BRPI0507622B1

BRPI0507622B1 - composto baseado em ácido hialurônico, processo para preparar um composto ou um sal do mesmo, composição farmacêutica, produto medicinal e dispositivo médico para uso humano ou veterinário, e,uso de composto ou de um sal do mesmo

Info

Publication number: BRPI0507622B1
Application number: BRPI0507622A
Authority: BR
Inventors: Pietrangelo Antonello; Travagli Valter
Original assignee: Laboratoire Medidom S A
Priority date: 2004-02-26
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2018-07-17
Also published as: RU2006134015A; PT1718679E; DE602005002538T2; UA91673C2; IL177072A; HK1099032A1; JP4870068B2; ATE373681T1; BRPI0507622B8; SI1718679T1; JP2007524753A; US20070203094A1; US7834173B2; CA2556942A1; CN1914228A; DE602005002538D1; EP1718679B1; IL177072A0; ES2293538T3; ITMI20040347A1

Description

(54) Título: COMPOSTO BASEADO EM ÁCIDO HIALURÔNICO, PROCESSO PARA PREPARAR UM COMPOSTO OU UM SAL DO MESMO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, PRODUTO MEDICINAL E DISPOSITIVO MÉDICO PARA USO HUMANO OU VETERINÁRIO, E,USO DE COMPOSTO OU DE UM SAL DO MESMO (51) Int.CI.: C08B 37/00 (30) Prioridade Unionista: 26/02/2004 IT MI2004A000347 (73) Titular(es): LABORATOIRE MEDIDOM S.A.

(72) Inventor(es): ANTONELLO PIETRANGELO; VALTER TRAVAGLI “COMPOSTO BASEADO EM ÁCIDO HIALURÔNICO, PROCESSO PARA PREPARAR UM COMPOSTO OU UM SAL DO MESMO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, PRODUTO MEDICINAL E DISPOSITIVO MÉDICO PARA USO HUMANO OU VETERINÁRIO, E, USO DE COMPOSTO OU DE UM SAL DO MESMO”

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se aos ésteres de ácido hialurônico (HA) com reina, mais particularmente a um composto baseado em ácido hialurônico, no qual grupos álcool de ácido hialurônico são esterificados com reina, a um processo para preparar o citado éster e a uma composição farmacêutica compreendendo o citado éster.

TÉCNICA ANTERIOR

Reina é um alcalóide derivado de sena que possui propriedades antiinflamatórias e protetoras de tecido.

Reina, cujo nome químico é ácido 4,5-di-hidróxi-9,10-dihidro-9,10-dioxo-2-antraceno-carboxílico, possui a seguinte fórmula geral (I):

na qual R é H.

Esta substância é administrada via a rota oral, normalmente como diacetil-reína, um derivado da fórmula geral (I) acima no qual cada um dos grupos R é um grupo acetila, que possui biodisponibilidade maior e que é usada principalmente no tratamento de inflamação das articulações.

Contudo, tanto reina quanto diacetil-reína apresentam a desvantagem de possuírem uma ação laxativa considerável, que pode até mesmo acarretar diarréia e assim tornar o seu uso desaconselhável para pacientes idosos ou debilitados.

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Ainda mais, por conta da insolubilidade de reina e de diacetilreína em água, este efeito colateral não pode ser evitado pela administração destes princípios ativos via a rota parental ou intraarticular.

Ácido hialurônico é um mucopolissacarídeo natural formado 5 de unidades alternadas de ácido D-glicurônico e N-acetil-glicosamina, como representado em uma maneira geral abaixo

para formar uma cadeia linear possuindo um peso molecular de até 13 χ 10⁶ Daltons.

z

Acido hialurônico está presente em todos os tecidos moles do organismo e em muitos fluidos fisiológicos tais como, por exemplo, o fluido sinovial das articulações e o humor vítreo dos olhos.

Ácido hialurônico é usado em muitas aplicações clínicas sob sua forma de sal ou ácida.

Em particular, é usado com grande sucesso em inflamação das articulações, onde ele é administrado por infiltração diretamente para dentro da articulação e atua por meio de um mecanismo duplo: por um lado pela redução da inflamação da articulação e por outro lado pelo aumento da viscosidade do fluido sinovial, beneficiando deste modo a cartilagem, que como um resultado é mais lubrificada.

Também é aplicável em oftalmologia, onde ele é usado por causa de suas propriedades protetoras e antiinflamatórias e de reparo de tecido, em virtude de sua ação anabólica-reconstrutiva sobre cartilagem e pele.

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Contudo, é sabido que ácido hialurônico sofre de degradação. Tem sido relatado que a degradação de ácido hialurônico é causada por hidrólise, dependendo das condições e pH e da concentração de cátion [cf. por exemplo Uchiyama H. et al. J. Biol. Chem. 1990; 265: 77535 7759; Tokita Y. e Okamoto A., Polymer Degr. and Stab. 1995; 48: 269-273;

Hawkins C-L. e Davies M.J. Free Rad. Biol. Med. 1998; 24: 1396-1410; Schiller J- et al. Current Med. Chem. 2003; 10: 2123-2145].

