ES2636646A1 - NUEVOS VEHÍCULOS PARA LA TRANSFECCIÓN DE miRNAs - Google Patents

Abstract

Nuevos vehículos para la transfección de miRNAs. La presente invención se refiere a una nanopartícula que comprende (i) entre un 60% y un 99% en peso, con respecto al peso total de la nanopartícula, de un éster de sorbitán; (ii) una sustancia cargada positivamente; y (iii) un miRNA; a sus métodos de fabricación, y sus usos, especialmente en usos terapéuticos, como el tratamiento del cáncer.

Description

CAMPO DE LA INVENCiÓN La presente invención se refiere a nuevos sistemas que comprenden miRNAs para su aplicación en Jos campos fannacéutico, cosmético o nutricional, entre otros. Estos sistemas permiten la administración más eficiente de distintos miRNAs, por ejemplo, en aplicaciones para eltratamienlo del cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los microRNAs, también comúnmente denominados miRNAs, son secuencias cortas de RNA que tienen la capacidad de interferir en procesos celulares. Esta capacidad ha despertado el interés en su potencial para aplicaciones médicas, cosméticas o nutricionales, entre otras. Se ha podido comprobar el potencial de muchos de estos miRNAs en ensayos biológicos, y hasta la fecha se han identificado aproximadamente un millar de estas sustancias naturales con potencial en diversas aplicaciones. Hasta el momento, el principal problema para su uso es su corta vida cuando son administrados. Los miRNAs son especialmente sensibles al ataque de exonucleasas y tienen una semivida de minutos en el medio biológico Esto ha disparado el interés por la búsqueda de medios de administración que permitan transportar los miRNAs de forma eficaz, evitando su rápida degradación in vivo Una de las primeras estrategias contempladas fue la modificación estructural de los miRNAs. Una de las variaciones más extendidas ha sido la modificación del grupo 2'·OH de la ribosa (Wu SY, Yang X, Gharpure KM, Hatakeyama H, Egli M, et al. (2014) 2'.OMe-phosphorodithioate-modified siRNAs show increased loading into the RISC complex and enhanced anti·tumour activity. Nat Commun 5: 3459.). Ejemplos de estas modificaciones son la sustitución en esta posición por 2'-f1uoro, 2'-Q-metil o 2'-O-metoximetil, solo por mencionar algunos ejemplos. Otra estrategia seguida ha sido el uso de vectores virales, por ejemplo, lentivirus o adenovirus, tal y como se explica en Kasar S, Salemo E, Yuan Y. Underbayev C, Vol1enweider D, et al. (2012) Systemic in vivo lentiviral delivery of miR-15a/16 reduces malignancy in the NZB de novo mouse model of chronic Iymphocytic leukemia. Genes Immun 13: 109-119; o en Brandt MR, Kirste AG, Pozzuto T, Schubert S, Kandolf R, et al. (2013) Adenovirus vector-mediated RNA interference for the inhibition of human parvovirus B 19 replication. Virus Res

176: 155-160. Sin embargo, y pese a que se han modificado genéticamente para eliminar su carga virulenta, la seguridad de estos vectores siempre despierta preocupación El campo de la oncología es donde posiblemente los miRNAs han recibido más atención hasta el momento. Este interés deriva del descubrimiento de que los miRNAs están desregulados en tejidos cancerosos y los tejidos que los rodean, y en la habilidad de los miRNAs para regular múltiples genes (por ejemplo, los siRNA son específicos y permiten la acción sobre un único gen), ya que se pueden unir a múltiples RNA mensajeros (mRNA) (GARZON, R., MARCUCCI, G. and CROCE, C.M., 2010. Targeting microRNAs in cancer: rationale, strategies and challenges. Nature reviews.Drug discovery, 9(10), pp. 775-789). Un ejemplo es el caso del cáncer coloreclal y la metástasis de higado, una de sus regiones más frecuentes de metástasis. Las células endoteliales sinusoidales del higado (LSECs) Juegan un papel clave en el desarrollo y regulación de la metástasis de hígado. Se ha encontrado que algunos miRNAs (miR-20a; miR-29 y miR-652) están desregulados en las LSECs, y la recuperación de sus niveles normales se presenta como una alternativa terapéutica prometedora. En vista del potencial de los miRNAs y sus dificultades en la administración, se ha probado la utilización de vectores no virales, por ejemplo, liposomas, péptidos, anticuerpos y otros ligandos, como el quitosano. Así, se ha buscado la mejora en la transfección de diferentes miRNAs con los agentes habituales como, por ejemplo, los de la familia lipofectamine® (DOTAP, DOTMA o DOPE) o Smarticles® (derivados amfotéricos). Por ejemplo, el miR34a se encuentra ahora en fases clínicas en forma de liposomas Smarticles® para el tratamiento del cá ncer de higado, y el miR-16 en forma de nanoparticulas de EnGenelC (minicell; EP23B6640) para el tratamiento de mesotelioma pleural maligno. Esta situación contrasta con la de medicamentos basados en siRNAs, otra familia diferente de RNAs que tienen doble cadena, los cuales no están encontrando tantos problemas en la búsqueda de vehículos adecuados para su transfección, y para los cuales existen ya multitud de ensayos clínicos en marcha. Dado el reciente interés despertado por los miRNAs como agentes terapéuticos, existe una necesidad en encontrar y desarrollar nuevos vehículos para una administración més efectiva (LAM, J.K., CHOW, M.Y., ZHANG, Y. and LEUNG, S.W., 2015. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Molecular therapy.Nuc/eie ae ids, 4, pp. e252). Sin embargo, los esfuerzos en el caso de los miRNAs se está viendo especialmente dificultados por ser moléculas de naturaleza hidrofílica, alto peso molecular y carga negativa, que impiden su paso a través de la membrana celular. El uso de vectores no virales mencionados arriba reduce estos problemas, sin embargo, especialmente en el caso de sistemas nanométricos, crea otras dificultades. El sistema reticuloendotelial (RES) absorbe rápidamente los sistemas nanométricos, y es la causa de la escasa estabilidad in vi vo (y por tanto, escasa eficaCia) de muchos de ellos (RINKENAUER, A.C., PRESS, A.T., RAASCH, M., PIETSCH, e., SCHWEIZER, S., SCHWORER, S., RUDOLPH, K.L., MOSIG, A., BAUER, M., TRAEGER, A. Y SCHUBERT, U.S., 2015 Comparison of the uptake of methacrylate-based nanoparticles in static and dynamic in vitro systems as well as in vivo. Joumalo( confrolled r elease . o fficial jau mal o( f he e onfrolled R elease Soc iefy, 216, pp. 158-168; SADAUSKAS, E., WALLlN, H., STOL TENBERG, M., VOGEL, U., DOERING, P., LARSEN, A. y DANSCHER, G., 2007. Kupffer cells are central in the removal of nanoparticles from the organismo Pariicle and fibre toxicology, 4, pp. 10). El RES comprende células fagocitarias como los monocitos o los macrófagos, por ejemplo, las células de

5 Kupffer. Aunque es generalmente aceptado que existe una correlación entre la carga superficial positiva de la nanoparticula y una menor absorción por parte de las células fagocitarias, no se conoce con exactitud qué factores influyen en esta absorción, lo que dificulta la predicción sobre el tipo de sistemas nanométricos que tendran una estabilidad adecuada in vivo El desarrollo de vehiculos con propiedades mejoradas para la administración de miRNAs resulta por tanto de gran interés

BREVE DESCRIPCiÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención resuelve los problemas mencionados anteriormente descritos, mejorando la estabilidad de

los miRNAs in viv o. Los investigadores han podidio comprobar que los sistemas de la presente invención

15 mejoran sorprendentemente el transporte in v ivo de los miRNA, y su eficacia se ve sorprendentemente incrementada. Se ha podido comprobar que evita su degradación por parte del RES, y en particular evita la fagocitación por parte de las células de Kupffer Por tanto, un primer aspecto de la invención es una nanoparticula que comprende (i) entre un 60% y un 99% en peso, con respecto al peso total de la nanoparticula, de un éster de sorbitán; (ii) una sustancia cargada positivamente; y (iii) un miRNA. La estabilidad de estos sistemas y la mejora en la transfección de miRNAs que aportan hacen las nanoparticulas de la invención adecuadas para, por ejemplo, aplicaciones en el ámbito de la farmacia, la cosmética o la nutrición Un aspecto adicional es el uso de una nanoparticula de la invención para la preparación de un medicamento.

