CN114846147B - 低分子量硫酸软骨素、包含其的组合物、其制备方法以及其用途 - Google Patents

低分子量硫酸软骨素、包含其的组合物、其制备方法以及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低分子量硫酸软骨素及其制备方法，利用大分子硫酸软骨素为原料，经过硫酸软骨素裂解酶的降解、脱蛋白、过滤除菌及干燥等生产工艺，可得到平均分子量小于1000道尔顿的低分子硫酸软骨素，分子量分布范围窄，硫酸软骨素二糖占比为43～60％，硫酸软骨素四糖占比为30～45％，硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖含量之和大于87％，低分子量硫酸软骨素中的寡糖总含量在97％以上，蛋白的含量不超过0.5％；与普通市售的大分子硫酸软骨素相比，该产品在50～100μg/mL浓度内，对1mM双氧水损伤的软骨细胞有更明显的修复作用，修复能力强，修复率在14％～23％之间，可用于治疗关节损伤，是医药产品、保健产品、化妆品、食品等的重要原料。

Description

低分子量硫酸软骨素、包含其的组合物、其制备方法以及其 用途
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种低分子量硫酸软骨素、包含其的组合物、其制备方法以及其用途。
背景技术
硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，CS，即大分子硫酸软骨素或硫酸软骨素多糖)是一类含有聚阴离子的线性多糖，由D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰-D-氨基半乳糖(GalNAc)以β-1,3糖苷键连接形成二糖单位，二糖单位之间以β-1,4糖苷键连接，并在后续的生物合成过程中在不同的位置引入硫酸基，其广泛存在于各种动物的软骨和结缔组织中。
大量研究表明，CS具有降血脂、抗动脉粥样硬化、增强免疫力、抗病毒性肝炎和抗肿瘤等活性，临床中已广泛应用于骨科、眼科、心血管疾病及口腔疾病等医药领域和食品领域。如欧洲风湿病联盟发表的治疗膝骨关节炎的建议中认为CS是一种治疗膝骨关节炎的有效药物；在日本，CS制成口服制剂用于关节止痛，或制成滴眼剂用于泪液补充或角膜保护；美国将CS作为膳食补充剂销售；在澳大利亚，CS大都被制成复合制剂，作为营养保健品销售；2015年版中国药典亦收录了硫酸软骨素钠(CS-Na)、CS-Na片及CS-Na胶囊，类别为降血脂及骨关节疾病治疗药。由此可见，CS是一类生物活性多样、应用广泛的大分子物质，具有很高的开发利用价值。但传统高分子量的CS表观粘度高、结构复杂，不易通过细胞膜，临床应用中主要面临生物利用率低、口服吸收差及疗效不稳定的问题。
天然CS的相对分子质量(Mr)范围一般为50～100kDa，采用不同工艺和不同来源生产得到的CS的Mr范围一般在10～40kDa，低于10kDa时，则称为低分子量硫酸软骨素(Lowmolecular weight chondroitin sulfate，LMWCS)或称为硫酸软骨素寡糖(ChondroitinSulphate Oligosaccharide,CSO)。
LMWCS一般通过CS产品降解来制备，主要有酸水解法、碱水解法和酶解法。酸降解反应产物中杂质较多且不易除去，反应过程中硫酸软骨素上的磺酸基团也会不同程度的脱落，且造成环境污染，相比之下，酶解法反应条件温和，污染小易操控，也不会造成磺酸基团的破坏，有利于工业化生产。
现有技术专利文献CN102676613B公开了使用来自牛睾丸的透明质酸酶特异性不高，效率较低，裂解得到了硫酸软骨素二糖、四糖、六糖混合物并分离制备三个单体，但其分子量分别为521Da、1024Da、1527Da，与我们的低分子量硫酸软骨素构成及分子量均有所区别，如我们工艺中二糖分子量约为379Da、459Da和四糖分子量约为838Da、918Da，并且该文献未开展所得产物的药效学研究。
专利CN108070627A公开了使用硫酸软骨素AC酶，成本较高，得到了特定结构和分子量的硫酸软骨素D四糖，但其分子量为1078Da，与我们的低分子量硫酸软骨素构成及分子量均有所区别，我们工艺中四糖的分子量约为838Da、918Da，并且该文献未开展所得产物的药效学研究。
专利CN103602711B公开了使用来自食砜节杆菌发酵后的酶液，效率较低，1000L发酵液只能催化400kg产品，裂解得到的硫酸软骨素二糖，其分子量450～480Da，二糖含量在97％以上，与我们的低分子量硫酸软骨素构成及分子量均有所区别，如我们工艺中二糖分子量约为379Da、459Da且二糖含量占比为42～58％，并且该文献公开所得产品原料是鸡软骨、猪软骨与牛软骨，而且是特定用于治疗心肌炎。
期刊文献《酶法制备硫酸软骨素寡糖及其抗氧化活性》(食品工业科技，2017,13,48～52.)公开了使用来自产酶菌株Acinetobacter sp.C26发酵后的硫酸软骨素酶(分子量76kDa)，催化效率低，报道的反应浓度仅为2％，寡糖的比例并未进行分析；裂解得到了硫酸软骨素二糖、四糖，m/z为342和458的是二糖，m/z为939的是四糖，与我们的低分子量硫酸软骨素构成及分子量均有所区别，如我们工艺中二糖分子量约为379Da、459Da和四糖分子量约为838Da、918Da，并且该文献所得产品只进行了抗氧化活性实验，未开展其它药效学研究。
因此国内外对低分子量硫酸软骨素药效学方面的研究不太充分，特别是对主成分为硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖，且二糖和四糖含量控制在一定范围内，平均分子量可稳定地控制在低于1000道尔顿且其分子量分布范围窄的，用于治疗关节损伤的低分子量硫酸软骨素有待进一步研究和确认，从而填补国内外该领域的研究空白。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足之处，提供了一种新的低分子量硫酸软骨素、包含其的组合物、及其制备方法以及其用途。
为了实现上述目的，本发明的目的之一是提供了如下的技术方案：一种低分子量硫酸软骨素：所述低分子量硫酸软骨素的平均分子量低于1000道尔顿，其分子量分布范围窄，主要以硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖为主，硫酸软骨素二糖含量占比为43～60％，硫酸软骨素四糖含量占比为30～45％，硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖含量之和大于87％；所述低分子量硫酸软骨素的结构通式如下式I所示：
式I：n＝0～5，且n为整数；R1,R2,R3＝-H或-SO3Na。
进一步地，所述低分子量硫酸软骨素的平均分子量为590～830Da，进一步优选为677～742Da。
进一步地，所述低分子量硫酸软骨素中硫酸软骨素二糖含量占比为48～55％，硫酸软骨素四糖含量占比为35～40％。
本发明的目的之二是提供了如下技术方案：一种低分子量硫酸软骨素的制备方法，包括：将大分子硫酸软骨素原料经过硫酸软骨素裂解酶的酶解得到平均分子量可稳定地控制在低于1000道尔顿的低分子量硫酸软骨素产物，其分子量分布范围窄，产物主要以硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖为主，硫酸软骨素二糖含量占比为43～60％，硫酸软骨素四糖含量占比为30～45％，硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖含量之和大于87％；所述低分子量硫酸软骨素的结构通式如下式I所示：
式I：n＝0～5,且n为整数；R1,R2,R3＝-H或-SO3Na。
进一步地，所述硫酸软骨素裂解酶从海岸边、河边、农贸市场、屠宰厂和食堂处的土样、污水或淤泥中筛选、鉴定，并用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌优化表达得到。
进一步地，所涉及的技术方法是利用市售普通大分子硫酸软骨素为生产原料，来源于陆生和海洋动物的软骨组织，所述原料进一步指鸡软骨，猪软骨，牛软骨或鲨鱼骨中的一种或几种混合，更进一步优选为鲨鱼骨。
进一步地，酶解反应的操作条件为，所述硫酸软骨素裂解酶相对每升发酵液的添加量为100～300U/L，大分子硫酸软骨素原料的浓度为100～700g/L，酶解时间为6～40h，优选6～10h，更优选为6～8h，酶解温度25～35℃，搅拌转速为100～700rpm，酶解pH为6.5～8.5。进一步地，所述酶解反应后的水解液利用混合溶剂脱除蛋白，水解液与混合溶剂的体积比为2～5:1，混合溶剂中二氯甲烷和异丙醇的体积比为3～5:1，100～500rpm搅拌10～40min，3000～5000rpm离心10～30min，取上层反应液。