Após estudos extensivos, os presentes inventores têm verificado que ácido hialurônico possuindo grupos álcool esterificados com reína possui uma estabilidade maior do que a de ácido hialurônico e adicionalmente possui uma atividade farmacológica melhorada comparada com aquela observada com respeito ao ácido hialurônico e ao reína separadamente utilizados.

Em adição, os presentes inventores têm verificado que ácido hialurônico possuindo grupos álcool esterificados com reína pode ser vantajosamente usado por administração local, evitando deste modo as desvantagens associadas com a administração oral de reína.

A presente invenção tem sido realizada baseando-se nestes resultados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um composto baseado em ácido hialurônico, no qual grupos álcool de ácido hialurônico são esterificados com reína, tal como ou em forma derivada, ou um seu sal, que possui não apenas uma estabilidade maior do que aquela de ácido hialurônico, mas também uma atividade farmacológica melhorada comparada com aquela que é observada com respeito ao ácido hialurônico e ao reína usados separadamente, e adicionalmente que pode ser utilizado por administração local, evitando deste modo as desvantagens associadas com a administração oral de reína.

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De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para preparar o composto ou um seu sal de acordo com o primeiro aspecto, que compreende reagir o cloreto de ácido de reína, como tal ou na forma derivada, com ácido hialurônico.

De acordo com um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo o composto ou um seu sal de acordo com o primeiro aspecto em combinação com excipiente e/ou diluentes adequados.

De acordo com outros aspectos, a presente invenção refere-se a um produto medicinal ou um dispositivo médico para uso humano ou veterinário, formado por uma composição de acordo com o terceiro aspecto, e ao uso de um composto ou de um seu sal de acordo com o primeiro aspecto para preparar um medicamento para tratar doenças inflamatórias, ou para reparo de tecido, ou para preparar biomateriais.

Outras vantagens da presente invenção surgirão na seguinte descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Fig. 1 mostra o espectro de ¹H-RMN de reína obtido por saponificação do composto Ha-Re da presente invenção,

Fig. 2 mostra o espectro em I.V. de reína obtido por saponificação do composto Ha-Re da presente invenção,

Fig. 3 mostra a análise por HPLC-MS de reína obtido por saponificação do composto Ha-Re da presente invenção,

Fig. 4 relata os resultados obtidos em experimentos de RT25 PCR comparando o efeito de ácido hialurônico na concentração farmacológica com o efeito de composto Ha-Re da presente invenção,

Fig. 5 relata os resultados obtidos em experimentos de RTPCR nos quais o efeito de reína na dose farmacológica tem sido comparado com o efeito de uma dose semelhante de composto Ha-Re da presente

Petição 870180044317, de 25/05/2018, pág. 12/34 invenção,

Fig. 6 mostra o espectro de ¹³C-RMN de um composto Ha-Re de acordo com a presente invenção.

Fig. 7 mostra o espectro de ¹H-RMN de um composto Ha-Re 5 de acordo com a presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção será agora descrita em uma maneira mais detalhada.

A presente invenção proporciona um composto baseado em 10 ácido hialurônico, no qual grupos álcool de ácido hialurônico são esterificados com reína, como tal ou na forma derivada, ou um seu sal.

Na presente descrição, o composto da presente invenção também será designado como composto Ha-Re.

É para ser observado que nas presentes descrição e reivindicações, o termo reína significa reína como tal ou na forma derivada.

Sais do composto HA-Re de acordo com a presente invenção incluem preferivelmente sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, um sal de sódio, um sal de potássio, um sal de magnésio, um sal de cálcio, ou outros sais farmaceuticamente aceitáveis convencionais, com maior preferência o sal de sódio.

De acordo com a presente invenção, o termo forma derivada de reína inclui qualquer derivado de reína que é farmacologicamente ativo in vivo e no qual o grupo ácido de reína está disponível na forma de ligação éster com os grupos hidroxila de ácido hialurônico.

Preferência é dada aos derivados de reína que tornam a citada antraquinona disponível in vivo.

Exemplos de reína na forma derivada de acordo com a presente invenção incluem reína como representado pela seguinte fórmula

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na qual R é independentemente qualquer grupo protetor de hidroxila apropriado, preferivelmente um grupo acila, por exemplo um grupo acetila, propionila, butirila ou pivaloíla, sem estar limitado a estes.

Em uma modalidade preferida da presente invenção reina está na forma derivada, e com maior preferência é diacetil-reína.

De acordo com a presente invenção, reina preferivelmente esterifica pelo menos 5% dos grupos álcool esterificáveis de ácido hialurônico, com maior preferência entre 5% e 60%, e ainda mais preferivelmente entre 5% e 20%.

Preferência particular é dada a um composto no qual reina esterifica 10% dos grupos álcool esterificáveis de ácido hialurônico.

O citado composto Ha-Re pode ser preparado por um processo de acordo com a invenção, que compreende reagir cloreto de ácido de reina com ácido hialurônico, preferivelmente em uma quantidade tal que uma razão percentual entre o mmol de cloreto de ácido de reina e o meq. de unidades álcool esterificáveis de ácido hialurônico seja maior do que 5%, com maior preferência esteja entre 5% e 50%, com preferência ainda maior entre 5% e 20%, e de acordo com uma modalidade particularmente preferida 10%.

