ES2940343T3 - Nuevos derivados obtenidos de ácido hialurónico y carnosina - Google Patents

Nuevos derivados obtenidos de ácido hialurónico y carnosina Download PDF

Info

Publication number
ES2940343T3
ES2940343T3 ES21177893T ES21177893T ES2940343T3 ES 2940343 T3 ES2940343 T3 ES 2940343T3 ES 21177893 T ES21177893 T ES 21177893T ES 21177893 T ES21177893 T ES 21177893T ES 2940343 T3 ES2940343 T3 ES 2940343T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
conjugate
carnosine
hyaluronic acid
compositions according
treatment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES21177893T
Other languages
English (en)
Inventor
Enrico Rizzarelli
Sebastiano Sciuto
Valentina Greco
Cristina Satriano
Rosanna Inturri
Luciano Messina
Susanna Vaccaro
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Degli Studi Di Catania, University of
Universita degli Studi di Catania
Fidia Farmaceutici SpA
Original Assignee
Degli Studi Di Catania, University of
Universita degli Studi di Catania
Fidia Farmaceutici SpA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Degli Studi Di Catania, University of, Universita degli Studi di Catania, Fidia Farmaceutici SpA filed Critical Degli Studi Di Catania, University of
Application granted granted Critical
Publication of ES2940343T3 publication Critical patent/ES2940343T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

El objeto de la invención es el conjugado químico entre carnosina (β-alanil-L-histidina) y ácido hialurónico unidos covalentemente a través de un enlace amina resistente a peptidasa; dicho conjugado se caracteriza por lo tanto por una resistencia mejorada a la degradación enzimática. Otro objeto de la invención son las composiciones para uso farmacéutico, cosmético y nutracéutico que comprenden dicho conjugado y sus usos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevos derivados obtenidos de ácido hialurónico y carnosina
Objeto de la invención
El objeto de la invención es el conjugado químico entre carnosina (p-alanil-L-histidina) y ácido hialurónico enlazados covalentemente a través de un enlace amina resistente a peptidasa; dicho conjugado se caracteriza por lo tanto por una resistencia mejorada a la degradación enzimática. Otros objetos de la invención son composiciones para uso farmacéutico, cosmético y nutracéutico que comprenden dicho conjugado, y los usos de estos.
Campo de la invención
El proceso de respiración celular genera un subproducto importante y potencialmente peligroso: el radical superóxido, que puede reaccionar y dañar macromoléculas biológicas como proteínas, ADN y lípidos y generar otras especies altamente reactivas (ROS) como •OH, RO2^ , ROOH, RO', H2O2 y ONOO', que son potencialmente agresivos con el sistema celular. Todos los organismos aeróbicos poseen mecanismos de defensa contra el radical O2", siendo los principales enzimas superóxido dismutasa (SOD), que catalizan la dismutación de O2" a O2 y H2O2. El peróxido de hidrógeno producido se convierte a su vez en H2O por catalasa y por glutatión peroxidasa, impidiendo así la formación del radical •OH que se habría originado a partir de la reacción de Fenton (Fe(II)+H2O2^ Fe(III)+^OH+'OH). Bajo determinadas condiciones patológicas, como procesos inflamatorios, las enzimas SOD pueden resultar insuficientes para eliminar el exceso de O2" producido, y en tales casos, los tejidos biológicos pueden dañarse aún más. Un alto nivel de moléculas pequeñas con actividad antioxidante, como el glutatión y otros péptidos (carnosina, homocarnosina, anserina, etc.), que tienen la función de reforzar la protección contra los procesos de estrés oxidativo, se ha encontrado en algunos tejidos de vertebrados, como músculo o tejido cerebral, caracterizado por un mayor nivel de metabolismo oxidativo. La actividad protectora de dichos péptidos frente a ROS ha sido ampliamente discutida y demostrada en la literatura (por ejemplo, en Prokopieva et al., Oxid Med Cell Longer).