进一步地，所述酶解反应后的水解液还可以通过超滤的方式脱除蛋白得到反应液。
进一步地，所述脱除蛋白后的上层反应液，经过0.22μm囊式滤芯过滤除菌，将反应液加入到8～12倍体积量的无水乙醇中，醇沉，真空干燥。
进一步地，所述通过超滤的方式脱除蛋白后的反应液，经过0.22μm囊式滤芯过滤除菌后进行喷雾干燥。
进一步地，由鲨鱼骨和鸡软骨中的一种或其混合骨酶解得到的低分子量硫酸软骨素相对鲨鱼骨的大分子硫酸软骨素，在50～100μg/mL浓度内对1mM双氧水损伤的软骨细胞有更明显的修复作用，修复率在14％～23％之间。
进一步地，本发明所述的特定二糖和四糖含量范围的低分子量硫酸软骨素在50～1600μg/mL浓度范围内对1mM双氧水损伤的软骨细胞有修复作用，修复率在20％-62.4％之间。
进一步地，本发明所述的特定二糖和四糖含量范围的低分子量硫酸软骨素，例如在50～1600μg/mL浓度范围内，对1mM双氧水损伤的软骨细胞的修复率在20％以上，优选在40％以上，更优选在50％以上，最优选在60％以上。
进一步地，所述低分子量硫酸软骨素具有在制备医药品和化妆品等领域方面的应用。
根据本发明的另一方面，提供一种用于增加骨密度、缓解关节炎的水解硫酸软骨素组合物，水解硫酸软骨素和氨基葡萄糖组合物的人体日服用剂量低于目前已知的市售硫酸软骨素和氨基葡萄糖组合物的人体日服用剂量，如Movefree中硫酸软骨素和氨基葡萄糖的人体日服用剂量为1700mg/天；汤臣倍健中硫酸软骨素和氨基葡萄糖的人体日服用剂量为1160mg/天。通过降低服用剂量以提高服用的顺应性，但又不降低增加骨密度、缓解关节炎的疗效。
在下文中，氨基葡萄糖有时简称为“氨糖”。
在本文中，术语“水解硫酸软骨素”与术语“硫酸软骨素寡糖(CSO)”和术语“低分子量硫酸软骨素”含义相同。
本文中所用的术语“水解硫酸软骨素”是指不同分子量的水解硫酸软骨素的混合物。分子量例如可以是分子量在约300Da以上且约10000Da以下，例如379～10000Da，例如约350Da以上、约400Da以上、约500Da以上、约600Da以上，约700Da以上、约800Da以上、约900Da以上、低于约9000Da、低于约8000Da、低于约7000Da、低于约6000Da、低于约5000Da、低于约4000Da、低于约3000Da、低于约2000Da、或低于约1000Da、优选低于约1000Da的低分子量硫酸软骨素产物，进一步优选约590Da-约830Da，例如约600Da-约750Da，更进一步优选为677～742Da。
在一个实施方式中，本发明提供一种水解硫酸软骨素组合物，采用如下技术方案：
本发明所述一种含水解硫酸软骨素组合物，其特征在于，含有50mg～800mg水解硫酸软骨素的人体日服用量。在一些实施方式中，含水解硫酸软骨素组合物包含约50mg～约800mg水解硫酸软骨素。在另一实施方式中，含水解硫酸软骨素组合物包含约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg、约200mg、约210mg、约220mg、约230mg、约240mg、约250mg、约260mg、约270mg、约280mg、约290mg、约300mg、约310mg、约320mg、约330mg、约340mg、约350mg、约360mg、约370mg、约380mg、约390mg、约400mg、约410mg、约420mg、约430mg、约440mg、约450mg、约460mg、约470mg、约480mg、约490mg、约500mg、约510mg、约520mg、约530mg、约540mg、约550mg、约560mg、约570mg、约580mg、约590mg、约600mg、约610mg、约620mg、约630mg、约640mg、约650mg、约660mg、约670mg、约680mg、约690mg、约700mg、约710mg、约720mg、约730mg、约740mg、约750mg、约760mg、约770mg、约780mg、约790mg、约800mg水解硫酸软骨素。
本发明所述的含水解硫酸软骨素组合物，其特征在于，所述组合物中可以包含氨基葡萄糖。
本发明所述一种含水解硫酸软骨素组合物，其特征在于，所述氨基葡萄糖可以是氨基葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖硫酸盐中的一种或两种的混合物。
本发明所述的含水解硫酸软骨素组合物，其特征在于，所述水解硫酸软骨素是不同分子量的水解硫酸软骨素的混合物。
本发明所述的含水解硫酸软骨素组合物，其特征在于，所述水解硫酸软骨素与氨基葡萄糖的比例为约1:3～约1:10，例如约1:9，约1:8，约1:7，约1:6，约1:5，约1:4，约1:3，优选地为约1:6-约1:4，最优选约1:5。所述组合物可含有约150mg～8000mg氨基葡萄糖的人体日服用剂量。在一些实施方式中，所述组合物可含有约7200mg、约6400mg、约5600mg、约4800mg、约4000mg、约3200mg、约2400mg、约1600mg、约1200mg、约800mg、约600mg、约450mg、约400mg、约350mg、约300mg、约250mg、约200mg、约150mg氨基葡萄糖。所述组合物进一步优选含有约100mg水解硫酸软骨素与约500mg氨基葡萄糖。所述组合物还可含有约200mg水解硫酸软骨素与约1000mg氨基葡萄糖。
本发明所述一种含水解硫酸软骨素的组合物，水解硫酸软骨素是将硫酸软骨素通过酶解、纯化、浓缩、喷雾干燥得到的混合物，其分子量在379～10000Da。
本发明所述的含水解硫酸软骨素组合物，所述组合物还包括药剂学上可以接受的辅料，其中所述辅料选自填充剂、崩解剂、粘合剂、矫味剂、润滑剂及薄膜包衣剂。
本发明所述一种水解硫酸软骨素组合物及其制备方法，其特征在于，所述制剂中的填充剂包括但不限于微晶纤维素、淀粉、糊精、甘露醇、乳糖等；崩解剂包括但不限于交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、羟丙基淀粉、预交化淀粉、低取代羟丙基纤维素、碳酸氢钠、枸橼酸、酒石酸等；粘合剂包括但不限于羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等；润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇、硬脂酸等；薄膜包衣剂的组成包括但不限于羟丙甲基纤维素、聚乙二醇、色淀等。
本发明所述一种水解硫酸软骨素组合物及其制备方法，其特征在于，所述的制剂包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂。
本发明所述的组合物，该组合物可用于制备减少关节炎、缓减疼痛方面用途的保健品或药物。特别地、该组合物可用于制备减少骨关节炎、增加骨密度、改善骨质疏松、或增缓减疼痛方面用途的保健品或药品。
本发明的低分子量硫酸软骨素组合物或水解硫酸软骨素组合物可以降低血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量和/或血清中补体C5b-9含量。
本发明的低分子量硫酸软骨素组合物或水解硫酸软骨素组合物可以升高股骨羟脯氨酸的含量。
与现有技术相比，本发明酶解硫酸软骨素制备的水解硫酸软骨素，可用于制备增加骨密度、改善骨质疏松，缓解关节炎作用的保健品，且服用量低，对胃肠道刺激性更小。本发明的组合物含有的水解硫酸软骨素和氨基葡萄糖的组分的人体日服用剂低于目前已知的市售硫酸软骨素和氨基葡萄糖的人体日服用剂量。通过降低服用剂量以提高服用的顺应性，但又不降低增加骨密度、缓解关节炎的疗效。小鼠支撑力差值的检测来评价小鼠关节炎的疼痛程度推及人体日用服量，表明水解硫酸软骨素日服用剂量在50～800mg之间具有比较明显的缓解、治疗骨关节炎疼痛的作用，组合物内添加氨基葡萄糖，可增加缓解、治疗骨关节炎疼痛和骨质疏松的作用。
本发明相对现有技术，还具有以下优势：
1、利用从海岸边、河边、农贸市场、屠宰厂和食堂处的土样、污水或淤泥中筛选、鉴定，并用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌优化表达得到的硫酸软骨素裂解酶催化法酶解，特异性好，酶活更高；可稳定地得到平均分子量小于1000道尔顿的低分子量硫酸软骨素，尤其是平均分子量为590～830Da的低分子量硫酸软骨素，分子量分布范围窄。
2、利用溶剂法或超滤方法脱除蛋白，蛋白的含量不超过0.5％。
3、100L发酵液催化超过400kg大分子硫酸软骨素，生产周期短，效率高，适于工业化放大使用。
4、通过LC-MS分析明确了不同组分寡糖的比例：产品质量稳定，包括硫酸软骨素二糖、四糖、六糖和八糖的低分子量硫酸软骨素的寡糖总含量在97％以上，其中产物主要以硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖为主，硫酸软骨素二糖含量占比为43～60％，硫酸软骨素四糖含量占比为30～45％，硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖含量之和在87％以上。
