PT1718679E

PT1718679E - ''ésteres de ácido hialurónico com reína, processo para a sua preparação e composições compreendendo o mesmo''

Info

Publication number: PT1718679E
Application number: PT05708619T
Authority: PT
Inventors: Antonello Pietrangelo; Valter Travagli
Original assignee: Medidom Lab
Priority date: 2004-02-26
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2007-11-27
Also published as: CN100551932C; JP2007524753A; CN1914228A; CA2556942A1; BRPI0507622B1; HK1099032A1; WO2005085293A1; UA91673C2; CA2556942C; DE602005002538T2; IL177072A; US7834173B2; RU2006134015A; IL177072A0; ES2293538T3; EP1718679B1; DE602005002538D1; RU2383554C2; US20070203094A1; ATE373681T1

Description

DESCRIÇÃO "ÉSTERES DE ÁCIDO HIALURÓNICO COM REINA, PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO E COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO O MESMO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a ésteres de ácido hialurónico (HA) com reina, mais em particular a um composto baseado em ácido hialurónico, em que os grupos álcool do ácido hialurónico estão esterifiçados com reina, a um processo de preparação do referido composto e a uma composição farmacêutica compreendendo o referido composto.

TÉCNICA ANTERIOR A reina é um alcaloide derivado de sene que possui propriedades anti-inflamatórias e protectoras de tecidos. A reina, da qual o nome químico é ácido 4,5-di-hidroxi-9,10-di-hidro-9,10-dioxo-2-antraceno carboxílico, possui a seguinte fórmula geral (I)

OR O OR

1 em que R é H.

Esta substância é administrada através da via oral, habitualmente como diacetilreina, um derivado da fórmula geral (I) anterior em que cada um dos grupos R é um grupo acetilo, que possui uma biodisponiblidade superior e que é utilizada principalmente no tratamento da inflamação de articulações.

Contudo, ambas a reina e diacetilreina apresentam a desvantagem de possuir uma acção laxante considerável, que pode até levar a diarreia, tornando assim a sua utilização desaconselhável para doentes idosos ou debilitados.

Para além disso, tendo em consideração a insolubilidade da reina e diacetilreina em água, este efeito secundário pode não ser obviado através da administração destes princípios activos por via parentérica ou intra-articular. 0 ácido hialurónico é um mucopolissacárido natural formado de unidades alternadas de ácido D-glucorónico e N-acetilglucosamina, como a seguir representado de um modo geral o-

ch2 Ácido glucorónico N-acetilglucosamina 2 para formar uma cadeia linear possuindo um peso molecular até 13 x 106 Daltons. 0 ácido hialurónico está presente em todos os tecidos moles do organismo e em muitos fluidos fisiológicos, tais como, por exemplo, fluido sinovial das articulações e o humor vítreo dos olhos. 0 ácido hialurónico é utilizado em muitas aplicações clínicas sob a sua forma acídica ou salina.

Em particular, é utilizado com grande sucesso na inflamação das articulações, onde é administrado directamente na articulação por infiltração e actua através de um mecanismo duplo: por um lado reduzindo a inflamação da articulação e por outro lado aumentando a viscosidade do fluido sinovial, beneficiando deste modo a cartilagem que, como resultado, é mais lubrificada. É também aplicável em oftalmologia, em que é utilizado pelas suas propriedades protectoras e anti-inflamatórias e para reparação dos tecidos, devido à sua acção anabólica- reconstrutiva na cartilagem e pele.

Contudo, o ácido hialurónico é conhecido por sofrer de degradação.

Foi referido que a degradação do ácido hialurónico é causada por hidrólise, dependendo das condições de pH e concentração de catiões [cf. e.g.Uchiyama H. et al. J. Biol. Chem. 1990; 265: 7753-7759; Tokita Y. e OkamotoA. , Polymer

Degr. e Stab. 1995; 48: 269-273; Hawkins C. L. e Davies M. J. 3

Free Rad.Biol. Med. 1998; 24: 1396-1410; Schiller J. et al.

Current Med. Chem. 2003; 10: 2123-2145].

Após amplos estudos, os actuais requerentes verificaram que o ácido hialurónico possuindo grupos álcool esterifiçados com reina possui, de uma forma surpreendente, uma estabilidade mais elevada que a do ácido hialurónico e possui adicionalmente uma actividade farmacológica melhorada comparada com aquela que é observada no que diz respeito ao ácido hialurónico e reina utilizados em separado.

Para além disso, os actuais requerentes verificaram que o ácido hialurónico possuindo grupos álcool esterifiçados com reina pode ser utilizado, de modo vantajoso, por administração local, evitando deste modo as desvantagens associadas com a administração oral da reina. A presente invenção foi alcançada com base nestes resultados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um composto baseado no ácido hialurónico, em que os grupos álcool do ácido hialurónico são esterifiçados com reina, como tal ou em forma derivada, ou um seu sal, que não possui apenas estabilidade mais elevada que a do ácido hialurónico, mas também uma actividade farmacológica melhorada comparada com aquela que é observada relativamente ao ácido hialurónico e reina utilizados em separado, e que ainda, pode ser utilizado 4 por administração local, evitando deste modo as desvantagens associadas à administração oral da reina.