O processo selecionado levou em consideração a escolha de solventes dependendo da aceitabilidade de seus resíduos (ICH - International Conference of Harmonisation of Technical Requeriments for Registration of Pharmaceuticals for Human Use).

Preferivelmente, o processo acima mencionado de acordo com a presente invenção compreende as seguintes etapas:

a) preparar uma suspensão de ácido hialurônico em um

Petição 870180044317, de 25/05/2018, pág. 14/34 solvente aprótico não-polar,

b) adicionar cloreto de ácido de reína dissolvido em uma quantidade mínima de um solvente aprótico não-polar e um aceitador de hidrogênio,

c) deixar a mistura agitar sob refluxo por um tempo que é suficiente para ocorrer a reação de esterificação, e

d) evaporar o solvente.

Exemplos de solventes apróticos não-polares que podem ser usados na etapa a) incluem ciclo-hexano, tetra-hidro-furano, tolueno, dicloro10 metano, n-hexano, mais preferivelmente ciclo-hexano.

Solvente aprótico não-polar que pode ser utilizado para dissolver cloreto de ácido de reína não é limitado, mas deve ser preferivelmente selecionado para ser igual àquele empregado na etapa a).

Exemplos de aceitador de íon hidrogênio que pode ser 15 adicionado na etapa b) incluem piridina, trietil-amina, mais preferivelmente

Et₃N.

O tempo durante o qual a reação é deixada sob refluxo não é limitado, mas deve ser preferivelmente de pelo menos 20 horas.

z

Ácido hialurônico que pode ser usado para preparar o 20 composto HA-Re de acordo com a presente invenção possui preferivelmente um peso molecular de 500.000 a 3.000.000 Da, com maior preferência ao redor de 600.000 Da.

O peso molecular de ácido hialurônico pode ser determinado de acordo com uma maneira convencional, por exemplo por cromatografia de permeação em gel (GPC).

X

Ácido hialurônico que é utilizado para preparar o composto HA-Re de acordo com a presente invenção pode estar comercialmente disponível (por exemplo na Fidia Farmaceutici SpA - Abano T. PD) ou pode ser preparado por exemplo por meio da extração de crista de galo, por meio

Petição 870180044317, de 25/05/2018, pág. 15/34 de fermentação de bactérias possuindo uma camada de mucina ou por meio de outras maneiras convencionais [cf. Proteoglycan Protocols, Humana Press, R.V. Iozzo Ed. Totowa, 2001].

O cloreto de ácido de reína que pode ser usado no processo 5 para preparar o composto HA-Re de acordo com a presente invenção pode ser obtido por meio de um processo compreendendo as seguintes etapas:

a') preparar uma suspensão de reína em um solvente aprótico não-polar;

b') adicionar uma quantidade de SOCl2 de modo a obter uma razão molar entre SOCH e reína maior do que 10;

c') deixar a reação agitar sob refluxo em uma atmosfera inerte por um tempo que é suficiente para formar o cloreto de ácido de reína; e d') remover o solvente e o excesso de SOCl2 não reagido por destilação.

Exemplos de solventes apróticos não-polares que podem ser usados na etapa a') incluem ciclo-hexano, tetra-hidro-furano, tolueno, diclorometano, n-hexano, preferivelmente um solvente cloreto e mais preferivelmente CH2Cl2.

O tempo durante o qual a reação é deixada sob refluxo na etapa c') não é limitado, deve ser preferivelmente de pelo menos 3 horas.

Reína, como tal ou na forma derivada, que pode ser empregado na etapa a') para preparar o cloreto de ácido de reína pode estar comercialmente disponível (por exemplo na Aldrich) ou pode ser sintetizado de acordo com processos convencionais [cf. Nawa H et al., J. Org. Chem.

1961; 26: 979-981 e as referência lá relatadas; Smith C.W. et al., Tetrahedron

Lett 1993; 34: 7447-7450; Gallagher P.T. et al., Tetrahedron Lett 1994; 35: 289-292].

De acordo com uma aplicação particularmente preferida, o composto HA-Re da presente invenção obtido usando o processo de acordo

Petição 870180044317, de 25/05/2018, pág. 16/34 com a presente invenção é purificado.

Esta purificação é preferivelmente realizada usando uma membrana de diálise.

Neste caso, como será descrito nos exemplos que seguem, 5 preferência é dada ao uso de membrana de diálise que esteja comercialmente disponível sob o nome comercial Slide-A-Lyzer 3.5K (Pierce, Rockford, IL

USA), seguindo as instruções do fabricante.

Como já discutido acima, o composto HA-Re da presente invenção possui uma estabilidade alta vantajosa, sendo estável por pelo menos 36 meses em uma temperatura de 4°C ± 0,5°C em solução aquosa, preferivelmente tamponada em pH 7,4, tal como por exemplo uma solução salina tamponada com fosfato preparada de acordo com a Oficial Italian Pharmacopoeia, XI edição.

O composto HA-Re de acordo com a presente invenção possui propriedades antiinflamtórias, cicatrizantes, reconstrutivas e anabólicas para pele e cartilagem.

A presente invenção portanto também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo um composto Ha-Re de acordo com a presente invenção em combinação com diluentes e/ou excipientes adequados.