5、由鲨鱼骨和鸡软骨中的一种或其混合骨酶解得到的低分子量硫酸软骨素相对鲨鱼骨的大分子硫酸软骨素，在50～100μg/mL浓度内，对1mM双氧水损伤的软骨细胞均有更明显的修复作用，修复能力强，修复率在14％～23％之间，可用于治疗关节损伤。其中鲨鱼源的低分子量硫酸软骨素修复效果优于鸡软骨、猪软骨、牛软骨和混骨来源的低分子量硫酸软骨素。在50μg/mL浓度时，由鲨鱼骨、鸡软骨、猪软骨、牛软骨和混骨来源酶解得到的低分子量硫酸软骨素均比鲨鱼骨来源的大分子硫酸软骨素，对1mM双氧水损伤的软骨细胞有更明显的修复作用。
附图说明
图1是实施例9中鲨鱼骨来源的低分子量硫酸软骨素的寡糖分布谱图。
图2是实施例10中鲨鱼骨来源的低分子量硫酸软骨素的寡糖分布谱图。
图3是实施例11中鲨鱼骨来源的低分子量硫酸软骨素的寡糖分布谱图。
图4是实施例12中鲨鱼骨来源的低分子量硫酸软骨素的寡糖分布谱图。
图5是实施例14中不同来源的低分子量硫酸软骨素的功效活性检测结果图。
图6表示本发明的组合物对小鼠体重的影响图。
图7表示本发明的组合物对小鼠支撑力的影响图。图8表示对照组1样品的纯度为97.72％的低分子量硫酸软骨素的寡糖分布谱图。
图9表示实施例9样品以及对照组1～2在不同浓度水平对1mM双氧水损伤的软骨细胞的修复作用的图。
图10A为不同剂量组对小鼠血清IL-6(A)、IL-1β(B)、TNF-α(C)和C5b-9(D)含量影响的图。
图10B表示小鼠股骨羟脯氨酸(HYP)含量测定的图。
图10C表示小鼠膝关节番红固绿染色(×100)的图。
图10D表示小鼠膝关节番红固绿染色病理评分的图。
图10E表示小鼠膝关节C5b-9免疫组织化学染色(×100)的图。
图10F表示小鼠膝关节C5b-9阳性细胞数目的图。
图11A表示在CSO对膝关节注射木瓜蛋白酶致大鼠骨关节炎模型给药剂量的研究中大鼠体重变化的图。
图11B表示在CSO对膝关节注射木瓜蛋白酶致大鼠骨关节炎模型给药剂量的研究中大鼠血清IL-6含量的图。
图11C表示在CSO对膝关节注射木瓜蛋白酶致大鼠骨关节炎模型给药剂量的研究中大鼠血清IL-1β含量的图。
图11D表示在CSO对膝关节注射木瓜蛋白酶致大鼠骨关节炎模型给药剂量的研究中大鼠血清TNF-α含量的图。
图11E表示在CSO对膝关节注射木瓜蛋白酶致大鼠骨关节炎模型给药剂量的研究中大鼠膝关节病理染色(×100)的图。
图11F表示在CSO对膝关节注射木瓜蛋白酶致大鼠骨关节炎模型给药剂量的研究中大鼠膝关节病理学评分的图。
图12A表示在CSO对去卵巢致雌性大鼠及去睾丸致雄性大鼠骨质疏松的治疗作用的研究中雌性大鼠体重变化的图。
图12B表示在CSO对去卵巢致雌性大鼠及去睾丸致雄性大鼠骨质疏松的治疗作用的研究中雄性大鼠体重变化的图。
图12C表示在CSO对去卵巢致雌性大鼠及去睾丸致雄性大鼠骨质疏松的治疗作用的研究中雄性大鼠股骨重系数的图。
图12D表示在CSO对去卵巢致雌性大鼠及去睾丸致雄性大鼠骨质疏松的治疗作用的研究中雌性大鼠股骨重系数的图。
图12E表示在CSO对去卵巢致雌性大鼠及去睾丸致雄性大鼠骨质疏松的治疗作用的研究中雌性大鼠骨密度的图。
图12F表示在CSO对去卵巢致雌性大鼠及去睾丸致雄性大鼠骨质疏松的治疗作用的研究中雄性大鼠骨密度的图。
图12G表示在CSO对去卵巢致雌性大鼠及去睾丸致雄性大鼠骨质疏松的治疗作用的研究中大鼠股骨骨灰含量的图。
图12H表示在CSO对去卵巢致雌性大鼠及去睾丸致雄性大鼠骨质疏松的治疗作用的研究中大鼠骨磷含量的图。
图12I表示在CSO对去卵巢致雌性大鼠及去睾丸致雄性大鼠骨质疏松的治疗作用的研究中大鼠血清碱性磷酸酶(ALP)含量的图。
图12J表示在CSO对去卵巢致雌性大鼠及去睾丸致雄性大鼠骨质疏松的治疗作用的研究中大鼠血清骨形成蛋白-4(BMP-4)含量的图。
图12K表示在CSO对去卵巢致雌性大鼠及去睾丸致雄性大鼠骨质疏松的治疗作用的研究中大鼠血清降钙素(CT)含量的图。
图12L表示在CSO对去卵巢致雌性大鼠及去睾丸致雄性大鼠骨质疏松的治疗作用的研究中大鼠血清甲状旁腺素(PTH)含量的图。
图12M表示在CSO对去卵巢致雌性大鼠及去睾丸致雄性大鼠骨质疏松的治疗作用的研究中大鼠股骨骨小梁面积的图。
图12N表示在CSO对去卵巢致雌性大鼠及去睾丸致雄性大鼠骨质疏松的治疗作用的研究中大鼠股骨骨小梁面积百分率的图。
图12O表示在CSO对去卵巢致雌性大鼠及去睾丸致雄性大鼠骨质疏松的治疗作用的研究中大鼠股骨骨小梁数量的图。
具体实施方式
为便于本领域技术人员理解本发明内容，下面将结合具体实施例进一步描述本发明的技术方案，但以下内容不应以任何方式限制本发明权利要求书请求保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中硫酸软骨素裂解酶来源于本实验室保存的从海岸边、河边、农贸市场、屠宰厂和食堂处的土样、污水或淤泥中筛选、鉴定，并用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌优化表达得到的，其最高酶活可达11976.5U/L，含有998个氨基酸，分子量113KDa，该硫酸软骨素裂解酶的氨基酸序列公开于本公司申请的另外一件发明专利中，其申请日：2019年4月3日，申请号：201910264385.5，公布日：2019年6月21日，公布号：CN109913437A，该专利申请的所有相关内容引入到本专利申请中。
低分子量硫酸软骨素平均分子量的计算公式如下所示：
其中，rt＝rU1+rU2+rU3+rU4+rU5。
其中：ru1：样品溶液中组分一(六糖和八糖)的峰响应值；MW1是样品溶液中组分一的分子量；
ru2：样品溶液中组分二(四糖)的峰响应值；MW2是样品溶液中组分二的分子量；
ru3：样品溶液中组分三(四糖)的峰响应值；MW3是样品溶液中组分三的分子量；
ru4：样品溶液中组分四(二糖)的峰响应值；MW4是样品溶液中组分四的分子量；
ru5：样品溶液中组分五(二糖)的峰响应值；MW5是样品溶液中组分五的分子量；
rt：样品溶液中组分一、组分二、组分三、组分四、组分五的峰响应值之和。
由鲨鱼骨来源的大分子硫酸软骨素酶解得到的低分子量硫酸软骨素中二糖(n＝0)、四糖(n＝1)、六糖(n＝2)、八糖(n＝3)的分子量有差异，其中n＝4的十糖和n＝5的十二糖含量非常少，因此在计算寡糖组合物的平均分子量时忽略不计，采用实施例9得到的样品使用液质联用仪器检测的二糖、四糖、六糖和八糖的分子量，具体如下表1所示：
表1鲨鱼骨来源的低分子量硫酸软骨素的分子量分布
# 二糖(Da) 四糖(Da) 六糖(Da) 八糖(Da)
1 379.1和459.1 838.2和918.2 1155.3 1534.5
实施例1酶解反应
于5L玻璃烧杯中，加入纯化水2L，控制搅拌转速为400rpm，加入800g鲨鱼骨硫酸软骨素，待全部溶解后使用氢氧化钠溶液调pH至7.0，加入200U/L的硫酸软骨素裂解酶，保持体系30℃搅拌反应，反应6h检测平均分子量是否低于1000Da，若未反应完全，延长4h反应时间后继续中控。继续反应直至平均分子量低于1000Da判断为合格。
实施例2酶解反应
于5L玻璃烧杯中，加入纯化水2L，控制搅拌转速为700rpm，加入400g鲨鱼骨硫酸软骨素，待全部溶解后使用氢氧化钠溶液调pH至6.5，加入300U/L的硫酸软骨素裂解酶，保持体系35℃搅拌反应，反应6h检测平均分子量是否低于1000Da，若未反应完全，延长4h反应时间后继续中控。继续反应直至水解液平均分子量低于1000Da判断为合格。
实施例3酶解反应
于5L玻璃烧杯中，加入纯化水2L，控制搅拌转速为100rpm，加入200g鲨鱼骨硫酸软骨素，待全部溶解后使用氢氧化钠溶液调pH至8.0，加入100U/L的硫酸软骨素裂解酶，保持体系25℃搅拌反应，反应6h检测平均分子量是否低于1000Da，若未反应完全，延长4h反应时间后继续中控。继续反应直至水解液平均分子量低于1000Da判断为合格。
实施例4酶解反应
于5L玻璃烧杯中，加入纯化水2L，控制搅拌转速为500rpm，加入1400g鲨鱼骨硫酸软骨素，待全部溶解后使用氢氧化钠溶液调pH至8.5，加入280U/L的硫酸软骨素裂解酶，保持体系28℃搅拌反应，反应6h检测平均分子量是否低于1000Da，若未反应完全，延长4h反应时间后继续中控。继续反应直至水解液平均分子量低于1000Da判断为合格。
实施例5蛋白脱除
取2L实施例1中反应结束后的水解液，转移到离心机中，在4200rpm离心15min除去菌体，取上清，加入有机溶剂0.4L(二氯甲烷和异丙醇的体积比＝5:1)，脱除蛋白，在100rpm搅拌40min，在4200rpm继续离心15min，取出后倒出上层反应液。
实施例6蛋白脱除