25 También es un aspecto adicional una nanoparticula de la invención para su uso como medicamento. Un aspecto adicional es el uso de una nanoparticula de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una indicación que se selecciona del grupo que consiste en cancer, diabetes y enfermedades neurodegenerativas. También es un aspecto una nanoparlícula de la invención para su uso en el tratamiento de una indicación que se selecciona del grupo que consiste en cancer, diabetes y enfermedades neurodegenerativas. Otra de las ventajas de la invención es que las nanoparticulas son de facil preparación, y la incorporación de los miRNAs se puede realizar de forma simultánea a la formación de la propia nanopartícula o en una etapa posterior de incubación, dependiendo de la naturaleza de los componentes, proporcionando asi flexibilidad a su preparación. Así, un aspecto adicional de la invención es un procedimiento para la preparación de una

35 nanoparticula de la invención que comprende (i) la etapa de añadir una solución organica que comprende un disolvente orgánico y un éster de sorbitán sobre una solución acuosa; en donde dicha solución orgánica o dicha solución acuosa o ambas comprenden una sustancia cargada positivamente; y (ii) la etapa de evaporar disolvente organico yagua; y (iii) la etapa opcional de incubar la nanoparlícula resultante de la etapa (ii) en presencia de otras sustancias; en donde un miRNA se incorpora (a) durante la etapa (i) como parte de la solución acuosa, (b) en la etapa de incubación (iii), o en ambas etapas (i) y (ii) Un aspecto adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende la nanoparticula de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

45 Figura 1. Gel de electroforesis que confinna la existencia de una asociación efectiva entre un miRNA y las nanoparticulas. A: banda correspondiente al miR-20a libre (5 J.lg/ml) B: banda en la que no se observa miR-20a libre, correspondiente al SP80-0A-CS-miR-20a (50 J.lgfml miR-20a).

Figura 2. Demostración del efecto terapéutico in vivo. Regulación clinica de la metastasis de higado mediante el uso de nanoparticulas según la invención SP80-0A-CS-miR-20a. Se inyectaron en ratones líneas celulares de cáncer colorectal murino c26 (200.000 células/animal). Los animales se trataron a partir del dia 3 tras la inoculación del tumor, y subsiguientemenle cada 3 días hasta el día 21 . En el día 21 los animales se sacrificaron y sus hígados se procesaron para el analisis histológico. Los ratones se separaron en 5 grupos de tratamiento. El grupo 1 se trató con placebo (glucosa); el grupo 2 (según la invención) con SP80-0A-CS-miRNA-20a; el grupo 3

55 con miRNA-20a libre, sin ningún vehículo específico; el grupo 4 con una nanoparticula SP80-0A-CS asociada a un miRControl (un miRNA que no ataca ninguna diana); el grupo 5 con nanopartículas SpaO-OA-CS sin ningún miRNA. La evaluación macroscópica de los hígados confinnó el efecto terapéutico en términos de regulación clínica en los animales tratados con SP80-0A-CS-miRNA-20a (grupo 2). Figure 3. Demostración del efecto terapéutico in vi vo. Analisis histológico. Se tiñeron con hematoxilin-eosin secciones de los hígados evaluados en la figura 2, y se cuantificó bajo el microscopio el área ocupada por el tumor. Los distintos grupos se relacionaron con el grupo control (grupo 1 tratado con placebo) mediante el test-T Las diferencias estadísticas significativas (p < 0,05) se marcan con' También se comparó el grupo 2 (tratados con SP80-0A-CS-miRNA-20a) con el grupo 5 (tratados con SP80-0A-CS sin miRNA) y su diferencia estadística sígníficativa (p < 0.05) indicada con -+

DESCRIPCiÓN DETALLADA

Definiciones Para la nomenclatura de las nanoparticulas de la invención se utiliza la fónnula [éster de sorbitanHsustancia cargada positivamente]. Si la nanoparticula tiene otros componentes, por ejemplo, una sustancia cargada negativamente, se indica a continuación separado por un guion. En algunos caso se indica al final el nombre del miRNA utilizado. Ademas se utilizan las siguientes abreviaturas' SPBO: se entiende como Span-BO®. El span-BO® es una sustancia que resulta de esterificar el sorbitan con ácido cis-9-octadecenoico (comúnmente conocido como acido oleico):, es decir, una molécula con la siguiente fórmula:

O

CH2 O-C-CH2 (CH2)s CH2 CH=CHCH2(CH2)sCH3

"

I

HO·"C O

H:)~~.:tOH

Span-BQ® OA-oleilamina, es decir, (Z}-octadec-9-enilamina CS: sulfato de condroitina. Su estructura y propiedades se explica abajo con mayor detalle. HA' acido hialurónico. Su estructura y propiedades se explica abajo con mayor detalle Así, por ejemplo, una nanoparlícula que se abrevia SPBO-OA-HA-miR-20a, sera una que incorpora Span-BO®, oleilamina, acido hialurónico y miR-20a, preparada de acuerdo con los procedimientos descritos aqui En el presente documento se ha seguido para los miRNAs su nomenclatura estandar. Se ha utilizado el prefijo "miR-" seguido por un guion y un número. De acuerdo con la nomenclatura estandar el prefijo "miRO con "R" mayúscula se reserva para los miRNAs maduros, mientras que el prefijo "mir-" con "r" minúscula suele reservarse para los pre-miRNAs, y el prefijo "MIR" para el gen que los codifica. Para los propósitos de la presente invención, el prefijo "miR-" los incluye todos, los miRNAs maduros, los pre-miRNAs y los genes que los codifican. Tras el número algunos miRNAs incorporan una letra que permite distinguir miRNAs con secuencias muy similares. Se entiende por "alquilo· una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que no contiene ninguna instauración, de 1 a 40 atamos de carbono a menos que se indique lo contrario, opcionalmente sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados entre -ORb, -SRb, -NRaRb, -C(O)Rb, -C02Rb, -C(O)NRaRb, -NRaC(O)Rb, NRaC{O)ORb, -NRaC(O)NRaRb, -CF3, -OCF3; donde Ra y Rb se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo Cl-CS, alquenilo C:c-C6 y alquinilo C2-C6. Se entiende por "alquenilo" una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que contiene al menos un doble enlace, de 2 a 40 atamos de carbono a menos que se indique lo contrario, opcionalmente sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados entre -ORb, -SRb, -NRaRb, -C(O)Rb, -C02Rb, -C(O)NRaRb, NRaC(O)Rb, -NRaC(O)ORb, -NRaC(O)NRaRb, -CF3, -OCF3; donde Ra y Rb se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo Cl-Cs, alquenilo C2-CS y alquinilo C2-CS. Se entiende por "alquinilo" una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que contiene al menos un triple enlace, de 2 a 40 átomos de carbono a menos que se indique lo contrario, opcionalmente sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados entre -ORb, -SRb, -NRaRb, -C(O)Rb, -C02Rb, -C(O)NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)ORb, -NRaC(O)NRaRb, -CF3, -OCF3; donde Ra y Rb se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo Cl-Cs, alquenilo C2-CS y alquinilo C2-CS Salvo que se indique lo contrario, los porcentajes en peso que se indican en el presente texto se calculan con referencia a la suma de todos los componentes añadidos a la mezcla en la formación de la nanoparticula, con excepción de los disolventes. Por ejemplo, para una nanopartícula SP80-0A-HA-miR-20a, el porcentaje en peso de SPBO seran los gramos de SP80 añadidos para la preparación de la nanopartícula, multiplicado por cien, y dividido entre la suma de gramos de SPBO, OA, HA y miR-20a añadidos para la preparación de la nanopartícula. Cuando se utiliza la particula "un" o "una" se debe entender como "al menos un(a)" o "un(a) o mas" Por ejemplo, "un miRNA" indica que el número de miRNAs presentes es al menos 1, pero que pueden existir mezclas de 2 o mas miRNAs.