Em particular, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser um dispositivo médico e/ou um produto médico para uso humano e veterinário.

A composição farmacêutica de acordo com a presente 25 invenção preferivelmente possui uma formulação adequada para administração loco-regional.

Uma composição farmacêutica particularmente preferida de acordo com a presente invenção é uma composição apropriada para uso via infiltração intraarticular, via administração oftálmica, por exemplo gotas

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Preferivelmente, a composição da invenção está na forma de uma dispersão aquosa.

A citada dispersão é preferivelmente uma solução tampão 5 possuindo um pH fisiológico, com maior preferência um pH 7,4, por exemplo uma solução salina tamponada com fosfato preparada de acordo com a

Oficial Italian Pharmacopoeia, XI edição.

De acordo com uma aplicação particularmente preferida, na composição farmacêutica da presente invenção, o composto Ha-Re ou um seu sal de acordo com a presente invenção está presente em uma concentração variando de 0,5% a 2% p/p, preferivelmente em uma concentração de 1% p/p.

Outro objetivo da presente invenção é o uso de composto HARe ou de um seu sal de acordo com a presente invenção para preparar um medicamento para tratar doenças inflamatórias, preferivelmente incluindo doenças inflamatórias das articulações, em particular osteoartrite e artrite reumatóide.

Um outro objetivo da presente invenção é também o uso de composto HA-Re ou de um seu sal de acordo com a presente invenção para preparar biomateriais, por exemplo gazes para tratar ferimentos ou queimaduras e matrizes para crescimento de células a serem utilizadas no tratamento de queimaduras e em implantologia.

A presente invenção será melhor ilustrada pelos seguintes Exemplos experimentais bem como Figuras.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Preparação de cloreto de ácido de reína

Reína (proporcionado por Aldrich) (21,5 mg; 0,075 mmol) foi adicionado em um frasco de fundo redondo de 50 mL e CH2Cl2 (15 mL) foi adicionado no mesmo. A suspensão tornou-se de cor laranja. Então, SOCl2

Petição 870180044317, de 25/05/2018, pág. 18/34 (0,5 mL; 6,9 mmol) foi adicionado na suspensão. A reação foi realizada com agitação sob refluxo (50^oC) em uma atmosfera inerte (N2). A mistura reacional foi deixada sob refluxo por 3 horas e a solução apresentou cor amarela-laranja clara. Com o objetivo de remover o CH2Cl2 e o excesso de

SOCl2 não reagido, tolueno (aproximadamente 5 mL) foi adicionado e a mistura foi destilada a 500 mm Hg, correspondendo a 66,6 Pa, pelo menos 4 vezes para obter 23 mg de cloreto de ácido bruto de reína (rendimento: quantitativo). O produto foi identificado por TLC, acetato de etila.

Exemplo 2

Preparação de composto HA-Re

Ácido hialurônico (proporcionado por Fidia Farmaceutici

SpA-Abano T. PD; peso molecular médio de aproximadamente 600.000 Da) (277,3 mg; 4,6 x 10^-4 mmol; correspondendo a 0,75 meq. de unidades de álcool primário esterificáveis) foi suspenso em ciclo-hexano (20 mL). Cloreto de ácido de reína preparado como descrito no Exemplo 1 (21,5 mg; 0,075 mmol) dissolvido em uma quantidade mínima de CH2Cl2 foi adicionado. Então, Et3N (3 mL) foi adicionada. A suspensão apresentou uma cor vermelha. A reação foi realizada com agitação sob refluxo (70^oC) em uma atmosfera inerte (N2). Após um tempo curto, a suspensão apresentou uma cor vermelha-laranja, que se tornou mais escura após aproximadamente três horas. Após 20 horas, a reação foi interrompida e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida (650 mm Hg, correspondendo a 86,7 Pa) até a secura, resultando no composto HA-Re na forma de um precipitado amarelo claro.

Exemplo 3

Purificação do composto HA-Re

a) Preparação da amostra

Uma solução salina tamponada com fosfato (5 mL) em pH 7,4 foi adicionada no composto HA-Re (0,1019 g) obtido como descrito no Exemplo 2.. Um sistema de duas fases foi obtido e a solução apresentou uma

Petição 870180044317, de 25/05/2018, pág. 19/34 cor laranja-amarela enquanto que o resíduo foi representado por uma massa de cor amarela-marrom de consistência gelatinosa. Após uma espera de pelo menos 24 horas, foi obtido um sistema coloidal viscoso de cor marrom.

b) Purificação

Uma membrana de diálise Slide-A-Lyzer® 3.5K (Pierce,

Rockford, IL, USA) foi deixada hidratar em uma maneira apropriada com solução salina tamponada com fosfato em pH 7,4. Seguindo as instruções do fabricante, uma quantidade adequada de composto HA-Re a ser purificada foi introduzida. Diálise foi realizada por 2 horas contra um tampão fosfato em pH

7,4 (após apenas 20 minutos a solução tampão apresentou uma cor ligeiramente amarelada). A operação foi repetida pelo menos três vezes até que a solução tampão permanecesse incolor, testando a ausência de absorção no espectro visível. O composto HA-Re purificado foi recuperado da membrana por diálise. A pureza do composto HA-Re assim obtido foi de

99,8%.