取2.1L实施例2中反应结束后的水解液，转移到离心机中，在4200rpm离心15min除去菌体，取上清，加入有机溶剂0.7L(二氯甲烷和异丙醇的体积比＝4:1)，脱除蛋白，在500rpm搅拌10min，在3000rpm继续离心30min，取出后倒出上层反应液。
实施例7蛋白脱除
取2L实施例3中反应结束后的水解液，转移到离心机中，在4200rpm离心15min除去菌体，取上清，加入有机溶剂1L(二氯甲烷和异丙醇的体积比＝3:1)，脱除蛋白，在300rpm搅拌30min，在5000rpm继续离心10min，取出后倒出上层反应液。
实施例8蛋白脱除
取2.3L实施例4中反应结束后的水解液，通过超滤系统，在低温条件下，采用截留分子量5-8万的膜包进行超滤，使蛋白去除得到超滤后反应液。
实施例9醇沉干燥
将2L实施例5得到的上层反应液经0.22μm囊式滤芯过滤除菌至洁净区中，然后滴加到20L无水乙醇中，搅拌0.5h，静置2h，固体完全沉淀，抽去上清，离心过滤收集固体，固体于真空干燥箱中45℃真空干燥24h，至干燥失重不超过10％，得到650g低分子量硫酸软骨素产品，收率为81.3％(即650g低分子量硫酸软骨素与800g鲨鱼骨硫酸软骨素原料的比值)，用考马斯亮蓝法检测蛋白含量为0.3％，用液质联用仪测定其分子量分布如图1所示，出峰时间为5.879min的组分一主要为六糖和八糖的组合物，含量为9.51％；出峰时间为8.632min组分二为四糖，含量为33.83％；出峰时间为8.966min的组分三也为四糖，含量为5.07％；出峰时间为9.846min的组分四为二糖，含量为47.08％；出峰时间为10.786min的组分五也为二糖，含量为2.03％；出峰时间为12.506min的组分六为盐峰；因此包括二糖、四糖、六糖和八糖的低分子量硫酸软骨素总含量为97.52％，主要以二糖和四糖为主，其中二糖和四糖含量之和为88.01％；由鲨鱼骨酶解得到的低分子量硫酸软骨素的平均分子量为704.3～741.2Da，具体计算过程如下：
假定组分一中全部为六糖，则
假定组分一中全部为八糖，则
用液质联用(LC-MS)技术分析其分子量，具体分析条件如下：
色谱条件：
色谱柱1：TSK Guard Column SWXL 7μm，6mm×4cm
色谱柱2：TSK G3000 SWXL 5μm，7.8mm×30cm
流速：1mL/min
进样量：10μL
柱温：30℃
检测波长：195nm
采集时间：25min
缓冲液：取甲酸铵0.38g用水稀释至2000mL，混匀，过滤，即得。
流动相：取缓冲液和甲醇体积比9:1。
质谱条件：
离子模式：负离子模式[M-H]-
碎裂电压：70V
质荷比范围：300-1000m/z
干燥气体流量：12L/min
雾化器压力：35psig
帽电压：3000V。
分子量检测的结果为：二糖对应的分子量为378.1和458.1，与四糖对应的分子量为837.2和917.1。
实施例10醇沉干燥
将2L实施例6得到的上层反应液经0.22μm囊式滤芯过滤除菌至洁净区中，然后滴加到16L无水乙醇中，搅拌0.5h，静置2h，固体完全沉淀，抽去上清，离心过滤收集固体，固体于真空干燥箱中50℃真空干燥24h，至干燥失重不超过10％，得到320g低分子量硫酸软骨素产品，收率为80.0％(即320g低分子量硫酸软骨素与400g鲨鱼骨硫酸软骨素原料的比值)，用考马斯亮蓝法检测蛋白含量为0.4％，用液质联用仪测定其分子量分布如图2所示，出峰时间为5.878min的组分一为六糖和八糖，含量为9.50％；出峰时间为8.625min的组分二为四糖，含量为33.90％；出峰时间为8.958min的组分三也为四糖，含量为5.08％；出峰时间为9.838min的组分四为二糖，含量为46.86％；出峰时间为10.785min的组分五也为二糖，含量为2.13％；出峰时间为12.505min的组分六为盐峰；因此包括二糖、四糖、六糖和八糖的低分子量硫酸软骨素总含量为97.47％，主要以二糖和四糖为主，其中二糖和四糖含量之和为87.97％；由鲨鱼骨酶解得到的低分子量硫酸软骨素的平均分子量为704.7～741.6Da，具体计算过程如下：
假定组分一中全部为六糖，则
假定组分一中全部为八糖，则
实施例11醇沉干燥
将2L实施例7得到的上层反应液经0.22μm囊式滤芯过滤除菌至洁净区中，然后滴加到24L无水乙醇中，搅拌0.5h，静置2h，固体完全沉淀，抽去上清，离心过滤收集固体，固体于真空干燥箱中40℃真空干燥24h，至干燥失重不超过10％，得到150g低分子量硫酸软骨素产品，收率为75.0％(即150g低分子量硫酸软骨素与200g鲨鱼骨硫酸软骨素原料的比值)，用考马斯亮蓝法检测蛋白含量为0.4％，用液质联用仪测定其分子量分布如图3所示，出峰时间为5.879min的组分一为六糖和八糖，含量为8.62％；出峰时间为8.632min的组分二为四糖，含量为30.79％；出峰时间为8.966min的组分三也为四糖，含量为4.41％；出峰时间为9.872min的组分四为二糖，含量为52.49％；出峰时间为10.786min的组分五也为二糖，含量为2.02％；出峰时间为12.512min的组分六为盐峰；因此包括二糖、四糖、六糖和八糖的低分子量硫酸软骨素总含量为98.32％，主要以二糖和四糖为主，其中二糖和四糖含量之和为89.70％；由鲨鱼骨酶解得到的低分子量硫酸软骨素的平均分子量为679.2～712.5Da，具体计算过程如下：
假定组分一中全部为六糖，则
假定组分一中全部为八糖，则
实施例12喷雾干燥
将2L实施例8得到的反应液经0.22μm囊式滤芯过滤除菌后进行喷雾干燥，喷雾干燥参数为：进风温度为120℃，出风温度为60℃，流速为100rpm。得到1200g低分子量硫酸软骨素产品，收率为85.7％(即1200g低分子量硫酸软骨素与1400g鲨鱼骨硫酸软骨素原料的比值)，用考马斯亮蓝法检测蛋白含量为0.5％，用液质联用仪测定其分子量分布如图4所示，出峰时间为5.876min的组分一为六糖和八糖，含量为8.50％；出峰时间为8.636min的组分二为四糖，含量为30.59％；出峰时间为8.963min的组分三也为四糖，含量为4.43％；出峰时间为9.870min的组分四为二糖，含量为52.69％；出峰时间为10.783min的组分五也为二糖，含量为2.14％；出峰时间为12.510min的组分六为盐峰；因此包括二糖、四糖、六糖和八糖的低分子量硫酸软骨素总含量为98.35％，主要以二糖和四糖为主，其中二糖和四糖含量之和为89.85％；由鲨鱼骨酶解得到的低分子量硫酸软骨素的平均分子量为677.4～710.2Da，具体计算过程如下：
假定组分一中全部为六糖，则
假定组分一中全部为八糖，则
实施例13
分别使用山东葆力嘉含量是90％的牛软骨、猪软骨、鸡软骨以及鸡软骨和鲨鱼骨的混骨硫酸软骨素按照实施例1的酶解反应、实施例5的蛋白脱除工艺以及实施例9的醇沉干燥工艺，得到另外四种不同来源的低分子量硫酸软骨素。
实施例14功效活性检测
(1)样品准备：
(1.1)实施例9中的样品,采用的是实施例1的酶解反应工艺。
(1.2)对照组1样品：为纯度为97.72％的二糖0.63g加上0.41g的深海鱼低聚肽(宁夏香草生物科技公司，规格为98％)混合，计算得到含量为61.56％和含量为40.18％的深海鱼低聚肽。
97.72％的二糖样品的制备过程如下：
流动相配制：
A:20mM Tris，HCl调节pH至7.5；
B:20mM Tris，1M NaCl，HCl调节pH至7.5。
样品处理：
实施例9中的样品用A流动相进行溶解，称取20g粉末溶于1L A流动相中。
步骤：纯化前用B流动相清洗Q-Sepharose-FF填料，再用A流动相平衡，将样品上样至Q-Sepharose-FF填料，收集穿透峰，用B流动相洗出挂在柱子上的四塘，收集的穿透峰再循环进行层析纯化，以此循环至检测出单一二糖峰为止。
脱盐:将检测出的单一二糖峰合并收集，用葡萄糖凝胶柱进行脱盐，上样前用纯化水洗至电导为0.1ms/cm以下，上样量为柱体积的20％-30％，再继续用纯化水洗，收集电导为1ms/cm以下的峰。
冻干：脱盐后的收集峰在-20℃预冻后放入冻干机进行冻干，冻干至粉末后收集纯度为97.72％的二糖。该二糖的纯度测定如下：用高效液相测定其分子量分布如图8所示，出峰时间为9.265min的组分一为四糖，含量为2.28％；出峰时间为10.070min的组分二为二糖，含量为65.79％；出峰时间为10.937min的组分三为二糖，含量为31.93％；图8中盐峰没有积分。
(1.3)对照组2样品：采用的是山东葆力嘉含量90％的鲨鱼骨大分子硫酸软骨素，平均分子量约70000Da，其中几乎不含有二糖和四糖。
(2)培养基、溶液及细胞准备：
(2.1)、基础培养基：DMEM/F-12培养基。
(2.2)、生长培养基：180mL的基础培养基中加入20mL的胎牛血清(FBS)，保存在2℃-8℃。
(2.3)、完全培养基：DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium)+胎牛血清细胞P5(第五代)。