Componentes de las nanoparticulas de la invención Las nanoparticulas de la invención comprenden ésteres de sorbitan. El sorbitan esta constituido por una mezcla de anh ídridos cíclicos del sorbitol, como, por ejemplo, el 1,4-anhidrosorbitol, 1,5-anhidrosorbitol y 1,4,3,6dianhidrosorbitol. Los ésteres de sorbitan se consideran tensioactivos no jónicos debido a que contienen dos regiones localizadas, una de naturaleza hidrófila y otra hidrófoba Se entiende por 'ésteres de sorbítan" los derivados esterificados del sorbitan donde los grupos éster poseen un sustituyente seleccionado de entre alquilo, alquenilo y alquinilo. Los ésteres de sorbitán incluyen derivados en los que uno, dos, tres o cuatro grupos hidroxilo estan esterificados, e incluso incluyen derivados esterificados en los que una molécula de éster esta presente por cada dos moléculas de sorbitan (en cuyo caso se nombran con el prefijo "sesqui-"). Asi, por ejemplo, el monooleato de sorbitan es el éster de sortitan resultado de la esterificación de un grupo hidroxilo con el ácido oleico; el Iriolealo de somitán es el éster de somitán resultante de la esterificación de tres grupos hidroxilo del somitán con el ácido oleico. Existen muchos tipos distintos de ésteres de sorbitán atendiendo al número de hidroxilos esterificados, la estructura del éster, la mezcla de anhidrosomitol, y otros factores. El experto en la materia puede elegir entre

5 distintos tipos dentro del ámbito de la invención y no está limitado a un tipo especifico Ésteres de sorbitán comúnmente utilizados son, por ejemplo, los comercializados con el nombre Span® (sin bloques de polioxietileno) o Tween® (con bloques de polioxietileno). Por mencionar algunos ejemplos, ésteres de sorbitán de la familia Span@) comunes pueden ser el Span-8Q® (monooleato de sorbitán), el Span-2Q® (monolaurato de somitán), el Span-40® (monopalmitato de somitán), el Span-65 (triestearato de somitán), o el

10 Span-85® (trioleato de sorbitán). Ésteres de sorbitán de la familias Tween® comunes son el Tween® 20 (Polioxietilensorbitan monolaurato), Tween® 40 (Polioxietilensorbitan monopalmitato), Tween® 60 (Polioxietilensorbitan monoestearato) o Tween® 80 (Polioxietilensorbitan monooleato). La formación de las nanoparlículas de la invención puede comprender mezclas de dos o más ésteres de sorbitán diferentes. Por ejemplo, una mezcla de un éster de sorbitán sin bloques de polioxietileno con otro éster de

15 sorbitán con bloques de polioxietileno. En la preparación de las nanopartículas de la invención el experto en la materia puede elegir pues diversos ésteres de sorbitán para combinar con la sustancia cargada positivamente, y a modo de ejemplo, se puede seleccionar del grupo que comprende monooleato de sorbitán, dioleato de sorbitan, trioleato de sorbitan, sesqui-oleato de sorbitan, monolaurato de 5Orbitan, dilaurato de sorbitan, trilaurato de sorbitán, sesqui-Iaurato de sorbitán, monoestearato de sorbitán, diestearato de sorbitán, triestearato de

20 sorbitán, sesqui-estearato de sorbitán, monopalmitato de somitán, dipalmitato de sorbitán, tripalmitato de sorbitan, sesqui-palmitato de sorbitan y combinaciones de los mismos Teniendo en cuenta que dichos ésteres de sorbitán opcionalmente comprenden bloques de polioxietileno, el éster de sorbitan utilizado en las nanoparticulas de la invención puede ser un compuesto de fórmula I

ov-~:5

25 Fórmula I en donde cada uno de RS, R6, R7 Y Re se selecciona independientemente del grupo que consiste en ~H, -(C=O)alquilo Cl-C40, -(C=O)-alquenilo C2-C40, -(C=O)-alquinilo C;¡-C40, con la condición de que al menos uno de RS, R6, R7Y RSno es -H; y

30 cada uno de a, b, c y d es independientemente un número entre O y 100. Aquellos más habituales son los comercialmente disponibles y suelen corresponder a un alquilo lineal que comprende entre 2 y 20 atomos de carbono, por ejemplo, uno con 9, 11, 13, 15 o 17 átomos de carbono, o a un grupo alquenilo lineal que comprende entre 4 y 25 átomos de carbono. Asi, un ejemplo puede ser un grupo alquenilo de fórmula -(CH2)n-CH=CH-(CH2)m-CH3, en donde n es un número entero comprendido entre 1 y 10, Y

35 m es un número entero comprendido entre 1 y 10. Uno habitualmente utilizado aquél en el que n es 7 y m es 7, correspondiente al ácido oleico. Como se puede ver, los bloques de polioxietileno son opcionales, y cada uno de a, b, c y d pueden ser O. En el caso de incluir dichos bloques de polioxietileno, la suma de a, b, c y d puede ser, por ejemplo, de entre 10 y 50 o o de entre 10 y 30 o de entre 15 y 30. Por ejemplo, en el caso del Tween® 80 (Polioxietilensorbitan monooleato) a, b, c y d suman 20.

40 De acuerdo con una realización preferida, R6, R7 Y R6 son -H. Es decir, se trata de un monoéster de sorbitán, por ejemplo, uno que se selecciona del grupo que consiste en monooleato de sorbitán, monolaurato de sorbitán, monoestearato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán, y combinaciones de los mismos. Este grupo de monoésteres de sorbitán puede representarse mediante la fórmula 11

o

HO

HO OH

Fórmula 11 en donde R5 se selecciona del grupo que consiste en -(C=O)-alquilo Cl-C4(J y -(C=O)-alquenilo Cl -C40; y

5 b es un numero entre O y 100, preferiblemente O De nuevo, se prefiere uno en donde R5 es un alquenilo de la fórmula -(CH2)n-CH=CH-{CH2)m-CH3, en donde n es un número entero comprendido entre 1 y 10, Y m es un numero entero comprendido entre 1 y 10. La proporción de ésteres de sorbitán en las nanoparticulas se sitúa entre el 60% y el 99% en peso con respecto al peso total de la nanoparlícula. Proporciones típicas en las que se encuentran los ésteres de sorbilan son entre

10 el 80% y el 98% en peso con respeclo al peso tolal de la nanopartícula, por ejemplo, entre el 85% y el 95%. La proporción de los ésteres de sorbitán suele ser mayor del 87% en peso con respecto al peso total de la nanoparticula Otro componente esencial de la invención es la inclusión de una sustancia cargada positivamente. En el contexto de la presente invención, se entiende por "sustancia cargada positivamente" aquella molécula dotada de carga

15 eléctrica positiva. En el campo de la presente invención se utilizan estas sustancias para modular las propiedades de las partículas formadas, y el experto en la materia tiene a su disposición una amplia variedad de las mismas. Estas sustancias se discuten ampliamente en numerosos libros de referencia, por ejemplo, en "Dekker Encyclopedia of Nanoscience and Nanotechnology, Volumen 4", James A. Schwarz, Cristian 1. Contescu, Karol Putyera, Editor: Marcel Dekker, 2004, o en "Encyclopedia of Polymer Science and Technology,

20 Concise", Herman F. Mark, tercera edición, Editor: Wiley, 2007. Ejemplos no-limitativos son las sales de amonio, polimeros catiónicos y las aminas grasas o lipofilicas. El polímero catiónico puede seleccionarse del grupo que consiste en protamina, poliglutámico, dextrano cationizado, Pululano cationizado, poliaminoácidos, proteinas cationizadas, 'i sus sales. Los poliaminoácidos son otra familia de sustancias cargadas positivamente que se pueden utilizar en las nanoparticulas de la invención 'i

25 que pueden seleccionarse del grupo que consiste en polilisina y poliarginina" Las proteinas cationizadas pueden seleccionarse del grupo que consiste en gelatina, albúmina, colágeno, atelocolágeno, y sus derivados cationizados Las sales de amonio pueden ser sustancias que comprenden un grupo amonio o amina unido a uno, dos o tres restos que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo Cl-Cto, alquenilo C2-C40,

30 alquinilo C2-C40, por ejemplo, seleccionadas del grupo que consiste en bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB) y cloruro de benzalconio (BZC). La amina grasa puede ser oleilamina. Sustancias cargadas positivamente adecuadas para la presente invención pueden ser las sales de amonio o las aminas grasas, por ejemplo CTAB, BZC, oleilamina o mezclas de las mismas. Asi, dicha sustancia cargada positivamente puede tener la fórmula (RlO)p (R" )(R'2)NR9, en donde

35 cada uno de R'o, Rl1 y R12 se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, alquilo ClC4, alquenilo C2-C4, alquinilo C2-C4, 'i fenilalquilo C7-CI 5; R9 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C,-Cto, alquenilo C2-CoIO, alquinilo C2-C40; pesOo1 ;

yen donde también comprende un contraanión en el caso en el que p es 1. Cuál es el contraanión no es critico y

40 puede ser, por ejemplo, un halogenuro (F", CI-, Br o 1") La sustancia cargada negativamente se puede añadir en proporciones que van desde el 1% hasta el 39% en peso con respecto al peso total de las nanopartículas. Cantidades preferidas oscilan entre el 2% y 20%, tipicamente entre el 3% y el 12% o entre e12% 'i 9% o entre el 3% 'i eI8%, en peso con respecto al peso total de la nanopartícula.

45 Un componente opcional de las nanopartículas de la invención es una sustancia cargada negativamente. Estas sustancias son conocidas por el experto en la materia y en el caso de la presente invención se prefieren aquellas capaces de formar una capa de recubrimiento en la nanopartícula. La familia de sustancias cargadas negativamente puede ser de acuerdo con la presente invención un polímero aniónico, entendiendo poli mero aniónico un polimero con una carga negativa

50 Los investigadores han comprobado que la incorporación de una o más sustancias cargadas negativamente proporcionan ventajas sorprendentes. En contra de lo que cabria esperar de un sistema con una carga superficial negativa, soportan los ataques del RES (no se observó fagocitación por las células de Kupffer) y las nanoparticulas mejoran la capacidad de transfección del miRNA transportado. Esto es contrario a las observaciones descritas en la literatura en la que se establece una correlación positiva entre la carga negativa y

una mayor fagocitación por las células de Kupffer.