Exemplo 4

Análise do composto HA-Re da presente invenção obtido 1) Teste usando um espectrofotômetro UV-VIS A concentração de reína no composto HA-Re purificado obtido como descrito no Exemplo 3 foi avaliada tomando uma leitura espectrofotométrica em 430 nm baseada na calibração robusta dentro da faixa de 10^-5-10^-3 (R²=0,9999). Este comprimento de onda foi selecionado porque o ácido hialurônico absorve na faixa do UV, que por sua vez torna difícil a determinação quantitativa de reína. Baseado na leitura espectrofotométrica, a rendimento de reação de esterificação verificado obtido baseado em reína foi de 58%.

Considerando o Exemplo 2, a quantidade de reína usada na reação foi selecionada para esterificar um máximo de 10% de grupos álcool primário esterificáveis de ácido hialurônico. Visto que a o rendimento da

Petição 870180044317, de 25/05/2018, pág. 20/34 reação de esterificação verificado baseado em reína foi de 58%, pode ser estimado que 5,8% dos grupos álcool esterificáveis de ácido hialurônico foram esterificados.

2) Análise por ¹H-RMN

Um espectro de ¹H-RMN do composto HA-Re obtido no Exemplo 2 foi realizado em solução tampão deuterada usando um espectrômetro Varian VRX300. Contudo, problemas foram encontrados quando se interpretou este espectro porque a percentagem de reína que reage com o ácido hialurônico não possibilitou a identificação do anel aromático. Levando-se em consideração a solubilidade insatisfatória de reína em um ambiente aquoso e considerando que a esterificação é uma reação reversível, saponificação, i.e. hidrólise básica, foi portanto realizada de modo a obter o reína a partir do composto HA-Re. O composto de saponificação obtido foi precipitado. Um espectro de ¹H-RMN do composto de saponificação assim obtido foi realizado em dimetil-sulfóxido (DMSO) usando o espectrômetro Varian VRX300. O espectro obtido, que é mostrado na Fig. 1, coincidiu completamente com aquele de reína.

3) Análise em I.V.

Um espectro em I.R. foi realizado em Nujol para o composto obtido da saponificação de composto HA-Re da presente invenção (usando Espectro BX Fischer-Tropsch-IR System, Perkin Elmer). Como mostrado na Fig. 2, o espectro obtido coincide com aquele de reína puro.

4) HPLC-MS

Uma análise por HPLC-MS foi realizada (usando o equipamento Agilent 1100, series LC/MSD) no composto obtido da saponificação do composto HA-Re da presente invenção, usando como a fase móvel uma mistura de metanol / água 80:20 contendo 2,5% de ácido fórmico, em uma vazão de fluxo de 0,8 mL/min. Como pode ser visto da Fig. 3, a massa do composto corresponde àquela de reína.

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Exemplo 5

Avaliação das características tecnológicas do composto HARe da invenção

1) Avaliação da estabilidade hidrolítica

O composto HA-Re da invenção como obtido no Exemplo 2 e não purificado por meio de diálise foi armazenado por mais do que seis meses no estado seco dentro de frascos, no escuro e na temperatura ambiente (22^oC). Esta amostra foi então purificada por meio de diálise como descrito no Exemplo 3 e a concentração de reína foi avaliada usando um espectrofotômetro UV-VIS. A concentração verificada foi igual àquela obtida para o produto imediatamente sintetizado. Os resultados experimentais portanto mostram que, no estado seco, não foi observada degradação. Ainda mais, o composto HA-Re da invenção produzido como descrito no Exemplo 2 e purificado por meio de diálise como descrito no Exemplo 3 foi armazenado por seis meses em uma solução 2% em tampão fosfato de pH 7,4, em frascos, no escuro e em uma temperatura de 4^oC. A presença de corpos estranhos foi verificada na amostra, devido ao uso de material não estéril e ao fato de que conservantes não foram empregados. A amostra foi de novo submetida à diálise usando o mesmo método como descrito no Exemplo 3, com ela sendo submetida à diálise por pelo menos quatro dias. Por meio de um teste em UVVIS, não foi possível verificar qualquer reína liberado para as várias soluções tampão usadas para a diálise. Neste caso também, portanto, foi mostrado que o composto é quimicamente estável porque não foi verificada liberação de reína do composto HA-Re, pelo menos em termos demonstráveis usando técnicas analíticas correntes. Portanto, até mesmo em solução, não foi observada degradação hidrolítica.

Os resultados obtidos possibilitam afirmar que o composto HA-Re de acordo com a invenção é estável por pelo menos 24 meses sob condições refrigeradas (a 4^oC ± 5^oC) em solução aquosa. Esta afirmação

Petição 870180044317, de 25/05/2018, pág. 22/34 deriva-se da ausência de qualquer degradação hidrolítica notável.