(2.4)、1mM H2O2刺激溶液：
取30％(9790mM)过氧化氢用0.2μm无菌滤膜过滤，再用基础培养基稀释成1mM备用。
(2.5)、样品贮备溶液1和2：
各称取一定重量的样品[CSO寡糖-牛骨(来源于实施例13)、CSO寡糖-猪骨(来源于实施例13)、CSO寡糖-鲨鱼骨(来源于实施例9)、CSO寡糖-鸡骨(来源于实施例13)、CSO寡糖-鸡骨和鲨鱼混骨(来源于实施例13)、CSO多糖-鲨鱼骨(山东葆力嘉)]，用DPBS作为稀释液，制备10mg/mL的样品贮备溶液1，再用0.2μm无菌滤膜过滤以备用。
各称取一定重量的样品(实施例9中的样品、对照组1～2中样品)，用DPBS作为稀释液，制备10mg/mL的样品贮备溶液2，再用0.2μm无菌滤膜过滤以备用。
(2.6)、样品检测梯度溶液1和2：
取上述配制完成的样品贮备溶液1用基础培养基进一步稀释，制备2个浓度的稀释系列，范围分别为50和100μg/mL。
取上述配制完成的样品贮备溶液2用基础培养基进一步稀释，制备7个浓度的稀释系列，范围从50至3200μg/mL，分别是：50、100、200、400、800、1600和3200μg/mL。
(2.7)、细胞培养准备
用生长培养基复苏ATDC5细胞，于37±2℃，二氧化碳浓度为5±1％，有湿度的培养箱中培养。当用合适放大倍数(例如：10–40×)的显微镜观察到培养物约在70％-90％汇合度时用生长培养基进行传代。
细胞传代时，移去细胞培养基。用DPBS漂洗细胞一次。用大约0.5mL含0.25％胰蛋白酶溶液浸润细胞约1分钟，细胞开始变成圆形并从表面脱落。在显微镜下，细胞的形态变圆，部分细胞脱离瓶壁，立即加入完全培养基终止消化。用移液管吸取培养基，将细胞吹离瓶壁，使细胞均匀分散于培养基中，转移细胞悬液至15mL离心管中，以1000r/m，持续离心5分钟。弃去离心上清液，用2mL完全培养基重悬细胞后，分别将细胞转移至2个新的T25方瓶中，每个方瓶中再分别加入5mL完全培养基，轻轻震荡混匀，置于二氧化碳培养箱中(37℃，5％CO2)培养。
使用传代数在4-20之间，70％-90％的汇合度，传代2-5天内的细胞。按照细胞培养准备的程序，在生长培养基中制备含2×106/mL活细胞的适量体积细胞溶液。取一块96孔透明细胞培养板，每孔加入100μL细胞溶液，使每个孔中约含6000个细胞。在加入细胞溶液时为了防止细胞沉降确保每孔的均匀性，频繁混匀细胞溶液。将板置于二氧化碳培养箱中(37℃，5％ CO2)过夜(24h)培养。
培养后，次日(24h)，弃去板中原有培养液，每孔内加入50μL 1mM H2O2(配制方法见步骤4.2 1mM H2O2刺激溶液配制)，再在每孔中加入不同来源、不同浓度的硫酸软骨素检测梯度溶液(配制方法见步骤4.3样品检测梯度溶液配制)，后置于二氧化碳培养箱中(37℃，5％CO2)继续培养12小时。
培养后，次日(12h)，每孔加入10μL CCK-8溶液继续培养2h。反应结束后，立即放入多功能酶标仪，检测450nm处的吸光值。每个样品检测会设置2个平行实验，最后取吸光值的平均值。
(3)不同动物来源的低分子量硫酸软骨素与大分子硫酸软骨素的细胞活性对比：
采用细胞活性测定CCK法，考察不同来源的低分子量硫酸软骨素和大分子硫酸软骨素，对损伤的软骨细胞的修复作用，其功效活性检测结果如图5所示，结果表明由鲨鱼骨或鸡骨中的一种或其混合骨酶解得到的低分子量硫酸软骨素相对鲨鱼骨来源的大分子硫酸软骨素(硫酸软骨素多糖)，在50～100μg/mL浓度内对1mM双氧水损伤的软骨细胞均有更明显的修复作用，修复能力在14％～23％之间，可用于治疗关节损伤。其中鲨鱼源的低分子量硫酸软骨素修复效果优于鸡软骨、猪软骨、牛软骨和混骨来源的低分子量硫酸软骨素。在50μg/mL浓度时，由鲨鱼骨、鸡软骨、猪软骨、牛软骨和混骨来源酶解得到的低分子量硫酸软骨素均比鲨鱼骨来源的大分子硫酸软骨素，对1mM双氧水损伤的软骨细胞有更明显的修复作用。
(4)含有不同成分的鲨鱼骨低分子量硫酸软骨素与鲨鱼骨大分子硫酸软骨素的细胞活性对比：
对照组1样品为纯度为97.72％的二糖0.63g加上0.41g的鱼胶原低聚肽混合，计算得到含量为61.56％的二糖和含量为40.18％的深海鱼低聚肽(宁夏香草生物科技公司，规格为98％)。
结果如下表A和图9所示，本发明产品在50～3200μg/mL浓度范围内对1mM双氧水损伤的软骨细胞的修复作用均比对照组1～2效果更明显；其中本发明产品在50～1600μg/mL浓度范围内，对软骨细胞的修复率随着浓度升高而升高，当浓度达到3200μg/mL时，浓度过高反而出现了抑制现象，修复率在20％-62.4％，有明显下降的趋势。
表A
实施例15：水解硫酸软骨素胶囊
处方：
制备方法：
(1)将来自实施例9的水解硫酸软骨素、微晶纤维素分别过80目筛备用；
(2)将水解硫酸软骨素和微晶纤维素混合均匀后，依次加入处方量的交联聚维酮、微粉硅胶和硬脂酸镁，混合15min；
(3)将混合物通过胶囊填充机灌入胶囊壳中，即得。
实施例16：水解硫酸软骨素片
处方：
制备方法：
(1)将来自实施例9的水解硫酸软骨素、微晶纤维素分别过80目筛备用；
(2)将水解硫酸软骨素和微晶纤维素混合均匀后，依次加入处方量的交联羧甲基纤维素钠、微粉硅胶和硬脂酸镁，混合15min；
(3)将混合物通过旋转压片机进行压片，控制片剂硬度为6～10kg；
(4)使用纯化水配制固含量为10％的包衣液；
(5)通过高效包衣机对片剂进行包衣，设置进风温度为55℃，雾化压力为0.2MPa，控制片床温度为40～45℃，包衣完成后即得。
实施例17：水解硫酸软骨素片
处方：
制备方法：
(1)将来自实施例9的水解硫酸软骨素、乳糖分别过80目筛备用；
(2)将水解硫酸软骨素和乳糖混合均匀后，依次加入处方量的羟丙基纤维素、低取代羟丙基纤维素、微粉硅胶和硬脂酸镁，混合15min；
(3)将混合物通过旋转压片机进行压片，控制片剂硬度为6～10kg；
(4)使用纯化水配制固含量为10％的包衣液；
(5)通过高效包衣机对片剂进行包衣，设置进风温度为55℃，雾化压力为0.2MPa，控制片床温度为40～45℃，包衣完成后即得。
实施例18：水解硫酸软骨素片
组分：
制备方法：
(1)将来自实施例9的水解硫酸软骨素、淀粉、糊精分别过80目筛备用；
(2)将水解硫酸软骨素、淀粉和糊精混合均匀后，依次加入处方量的羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、微粉硅胶和硬脂酸镁，混合15min；
(3)将混合物通过旋转压片机进行压片，控制片剂硬度为6～10kg；
(4)使用纯化水配制固含量为10％的包衣液；
(5)通过高效包衣机对片剂进行包衣，设置进风温度为55℃，雾化压力为0.2MPa，控制片床温度为40～45℃，包衣完成后即得。
实施例19：水解硫酸软骨素胶囊
实施例20：水解硫酸软骨素和氨基葡萄糖硫酸盐片
处方
制备方法：
(1)将来自实施例9的水解硫酸软骨素、氨基葡萄糖硫酸盐、微晶纤维素和乳糖分别过80目筛备用；
(2)将水解硫酸软骨素、氨基葡萄糖硫酸盐、微晶纤维素和乳糖混合均匀后，依次加入处方量的交联羧甲基纤维素钠、微粉硅胶和硬脂酸镁，混合15min；
(3)将混合物通过旋转压片机进行压片，控制片剂硬度为6～10kg；
(4)使用纯化水配制固含量为10％的包衣液；
(5)通过高效包衣机对片剂进行包衣，设置进风温度为55℃，雾化压力为0.2MPa，控制片床温度为40～45℃，包衣完成后即得。
实施例21：鼠内侧半月板不稳定(DMM)模型试验
1、材料
1.1、受试样品：按照本发明实施例15-20制备组合物，实施例15、实施例16、实施例17、实施例18、实施例19和实施例20人体推荐日服用量为2片(粒)/天，早晚各1片(粒)。
1.2、受试物制备：将受试样品掺入饲料中给样，实施例15、实施例16、实施例17、实施例18、实施例19和实施例20，每日小鼠服用的样品需150mg/天。
1.3、给予受试物途径：将各实施例样品通过灌胃给药方式给予各组动物。
2、模型建立
水合氯醛麻醉小鼠，剃去右后肢膝关节毛发，碘酒酒精消毒后，沿着小鼠内侧骸骨旁纵向切开一个长约1cm的开口，使膝关节暴露出来。利用显微手术剪打开关节腔，将使内侧半月板铆钉在胫骨平台上的内侧半月板胫骨韧带剪断。6-0的可吸收缝合线将关节囊缝合，6-0的缝合线将关节的皮肤缝合，并在缝合的皮肤上涂少量青霉素防止感染。空白组(9只小鼠)做同样操作，但是不剪断内侧半月板胫骨韧带。术后第二天，将DMM小鼠随机分为7组(1、模型对照组；2、实施例15组；3、实施例16组；4、实施例17组；5、实施例18组；6、实施例19组；7、实施例20组)每组13只。
3、实验结果
术后第二天小鼠开始灌胃给药，空白组和模型组给予相同体积的生理盐水灌胃。每天给药一次，连续给药12周，每周称量一次动物体重，并根据体重调整给药量。
表1本发明制备的组合物对小鼠体重的影响(n＝13，)