Los polímeros aniónicos son preferiblemente polisacáridos. Existe una gran variedad de estos polisacáridos a

disposición del experto en la materia, y que se utilizan frecuentemente en este campo. Una variedad preferida

5 son aquellos que contienen un grupo carboxilo (-COOH) o sulfato (.S03H) en el monómero que se repite. Se han mostrado especialmente adecuados para la presente invención aquellos polisacáridos que tienen al menos un ácido glucurónico en la estructura que se repite. Por ejemplo, dicha sustancia cargada negativamente puede comprender un polisacárido cuya unidad repetitiva tiene la fónnula [X-Y-(Z)n] en donde n es O o 1; X, Y YZ se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en monosacáridos, disacáridos y

10 polisacáridos; con la condición de que al menos uno de X, Y Y Z comprende un azúcar ácido y en donde los grupos X, Y Y Z se unen entre sí a través de enlaces -O-glucosídicos. De acuerdo con una realización de la invención, dicho azúcar ácido se selecciona del grupo formado por los ácidos aldónicos, ácidos ulos6nicos, ácidos urónicos, ácidos aldáricos y mezclas de los mismos. Por ejemplo. Y puede comprender un azúcar ácido, por ejemplo, un ácido urónico. Un ejemplo no limitativo de dicho ácido urónico puede ser uno de la fórmula 111

O O O-

Ha

R' R' R2

Fórmula 111

en donde cada uno de R1, R2 Y R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, -0-, OR4, N(H)-R4 Y -0-S03, con la condición de que al menos uno de Rl, R2 Y R3 sea -0-,

20 en donde los -0 -fonnan los enlaces glucosídicos, y en donde R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo e,-C4, alquenilo C2-C4, alquinilo C2C4, -(C=O)-alquilo C,-C!, -(C=O)-alquenilo C2-C4, -(C=O)-alquinilo C2-C4. Ejemplos no limitativos de sustancias cargadas negativamente que tienen esta fórmula se seleccionan del grupo que consiste en ácido hialurónico, sulfato de condroitina y goma xantana

25 Las sustancias cargadas negativamente que pueden incorporarse a las nanopartículas de la presente invención también pueden ser aquellas que se seleccionan del grupo que consiste en ácido hialurónico, ácido colomínico, polisiálico, condroitina, queratano, dextranos, heparina, carragenanos, furceleranos, alginatos, agar agar, glucomanano. goma gelano. goma garrotín. goma guaro goma tragacanto. goma arábiga. goma xantano. goma karaya, pectinas, celulosas, almidones, sus sales, fragmentos, derivados y mezclas de los mismos

30 El hialuronano es un polímero lineal que comprende la repetición de una estructura de disacárido formada por la adición alterna de ácido D-glucurónico y D-N-acetilglucosamina, unidos alternando enlaces beta-1,4 y beta-1,3 glucosídicos. En el contexto de la presente invención, se puede emplear ácido hialurónico con un amplio intervalo de pesos moleculares. El ácido hialurónico de elevado peso molecular es comercialmente disponible, mientras que el de peso molecular inferior puede obtenerse mediante la fragmentación del ácido hialurónico de

35 elevado peso molecular, utilizando, por ejemplo, una enzima hialuronidasa. El término "hialurónico, ácido hialurónico, hialuronano· tal como se utiliza en la presente descripción incluye o bien el ácido hialurónico o bien una base conjugada del mismo (hialuronato). Esta base conjugada puede ser una sal alcalina del ácido hialurónico que incluyen sales inorgánicas tales como, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminio y litio, sales orgánicas tales como sales de aminoácidos básicos a pH neutro, preferiblemente

40 dichas sales son farmacéuticamente aceptables. En una realización preferida de la invención, la sal alcalina es la sal de sodio del ácido hialurónico. La familia de los ácidos polisiálicos, ténnino que incluye al ácido colomínico, se encuentra integrada por polímeros lineales constituidos por residuos de ácido N-acetilneuraminico (NeuSAc; también conocido como ácido siálico), un constituyente natural de células y tejidos, unidos por enlaces glicosídicos a-{2--+8). Cada

45 residuo de ácido N-acetilneuraminico posee un grupo carboxilo, responsable de la carga negativa del ácido colomínico. Se trata de un material biocompatible y biodegradable, no inmunogénico, cuyos productos de degradación no son tóxicos (Gregoriadis G et al. Cell. Mol. Life Sci. 2000, 57, 1964-1969) El sulfato de dextrano es un glucano (polisacárido) complejo constituido por unidades de moléculas de glucosa, cada una de las cuales contiene aproximadamente dos grupos sulfato. El sulfato de dextrano se prepara

50 mediante sulfatación de dextrano y posterior purificación mediante procedimientos de sobra conocidos por un experto en la materia La heparina es una sustancia de origen natural de la familia de los glicosaminoglicanos cuya estructura química comprende la repetición de unidades monoméricas disacáridas de ácido 2-0 sulfo--L-idurónico y 2-deoxi·2sulfamido--D-glucopiranosil-6-0 -sulfato. En el contexto de la presente invención, es posible emplear tanto la

55 heparina fraccionada como la no fraccionada. La heparina tradicional o no fraccionada se distingue claramente de la heparina fraccionada o de bajo peso molecular. La primera de ellas es una sustancia natural presente en todos los vertebrados. Ambos tipos de heparina se pueden utilizar en forma de base libre o en forma de sal, como por ejemplo su sal sódica o cálcica. La heparina fraccionada o de bajo peso molecular se produce por despolimerización químíca o enzímática de heparinas convencionales. Ejemplos de este tipo de heparinas son enoxaparina, pamaparina, dalteparina y nadroparina, así como sus sales tales como las sales de sodio y calcio

5 Los derivados de heparina también pueden ser empleados en la composición de Jos sistema nanoparticulares de la presente invención. Estos derivados son conocidos en el estado de la técnica y se originan como consecuencia de la reactividad de los diferentes grupos funcionales presentes en la molécula. ASi, heparinas Nacetiladas, O-descarboxiladas, oxidadas o reducidas son ampliamente conocidas El sulfato de condroitina es un glucosaminoglucano (GAG) sulfatado compuesto por una cadena de azúcares

10 alternados. Se encuentra normalmente unido a proteinas como parte de un proteoglucano. En el contexto de la presente invención, el término "sulfato de condroitina" incluye todos sus diferentes isómeros y derivados, así como combinaciones de los mismos. Por ejemplo, se selecciona entre las siguientes sustancias y combinaciones de las mismas, resumidas en la fórmula IV

o R0

O

O

OR13

HO O OR 15 NH

OH I

Ac O e

IV

• sulfato de condroitina A que está sulfatado predominantemente en el carbono 4 del azúcar Nacetilgalactosamina (GaINAc) y que también se conoce como sulfato de 4-condroitina (R13=H, R14=S03H y RI5=H)

20 -sulfato de condroitina B que se denomina también sulfato de dermatano. Esta sustancia está compuesta por unidades de repetición lineales que contienen N-acetilgalactosamina y o bien ácido L· idurónico o bien ácido glucurónico, y cada disacárido puede estar sulfatado una vez o sulfatado dos veces. Está presente mayoritariamente en la piel, pero también se encuentra en vasos sanguineos, valvulas card iacas, tendones y pulmones

25 -sulfato de condroitina C que está sulfatado predominantemente en el carbono 6 del azúcar GalNAc y

que se conoce también como sulfato de 6-condroitina (RI3=S03H, RI4=H y RI5=H); -sulfato de condroitina O que está sulfatado predominantemente en el carbono 2 del ácido glucurónico yen el carbono 6 del azúcar GalNAc y se conoce también como sulfato de 2,6-condroitina (RI3=S03H, RI4=H y R15= S03H);

30 -sulfato de condroitina E que está sulfatado predominantemente en los carbonos 4 y 6 del azúcar GalNAc y se conoce también como sulfato de 4,6-condroitina (RI3=S03H, R14= S03H y R1S=H); y en donde "e" representa el número de repeticiones del monómero, es decir, su grado de polimerización

El término "sulfato de condroitina" también incluye sales organicas e inorganicas del mismo. Generalmente, tales

35 sales se preparan, por ejemplo, mediante reacción de la forma básica de este compuesto con una cantidad estequiométrica del ácido apropiado en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. Generalmente, se prefieren medios no acuosos tales como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Ejemplos de sales inorgánicas incluyen, sales de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminio y litio, y las sales organicas incluyen, por ejemplo, sales de etilendiamina, etanolamina, N,N-dialquileno

40 etanolamina, trietanolamina, glucamina y aminoácidos básicos. Preferiblemente las sales son farmacéuticamente aceptables. El sulfato de queratano es un glucosaminoglicano sulfatado similar al sulfato de condroitina en el que el grupo sulfato se encuentra en el glucurónico. Concretamente, se encuentra constituido por galactosa y GlcNAc-6sulfato, unidos mediante un enlace ~-1 ,4 .