De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para preparar o composto ou um seu sal de acordo com o primeiro aspecto, que compreende fazer reagir cloreto acidico de reina, como tal ou e forma derivada, com ácido hialurónico.

De acordo com um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se uma composição farmacêutica compreendendo o composto ou um seu sal de acordo com o primeiro aspecto em combinação com excipientes e/ou diluentes apropriados.

De acordo com outros aspectos, a presente invenção refere-se a um produto medicinal ou um dispositivo médico para utilização humana ou veterinária, formado por uma composição de acordo com o terceiro aspecto, e à utilização de um composto ou um seu sal de acordo com o primeiro aspecto para preparar um medicamento para tratar doenças inflamatórias, ou para reparação de tecidos, ou para preparar biomateriais.

Outras vantagens da presente invenção surgirão na seguinte descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 apresenta o espectro de RMN de ΧΗ da reina obtido por saponificação do composto HA-Re da presente invenção. 5 A Fig. 2 apresenta o espectro de I. V. da reina obtido por saponificação do composto HA-Re da presente invenção. A Fig. 3 apresenta a análise de HPLC-MS da reina obtida por saponificação do composto HA-Re da presente invenção. A Fig. 4 descreve os resultados obtidos nas experiências de RT-PCR comparando o efeito do ácido hialurónico à concentração farmacológica com o efeito do composto HA-Re da invenção às mesmas concentrações. A Fig. 5 descreve os resultados das experiências de RT-PCR nas quais o efeito da reina à dose farmacológica foi comparado com o efeito de uma dose similar do composto HA-Re da presente invenção. A Fig. 6 apresenta o espectro de RMN de 13C do composto HA-Re de acordo com a presente invenção. A Fig. 7 apresenta o espectro de RMN de XH de um composto HA-Re de acordo com a presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção será agora descrita de um modo mais detalhado. A presente invenção proporciona um composto baseado em ácido hialurónico, em que grupos álcool de ácido hialurónico são esterifiçados com reina, como tal ou em forma derivada, ou um seu sal. 6

Na presente descrição, o composto da presente invenção será também designado como "composto HA-Re".

Deve ser salientado que na presente descrição e reivindicações, o termo "reina" refere-se à reina como tal ou em forma derivada.

Os sais do composto HA-Re de acordo com a presente invenção incluem, de um modo preferido, sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, um sal de sódio, um sal de potássio, um sal de magnésio, um sal de cálcio, ou outros sais farmaceuticamente aceitáveis convencionais, de um modo mais preferido, o sal de sódio.

De acordo com a presente invenção, o termo "forma derivada" de reina inclui qualquer derivado da reina que é farmacologicamente activo in vivo e no qual o grupo ácido da reina está disponível para formar a ligação éster com os grupos hidroxilo do ácido hialurónico. É dada preferência a derivados da reina que tornam a referida antraquinona disponível in vivo.

Exemplos de reina na forma derivada, de acordo com a presente invenção, incluem reina como representada pela fórmula seguinte 7

OR O OR

em que R é, independentemente, qualquer grupo protector de hidroxilo, de um modo preferido, um grupo acilo, por exemplo um grupo acetilo, propionilo, butirilo ou pivaloilo, sem estar limitado a estes.

Numa forma de realização preferida da presente invenção a reina está em forma derivada, e de um modo mais preferido, é diacetilreina.

De acordo com a presente invenção, a reina, de um modo preferido, esterifica pelo menos 5% dos grupos álcool esterifiçáveis do ácido hialurónico, de um modo mais preferido entre 5 e 50%, e ainda, de um modo mais preferido, entre 5 e 20%. E dada preferência particular a um composto no qual a reina esterifica 10% dos grupos álcool esterifiçáveis do ácido hialurónico. O referido composto HA-Re pode ser preparado através de um processo de acordo com a invenção, que compreende fazer reagir cloreto acídico de reina com ácido hialurónico, de um modo preferido, numa quantidade tal que uma proporção da percentagem entre as mmol de cloreto acídico de reina e os meq. das unidades 8 de álcool esterifiçáveis de ácido hialurónico é superior a 5%, de um modo mais preferido, entre 5% e 50%, ainda de um modo mais preferido, entre 5% e 20%, e de acordo com uma forma de realização particularmente preferida, 10%. O processo seleccionado tomou em consideração a escolha de solventes dependendo da aceitação dos seus resíduos (ICH International Conference of Harmonisation of Technical

Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use).

De um modo preferido, o processo anteriormente mencionado de acordo com a presente invenção compreende os seguintes passos: a) preparar uma suspensão de ácido hialurónico num solvente apoiar aprótico, b) adicionar cloreto acídico de reina dissolvido numa quantidade mínima de um solvente apoiar aprótico e um receptor do ião hidrogénio, c) permitir que a mistura agite em refluxo durante um tempo que seja suficiente para que se realize a reacção de esterificação, e d) evaporar o solvente.

Exemplos de solventes apoiares apróticos que podem ser utilizados no passo a) incluem o ciclo-hexano, tetra-hidrofurano, tolueno, diclorometano, n-hexano, de um modo mais preferido, ciclo-hexano. 9 0 solvente apoiar aprótico que pode ser utilizado para dissolver cloreto acídico de reina não está limitado, mas deve ser de um modo preferido, seleccionado para ser o mesmo do que aquele utilizado no passo a).