Ainda mais, com o propósito de excluir a possibilidade de que a degradação hidrolítica do ácido hialurônico ocorra durante a reação de esterificação com reína, um teste branco de citada reação é conduzido. Em particular, as mesmas condições foram usadas como na reação de ligação de reína em ácido hialurônico, mas na ausência de citado reína. Em particular, ácido hialurônico (100 mg) foi adicionado em uma mistura de ciclo-hexano (10 mL), dicloro-metano (1 mL) e trietil-amina (1 mL) e a reação foi realizada sob refluxo (70^oC) em uma atmosfera inerte (N2) por 24 horas; uma vez tendo passado este tempo, os solventes de reação foram removidos sob uma atmosfera de nitrogênio. O composto obtido foi muito menos solúvel em água do que o ácido hialurônico no estado nativo e foi caracterizado por uma viscosidade não-determinável após 24 horas de dispersão. Isto significa que despolimerização pode ser evitada, visto que esta teria resultado em solubilidade em água e portanto em uma redução na viscosidade.

Finalmente, uma checagem foi feita da estabilidade hidrolítica do composto HA-Re purificado da invenção como obtido no Exemplo 3 sob esterilização. Como discutido acima, foi verificado que o uso de material não estéril e o fato de que conservantes não foram usados acarreta a presença de corpos estranhos nas amostras do composto da invenção. Em particular foi preparada solução a 1% de composto HA-Re da invenção, purificada usando uma membrana de diálise, em uma solução salina tamponada com fosfato em pH 7,4. Dada a evidência experimental que mostrou que ácido hialurônico é uma molécula sensível ao calor (Biomaterials 23 (2002) 4503-4513), a amostra assim obtida foi esterificada usando vapor saturado pressurizado em um autoclave por 20 minutos a 121^oC. A amostra foi então submetida à diálise mais uma vez em uma membrana de diálise com o objetivo de avaliar qualquer presença de reína no líquido dialisado; nenhum traço de reína foi verificado. Estes resultados permitem concluir que a amostra é

Petição 870180044317, de 25/05/2018, pág. 23/34 hidroliticamente estável sob esterilização quente.

2) Análise das características reológicas e da seringabilidade

A seringabilidade do composto HA-Re da invenção foi analisada em comparação com aquela de ácido hialurônico de peso molecular tanto alto quanto baixo.

Em particular, as seguintes três amostras foram preparadas: a) uma solução a 1% p/v de ácido hialurônico de peso molecular alto (peso molecular médio de aproximadamente 1.200.000) em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4.

b) uma solução a 1% p/v de ácido hialurônico de peso molecular baixo (peso molecular médio de aproximadamente 600.000) em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4.

c) uma solução a 1% p/v de composto HA-Re da invenção em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4.

A viscosidade das amostras foi então medida usando um

VISCOMATE MODEL VM-10A (frasco de vidro: 3 mL; na ausência de condições de agitação; temperatura de 20^oC±0,2^oC), com os seguintes valores sendo observados:

a) η = 78,4 mPa.s

b) η = 64,8 mPa.s

c) η = 47,9 mPa.s

Os resultados obtidos mostram que o composto HA-Re da invenção possui seringabilidade melhor do que a de ácido hialurônico no estado nativo de peso molecular tanto baixo quanto alto. Isto é porque uma solução a 1% p/v de composto HA-Re da invenção possui uma viscosidade menor do que a de uma solução a 1% p/v de ácido hialurônico de peso molecular baixo, que por sua vez possui uma viscosidade menor do que a de uma solução a 1% p/v de ácido hialurônico de peso molecular alto.

A redução na viscosidade que foi observada, tendo

Petição 870180044317, de 25/05/2018, pág. 24/34 demonstrado que não há reação de despolimerização do ácido hialurônico após a reação de esterificação, pode ser atribuída à interação covalente entre reína e ácido hialurônico.

Exemplo 6

Avaliação da atividade farmacológica in vitro do composto

HA-Re da invenção

Biópsias de cartilagem normal foram obtidas de 5 indivíduos (3 machos e 2 fêmeas, idade média: 58,3±5,1 anos) durante cirurgia do fêmur ou do quadril como um resultado de fratura traumática. Os indivíduos escolhidos para o estudo não apresentaram sinal bioquímico ou clínico de doenças inflamatórias ou de articulação, e apresentaram cartilagem normal em ambos os níveis macroscópico e microscópico. Cartilagem foi coletada sob condições estéreis e imediatamente processada para isolamento de condrócito. As amostras foram primeiro limpas de quaisquer tecidos musculares, conjuntivos ou ósseos subcondrais aderentes, então foram fragmentados em fragmentos de 1-3 mm³ e enxaguados em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,2. Condrócitos individuais foram então liberados por digestões enzimáticas repetidas de 60-75 min a 37^oC com tripsina 0,25%, 100 U/mL de colagenase I, 1000 U/mL de colagenase II e 1 mg/mL de hialuronidase. As células foram reunidas, lavadas extensivamente em PBS e semeadas em uma densidade alta em placas de 35 mm (45 x 10³ células/cm²). Meio de cultura foi F12 de Ham modificado por Coon suplementado com 10% de FCS (Mascia Brunelli, Milão, Itália). Manutenção do fenótipo de condrócito foi estimado pela detecção de colágeno do tipo II após digestão por pepsina do sobrenadante de cultura. Viabilidade celular foi avaliada pelo teste de exclusão de Azul Triptano. Duplicação celular foi determinada em intervalos regulares por tripsinação da cultura e quantificação do número de células. Os experimentos de estimulação foram realizados quando as culturas primárias alcançaram confluência (passagem 0). As células foram cultivadas

Petição 870180044317, de 25/05/2018, pág. 25/34 por 2 dias na presença de ácido ascórbico 50 pg/mL) e incubadas depois por 20 h na ausência ou presença de (rh)IL-1 β (5 ng/mL), com ou sem a adição de várias concentrações de ácido hialurônico (HA), composto da invenção (HARe) ou reína.