45 La carragenina o carragenano está formada por unidades de galactosa yfo de anhidrogalactosa, sulfatadas o no, unidas por enlaces alternos ·1 ,3 y -1,4. Dependiendo del grado de sulfatación, de las posiciones de los grupos sulfato y de la presencia de grupos de anhidrogalactosa se distinguen varios tipos de carragenano, todos incluidos en el ámbito de la presente invención El glucomanano es un polisacárido soluble en agua de origen natural. La estructura química de este compuesto

50 consiste en una cadena polimérica lineal con una pequeña proporción de ramificaciones. En concreto, esta formado por unidades de o-manosa y O-glucosa unidas por enlaces -1,4 en una proporción de 1.6:1, respectivamente. En una realización particular de la invención, el glucomanano empleado es un derivado de glucomanano con carga negativa seleccionado entre los derivados fosforilados, carboximetil y dicarboxi·

glucomananos.

La goma gelano es un polisacárido soluble en agua de origen natural. La estructura química de este compuesto

consiste en una cadena polimérica formada por unidades de a-L·ramnosio, ~-Dácido glucurónico y dos unidades

5 de ~-D-glucosa. El polímero puede encontrarse en forma parcialmente acetilada. Dependiendo de su grado de acetilación, la goma gelano proporciona geles con propiedades mecánicas distintas. En el contexto de la presente invención, el término "goma gelano" incluye todos sus diferentes derivados, así como combinaciones de los mismos Sin querer estar limitado por la teoría, pensamos que las nanopartículas de la invención son estructuras sólidas homogéneas en las que los miRNAs son adsorbidos. Esto es contrario a los sistemas utilizados para transportas miRNAs que se han venido utilizando hasta ahora. Como ya se ha mencionado arriba, los que se están utilizando ahora para la realización de ensayos dinicos de miRNAs utilizan liposomas o vesiculas, es decir, estructuras de bicapa lipídica que encierran en su interior una fase acuosa. Los miRNAs quedan unidos a la estructura sólida que forman los ésteres de sorbitol y la sustancia cargada positivamente.

15 El tamaño medio de las nanopartículas de la invención es de entre 1 y 999 nanómetros. Y pueden tener un potencial negativo o positivo, dependiendo de los componentes añadidos, por ejemplo, si comprenden o no una sustancia cargada negativamente, o de la concentración del o de los miRNA(s) añadido(s). De acuerdo con una realización preferida, la nanoparticula de la invención tienen un potencial positivo comprendido entre +1 y +100 mV. De acuerdo con otra realización preferida, la nanopartícula de la invención tienen un potencial negativo comprendido entre -25 y -40 mV. Las nanopartículas de la invención pueden induir otras sustancias auxiliares, por ejemplo, un derivado de óxido de etileno, un compuesto en el que se repite una unidad -CH2CH20-. Dicho derivado de óxido de etileno puede ser un compuesto de fórmula R160[CH2'"CH2+0]r-C(H){R17){R16), en donde R17 es un grupo carbonilo o hidrógeno; R16 es un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo, de entre 2 a 24 átomos de carbono; R16 es hidrógeno o un grupo

25 alquilo de entre 1 a 6 átomos de carbono; f es un valor de entre 1 y 100, por ejemplo, entre 1 y 50, o entre 1 y 24. Ejemplos de derivados de óxido de etileno, sin limitarse a éstos, son polietilenglicol dodecil éter (Brij 30), polietilenglicol hexadecil éter (BriJ 56), polietilenglicol 2-octadecil éter (Brij 72), polietilenglicol 8-octadecil éter (Brij 78), polietilenglicol 8-estearato (My~ 45). 2-hidroxietil octadecanoato (Myrj 52), monoestearato de etilen glicol Los derivados de óxido de etileno se pueden incorporar en proporciones que varían entre el 0,1% y el 20% en peso con respecto al peso total de la nanopartícula. Dependiendo de las aplicaciones, las proporciones pueden variar y ser de, por ejemplo, entre el 0,1% Y el 15% o entre el 5% y el 15% o entre el 7 y el 13% en peso, con respecto al peso total de la nanopartícula

Aplicaciones y miRNAs

35 El otro componente esencial de las nanoparticulas de la invención es un miRNA o una mezcla de miRNAs, los cuales se suelen encontrar en proporciones por debajo del 25% en peso con respecto al peso total de la nanopartícula. La proporción en la que se encuentran en cada caso puede ajustarse y puede ser, por ejemplo de entre 0,01 y 10% o entre 0,2% y 3% en peso con respecto al peso total de la nanopartícula. Los miRNAs que se utilizan en las nanoparticulas de la invención son moléculas de RNA que típicamente comprenden entre 5 y 30 bases o entre 15 y 25 bases Los miRNAs tienen múltiples aplicaciones, y por tanto también las nanopartículas de la invención, por ejemplo, en el campo farmacéutico, cosmético o de la nutrición. Así, por ejemplo, se estudia en la actualidad la aplicación terapéutica de diversos miRNAs en campos como el cáncer (miRNA-20a, miR-29, miR-652 miR-34a, miR-16), la diabetes o las enfermedades neurodegenerativas. Uno de los campos en los que más se ha desarrollado el uso

45 de los miRNAs es el del cáncer. Por tanto, una realización preferida son las nanopartículas de la invención para su uso en el tratamiento de un cancer que se selecciona del grupo que consiste en colorectal, mesotelioma pleural maligno, de hígado, páncreas, colon y las metástasis hepática y de pulmón. El término "tratamiento" o "tratar" en el presente documento significa administrar las nanopartículas de la invención para prevenir, reducir o eliminar uno o más de los síntomas o causas o efectos (metástasis) de una enfennedad o condición. También abarca la prevención, reducción o eliminación de las secuelas de dicha enfermedad o condición, o de los efectos secundarios o adversos provocados por otra medicación utilizada. También abarca la administración para mantener la salud en sUjetos en riesgo de padecer dicha enfermedad. El ténnino "reducir" se entiende como cualquier mejora en la situación del paciente, bien medido por parametros subjetivos (por ejemplo, percepción del paciente) u objetivos (medición de parámetros fisiológicos, bioquímicos,

55 histopatológicos, microbiológicos-analíticos). Por ejemplo, las nanopartículas de la invención para su uso en el tratamiento de la metástasis de hígado es una realización de la invención, y se ha podido comprobar que permiten reducir o eliminar la metástasis y los efectos dicha metátesis de hígado que acompaña muchas veces al cáncer colorectal, lo cual también constituye una realización de la invención. En una realización las nanopartículas de la invención comprenden miR-20a, miR-29, miR-652 o mezclas de las mismas, preferiblemente miRNA-20a, para su uso en el tratamiento del cáncer coloreclal yfo su metastasis de hígado asociado Otro aspecto de la invención es un método para el tratamiento de un individuo en necesidad de tratamiento que comprende la administración de una cantidad terapéutica mente eficaz de nanopartículas de la invención. En el sentido utilizado en esta descripción "cantidad terapéutica mente eficaz· se refiere a la cantidad de principio activo calculada para producir el efecto deseado y estará determinada generalmente, entre otros motivos, por las propias características del principio activo utilizado y el efecto terapéutico que va a obtenerse. En una realización particular, la dosis de principio activo administrada a un sujeto para el tratamiento o la profilaxis de los estados mencionados anteriormente está en el intervalo de 10.10 a 1010 mgfkg de peso corporal, normalmente entre 10.3 y

5 10' mgl kg o entre 10.2 Y 50 mglKg de peso corporal Por tanto, las nanopartículas de la invención pueden formar composiciones farmacéuticas junto con un excipiente fannacéuticamente aceptable. De hecho, se prefiere que todos los componentes sean farmacéuticamente aceptables. El término ~farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y no producen normalmente una reacción no deseada alérgica o similar, tal como molestias gástricas, mareos y similares, cuando se administra a un ser humano. Preferiblemente, tal como se utiliza en el presente documento, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o de un estado o enumerado en la Farmacopea de los EE.UU. u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales y más particularmente en seres humanos El término "excipiente" se refiere a un diluyente, adyuvante, o vehículo con el que se administran las