Exemplos de receptor do ião hidrogénio que pode ser adicionado no passo b) incluem piridina, trietilamina, de um modo mais preferido, Et3N; Não está limitado o tempo durante o qual a reacção é mantida em refluxo, mas deve ser, de um modo preferido, pelo menos, 20 horas. O ácido hialurónico que pode ser utilizado para preparar o composto HA-Re de acordo com a presente invenção possui, de um modo preferido, um peso molecular desde 500000 a 3000000 Da, de um modo mais preferido, cerca de 600000 Da. O peso molecular do ácido hialurónico pode ser determinado de acordo com um modo convencional, por exemplo através de cromatografia de permeação de gel (GPC). O ácido hialurónico que é utilizado para preparar o composto HA-Re de acordo com a presente invenção, pode estar disponível comercialmente (por exemplo da Fidia Farmaceutici SpA - Abano T. PD) ou pode ser preparado, por exemplo, através da extracção a partir de cristãs de galos, através da fermentação de bactérias contendo uma camada de mucina ou através de outros modos convencionais [cf. Proteoglycan Protocols Human Press, R.V. lozzo Ed. Totowa, 2001] . 10 0 cloreto acídico de reina que pode ser utilizado no processo para preparar o composto HA-Re de acordo com a presente invenção pode ser obtido através de um processo compreendendo os seguintes passos: a') preparar uma suspensão de reina num solvente apoiar aprótico; b') adicionar uma quantidade de S0C12 de modo a obter uma proporção molar entre S0C12 e reina superior a 10; c') manter a agitação da solução em refluxo numa atmosfera inerte durante um tempo que é suficiente para se formar o cloreto acidico de reina; e d') remover o solvente e o excesso de S0C12 que não reagiu através de destilação.

Exemplos de solvente apoiares apróticos que podem ser utilizados no passo a') incluem ciclo-hexano, tetra-hidrofurano, tolueno, diclorometano, n-hexano, de um modo preferido, um solvente de cloreto e, de um modo mais preferido, CH2C12. O tempo durante o qual a reacção é mantida em refluxo no passo c') não está limitado, deve estar, de um modo preferido, durante pelo menos 3 horas. A reina, nesta ou na sua forma derivada, que pode ser utilizada no passo a') para preparar o cloreto acidico de reina pode estar disponível comercialmente (por exemplo, pela Aldrich) ou pode ser sintetizada de acordo com os processos convencionais [cf. cf. Nawa H et al. J. Org. Chem. 1961; 26: 979-981 e 11 referências aqui referidas; Smith C. W. et al. Tetrahedron Lett. 1993; 34: 7447-7450; Gallagher P. T. et al. Tetrahedron Lett. 1994; 35: 289-292] .

De acordo com uma aplicação particularmente preferida, é purificado o composto HA-Re da presente invenção obtido utilizando o processo de acordo com a presente invenção.

Esta purificação é, de um modo preferido, realizada utilizando uma membrana de diálise.

Neste caso, como será descrito nos exemplos que se seguem, é dada preferência à utilização da membrana de diálise que está disponível comercialmente sob o nome de mercado "Slide-A-Lyzer 3.5K" (Pierce, Rockford, IL USA), seguindo as instruções do fabricante.

Como anteriormente discutido, o composto HA-Re da presente invenção, possui uma estabilidade elevada, vantajosa, sendo estável, pelo menos, durante 36 meses a uma temperatura de 4 °C ± 0,5 °C em solução aquosa, de um modo preferido, tamponada a pH 7,4, tal como, por exemplo, uma solução salina tamponada com fosfato preparada de acordo com a Farmacopeia Oficial Italiana, edição XI. O composto HA-Re, de acordo com a presente invenção, possui propriedades anti-inflamatórias, cicatrizantes, reconstrutivas e anabólicas para a pele e cartilagem.

Consequentemente, a presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo um composto HA-Re, de 12 acordo com a presente invenção, em combinação com excipientes e/ou diluentes apropriados.

Em particular, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, pode ser um dispositivo médico e/ou um produto medicinal para utilização médica ou veterinária. A composição farmacêutica, de acordo com a presente invenção, de um modo preferido, possui uma formulação apropriada para administração loco-regional.

Uma composição farmacêutica particularmente preferida, de acordo com a presente invenção, é uma composição apropriada para utilização via infiltração intra-articular, via administração oftálmica, por exemplo, gotas para olhos e pomadas oftálmicas, e via administração tópica.

De um modo preferido, a composição da invenção está na forma de uma dispersão aquosa. A referida dispersão aquosa está, de um modo preferido, numa solução de tampão possuindo um pH fisiológico, de um modo mais preferido, um pH de 7,4, por exemplo uma solução salina tamponada com fosfato preparada de acordo com a Farmacopeia Oficial Italiana, edição XI.