实验结论：如图6，从实验开始第0天起，每组小鼠体重都呈现稍微上升的趋势，各时间点各组间无显著性差异(P＞0.05)。
小鼠灌胃12周后，采用YLS-11A通道式鼠足支撑力测量仪对各组小鼠站立时两条后腿的支撑力差值进行检测，以此评价小鼠的骨关节炎疼痛程度。将小鼠驱赶到一个单通道中进行一个60度的爬坡实验。当小鼠开始爬坡站立时，记录下小鼠左、右两条后腿之间的支撑力差值。支撑力差值越大，表明骨关节炎程度越严重。
表2本发明制备的组合物对小鼠后足支撑力的影响(n＝13，)
通过对小鼠支撑力差值的检测来评价小鼠骨关节炎的疼痛程度，结果如图7所示，模型组的足支撑力的差值最大，表明模型组的骨关节炎疼痛程度最严重。与假手术组之间有极显著差异(P<0.01)，表明模型建立成功。与模型组比较，实施例15、实施例16、实施例19和实施例20能显著降低足支撑力差值(P＜0.01)，实施例17和实施例18也能降低足支撑力差值(P＜0.05)，由小鼠的日服用剂量按照公式：人体剂量＝小鼠剂量*人体体重/等效剂量比值，推算到人体日服用剂量，计算过程如下：
备注：1、小鼠与人的等效剂量比值为9.1；2、小鼠水解硫酸软骨素给药量＝小鼠组合物给药量*水解硫酸软骨素处方量/总片重。
表明水解硫酸软骨素日服用剂量在50～800mg之间具有比较明显的缓解、治疗骨关节炎疼痛的作用，组合物内添加氨基葡萄糖，可增加缓解、治疗骨关节炎疼痛的作用。
实施例22通过对小鼠血清中炎症因子、骨羟脯胺酸、番红固绿染色法的病理学和免疫组化的检测，评价硫酸软骨素寡糖(CSO)及其与氨基葡萄糖(氨基糖)的组合对小鼠内侧半月板不稳定(DMM)致骨关节炎的治疗作用
C57BL/6雄性小鼠，8-9周龄，100只，自由饮水和摄食。水合氯醛麻醉小鼠，剃去右后肢膝关节毛发，碘酒酒精消毒后，沿着小鼠内侧骸骨旁纵向切开一个长约1cm的开口，使膝关节暴露出来。利用显微手术剪打开关节腔，将使内侧半月板铆钉在胫骨平台上的内侧半月板胫骨韧带剪断。6-0的可吸收缝合线将关节囊缝合，6-0的缝合线将关节的皮肤缝合，并在缝合的皮肤上涂少量青霉素防止感染。假手术组(9只小鼠)做同样操作，但是不剪断内侧半月板胫骨韧带。
术后第二天，将DMM小鼠随机分为7组，每组13只：
1)模型对照组；
2)硫酸软骨素寡糖最高剂量(60mg/kg)组；
3)硫酸软骨素寡糖高剂量(30mg/kg)组；
4)硫酸软骨素寡糖中剂量(15mg/kg)组；
5)硫酸软骨素寡糖低剂量(7.5mg/kg)组；
6)硫酸软骨素寡糖(15mg/kg)+盐酸氨基葡萄糖(75mg/kg)组；
7)大分子量硫酸软骨素(CS)(80mg/kg)+氨基葡萄糖(400mg/kg)组。
术后第二天小鼠开始灌胃给药，给药容积为0.2ml/20g，假手术组和模型组给予相同体积的生理盐水。大分子量硫酸软骨素(Chondroitin Sulphate,CS)(80mg/kg)+氨基葡萄糖(400mg/kg)组药物用0.5％ CMC-Na混悬。每天给药一次，连续给药12周，每周称量一次动物体重，并根据体重调整给药量。
小鼠摘眼球取血，分离血清，Elisa法测定TNF-α、IL-1β、IL-6、C5b-9。处死小鼠，取右后肢股骨，按照试剂盒方法测定骨羟脯胺酸。取右后肢膝关节，进行病理(番红固绿染色法)及其C5b-9表达(免疫组化)检测。测评指标及指标表征汇总如下：
-对于血清中炎症因子的含量影响
通过对小鼠血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量的检测及小鼠血清中补体C5b-9含量的检测来评价小鼠骨关节炎的严重程度，结果如图10A所示，模型组的炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量及补体C5b-9含量最高，表明模型组的骨关节炎最严重。与假手术组之间有极显著差异(P<0.01)，表明模型建立成功。
如图10A所示，与模型组相比，硫酸软骨素寡糖最高、高、中、低剂量组小鼠血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量及血清中补体C5b-9含量均有不同程度的降低，表明不同剂量的硫酸软骨素寡糖具有缓解、治疗骨关节炎的作用。
与中剂量组比较，CSO+氨糖组中小鼠血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量及血清中补体C5b-9含量有不同程度的降低，表明硫酸软骨素寡糖与氨糖联用，缓解、治疗骨关节炎的效果增强。
与大分子硫酸软骨素+氨糖组比较，CSO+氨糖组和本发明寡糖组中小鼠血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量及血清中补体C5b-9含量有较大程度的降低，表明硫酸软骨素寡糖治疗骨关节炎的效果优于大分子硫酸软骨素。
-对股骨羟脯氨酸含量的影响
通过对小鼠股骨羟脯氨酸的检测来评价小鼠骨关节炎的严重程度，结果如图10B所示，模型组的股骨羟脯氨酸含量最低，表明模型组的骨关节炎最严重。与假手术组之间有极显著差异(P<0.01)，表明模型建立成功。
与模型组相比，硫酸软骨素寡糖最高、高、中、低剂量组，硫酸软骨素寡糖+氨糖组能极显著升高小鼠股骨中羟脯氨酸含量(P<0.01)。
与中剂量组比较，CSO+氨糖组的羟脯氨酸含量显著升高，表明氨糖与CSO联用，能促进治疗骨关节炎的药效。
与大分子硫酸软骨素+氨糖组比较，CSO+氨糖组的数据表明CSO的效果优于CS。
-膝关节病理检测
通过对小鼠膝关节番红固绿染色来评价小鼠骨关节炎的严重程度，结果如图10C及图10D所示，模型组小鼠的膝关节番红固绿染色病理评分最高，表明模型组的骨关节炎最严重。与假手术组之间有极显著差异(P<0.01)，表明模型建立成功。
与模型组相比，硫酸软骨素寡糖最高、高剂量组，硫酸软骨素寡糖+氨糖组均能显著降低番红固绿染色病理评分(P<0.05)，表明硫酸软骨素寡糖有缓解骨关节炎的功效。
-膝关节软骨表面C5b-9含量
通过对小鼠膝关节C5b-9免疫组织化学染色来评价小鼠骨关节炎的严重程度，结果如图10E及图10F所示，模型组小鼠的膝关节C5b-9阳性细胞数目最高，表明模型组的骨关节炎最严重。与假手术组之间有极显著差异(P<0.01)，表明模型建立成功。
与模型组相比，硫酸软骨素寡糖最高、高剂量组，寡糖中剂量+氨糖组能极显著降低小鼠膝关节C5b-9阳性细胞数目(P<0.01)，表明硫酸软骨素寡糖能减轻骨关节炎的软骨损伤。
实施例23CSO对膝关节注射木瓜蛋白酶致大鼠骨关节炎模型的治疗作用
Wistar雄性大鼠80只，180-220g。将4％木瓜蛋白酶与0.03mol/L的L-半胱氨酸按2∶1混合静置30min后备用。在实验第0、3、6天，大鼠膝关节腔注入0.3mL混合溶液诱导骨关节炎模型。正常对照组注射等体积生理盐水。
在末次注射木瓜蛋白酶混合溶液后，造模动物随机分成7组，每组10只：
1)模型对照组；
2)硫酸软骨素寡糖最高剂量(30mg/kg)组；
3)硫酸软骨素寡糖高剂量(15mg/kg)组；
4)硫酸软骨素寡糖中剂量(7.5mg/kg)组；
5)硫酸软骨素寡糖低剂量(3.8mg/kg)组；
6)硫酸软骨素寡糖(7.5mg/kg)+盐酸氨基葡萄糖(37.5mg/kg)组；
7)大分子量硫酸软骨素(40mg/kg)+氨基葡萄糖(200mg/kg)组；
造模后第二天大鼠开始灌胃给药，给药容积为0.2ml/100g，正常对照组和模型组给予相同体积的生理盐水。大分子量硫酸软骨素(40mg/kg)+氨基葡萄糖(200mg/kg)组药物用0.5％ CMC-Na混悬。每天给药一次，连续给药12周，每3天称量一次动物体重，并根据体重调整给药量。
测量造模前、给药前，以及给药第1、3、6、9、12周的双膝关节宽度，按照以下公式计算出关节肿胀度。关节肿胀度(mm)＝致炎后(给药后)膝关节宽度-致炎前膝关节宽度。
灌胃给药12周后，大鼠腹主动脉取血，分离血清，Elisa法测定TNF-α、IL-1β、IL-6。处死大鼠，取股骨，按照试剂盒方法测定骨羟脯胺酸。取膝关节，进行病理(HE染色法)检测。测评指标及指标表征汇总如下：
如图11A所示，从实验开始第0天起，每组大鼠体重都呈现上升的趋势，各时间点各组间无显著性差异。结果表明，硫酸软骨素寡糖给药12周对大鼠体重没有明显影响。
通过对大鼠血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量的检测来评价大鼠骨关节炎的严重程度，结果如图11B、图11C、图11D所示，模型组血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量最高，表明模型组的骨关节炎最严重。与假手术组之间有极显著差异(P<0.01)，表明模型建立成功。
如图11B、图11C、图11D所示，与模型组相比，硫酸软骨素寡糖最高、高、中、低剂量组大鼠血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量均有不同程度的降低，表明不同剂量的硫酸软骨素寡糖具有缓解、治疗骨关节炎的作用。