En el caso particular de carnosina, en cuanto a sus propiedades antirradicales y antiperoxidativas, estudios preclínicos han demostrado su capacidad para prevenir, y en parte tratar, daño inflamatorio, como se ha demostrado en los tejidos del aparato digestivo, ojos y piel. Además, la carnosina ha mostrado efectos inhibitorios contra la oxidación de las LDL humanas inducida por cobre Cu(II) (Bellia et al., Eur J Med Chem, 2007, 43:373-380), y se ha demostrado específicamente su actividad secuestrante frente al radical hidroxilo (La Mendola et al., Helv Chim Acta, 2002, 85:1633-1643). También es interesante notar que los complejos de carnosina con Cu(II) exhiben actividad sinérgica contra dos especies de radicales tóxicos, O2^y •OH (Bonomo et al., Dalton Trans, 2003, 23: 4406-4415). La actividad secuestrante de dichos complejos de carnosina con Cu(II) también está presente cuando se dimerizan (Tamba y Torreggiani, Int J Radiat Biol, 1999, 75:1177-1188). En cuanto a la capacidad de la carnosina para contrarrestar los efectos patológicos del estrés nitrosativo, se ha demostrado que la interacción directa con óxido nítrico es responsable del efecto protector (Nicoletti et al., J. Neurosci Res, 2007, 85:2239-2245). La eficacia de la carnosina en la reducción de la activación de PARP-1 y PARP-2 después de la inducción del estrés oxidativo también se demostró más recientemente (Spina-Purrello et al., Neurochem Res, 2010, 35:2144-2153; Bellia et al., Mol Aspects Med, 2011, 32:258-266).
La naturaleza peptídica de la carnosina implica algunas limitaciones en su uso, asociadas con su degradabilidad por peptidasas específicas denominadas carnosinasas, y por otras enzimas normalmente presentes en tejidos biológicos. Para superar esta limitación se ha propuesto el uso de N-acetil-carnosina, que se produce mediante procesos conocidos por la persona experimentada en la técnica y se purifica cromatográficamente con grandes cantidades de disolventes (documento WO9510294). También se ha utilizado con el mismo fin la derivatización de carnosina con ciclodextrinas, compuestos ampliamente utilizados como portadores de fármacos, mediante un procedimiento químico que implica sucesivas etapas de purificación mediante técnicas cromatográficas (documento EP1176154). Posteriormente se patentó un conjugado de carnosina con trehalosa sobre la base de la misma lógica. La síntesis del compuesto requiere una posterior purificación mediante cromatografía en columna de intercambio catiónico (documento EP1860116). Sin embargo, el perfil de degradación exacto de la carnosina derivatizada como se divulga en los documentos WO9510294, EP1176154 y EP1860116 por las enzimas naturalmente presentes en los tejidos biológicos no se conoce, y la verdadera capacidad de acción in vivo de dichos derivados sigue sin demostrarse.
A diferencia de los conjugados anteriores, el conjugado de fórmula (1) de acuerdo con la presente invención se obtiene por conjugación covalente de carnosina con ácido hialurónico (HA). El procedimiento de síntesis del conjugado (1) es sencillo, al igual que la posterior purificación, que no implica técnicas cromatográficas, sino simplemente una etapa de diálisis. Además, el conjugado (1) no es un objetivo de peptidasas no específicas y muestra una resistencia inesperada a la degradación por hialuronidasa. Por lo tanto, el conjugado (1) divulgado en el presente documento parece ser más simple de obtener y más estable que la carnosina sola, ya sea como derivado de acetilo o derivatizado con trehalosa o ciclodextrinas. Además, la presencia de HA en el conjugado de acuerdo con la presente invención potencia la acción de la carnosina frente a los procesos oxidativos descritos anteriormente, mejorando su actividad biológica con respecto a los compuestos conocidos.