De acordo com uma aplicação particularmente preferida, na composição farmacêutica da presente invenção, o composto HA-Re ou um seu sal, de acordo com a presente invenção, está presente numa concentração num intervalo entre 0,5% a 2% p/v, de um modo preferido, numa concentração de 1% p/v. 13

Outro objectivo da presente invenção é a utilização do composto HA-Re ou um seu sal, de acordo com a presente invenção, para preparar um medicamento para tratar doenças inflamatórias, de um modo preferido, incluindo doenças inflamatórias de articulações, em particular osteoartrite ou artrite reumatóide.

Um objectivo posterior da presente invenção é também a utilização do composto HA-Re ou um seu sal, de acordo com a presente invenção, para preparar um medicamento para reparação de tecidos, no qual o referido tecido é cartilagem ou pele.

Adicionalmente, o composto HA-Re ou um seu sal de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para preparar biomateriais, por exemplo, gazes para tratar feridas ou queimaduras e matrizes para o crescimento de células para serem utilizados no tratamento de queimaduras e em implantologia. A presente invenção será melhor ilustrada nos seguintes Exemplos experimentais bem como as Figuras.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Preparaçao de cloreto acídico de reina A reina (fornecida pela Aldrich) (21,5 mg; 0,075 mmol) foi colocada num frasco de fundo redondo de 50 mL e foi adicionado a este CH2CI2 (15 mL) . A suspensão virou para uma cor alaranjada. Depois, foi adicionado S0C12 (0,5 mL; 6,9 mmol) à suspensão. 14 A reacção foi realizada com agitação e refluxo (50 °C) numa atmosfera inerte (N2) . A mistura da reacção foi mantida em refluxo durante 3 horas e a solução virou para uma cor laranja-amarelado clara. De modo a remover o CH2C12 e o excesso de S0C12, foi adicionado tolueno (aproximadamente 5 mL) e foi destilada a mistura a 500 mmHg, correspondendo a β,β x 104 Pa, pelo menos 4 vezes para obter 23 mg de cloreto acidico bruto de reina (rendimento:quantitativo). O produto foi identificado por TLC, acetato de etilo.

Exemplo 2

Preparação do composto HA-Re

Foi suspenso em ciclo-hexano (20 mL) ácido hialurónico (fornecido por Fidia Farmaceutici SpA-Abano T.PD; peso molecular médio de 600000 Da) (277,3 mg; 4.6 x 104 mmol; correspondendo a 0,75 meq. de unidades de álcool primárias esterificáveis). Foi adicionado cloreto acidico de reina preparado como descrito no Exemplo 1 (21,5 mg; 0,075 mmol) dissolvido numa quantidade minima de CH2C12. De seguida, foi adicionado Et3N (3 mL) . A suspensão virou para uma cor vermelha. A reacção foi realizada com agitação e refluxo (70 °C) numa atmosfera inerte (N2) . Após um tempo curto, a suspensão tomou uma cor vermelha-alaranjada, que se tornou mais escura após aproximadamente três horas. Após 20 horas, a reacção foi cessada e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida (650 mmHg, correspondendo a 8,7 x 104 Pa) até à secagem, resultando no composto HA-Re na forma de uma precipitado amarelo claro. 15

Exemplo 3

Purificação do composto HA-Re a) preparação da amostra

Foi adicionada uma solução salina tamponada com fosfato (5 mL) a pH 7,4 ao composto HA-Re (0,1019 g) obtida como descrito no Exemplo 2. Foi obtido um sistema de duas fases e a solução virou para uma cor laranja-amarelada enquanto o residuo foi representado por uma massa de cor amarela-acastanhada de consistência gelatinosa. Após um período de espera de, pelo menos, 24 horas, foi obtido um sistema coloidal viscoso de cor castanha. b) purificação

Foi mantida a hidratar de um modo apropriado com solução salina tamponada com fosfato a pH 7,4 uma membrana de diálise "Slide-A-Lyzer®3.5K" (Pierce, Rockford, IL USA). Seguindo as instruções do fabricante, foi introduzida uma quantidade apropriada do composto HA-Re a ser purificada. A diálise foi realizada durante duas horas contra um tampão fosfato a pH 7,4 (após somente 20 minutos a solução de tampão pareceu possuir uma cor ligeiramente amarelada). A operação foi repetida pelo menos três vezes até a solução tampão permanecer incolor, sujeita a teste quanto à ausência de absorção no espectro visível. O composto HA-Re purificado foi recuperado a partir da membrana por diálise. A pureza do composto HA-Re deste modo obtido foi de 99,8%. 16

Exemplo 4

Análise do composto HA-Re obtido da presente invenção

1) Teste utilizando um espectrofotómetro UV-VIS A concentração de reina no composto HA-Re purificado obtida como descrito no Exemplo 3 foi avaliada através de leitura em espectrofotómetro a 430 nm baseada na calibração "robusta" no intervalo de 10“5 - 1CT3 (R1=0,9999). Este comprimento de onda foi seleccionado uma vez que o ácido hialurónico absorve no intervalo dos UV, que assim torna difícil a determinação quantitativa da reina. Com base na leitura espectrofotométrica, o rendimento da reacção de esterificação baseada na reina foi verificado ser de 58%.