与中剂量组比较，寡糖中剂量+氨糖组中大鼠血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量有不同程度的降低，表明硫酸软骨素寡糖与氨糖联用，缓解、治疗骨关节炎的效果增强。
与大分子硫酸软骨素+氨糖组比较，CSO+氨糖组中大鼠血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量有较大程度的降低，表明硫酸软骨素寡糖治疗骨关节炎的效果优于大分子硫酸软骨素。
通过对大鼠膝关节病理检测来评价大鼠骨关节炎的严重程度，结果如图11E及图11F所示，模型组大鼠的膝关节病理评分最高，表明模型组的骨关节炎最严重。与假手术组之间有极显著差异(P<0.01)，表明模型建立成功。
与模型组相比，硫酸软骨素寡糖最高、高剂量组，寡糖中剂量+氨糖组均能极显著降低病理评分(P<0.01)，表明硫酸软骨素寡糖有缓解骨关节炎的功效。
实施例24CSO对去卵巢致雌性大鼠及去睾丸致雄性大鼠骨质疏松的治疗作用
雌性大鼠组：
取体重200-220g雌性SD大鼠90只。大鼠适应环境3d。手术前禁食不禁水24h。大鼠腹腔注射3％水合氯醛，麻醉，其中10只从腰背部脊柱两侧做纵行切口切开皮肤及肌肉但不摘除卵巢，作为假手术组。其余动物从腰背部脊柱两侧做纵行切口切开皮肤及肌肉，摘除两侧卵巢，关闭创口。所有动物术后肌肉注射青霉素，连续注射3d。(雄性大鼠同法操作，去除睾丸)
术后第二天，将去卵巢大鼠随机分为8组，每组8只：
1)假手术组
2)模型组
3)醋酸钙(158mg/kg)组：
4)硫酸软骨素寡糖最高剂量(30mg/kg)+醋酸钙(158mg/kg)组
5)硫酸软骨素寡糖高剂量(15mg/kg)+醋酸钙(158mg/kg)组
6)硫酸软骨素寡糖中剂量(7.5mg/kg)+醋酸钙(158mg/kg)组
7)硫酸软骨素寡糖低剂量(3.8mg/kg)+醋酸钙(158mg/kg)组
8)硫酸软骨素寡糖(7.5mg/kg)+盐酸氨基葡萄糖(37.5mg/kg)+醋酸钙(158mg/kg)组
9)大分子量硫酸软骨素(40mg/kg)+氨基葡萄糖(200mg/kg)+醋酸钙(158mg/kg)组
术后第二天大鼠开始灌胃给药，给药容积为0.2mL/100g，假手术组和模型组给予相同体积的生理盐水。连续给药12周，每周称量一次动物体重，并根据体重调整给药量。
末次给药后24小时，大鼠眼眶取血，测定血清碱性磷酸酶(ALP)、骨形成蛋白(BGP)、甲状旁腺激素(PTH)、降钙素(CT)。
将大鼠处死，分离双侧股骨，取右侧股骨测定如下指标：称重并计算骨重系数(g/100g体重)、骨密度、骨灰含量、骨钙或骨磷、骨羟脯氨酸、HE病理。测评指标及指标表征汇总如下：
雄性大鼠组：
取体重200-220g雄性SD大鼠90只。大鼠适应环境3d。手术前禁食不禁水24h。大鼠腹腔注射3％水合氯醛，麻醉，取仰卧式，碘酒、酒精消毒阴囊皮肤，纵隔旁相距1cm各开一纵性切口，剪开鞘膜后，其中10只分别将双侧睾丸与附睾分离(不切除)，然后放回阴囊，缝合切口，作为假手术组。其余80只去睾丸组用同样方法找出双侧睾丸并切除之。所有动物术后肌肉注射青霉素，连续注射3d。
术后第二天，将去卵巢大鼠随机分为8组，每组8只：
其余步骤与上述雌性大鼠一致。
实验结果
-体重的变化
如图12A、图12B所示，从实验开始第0天起，每组大鼠体重都呈现上升的趋势，各时间点各组间无显著性差异。结果表明，硫酸软骨素寡糖给药12周对雌性及雄性大鼠体重没有明显影响。
-骨重系数
如图12C、图12D所示，与假手术组相比，模型组大鼠骨重系数显著降低(P<0.01)，表明建模成功。
与模型组相比，寡糖高剂量组能显著升高雌性及雄性大鼠的骨重系数(P<0.05)。
-骨密度
通过对大鼠骨密度的检测来评价大鼠骨质疏松的严重程度，如图12E、图12F所示，模型组大鼠骨密度显著降低，表明模型组大鼠的骨质疏松最严重，与假手术组之间有极显著性差异(P<0.01)，表明模型建立成功。
与模型组雌性大鼠相比，各给药组显著升高雌性骨质疏松大鼠股骨骨干、骨骺骨密度(P<0.05，P<0.01)，表明硫酸软骨素寡糖有改善骨质疏松的功效。
与模型组雄性大鼠相比，最高、高、中、低、CSO+氨糖组、大分子硫酸软骨素+氨糖组显著升高雄性大鼠股骨骨骺骨密度(P<0.05，P<0.01)；CSO+氨糖组、大分子硫酸软骨素+氨糖组显著升高雄性大鼠股骨骨干骨密度(P<0.05)。
-骨灰含量
通过对大鼠股骨骨灰含量的检测来评价大鼠骨质疏松的严重程度，结果如图12G所示，模型组大鼠骨灰含量显著降低，表明模型组大鼠的骨质疏松最严重，与假手术组有显著差异(P<0.01，P＜0.05)，表明模型建立成功。
与模型组相比，CSO+氨糖组显著升高雌性大鼠股骨骨灰含量P<0.05)，其他各给药组有升高趋势，没有统计学差异(P＞0.05)；CSO高、中、低剂量组、CSO+氨糖组、Ca组显著升高雄性大鼠股骨骨灰含量P<0.01，P<0.05)。表明硫酸软骨素寡糖有改善骨质疏松的功效。
-骨磷
通过对大鼠骨磷含量的检测来评价大鼠骨质疏松的严重程度，结果如图12H所示，模型组大鼠骨磷含量显著降低，表明模型组大鼠的骨质疏松最严重，与假手术组有极显著差异(P<0.01)，表明模型建立成功。
与模型组相比，CSO最高、中剂量组，大分子硫酸软骨素+氨糖组、CSO+氨糖组显著升高雌性大鼠的骨磷含量(P<0.05，P＜0.01)。CSO低剂量组、CSO+氨糖组及Ca组显著升高雄性大鼠的骨磷含量(P<0.05，P＜0.01)，表明硫酸软骨素寡糖有改善骨质疏松的功效。
-血清碱性磷酸酶
通过对大鼠血清碱性磷酸酶(ALP)含量的检测来评价大鼠骨质疏松的严重程度，结果如图12I所示，模型组大鼠血清碱性磷酸酶含量显著降低，表明模型组大鼠的骨质疏松最严重，与假手术组有极显著差异(P<0.01)，表明模型建立成功。
与模型组相比，各给药组极显著升高雌性骨质疏松大鼠血清碱性磷酸酶含量(P＜0.05，P<0.01)。除CSO低剂量组外，其他各给药组极显著升高雄性骨质疏松大鼠血清碱性磷酸酶含量(P<0.01)；
-血清骨形成蛋白-4
通过对大鼠血清骨形成蛋白-4(BMP-4)含量的检测来评价大鼠骨质疏松的严重程度，结果如图12J所示，模型组大鼠血清骨形成蛋白-4(BMP-4)含量显著降低，表明模型组大鼠的骨质疏松最严重，与假手术组有极显著差异(P<0.01)，表明模型建立成功。
与模型组相比，各给药组显著升高雌性骨质疏松大鼠血清BMP-4含量(P＜0.05，P<0.01)。除CSO低剂量组外，其他各给药组显著升高雄性骨质疏松大鼠血清BMP-4(P<0.05，P<0.01)。
-血清降钙素
通过对大鼠血清降钙素(CT)含量的检测来评价大鼠骨质疏松的严重程度，结果如图12K所示，模型组大鼠血清降钙素(CT)含量显著降低，表明模型组大鼠的骨质疏松最严重，与假手术组有极显著差异(P<0.01)，表明模型建立成功。
与模型组相比，各给药组显著升高雌性骨质疏松大鼠血清CT含量(P＜0.05，P<0.01)。除CSO低剂量组外，其他各给药组显著升高雄性骨质疏松大鼠血清CT(P<0.05，P<0.01)；
-血清甲状旁腺素
通过对大鼠血清甲状旁腺素(PTH)含量的检测来评价大鼠骨质疏松的严重程度，结果如图12L所示，模型组大鼠血清甲状旁腺素(PTH)含量显著降低，表明模型组大鼠的骨质疏松最严重，与假手术组有极显著差异(P<0.01)，表明模型建立成功。
与模型组相比，除CSO低剂量组和Ca组外，其他各给药组显著降低雌性骨质疏松大鼠血清PTH含量(P＜0.05，P<0.01)。除大分子硫酸软骨素+氨糖组外，其他各给药组显著降低雄性骨质疏松大鼠血清PTH(P<0.05，P<0.01)。
-股骨骨小梁面积、骨小梁面积百分率、骨小梁数量
通过对大鼠股骨骨小梁面积、骨小梁面积百分率、骨小梁数量的检测来评价大鼠骨质疏松的严重程度，结果如图12M、图12N、图12O所示，模型组大鼠股骨骨小梁面积、骨小梁面积百分率、骨小梁数量显著降低，表明模型组大鼠的骨质疏松最严重，与假手术组有极显著差异(P<0.01)，表明模型建立成功。
与模型组相比，最高、高、中剂量组及寡糖中剂量+氨糖组能显著增加雄性骨质疏松大鼠股骨骨小梁面积、骨小梁面积百分率(P<0.05，P<0.01)；与模型组相比，各给药组显著增加雌性骨质疏松大鼠股骨骨小梁面积、骨小梁面积百分率(P<0.05，P<0.01)；
与模型组相比，除Ca组外，其他各给药组显著增加雄性骨质疏松大鼠股骨骨小梁数量(P<0.05，P<0.01)；与模型组相比，除CSO低剂量组和Ca组外，各给药组显著增加雌性骨质疏松大鼠股骨骨小梁数量(P<0.05，P<0.01)
由此，表明硫酸软骨素寡糖有缓解骨质疏松的功效。
根据已有实验数据，可得到如下结论：不同剂量的硫酸软骨素寡糖均具有缓解、治疗骨关节炎疼痛及骨质疏松的作用；硫酸软骨素寡糖与氨糖联用，可增强缓解、治疗骨关节炎疼痛及骨质疏松的效果；硫酸软骨素寡糖对于骨关节炎及骨质疏松的疗效优于大分子硫酸软骨素。