Tem sido relatado que tanto ácido hialurônico quanto reína possuem efeitos benéficos em osteoartrite devido à sua capacidade de inibir a atividade de metaloproteinase (MMP) envolvida em catabolismo de cartilagem.

Com o objetivo de estudar o efeito de vários compostos sobre 10 a expressão de MMP em condrócitos de humano realizamos ensaios de PCR em tempo real. RNA total foi extraído dos condrócitos de humano cultivados usando Trizol (Gibco BRL) de acordo com as instruções do fabricante. Fitas de cDNA foram sintetizadas usando um kit de síntese de Primeira-Fita Superscript (Gibco BRL) com 1 pg de RNA total. Os iniciadores foram os seguintes:

MMP-1 (colagenase) Senso: 5'-CTGAAGGTGATGAAGCAGCC-3' Antisenso: 5' -AGTCCAAGAGAATGGCCGAG-3 (tamanho do fragmento 428 pb); MMP-3 (estromelisina) Senso: 5'-CCTCTGATGGCCCAGAATTGA-3', Anti-senso: 5'-GAAATTGGCCACTCCCTGGGT-3' (tamanho do fragmento

440 pb); Gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH),

Senso: 5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3';

Anti-senso: 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCA (tamanho do fragmento 598 pb).

Amplificação foi realizada a 60-64^oC por 45 ciclos em iCycler

Thermal Cycler (Bio-Rad Hercules, CA), e dados foram analisados usando o Programa de Computador iCycler iQ Optical System. A expressão relativa em cada amostra foi calculada por um método matemático baseado em eficiência de PCR em tempo real usando como referências GAPDH-mRNA. Todas as amostras foram analisadas três vezes. Após 45 ciclos de amplificação, valores

Petição 870180044317, de 25/05/2018, pág. 26/34 limite de ciclo foram automaticamente calculados, e fentogramas de cDNA inicial foram calculados de uma curva padrão cobrindo uma faixa de quatro ordens de magnitude. Ambas as curvas padrão de MMPs e de GAPDH variaram de 1 a 10 fentogramas por 25 μL de reação. Razões de quantidade inicial de MMPs para GAPDH foram calculadas. Diferenças estatísticas dos resultados entre várias variáveis experimentais e controles relevantes foram analisadas usando o teste t de Student.

Figuras 4 e 5 relatam os resultados obtidos em experimentos de RT-PCR.

Todas as amostras foram ensaiadas três vezes. Em cada experimento, a mudança de expressão de MMPs mRNA foi expressada como aumento de vezes em comparação com aquele de células não tratadas. Média e desvio padrão de três experimentos são mostrados. Teste t de Student pareado foi usado para determinar a significância dos efeitos de vários tratamentos. Diferenças estatísticas entre grupos de tratamento e de controle também são relatadas:

* = p < 0,01; ** = p < 0,001 (teste t de Student).

Tratamento com IL-1 acarretaram um aumento dramático na expressão de ambas MMP-1 e MMP-3, consistente com dados de literatura.

Nos experimentos relatados na Figura 4 temos comparado o efeito de HA na concentração farmacológica comumente relatada na literatura (1 mg/mL) com o efeito de HA-Re (composto da invenção) nas mesmas concentrações (1 mg/mL). Resultados semelhantes foram obtidos em uma faixa de 0,1-1,5 concentrações de HA. Exposição de condrócitos de humano ao HA em dose farmacológica (1 mg/mL) foi capaz de prevenir significativamente indução de MMP1 e de MMP2 por IL1 (Figuras 4A e 4B). Surpreendentemente, doses semelhantes de composto HA-Re da invenção acarretaram um efeito protetor ainda mais dramático, com expressão de MMP lavada de volta para o nível basal a despeito da exposição à IL1. Figura 5 relata os resultados dos

Petição 870180044317, de 25/05/2018, pág. 27/34 experimentos nos quais o efeito de reína na dose farmacológica (10 μΜ) tem sido comparado com o efeito de uma dose semelhante de HA-Re. Também parece que o composto HA-Re da invenção é mais potente do que Re sozinho na obtenção de uma infra-regulação de expressão de MMP induzida por IL1.

Exemplo 7

Uma síntese adicional de HA-Re de acordo com a presente invenção foi realizada como no Exemplo 2, exceto que 20 mg de ácido hialurônico e 23 mg de cloreto de ácido de reína foram usados, correspondendo às concentrações estequiométricas de reína e de ácido hialurônico baseadas em grupos alcoólicos primários de ácido hialurônico.

Figura 6 mostra o espectro de ¹³C-RMN do composto HA-Re assim obtido de acordo com a presente invenção, no qual é mostrado claramente um pico característico em 175 ppm, específico para funções éster.