Considerando o Exemplo 2, a quantidade de reina utilizada na reacção foi seleccionada para esterificar um máximo de 10% de grupos álcool primário esterifiçáveis de ácido hialurónico. Uma vez que o rendimento da reacção de esterificação baseado na reina foi verificado ser 58%, pode ser estimado que 5,8% dos grupos álcool esterifiçáveis de ácido hialurónico foram esterifiçados. 17 1

Análise de RMN de 1h

Foi efectuada numa solução de tampão deuterado um espectro de RMN de ΧΗ do composto HA-Re obtido no Exemplo 2 utilizando um espectrofotómetro Varian VRX300. Contudo, foram encontrados problemas ao interpretar o espectro uma vez que a percentagem de reina que reage com o ácido hialurónico não tornou possível identificar o anel aromático. Tendo em conta a fraca solubilidade da reina num ambiente aquoso e considerando que a esterificação é uma reacção reversível, saponificação, i. e., hidrólise de base, foi assim realizada de modo a obter a reina a partir do composto HA-Re. 0 composto obtido da saponificação foi precipitado. Foi realizado em dimetilsulfóxido (DMS) um espectro de ^-NMR do composto da saponificação assim obtido utilizando o espectrofotómetro Varian VRX300. 0 espectro obtido, que é apresentado na Fig. 1, coincidiu completamente com aquele da reina. 3) analisados por I.V.

Foi realizado um espectro de I.V. em Nujol para o composto obtido a partir da saponificação do composto HA-Re da presente invenção (utilizando o Espectro BX FT-IR System, Perkin Elmer). Como apresentado na Fig. 2, o espectro obtido coincide com aquele da reina pura.

4) HPLC-MS

Foi realizada uma análise por HPLC-MS (utilizando o equipamento Agilent 1100, séries LC/MSD) no composto obtido a partir da saponificação do composto HA-Re, obtido por saponificação da presente invenção, utilizando como fase móvel uma mistura de metanol/água 80:20 contendo ácido fórmico a 2,5%, a um caudal de 0,8 mL/min. Como pode ser verificado a partir da Figura 3, a massa do composto corresponde àquela da reina. 18

Exemplo 5

Avaliação das características tecnológicas do composto HA-Re da invenção 1) Avaliação da estabilidade hidrolítica O composto HA-Re da invenção como obtido no Exemplo 2 e não purificado através de diálise foi armazenado durante mais de seis meses no estado seco em frascos, no escuro e à temperatura ambiente (22 °C) . Esta amostra foi então purificada através de diálise como descrito no Exemplo 3 e a concentração de reina foi avaliada utilizando um espectrofotómetro UV-VIS. A concentração foi verificada ser igual àquela obtida para o produto sintetizado imediatamente. Os resultados experimentais por conseguinte mostram que, no estado seco, não foi observada degradação. Para além disso, o composto HA-Re da invenção produzido como descrito no Exemplo 2 e purificado através de diálise como descrito no Exemplo 3 foi armazenado durante seis meses numa solução a 2% num tampão fosfato a pH 7,4, em frascos, no escuro e a uma temperatura de O O Foi encontrada na amostra a presença de corpos estranhos, devido à utilização < de material não estéril e ao facto de não terem sido utilizados conservantes. A amostra foi uma vez mais sujeita a diálise utilizando o mesmo método como descrito no Exemplo 3, com este a ser sujeito a diálise durante, pelo menos, quatro dias. Através de um teste UV-VIS, não foi possivel encontras qualquer reina libertada nas várias soluções de tampão utilizadas para a diálise. Neste caso dois, por conseguinte, o composto foi verificado ser estável quimicamente uma vez que não foi libertada qualquer reina do composto HA-Re, pelo menos, em termos demonstráveis utilizando técnicas analíticas correntes. 19

Portanto, mesmo em solução, não foi observada degradação hidrolítica.

Os resultados obtidos tornam possível referir que o composto HA-Re de acordo com a presente invenção é estável durante, pelo menos, 24 meses sob condições de refrigeração (a 4 °C ± 0,5 °C) em solução aquosa. Esta afirmação deriva da ausência de qualquer degradação hidrolítica verificável.

Adicionalmente, de modo a regular a possibilidade de que a degradação hidrolítica do ácido hialurónico ocorra durante a reacção de esterificação com a reina, foi realizado um teste com um branco da referida reacção. Em particular, foram utilizadas as mesmas condições como na reacção de ligação da reina a ácido hialurónico, mas na ausência da referida reina. Em particular, foi adicionado ácido hialurónico (100 mg) a uma mistura de ciclo-hexano (10 mL), diclorometano (1 mL) e trietilamina (1 mL) sendo a reacção realizada em refluxo (70 °C) numa atmosfera inerte (N2) durante 24 horas; uma vez este tempo decorrido, os solventes da reacção foram removidos sob uma atmosfera de azoto. O composto obtido era muito menos solúvel em água do que o ácido hialurónico no estado nativo e foi caracterizado por uma viscosidade não determinável após 24 horas de dispersão. Isto significa que a despolimerização pode ser regulada, uma vez que tal resultou na solubilidade em água e consequentemente numa redução da viscosidade.