15 nanopartículas de la invención. Son sustancias que, por ejemplo, se añaden a los principios activos o a sus asociaciones para servirles de vehiculo, posibilitar su preparación y estabilidad, modificar sus propiedades organolépticas o determinar las propiedades físicoquímicas del medicamento y su biodisponibilidad. Tales vehiculos farmacéuticos pueden ser liquidos estériles, tales como agua o aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Se emplean preferiblemente agua o soluciones salinas de disolución acuosa y disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehiculos, particularmente para disoluciones inyectables. Se describen vehículos farmacéuticos adecuados en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. La composición farmacéutica o medicamento puede hallarse en cualquier forma adecuada para su administración a humanos y/o animales, preferentemente humanos, incluyendo bebés, niños y adultos y puede

25 prepararse por procedimientos estándar conocidos por los expertos en la materia. El medicamento puede prepararse por procedimientos estándar conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, reflejado en "Pharmaceutics: The Science of Dosage Forms, segunda edición, Aullon, M.E. (ed.) Churchil1 UVingstone, Edinburgo (2002); "Encyclopedia of Phannaceutical Technology", segunda edición, Swarbrick, J. y Boylan J.C (eds.), Marcel Dekker, Inc. Nueva York (2002); "Modern Pharmaceutics", cuarta edición, Banker G.S. y Rhodes

C.T. (eds.) Marcel Dekker, Inc. Nueva York 2002 y "The Theory and Practice of Industrial Pharmacy·, Lachman

L., Lieberman H. y Kanig J. (eds.), Lea & Febiger, Filadelfia (1986). Las descripciones respectivas se hallan incorporadas en este documento por referencia y forman parte de la descripción. La composición del medicamento puede variar dependiendo de la vía de administración. Ejemplos ilustrativos no limitantes de dichas formas farmacéuticas de administración de la composición farmacéutica de la invención incluyen formulaciones

35 orales o bucales (líquidas, disolución, suspensión, emulsión, gel, pasta, polvo, liofilizado oral, comprimidos, cápsulas, píldoras, emulsiones); formulaciones sublinguales; formulaciones oftálmicas; formulaciones para el oído (óticas); formulaciones tópicas; formulaciones nasales; formulaciones rectales; formulaciones vaginales; formulaciones intrauterinas; formulaciones para inhalación o pulmonares; formulaciones parenterales, por ejemplo, formulación inyectables, por ejemplo, para inyecciones intravenosas o para inyecciones subcutáneas.

Procedimiento de preparación

Otra de las ventajas de la presente invención es la facilidad con la que se preparan las nanopartículas,

procedimiento que no requiere inyección u homogeneización En términos generales el procedimiento

comprende (i) la etapa de añadir una solución orgánica que comprende un disolvente orgánico y un éster de

45 sorbitán sobre una solución acuosa; (ii) la etapa de evaporar el disolvente y el agua; y {iii} una etapa opcional de incubación. La sustancia cargada positivamente puede incorporarse a la solución orgánica o a la solución acuosa. Por otro lado, el miRNA (o los miRNAs) se incorpora{n), bien durante la etapa (i) como parte de la solución acuosa, bien en la etapa de incubación (iii), o bien en ambas etapas (i) y (iii). En caso de que no se incorpore ningún miRNa durante la etapa (i), es necesario proceder a la incubación {etapa (iii» para incorporar el miRNAs (o los miRNAs) Así, una alternativa es un procedimiento que comprende (i) la etapa de añadir una solución que comprende un disolvente orgzmico, un éster de sorbitán y una sustancia cargada positivamente sobre una solución acuosa que comprende un miRNA; y (ii) la etapa de evaporar el disolvente y el agua. Otra alternativa comprende (i) la etapa de añadir una solución que comprende un disolvente orgánico, un éster de sorbitán y una sustancia cargada

55 positivamente sobre una solución acuosa; (ii) la etapa de evaporar el disolvente y el agua; y (iii) la etapa de incubar la nanoparticula resultante de la etapa (ii) en presencia de un miRNA. Procedimientos adecuados se describen, por ejemplo, en W02013/068625 A continuación se hace una descripción detallada que se complementará con los ejemplos . La adición de la fase orgánica se realiza preferiblemente bajo agitación de la fase acuosa. Los componentes que adicionalmente puede comprender el sistema, como por ejemplo una sustancia cargada negativamente, pueden añadirse a la fase orgánica o a la fase acuosa, dependiendo de las caracteristicas de la sustancia que se incorpore al sistema. Así, en una realización particular, la disolución acuosa además comprende una sustancia cargada negativamente.

Alternativamente, los componentes adicionales pueden incorporarse en una etapa posterior, por ejemplo, la etapa (iii) de incubación de la dispersión de nanopartículas formadas con una disolución que comprende alguna de estas sustancias. Alternativamente, es posible obtener nanopartículas pegiladas o modificadas con derivados de óxido de etileno

5 Estas nanopartículas pegiladas o modificadas con derivados de óxido de etileno se pueden preparar en una única etapa y además tiene la ventaja de que no es necesario ninguna reacción química a fin de anclar las cadenas de óxido de etileno a la supertlcie de las nanopartículas. Así, en otra realización particular la fase orgánica comprende además un derivado de óxido de etileno, por ejemplo, uno de fórmula R160[CHz-CH2-0]rC(H)(R H)(R1S) como los descritos más arriba. Para la preparación de las nanoparticulas de la invención normalmente es preferible que el disolvente de la fase orgánica sea un solvente hidromiscible, por ejemplo, un alcohol alifático, tal como el etanol, fácil de evaporar, más inocuo y estable frente a los componentes de las nanoparticulas. Las concentraciones de los diferentes componentes no es critica. Por ejemplo, el éster de somitán se disuelve en la fase orgánica en una concentración que puede ser de entre 0,1 Y 10 mg/ml, o entre 2 y 7 mg/ml. Por otro lado,

15 las sustancia cargada positivamente puede estar en una concentración de entre 0,01 y 5,0 mg/mL, por ejemplo, entre 0,1 y 2,0 mgfmL preferiblemente entre 0,2 y 0,5 mgfmL. La sustancia cargada negativamente puede estar en una concentración de entre 0,01 y 5,0 mg/mL, por ejemplo, entre 0,05 y 2,0 mg/mL preferiblemente entre 0,1 y 0,3 mg/ mL La mezcla de las fases acuosas y orgánica puede hacerse a temperatura ambiente o bien calentando una o ambas fases. Se ha comprobado que las nanoparlículas de la invención aguantan sin degradación la liofilización y otros procesos de deshidratación. Por tanto, el procedimiento puede comprender una etapa adicional de deshidratación total o parcial (liofilización o desecación, respectivamente). De este modo es posible preservarlas durante su almacenamiento para que conserven sus características iniciales y se reduzcan los volúmenes de

25 producto que van a manipularse. El proceso de liofilización o desecación conduce, respectivamente, a un producto deshidratado total o parcialmente. En caso deshidratación, el procedimiento comprende una etapa adicional en la que se regeneran las nanoparticulas deshidratadas parcialmente o liofilizadas. De este modo es posible deshidratar las nanopartículas para obtener un producto más estable durante el almacenamiento y posteriormente regenerar o recuperar las nanopartículas mediante un proceso de re-suspensión en un medio acuoso. De este modo, un último aspecto de la invención se dirige a nanoparticulas obtenibles como se describió anteriormente Los componentes descritos arriba se pueden combinar para que en cada caso la nanopartícula de la invención que resulta se adapte a la situación concreta, y la presente invención abarca distintas combinaciones de ésteres

35 de somitán, sustancias cargadas positivamente, miRNAs, así como sustancias cargadas negativamente y otros componentes opcionales en caso de ser usados. Por ejemplo, una realización de la presente invención es una nanopartícula que comprende (i) uno o más miRNAs (por ejemplo, miR-20a, miR-29, miR--652 o mezclas de los mismos); (ii) un éster de sorbitán de fórmula J, tal y como se ha definido anteriormente; (iii) una sustancia cargada positivamente de fórmula (R' O)p (R ll )(R 12)NR9, tal y como se ha descrito más arriba; y (iv) un polisacárido cargado negativamente. En otra realización, la presente invención comprende (i) uno o más miRNAs (por ejemplo, miR-20a, miR-29, miR-652 o mezclas de los mismos); (ji) un éster de sorbitán de fórmula 1, tal y como se ha definido anteriormente; (iii) una sustancia cargada positivamente que se selecciona del grupo que consiste en CTAB, BZC, oleilamina y mezclas de las mismas; y (iv) un polisacárido cargado negativamente. Otra realización de la presente invención es una nanopartícula que comprende (i) uno o más miRNAs; (ii) un éster de

45 sorbitán de fórmula 1, tal y como se ha definido anteriormente; (iii) una sustancia cargada positivamente de

fónnula (Rl0)P (Rll)(R12)NR9, tal y como se ha descrito más arriba; y (iv) un polisacárido cargado negativamente en donde al menos uno de sus monómeros comprende un grupo -COOH o -S03H. Otra realización de la presente invención es una nanoparlícula que comprende (i) uno o más miRNAs; (ii) un éster de sorbitán; (iii) una sustancia cargada positivamente; y (iv) un polisacárido cargado positivamente en donde al menos uno de sus monómeros comprende un grupo -COOH o -S03H. Otra realización de la presente invención es una nanopartícula que comprende (j) uno o más miRNAs; (ii) un éster de sorbitán de fórmula 1, tal y como se ha definido anteriormente; (jii) una sustancia cargada positivamente de fónnula (R lO)p (R1')(R12)NR9, tal y como se ha descrito más arriba; y (iv) un polisacárido cargado negativamente. Las anteriores combinaciones y otras que no se describen explícitamente forman también parte del ámbito de protección

55 Hay que tener en cuenta que, además del miRNA, las nanopartículas de la invención pueden comprender otros componentes como, por ejemplo, otros principios activos de interés, para lo cual bastaría con añadirlos, a la solución org¿mica o a la solución acuosa o a ambas durante la preparación de la nanoparticula También sería posible añadirlas durante la etapa adicional (iii) de incubación.