Figura 7 mostra o espectro de ¹H-RMN do composto HA-Re assim obtido de acordo com a presente invenção, no qual são mostrados claramente picos característicos entre 7 ppm e 8 ppm, específicos para anéis aromáticos de reína.

Portanto, é mostrado claramente destes dois espectros de RMN que no composto HA-Re de acordo com a presente invenção, reína esterifica grupos álcool de ácido hialurônico.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composto baseado em ácido hialurônico, caracterizado pelo fato de que os grupos álcool de ácido hialurônico são esterificados com reina, como tal, ou como o derivado de reina da Fórmula (I), ou um sal do mesmo (I) em que R é acetila, propionila, butirila ou pivaloíla.
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que reina esterifica pelo menos 5% dos grupos álcool esterificáveis de ácido hialurônico.
3. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que reina esterifica entre 5% e 50% dos grupos álcool esterificáveis de ácido hialurônico.
4. Composto de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que reina esterifica entre 5% e 20% dos grupos álcool esterificáveis de ácido hialurônico.
5. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que reina esterifica 10% dos grupos álcool esterificáveis de ácido hialurônico.
6. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que dito composto é na forma de um sal de sódio.
7. Processo para preparar um composto ou um sal do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de compreender reagir cloreto de ácido de reina, como tal, ou como o derivado de reina da Fórmula (I)

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8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o cloreto de ácido de reina e o ácido hialurônico estão em uma quantidade tal que a razão percentual entre o mmol de cloreto de ácido

10 de reina e o meq. de unidades álcool esterificáveis de ácido hialurônico é pelo menos 5%.
9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a citada razão percentual varia de 5% a 50%.
10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado 15 pelo fato de que a citada razão percentual varia de 5% a 20%.
11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a citada razão percentual é de 10%.
12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas de:

20 a) preparar uma suspensão de ácido hialurônico em um solvente aprótico não-polar,

b) adicionar cloreto de ácido de reina dissolvido em um solvente aprótico não-polar e um aceitador de íon de hidrogênio,

c) deixar a mistura agitar sob refluxo por um tempo que é 25 suficiente para ocorrer a reação de esterificação, e

d) evaporar o solvente.
13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o citado solvente aprótico não-polar da etapa a) é ciclohexano.

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14. Processo de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que na etapa b), o citado aceitador de íon hidrogênio é NEt3.
15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações

5 12 a 14, caracterizado pelo fato de que na etapa c), a reação é deixada sob refluxo por pelo menos 20 horas.
16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 15, caracterizado pelo fato de que o cloreto de ácido de reína é obtido por meio de um processo compreendendo as etapas de:

10 a') preparar uma suspensão de reína em um solvente aprótico não-polar;

b') adicionar uma quantidade de SOCl2 de modo a obter uma razão molar entre SOCl2 e reína maior do que 10;

c') deixar a reação agitar sob refluxo em uma atmosfera inerte 15 por um tempo que é suficiente para formar o cloreto de ácido de reína; e d') remover o solvente e o excesso de SOCl2 não reagido por destilação.
17. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o citado solvente aprótico não-polar da etapa a') é um

20 solvente cloreto.
18. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o citado solvente cloreto é CH2Cl2.
19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que na etapa c'), a reação é deixada sob

25 refluxo por pelo menos 3 horas.
20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 19, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender uma etapa final de purificação.
21. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado

Petição 870180044317, de 25/05/2018, pág. 31/34 pelo fato de que a citada etapa de purificação é realizada usando uma membrana de diálise.
22. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender o composto ou um sal do mesmo como definido em qualquer

5 uma das reivindicações 1 a 6 em combinação com diluentes e/ou excipientes adequados.
23. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação

22, caracterizada pelo fato de que possui uma formulação adequada para administração loco-regional.

10
24. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação

23, caracterizada pelo fato de ser adequada para administração via infiltração intraarticular.
25. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de ser adequada para administração oftálmica.

15
26. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação

23, caracterizada pelo fato de ser adequada para administração tópica.
27. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, caracterizada pelo fato de estar na forma de uma dispersão aquosa.

20
28. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação

27, caracterizada pelo fato de que a citada dispersão é uma solução tampão possuindo um pH de 7,4.
29. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizada pelo fato de que o composto está em uma

25 concentração variando de 0,1% a 2% p/v.
30. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que o composto está em uma concentração de 1% p/v.
31. Produto medicinal para uso humano ou veterinário,

Petição 870180044317, de 25/05/2018, pág. 32/34 caracterizado pelo fato de ser formado por uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 22 a 30.
32. Dispositivo médico para uso humano ou veterinário, caracterizado pelo fato de ser formado por uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 22 a 30.
33. Uso de composto ou de um sal do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento para tratar doenças inflamatórias.
34. Uso de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que as citadas doenças inflamatórias são doenças inflamatórias das articulações.
35. Uso de composto ou de um sal do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento para reparo de tecido, no qual o citado tecido é cartilagem ou pele.
36. Uso de composto ou de um sal do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para preparar biomateriais.

Petição 870180044317, de 25/05/2018, pág. 33/34

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