Finalmente, foi efectuada uma verificação da estabilidade hidrolítica do composto HA-Re purificado da invenção como obtido no Exemplo 3 após esterilização. Como discutido anteriormente, foi verificado que a utilização de material não estéril e o facto de que não são utilizados conservantes conduz à presença 20 de corpos estranhos nas amostras do composto da invenção. Em particular, foi preparada uma solução do composto HA-Re a 1% da invenção, purificado utilizando uma membrana de diálise, numa solução salina tamponada com fosfato a um pH 7,4. Dada a evidencia experimental que demonstrou que o ácido hialurónico é uma molécula sensível ao calor (Biomaterials 23 (2002) 4503-4513), a amostra assim obtida foi esterilizada utilizando vapor saturado pressurizado numa autoclave durante 20 min a 121 °C. A amostra foi então sujeita a diálise uma vez mais numa membrana de diálise de modo a avaliar qualquer presença de reina no líquido dialisado; não foi encontrado nenhum vestígio de reina. Estes resultados permitem que seja retirada a conclusão de que a amostra é hidroliticamente estável após esterilização a quente. 2) Análise das características reolóqicas e de injectabilidade A injectabilidade do composto HA-Re da invenção foi analisada em comparação com aquele do ácido hialurónico, ambos com um elevado e reduzido peso molecular.

Em particular, foram preparadas as três amostras seguintes: a) uma solução de ácido hialurónico a 1% p/v de elevado peso molecular (peso molecular médio de aproximadamente 1200000) numa solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4 b) uma solução de ácido hialurónico a 1% p/v de reduzido peso molecular (peso molecular médio de aproximadamente 600000) numa solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4 21 c) uma solução do composto HA-Re a 1% p/v da invenção numa solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4. A viscosidade das amostras foi assim medida utilizando um VISCOMATE MODEL VM-10A (frasco de vidro: 3 mL; na ausência de condições de agitação; temperatura 20 ± 0,2 °C), tendo sido obtidos os seguintes valores: a) η = 78,4 mPa.s b) η = 64,8 mPa.s c) η = 47,9 mPa. s

Os resultados obtidos demonstram que o composto HA-Re da invenção possui melhor seringebilidade do que o ácido hialurónico no seu estado nativo, ambos com um elevado e reduzido peso molecular. Tal é devido a uma solução do composto HA-Re a 1% p/v da invenção possuir uma viscosidade mais reduzida do que uma solução de ácido hialurónico a 1% p/v de reduzido peso molecular, que por sua vez possui uma viscosidade mais reduzida do que uma solução de ácido hialurónico a 1% p/v de elevado peso molecular. A redução da viscosidade que foi observada, tendo demonstrado que não existe reacção de despolimerização do ácido hialurónico após a reacção de esterificação, pode ser atribuída à interacção covalente entre reina e ácido hialurónico. 22

Exemplo 6

Avaliaçao da actividade farmacológica in vitro do composto HA-Re da invenção

Foram obtidas biopsias de cartilagem normal a partir de 5 indivíduos (3 homens e 2 mulheres, de idade média: 59,3 ±5,1 anos) durante cirurgia da anca ou do fémur como resultado de fractura traumática. Os indivíduos escolhidos para o estudo não apresentavam sinal bioquímico ou clínico de doenças inflamatórias ou das articulações, e apresentaram cartilagem normal a ambos os níveis macroscópicos e microscópicos. A cartilagem foi recolhida sob condições de esterilidade e processada imediatamente para o isolamento de condrócitos. As amostras foram limpas, em primeiro lugar, de quaisquer tecidos musculares, contínuos ou ósseos subcondrais aderentes, depois moídos em fragmentos de 1-3 mm3 e lavados com uma solução salina tamponada com fosfato, pH 7,2 (PBS). Os condrócitos isolados foram então libertados através de digestões enzimáticas repetidas de 60-75 min. a 37 °C com tripsina a 0,25%, colagenase I a 400U/mL, colagenase II a 1000 U/mL e hialuronidase a 1 mg/mL. As células foram misturadas, lavadas extensivamente em PBS e inoculadas em placas de 35 mm de elevada densidade (45 x 103 células/cm2) . O meio de cultura foi o meio de Ham F12 com modificação de Coon suplementado com FCS a 10% (Mascia Brunelli, Milano, Itália). A manutenção do fénotipo de condrócitos foi estimada através da detecção de colagénio tipo II após digestão com pepsina do sobrenadante da cultura. A viabilidade das células foi avaliada através do teste de exclusão de Azul de Tripano. A duplicação celular foi determinada em intervalos regulares por tripsinização da cultura e quantificação do número de células. As experiências de 23 estimulação foram realizadas quando as culturas primárias alcançaram confluência (passagem 0). As células foram então cultivadas durante 2 dias na presença de ácido ascórbico (50 pg/mL) e posteriormente incubadas durante 20 h na ausência ou presença de (rh)IL-ip )5 ng/mL), com ou sem a adição de várias concentrações de ácido hialurónico (HA), composto da invenção (HA-Re) ou reina.

Quer o ácido hialurónico e a reina fora referidos possuírem efeitos benéficos na osteoartrite devido à sua capacidade para inibir a actividade das metaloproteínases (MMP) envolvidas no catabolismo da cartilagem.