如上在整个本申请中引用的每个参考文献通过参考并入本文。在前述描述与参考文献之间发生冲突的情况下，以本文提供的描述为准。

Claims (25)

1.一种低分子量硫酸软骨素，其特征在于：所述低分子量硫酸软骨素的平均分子量为300～低于1000道尔顿，其分子量分布范围窄，主要以硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖为主，硫酸软骨素二糖含量占比为43～60％，硫酸软骨素四糖含量占比为30～45％，硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖含量之和大于87％；所述低分子量硫酸软骨素的结构通式如下式I所示：
式I：n＝0～5，且n为整数，R1,R2,R3＝-H或-SO3Na
其中所述的低分子量硫酸软骨素通过如下的制备方法制备：
将大分子硫酸软骨素原料经过硫酸软骨素裂解酶的酶解得到平均分子量可稳定地控制在300～低于1000道尔顿的低分子量硫酸软骨素产物；
其中，所述硫酸软骨素裂解酶从海岸边、河边、农贸市场、屠宰厂和食堂处的土样、污水或淤泥中筛选、鉴定，并用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌优化表达得到；
其中，所述大分子硫酸软骨素原料来源于陆生和/或海洋动物的软骨组织，其选自鸡软骨，猪软骨，牛软骨或鲨鱼骨中的一种或几种混合；并且
其中，酶解反应的操作条件为，所述硫酸软骨素裂解酶相对每升发酵液的添加量为100～300U/L，大分子硫酸软骨素原料的浓度为100～700g/L，酶解时间为6～40h，酶解温度为25～35℃，搅拌转速为100～700rpm，酶解pH为6.5～8.5。
2.根据权利要求1所述的低分子量硫酸软骨素，其特征在于：所述低分子量硫酸软骨素的平均分子量为590～830Da。
3.根据权利要求2所述的低分子量硫酸软骨素，其特征在于：所述低分子量硫酸软骨素的平均分子量为677～742Da。
4.一种权利要求1～2任一项所述的低分子量硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：将大分子硫酸软骨素原料经过硫酸软骨素裂解酶的酶解得到平均分子量可稳定地控制在300～低于1000道尔顿的低分子量硫酸软骨素产物，其分子量分布范围窄，产物主要以硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖为主，硫酸软骨素二糖含量占比为43～60％，硫酸软骨素四糖含量占比为30～45％，硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖含量之和大于87％；所述低分子量硫酸软骨素的结构通式如下式I所示：
式I：n＝0～5，且n为整数；R1,R2,R3＝-H或-SO3Na。
其中，所述硫酸软骨素裂解酶从海岸边、河边、农贸市场、屠宰厂和食堂处的土样、污水或淤泥中筛选、鉴定，并用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌优化表达得到；
其中，所述大分子硫酸软骨素原料来源于陆生和/或海洋动物的软骨组织，其选自鸡软骨，猪软骨，牛软骨或鲨鱼骨中的一种或几种混合；并且
其中，酶解反应的操作条件为，所述硫酸软骨素裂解酶相对每升发酵液的添加量为100～300U/L，大分子硫酸软骨素原料的浓度为100～700g/L，酶解时间为6～40h，酶解温度为25～35℃，搅拌转速为100～700rpm，酶解pH为6.5～8.5。
5.根据权利要求4所述的低分子量硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：所述大分子硫酸软骨素原料来源于鲨鱼骨。
6.根据权利要求4所述的低分子量硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：酶解反应后的水解液通过混合溶剂脱除蛋白，水解液与混合溶剂的体积比为2～5:1，混合溶剂中二氯甲烷和异丙醇的体积比为3～5:1，100～500rpm搅拌10～40min，3000～5000rpm离心10～30min，取上层反应液。
7.根据权利要求4所述的低分子量硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：酶解反应后的水解液通过超滤的方式脱除蛋白得到反应液。
8.根据权利要求6所述的低分子量硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：将脱除蛋白后的上层反应液，经过0.22μm囊式滤芯过滤除菌，然后将反应液加入到8～12倍体积量的无水乙醇中，醇沉，真空干燥。
9.根据权利要求7所述的低分子量硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：将脱除蛋白后的反应液，经过0.22μm囊式滤芯过滤除菌后进行喷雾干燥。
10.根据权利要求1所述的低分子量硫酸软骨素，其特征在于：由鲨鱼骨和鸡软骨中的一种或其混合骨酶解得到的低分子量硫酸软骨素相对鲨鱼骨的大分子硫酸软骨素，在50～100μg/mL浓度内对1mM双氧水损伤的软骨细胞有更明显的修复作用，修复率在14％～23％之间；或者权利要求1所述的特定二糖和四糖含量范围的低分子量硫酸软骨素在50～1600μg/mL浓度范围内对1mM双氧水损伤的软骨细胞有修复作用，修复率在20％～62.4％之间。
11.一种含权利要求1所述低分子量硫酸软骨素的组合物，其特征在于，含有50mg～800mg低分子量硫酸软骨素的人体日服用量。
12.根据权利要求11所述的含低分子量硫酸软骨素的组合物，其特征在于，所述组合物中包含氨基葡萄糖。
13.根据权利要求12所述的含低分子量硫酸软骨素的组合物，其特征在于，所述氨基葡萄糖是氨基葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖硫酸盐中的一种或两种的混合物。
14.根据权利要求11所述的含低分子量硫酸软骨素的组合物，其特征在于，所述低分子量硫酸软骨素是不同分子量的低分子量硫酸软骨素的混合物。
15.根据权利要求14所述的含低分子量硫酸软骨素的组合物，其特征在于，低分子量硫酸软骨素的平均分子量在379～低于1000Da。
16.根据权利要求11所述的含低分子量硫酸软骨素的组合物，其特征在于，所述组合物还包括药学上可接受的辅料，其中所述辅料选自填充剂、崩解剂、粘合剂、矫味剂、润滑剂及薄膜包衣剂。
17.根据权利要求16所述的含低分子量硫酸软骨素的组合物，其特征在于，所述的填充剂包括微晶纤维素、淀粉、糊精、甘露醇、乳糖；崩解剂包括交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、羟丙基淀粉、预交化淀粉、低取代羟丙基纤维素、碳酸氢钠、枸橼酸、酒石酸；粘合剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮；润滑剂包括硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇、硬脂酸；薄膜包衣剂的组成包括羟丙甲基纤维素、聚乙二醇、色淀。
18.根据权利要求11所述的含低分子量硫酸软骨素的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂。
19.权利要求11-18任一项所述组合物的用途，其特征在于，该组合物在制备用于减少关节发炎；缓解疼痛；缓解、治疗骨质疏松方面的药物中的用途。
20.根据权利要求19所述组合物的用途，其特征在于，该组合物通过减少血清中炎性因子或补体的水平或降低番红O-固绿染色的病理学评分来减少关节炎症，其中所述炎性因子是下列之一:IL-6、IL-1β或TNF-α；其中补体是C5b-9。
21.根据权利要求19所述组合物的用途，其特征在于，该组合物通过提高股骨中骨羟脯氨酸的水平来减少关节炎症。
22.根据权利要求19所述组合物的用途，其特征在于，该组合物通过提高骨重系数、骨密度、骨灰含量、骨磷、血清碱性磷酸酶、骨形成蛋白、降钙素、股骨骨小梁面积、骨小梁面积百分比或骨小梁数量水平或者通过降低甲状旁腺激素的水平来缓解和治疗骨质疏松症。
23.根据权利要求19所述组合物的用途，其特征在于，其中所述组合物含有50mg～800mg的低分子量硫酸软骨素的人体日服用量。
24.根据权利要求19所述组合物的用途，其特征在于，其中所述组合物以片剂、颗粒剂、胶囊剂或丸剂的剂型给药。
25.根据权利要求19所述组合物的用途，其特征在于，其中所述组合物每天给药一次或每天给药两次。
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