EJEMPLOS Para la descripción de algunos de los siguientes ejemplos se hace referencia a resultados obtenidos mediante las siguientes técnicas· El tamaño de las nanopartículas se determinó mediante la técn ica de espectroscopía de correlación fotón ica (PCS) y usando un Zeta Sizer (Zeta Sizer, Nano Series, Nano-ZS, Malvern Inslruments, R.U.), obteniendo el tamaño medio de la población y el índice de polidispersión del mismo_ El procedimiento comprende diluir las muestras en agua Milli-Q a una proporción 1:19. Cada análisis se llevó a cabo a 25Q C con un ángulo de detección de 173Q

•

El potencial zeta de las nanoparticulas se detectó mediante la técnica de anemometría de dispersión de láser

5 (LDA) usando un Zeta Sizer (Zeta Sizer, Nano series, Nano-ZS, Malvern Instruments, RU.). El procedimiento comprende diluir las muestras en solución de KCI milimolar. La eficacia de la asociación de los miRNAs con las nanopartículas se determinó mediante la técnica de electroforesis en gel de agarosa. El procedimiento comprende preparar un gel de agarosa al 2% en tampón TAE (Tris-Acetato-EDTA, Tris 40 mM, ácido acético aI 1%, EDTA 1 mM), pH 8 con SYBR®. Como sustancia de carga

10 se usó tinción de gel de acidos nucleicos de oro y glicerol. Se aplicó una diferencia de potencial de 25 mV durante 30 minutos y se usó miRNA libre como control. Tal y como se usan en los siguientes ejemplos, se adquirieron los siguientes polimeros de diferentes establecimientos comerciales: acido hialurónico (Bioibérica, España), sulfato de condroitina (Calbiochem, EE.UU.). El Span® 80 y la oleilamina se adquirieron de Sigma (España). Los diferentes miRNAs usados se

15 adquirieron de Exiqon (Dinamarca). Los demás productos indicados en los ejemplos a continuación se adquirieron de Sigma (España)

Ejemplo 1: Prueba de concepto In v ¡va del efecto terapéutico en términos de regulación ctínica de las metástasis hepáticas proporcionadas

Preparación de nanopartículas Para la elaboración de las nanopartículas, se preparó una solución de monooleato de sorbitán (Span® 80, SP80) y oleilamina (OA) en 3 mi de etanol (fase organica) a una concentración de 6,6 y 0,33 mgfml respectivamente Después, esta fase orgánica se añadió a 6 mi de una fase acuosa agitada que contenía sulfato de condroitina

25 (CS) a una concentración de 0,125 mgfml, dando lugar de este modo a la formación espontánea de NPs. El etanol se retiró finalmente a presión reducida en un evaporador rotatorio. El miRNA se incluyó en la fase acuosa a una concentración de 8,33 IJg/ml durante la elaboración de las nanopartículas. Para este propósito se seleccionó miR-20a Estas proporciones corresponden a porcentajes en peso con respecto al peso total de la nanopartícula de 91 ,67% de SP80, 4,63% de OA, 3,47% de CS y 0,23% de miR-20a

Caracterización de las nanopartículas Se midió el tamaño y potencial zeta de las nanoparlículas mediante espectroscopía de correlación fotónica (photon corre/ation spectroscopy) y anometría Doppler laser (Iaser Dopp/er anemometry), respectivamente

Formulación

tamaño (n m) Pdl ~ Potencial

SP80-0A-CS

115,9 ± 15,6 0,073 -37,5±1 ,5

SP80-0A-CS-miR20 (50 IJgfml miR-20a)

144,H 1,7 0,062 -31 ,9±2,1

35 Tabla 1. Caracteristicas físico-quimicas de las nanopartículas de la invención

Eficiencia de la asociación entre el miRNA y la nanopartícula La eficiencia de la carga del microRNA a las nanopartículas se confirmó mediante la técnica de electroforesis en gel de agarosa, tal como se ilustra en la Figura 1.

Manejo de animales· Todos los experimentos descritos en este trabajo se han llevado a cabo de acuerdo con las leyes españolas y europeas relativas al cuidado de animales para experimentación. La manipulación de animales y los métodos experimentales de nuestro laboratorio se han analizado y aprobado por el Comité de Experimentación Animal de

45 la Universidad del País Vasco, España. Se llevaron a cabo todos los esfuerzos para minimizar el número de animales empleados y su sufrimiento. Se obtuvieron ratones C57 BU6NCrl (hembras, B semanas de edad) a través de Charles River Laboratories España, S.A. Se alOJó a los ratones en la Unidad de Recursos Biológicos de la Universidad del País Vasco y se los mantuvo en un ambiente de temperatura controlada (21 ± 1 QC), humedad relativa del 55 ± 5%, ciclo de luz/oscuridad de 08hOO-20hOO y se les suministró alimento para ratón convencional

50 yagua ad /ibitum

Modelo de metástasis hepática y evaluación clínica: Se desarrolló un modelo de metástasis hepatica inyectando en los ratones una línea celular de cancer colorrectal murino c26 (200.000 células/animal). Se anestesió a los animales con isofluorano (5% y 1,5% de mantenimiento) y se inyectaron las células en el bazo. 55 Después de la intervención se suturaron las incisiones. Se trató a los animales en el dia 3 después de la inoculación del tumor y posteriormente cada 3 días hasta el dia 21 con una dosis total de 25 IJg de miRNA por animal. Los ratones se separaron en 5 grupos diferentes dependiendo del tratamiento, El grupo 1 se trató con placebo (glucosa); el grupo 2, según la invención, se trató con nanopartículas de SP80-0A-CS asociadas con

miR-20a con un marcador fluorescente (6-carboxifluoresceína) (FAM); el grupo 3 se trató con miR-20a libre o desnudo (sin ningún vehículo especifico); el grupo 4 se trató con nanopartículas de SP80-0A-CS asociadas con un miRControl (este miR no ataca a ningún mRNA); el grupo 5 se trató con las nanopartículas SP80-0A-CS en blanco (sin mRNA asociado). En el día 21 después de la inoculación se sacrificó a los animales y se observaron

5 Jos hígados y se procesaron posteriormente para análisis histológico

Histología: Después de la dislocación cervical se extirparon rápidamente los higados y se fijaron en paraformaldehído (PFA al 4%) en PBS, durante toda la noche a 4Q C. Los hígados fijados se procesaron para su inclusión en parafina. Se

10 montaron secciones seriadas de 10 J.lm de grosor en cinco series paralelas y se procesaron para hematoxilinaeosina. Se capturaron imágenes microscópicas en un microscopio Zeiss. Algunas secciones de higado se observaron 48 horas después de la última inyección. Las secciones se incubaron con marcador de receptor anti-manosa y anticuerpo Alexa 593 anti-ratón. El marcador verde del miR20a (FAM) se observó dentro de las células endoteliales marcadas en rojo, lo que confirma el ataque endotelial o

15 la distribución especifica a las células endoteliales sinusoides que proporcionan las nanopartículas al miR-20a. Después de la evaluación macroscópica de los hígados, se confirmó el efecto terapéutico en términos de regulación clínica de las metástasis hepáticas en el grupo de animales tratados con SP80-0A-CS asociadas con miR-20a (Figura 2) Las secciones de los hígados de la Figura 2 se tiñeron con hematoxilina-eosina y se cuantificó el área ocupada

20 por el tumor bajo el microscopio. Los diferentes grupos se relacionaron con el grupo de control (tratado con glucosa como placebo) usando del test-T. Las diferencias estadisticamente significativas (p < 0,05) se indicaron con un • Asimismo, se compararon el grupo tratado con nanoparticulas de SP80-0A-CS asociadas con miR-20a y con nanopartículas de SP80-0A-CS en blanco (sin mRNA asociado) y la diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) se indicó con un +. Tal como puede apreciarse en la Figura 3, el área ocupada por el