De modo a estudar o efeito de vários compostos na expressão de MMP em condrócitos humanos foram realizados ensaios de PCR em Tempo Real. O ARN total foi extraído dos condrócitos humanos cultivados utilizando Trizol (Gibco BRL) de acordo com as instruções do fabricante. As cadeias de ADNc foram sintetizadas utilizando o Superscript First-Strand synthesis kit (Gibco BRL) com 1 pg de ARN total. Os iniciadores foram os seguintes: MMP-1 (colagenase) Sentido: 5'-CTGAAGGTGATGAAGCAGCC-3'

Antisenso: 5'-AGTCCAAGAGAATGGCCGAG-3 (tamanho do fragmento 428 pb); MMP-3 (estromelisina) Sentido: CCTCTGATGGCCCAGAATTGA-3',

Antisenso: 5'-GAAATTGGCCACTCCCTGGGT-3' ((tamanho do fragmento 440 pb); Desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH), sentido: 5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3';

Antisenso: 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCA (tamanho do fragmento 598 pb). 24 A amplificação foi realizada a 60-64 °C durante 45 ciclos no iCycler Thermal Cycler (Bio-Rad Hercules, CA), e os dados foram analisados utilizando o programa informático iCycler iQ Optical. A expressão relativa de cada amostra foi calculada através de um método matemático baseado nas eficiências da PCR em tempo real, utilizando como referências ARNm de GAPDH. Todas as amostras foram sujeitas a ensaio em triplicado. Após 45 ciclos de amplificação, os valores do ciclo limite foram calculados automaticamente, e os fentogramas do ADNc de partida foram calculados a partir de uma curva padrão abrangendo um intervalo de quatro ordens de magnitude. Ambas as curvas de calibração de MMPs e GAPDH estão entre 1 a 1000 fentogramas por 25 pL de reacção. Foram calculadas as proporções da quantidade de partida de MMPs para GAPDH. As diferenças estatísticas dos resultados entre diversas variáveis experimentais e controlos relevantes foram analisadas utilizando o teste t de Student.

As Figuras 4 e 5 referem-se aos resultados obtidos nas experiências com RT-PCR.

Todas as amostras foram sujeitas a ensaio em triplicado. Em cada experiência, a mudança da expressão de ARNm de MMP foi expressa como um aumento do enrolamento quando comparado com aquele de células não tratadas. São apresentadas a média e o desvio padrão das três experiências. Foi utilizado o teste t de Student emparelhado para determinar o significado dos efeitos dos vários tratamentos. A diferença estatística entre os grupos de tratamento e de controlo é também referida: *=p<0,01; **=p<0,001 (teste de t de Student). 25 0 tratamento com IL-1 conduziu a um aumento dramático na expressão de ambos o MMP-1 e MMP-3, consistente com os dados bibliográficos. Nas experiências referidas na Figura 4, foi comparado o efeito de HA à concentração farmacológica habitualmente referida na bibliografia (1 mg/mL) para o efeito de HA-Re (composto da invenção) á mesma concentração (1 mg/mL). Foram obtidos resultados similares num intervalo de concentrações de HA de 0,1 - 1,5. A exposição de condrócitos humanos a uma dose farmacológica de HA (1 mg/mL) foi capaz de prevenir significativamente a indução de MMPl e MMP2 através de ILl (Figura 4 A e B) . De um modo surpreendente, doses similares do composto HA-Re da invenção levam ainda a um efeito protector ainda mais dramático, com a expressão de MMP a ser levada de volta para o nível basal em vez da exposição a IL4. A Figura 5 refere-se aos resultados das experiências nas quais o efeito da reina à dose farmacológica (10 μΜ) foi comparado com o efeito da uma dose similar de HA-Re. Também parece que o composto HA-Re da invenção é mais potente do que o Re isolado na realização de uma regulação negativa da expressão de MMP induzida por IL-1.

Exemplo 7

Foi realizada como no Exemplo 2, uma síntese adicional de HA-Re de acordo com a presente invenção, exceptuando que foram utilizadas 20 mg de ácido hialurónico e 23 mg de cloreto acídico de reina, correspondendo a concentrações estequiométricas de reina e ácido hialurónico baseadas em grupos alcoólicos primários do ácido hialurónico. A Figura 6 apresenta o espectro RMN de 13C do composto HA-Re assim obtido de acordo com a presente invenção, no qual aparece 26 claramente um pico característico a 175 ppm, especifico para funções éster. A Figura 7 apresenta o espectro RMN de do composto HA-Re assim obtido da presente invenção, no qual aparecem claramente picos caracteristicos entre 7 e 8 ppm, específicos para anéis aromáticos de reina.

Consequentemente, parece claro a partir destes dois espectros de RMN que no composto HA-Re, de acordo com a presente invenção, a reina esterifica os grupos álcool do ácido hialurónico.

