fabrication de un medicamento.
31. 31. Uso de la nanoparticula tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, para la

    fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una indication que se selecciona del grupo que

    consiste en cancer, diabetes, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades del sistema respiratorio, alteraciones metabolicas y enfermedades vasculares.
32. 32. Uso segun la reivindicacion 31 para el tratamiento del cancer.
33. 33. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 31 o 32 para el tratamiento del cancer colorectal.
34. 34. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 31, 32 o 33 para el tratamiento de la metastasis en higado.
35. 35. Un procedimiento para la preparation de la nanoparticula tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, caracterizado por que comprende (i) la etapa de anadir una solution organica que comprende un disolvente organico y un ester de sorbitan sobre una solucion acuosa; en donde dicha solucion organica o dicha solucion acuosa o ambas comprenden una sustancia cargada positivamente; (ii) la etapa de evaporar disolvente organico y agua; y (iii) la etapa opcional de incubar la nanoparticula resultante de la etapa (ii) en presencia de otras sustancias; en donde un miRNA se incorpora (a) durante la etapa (i) como parte de la solucion acuosa, (b) en la etapa de incubation (iii), o en ambas etapas (i) y (ii).
36. 36. El procedimiento segun la reivindicacion 35, caracterizado por que dicha solucion acuosa comprende una sustancia cargada negativamente.
37. 37. El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 35 o 36, caracterizado por que dicho disolvente organico es total o parcialmente soluble en agua.
38. 38. El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 35, 36 o 37, caracterizado por que dicho disolvente es un alcohol.