25 tumor fue sorprendentemente más pequeña en los ratones tratados con nanopartículas de SP80-0A-CS asociadas con miR-20a (según la invención) que en ratones tratados solo con miR-20a Esto confirma una mejora imposible de anticipar a priori de las nanopartículas segun la invención en la vehiculización de miRNAs in vivo. Más aún, resulta sorprendente el efecto terapéutico proporcionado por estas nanoparticulas en térm inos de regulación clínica de metástasis hepáticas

Ejemplo 2: Liofilización Las nano partículas desarrolladas se evaluaron con éxito respecto de su capacidad para mantener la asociación al miRNA después de un proceso de liofilización.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES

   Una nanoparticula que comprende (i) entre un 60% y un 99% en peso, con respecto al peso total de la 5 nanoparticula, de un éster de sorbitán; (ii) una sustancia cargada positivamente; y (iii) un miRNA
2. 2. La nanopartícula según la reivindicación 1, caracterizada por que dicha sustancia cargada positivamente comprende un grupo amonio o amina unido a uno, dos o tres restos que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C,-C40, alquenilo C2-C40, alquinilo CZ-C40
3. 3. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que dicha sustancia 10 cargada positivamente tiene la fórmula (RIO)¡, (Rll)(R12)NR9, en donde

   cada uno de Rl0, R11 Y R12 se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, alquilo Cl C4, alquenilo C2-C4, alquinilo C2-C4, y fenilalquilo C7-C15; R9 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C,-C4 o, alquenilo CZ-C4Q, alquinilo C2-C40; pes001 ,

   15 yen donde también comprende un contranión en el caso en el que p es 1.

   4 La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que dicha sustancia cargada positivamente se selecciona del grupo que consiste en oleilamina, cloruro de benzalconio y bromuro de cetil trimetil amonio
4. 5. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que dicho éster de 20 sorbitán comprende un compuesto de fórmula I

   Fórmula I en donde cada uno de RS, R6, R7 Y Re se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, -(C=O)

   25 alquilo Cl-C40, -(C=O)--alquenilo CZ-C40, .(C=O)-alquinilo C2,C40, con la condición de que al menos uno de R5, R6, R7Y Re no es -H; cada uno de a, b, c y d es independientemente un número entre O y 100.

   6 La nanoparticula según la reivindicación 5, caracterizada por que dicho grupo alquilo es lineal y comprende entre 2 y 20 átomos de carbono. 30 7 La nanoparticula según cualquiera de las reivindicaciones 5 Ó 6, caracterizada por que dicho grupo alquilo tiene 9, 11 , 13, 15 o 17 átomos de carbono. 8 La nanoparticula según cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 Ó 7, caracterizada por que dicho grupo alquenilo es lineal y comprende entre 4 y 25 átomos de carbono
5. 9. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 5, 6, 7 u 8, caracterizada por que dicho grupo

   35 alquenilo tiene la fánnula --(CHz)n-CH=CH-(CHz)rrr-CH3, en donde n es un número entero comprendido entre 1 y 10, Y m es un número entero comprend ido entre 1 y 10
6. 10. La nanoparticula según la reivindicación 9, caracterizada por que n es 7 y m es 7. 11 La nanoparticula según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, caracterizada por que a, b, c y d son O
7. 12. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, caracterizada por que la suma de a, b, c y

   40 d se encuentra entre 10 y 30 13 La nanoparticula según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, caracterizada por que R6, R7 Y Re son-H
8. 14. La nanoparticula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que dicho éster de sorbitán tiene la fórmula 11

   o

   HO

   HO OH

   Fórmula 11 en donde R5 se selecciona del grupo que consiste en -(C=O)-alquilo el-G.Il) y -(C=O)-alquenilo C¡-C40; y 5 b es un número entre Oy 100.

   15 La nanoparlícula según la reivindicación 14, caracterizada por que b es O; y RS liene la fánnula -(CH2)nCH=CH-(CH2)m-CH3, en donde n es un número entero comprendido entre 1 y 10, Y m es un número entero comprendido entre 1 y 10.

   ,. La nanoparticula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que tiene un 10 potencial positivo comprendido entre +1 y +100 mV.
9. 17. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizada por que comprende una sustancia cargada negativamente. ,. La nanopartícula según la reivindicación 17, caracterizada por que dicha sustancia cargada negativamente comprende un polisacárido cuya unidad repetitiva tiene la fórmula [X-Y-(Z)n] en donde n es Oo 1; X, Y Y Z

   15 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en monosacáridos, disacáridos y polisacáridos; con la condición de que al menos uno de X, Y Y Z comprende un azucar ácido y en donde los grupos X, Y Y Z se unen entre sí a través de enlaces -O-glucosídicos
10. 19. La nanopartícula segun la reivindicación 18, caracterizada por que dicho azucar á.cido se selecciona del

    grupo formado por los ácidos aldónicos. ácidos ulosónicos. ácidos urónicos. ácidos aldáricos y mezclas de 20 los mismos
11. 20. La nanopartícula segun la reivindicación 18, caracterizada por que Y comprende un azucar ácido.
12. 21 . La nanopartícula segun la reivindicación 20, caracterizada por que Y comprende un écido urónico. 22 La nanopartícula segun cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 21, caracterizada por que dicho ácido

    uronico tiene la fórmula 111 O

    O 0-

    HO

    R' R R'

    Fórmula 111

    en donde cada uno de R', R2 Y R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, -0-, OR4, N(H)-R4 Y -0-803, con la condición de que al menos uno de R', R2 Y R3 sea -0-,

    30 en donde -0-es el átomo de oxígeno que forma el enlace glucosidico, y en donde R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C,-C4, alquenilo C2-C4, alquinilo CZ-C4, (C=O)-alquilo C,-C4, -(C=O}-alquenilo CZ-C4, -(C=O)-alquinilo C2-C4.

    23 La nanoparticula segun la reivindicación 17, caracterizada por que dicha sustancia cargada negativamente es un polisacárido que comprende uno o más grupos carboxílicos. 35 24. La nanopartícula segun la reivindicación 23, caracterizada por que dicha sustancia cargada negativamente comprende ácido glucurónico en su estructura repetitiva

    25 La nanopartícula segun cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, caracterizada por que dicha sustancia cargada negativamente se selecciona del grupo que consiste en ácido hialurónico, sulfato de condroitina y goma xantana

    40 26. La nanopartícula segun cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25, caracterizada por que tiene un potencial negativo comprendido entre -25 y -40 mV

    27 La nanoparticula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho miRNA se selecciona del grupo que consiste en miR-20a, miR-29, miR-652 miR-34a, miR-16 y mezclas de los mismos.
13. 28. La nanopartícula según la reivindicación 27, caracterizada por que dicho miRNA es miR-20a. 29 Una composición farmacéutica que comprende la nanoparticula tal y como se define en cualquiera de las

    reivindicaciones 1 a 28, y un excipiente farmacéuticamente aceptable

14. 30.

    Uso de la nanopartícula tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones a 28, para la

    fabricación de un medicamento.

    31

    Uso de la nanoparticula tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones a 28, para la

    fabricación de un medicamento para el tratamiento de una indicación que se selecciona del grupo que consiste en dlncer, diabetes, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades del sistema respiratorio, alteraciones metabólicas y enfermedades vasculares.
15. 32. Uso según la reivindicación 31 para el tratamiento del cancer. 33 Uso según cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 32 para el tratamiento del cancer colorectal

16. 34.

    Uso según cualquiera de las reivindicaciones 31 , 32 ó 33 para el tratamiento de la metástasis en hígado.

17. 35.

    Un procedimiento para la preparación de la nanopartícula tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, caracterizado por que comprende (i) la etapa de añadir una solución organica que comprende un disolvente orgánico y un éster de sorbitán sobre una solución acuosa; en donde dicha solución organica o dicha solución acuosa o ambas comprenden una sustancia cargada positivamente; (ii) la etapa de evaporar disolvente organico yagua; y (iii) la etapa opcional de incubar la nanopartícula resultante de la etapa (ii) en presencia de otras sustancias; en donde un miRNA se incorpora (a) durante la etapa (i) como parte de la solución acuosa, (b) en la etapa de incubación (iii), o en ambas etapas (i) y (ii)

18. 36.

    El procedimiento según la reivindicación 35, caracterizado por que dicha solución acuosa comprende una sustancia cargada negativamente

19. 37.

    El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 35 ó 36, caracterizado por que dicho disolvente orgánico es total o parcialmente soluble en agua.

20. 38.

    El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 35, 36 ó 37, caracterizado por que dicho disolvente es un alcohol.