Lisboa, 14 de Novembro de 2007 27

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composto baseado em ácido hialurónico, em que grupos de ácido hialurónico são esterifiçados com reina, como tal ou em forma derivada, ou um seu sal.
2. Composto de acordo com a Reivindicação 1, em que a reina esterifica pelo menos 5% dos grupos álcool esterifiçáveis do ácido hialurónico.
3. Composto de acordo com a Reivindicação 2, em que a reina esterifica desde 5% a 50% dos grupos álcool esterifiçáveis do ácido hialurónico.
4. Composto de acordo com a Reivindicação 3, em que a reina esterifica desde 5% a 20% dos grupos álcool esterifiçáveis do ácido hialurónico.
5. Composto de acordo com a Reivindicação 4, em que a reina esterifica 10% dos grupos álcool esterifiçáveis do ácido hialurónico.
6. Sal de sódio do composto de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 5.
7. Processo para preparação de um composto ou um seu sal de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 6, que compreende fazer reagir cloreto acidico de reina, como tal ou em forma derivada, com ácido hialurónico. 1
8. Processo de acordo com a Reivindicação 7, em que o cloreto acidico de reina e o ácido hialurónico estão numa quantidade tal que a proporção em percentagem entre as mmol de cloreto acidico de reina e os meq. de unidades de álcool esterifiçáveis de ácido hialurónico é, pelo menos, 5%.
9. Processo de acordo com a Reivindicação 8, em que a referida proporção em percentagem varia entre 5% a 50%.
10. Processo de acordo com a Reivindicação 9, em que a referida proporção em percentagem varia entre 5% a 20%.
11. Processo de acordo com a Reivindicação 10, em que a referida proporção em percentagem é de 10%.
12. Processo de acordo com as Reivindicações 7 a 11, que compreende os seguintes passos: a) preparar uma suspensão de ácido hialurónico num solvente apoiar aprótico, b) adicionar cloreto acidico de reina dissolvido numa quantidade minima de um solvente apoiar aprótico e um receptor do ião hidrogénio, c) permitir que a mistura agite em refluxo durante um tempo que seja suficiente para que se realize a reacção de esterificação, e d) evaporar o solvente. 2
13. Processo de acordo com a Reivindicação 12, em que o referido solvente não polar aprótico do passo a) é o ciclo-hexano.
14. Processo de acordo com as Reivindicações 12 ou 13, em que no passo b), o referido receptor do ião hidrogénio é NEt3.
15. Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 12 a 14, em que no passo c), a reacção é mantida em refluxo durante pelo menos 20 horas.
16. Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 7 a 15, no qual o cloreto acidico de reina é obtido através de um processo compreendendo os seguintes passos: a') preparar uma suspensão de reina num solvente apoiar aprótico; b') adicionar uma quantidade de SOCI2 de modo a obter uma proporção molar entre S0C12 e reina superior a 10; c') permitir a agitação da solução em refluxo numa atmosfera inerte durante um tempo que é suficiente para se formar o cloreto acidico de reina; e d') remover o solvente e 0 excesso de SOCI2 que não reagiu através de destilação.
17. Processo de acordo com a Reivindicação 16, em que o referido solvente apoiar aprótico do passo a') é um solvente de cloreto. 3
18. Processo de acordo com a Reivindicação 17, em que o referido solvente de cloreto é CH2C12.
19. Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 16 a 18, em que no passo c'), a reacção é mantida em refluxo durante, pelo menos, 3 horas.
20. Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 7 a 19, que compreende ainda um passo final de purificação.
21. Processo de acordo com a Reivindicação 20, em que o referido passo de purificação é realizado utilizando uma membrana de diálise.
22. Composição farmacêutica compreendendo o composto ou um seu sal de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 6 em combinação com excipientes apropriados e/ou diluentes.
23. Composição farmacêutica de acordo com a Reivindicação 22, que possui uma formulação apropriada para administração locorregional.
24. Composição farmacêutica de acordo com a Reivindicação 23, que é apropriada para administração por infiltração intra-articular.
25. Composição farmacêutica de acordo com a Reivindicação 23, que é apropriada para administração oftalmológica.
26. Composição farmacêutica de acordo com a Reivindicação 22, que é apropriada para administração tópica. 4
27. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das Reivindicações 22 a 26, na forma de uma dispersão aquosa.
28. Composição farmacêutica de acordo com a Reivindicação 27, em que a referida dispersão está numa solução tampão possuindo um pH de 7,4.
29. Composição farmacêutica de acordo com a Reivindicação 27 ou 28, em que o composto está numa concentração variando desde 0,1% a 2% p/v.
30. Composição farmacêutica de acordo com a Reivindicação 29, em que o composto está numa concentração de 1% p/v.
31. Produto medicinal para utilização médica ou veterinária, formado por uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das Reivindicações 22 a 30.
32. Dispositivo médico para utilização médica ou veterinária, formado por de uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das Reivindicações 22 a 30.
33. Utilização de um composto ou seu sal de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 6 para preparar um medicamento para tratar doenças inflamatórias.
34. Utilização de acordo com a Reivindicação 33, em que as referidas doenças inflamatórias são doenças inflamatórias das articulações.
35. Utilização de um composto ou um seu sal de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 6 para preparar um 5 medicamento para reparação de tecidos, no tecido é cartilagem ou pele.
36. Utilização de um composto ou um seu sal qualquer uma das Reivindicações 1 a 6 biomateriais. Lisboa, 14 de Novembro de 2007 qual o referido de acordo com para preparar 6