El ácido hialurónico (HA) es un polímero de cadena lineal que consta de un número variable de unidades de disacárido que se repiten, cada una compuesta por residuos de ácido glucurónico (ácido p-D-glucopiranurónico) y acetilglucosamina (2-acetilamino-2-desoxi-p-D-glucopiranosa), enlazados entre sí mediante un enlace glucosídico entre el átomo de carbono anomérico del primero y el C-3 de la acetilglucosamina. El HA es uno de los principales constituyentes de la matriz extracelular (ECM) de los tejidos de vertebrados, cuya presencia es especialmente significativa en el fluido sinovial, humor vítreo y cartílago hialino, pero también abundante en piel, tendones y músculos. El HA juega un papel clave proporcionando apoyo mecánico para los tejidos, así como el apoyo a una amplia variedad de procesos celulares. Se sabe que HA, a través de su receptor de membrana CD44, modula muchos procesos diferentes relacionados con la fisiología y biología celular, como la proliferación, migración, diferenciación y angiogénesis celular, y también realiza otras funciones, como hidratar los tejidos y lubricar las articulaciones. También se ha demostrado que el HA juega un papel crucial en el proceso de reparación tisular, tanto desde el punto de vista estructural (organizando la matriz extracelular y regulando su hidratación), y como sustancia estimuladora de una amplia gama de procesos en donde actúa directa y/o indirectamente (formación de coágulos, actividad fagocitaria, proliferación de fibroblastos, neovascularización, reepitelización, etc.) (Weigel P. et al., J Theoretical Biol, 1986, 119:219-234; Abatangelo G. et al., J Surg Res, 1983, 35:410-416; Goa K. et al., Drugs, 1994, 47:536-566).
En vista de las propiedades descritas anteriormente, el HA se utiliza para tratar una amplia gama de trastornos, que van desde la cicatrización de heridas hasta contrarrestar los procesos de degeneración del cartílago articular. La cicatrización de heridas y úlceras de diversa índole, incluidas las crónicas, mejora considerablemente tras la aplicación local de pomadas o ungüentos que contengan HA. De hecho, se ha demostrado que el HA protege el tejido de granulación de la herida porque previene el daño derivado de la formación local de radicales libres de oxígeno (Trabucchi et al., Int J Tissue React, 2002, 24:65-71). El HA también se puede incorporar en "armazones" moleculares que actúan como plantillas para la regeneración de tejidos en el campo de la ingeniería de tejidos (Fakhari y Berkland, Acta Biomater, 2013, 9:7081-92). El HA también se utiliza como sustituto del humor vítreo en el campo oftalmológico, y como agente de relleno dérmico e hidratante en el campo cosmético. Uno de los usos biomédicos más importantes del HA es, sin duda, la inyección intraarticular para contrarrestar la degeneración del cartílago asociada con diversos trastornos, como la osteoartritis (OA) y artritis reumatoide (RA). Además de actuar como sustituto del fluido sinovial, el HA también actúa como antiinflamatorio, modulando la liberación de citoquinas inflamatorias (en particular IL-1) y se enlaza a los receptores de dinorfina, dando lugar a un efecto analgésico (Zavan et al., PLoS One, 2013, 8:e55510).
El documento EP2648715 divulga un compuesto que comprende HA que se salifica, o al menos se salifica parcialmente, con carnosina, para obtener preparaciones que ofrecen las propiedades biofarmacológicas de ambos compuestos. El compuesto descrito se caracteriza porque el enlace químico entre HA y carnosina es de tipo iónico, y por tanto débil y únicamente electrostático. Se sabe que las especies químicas, o electrolitos, unidos por un enlace iónico, se disuelven en una solución acuosa, liberando inmediatamente carnosina y HA libre, que se degradan rápidamente por la acción de numerosas enzimas normalmente presentes en ellos, incluidas las carnosinasas, peptidasas no específicas e hialuronidasas.
También se ha preparado un conjugado entre ácido hialurónico (HA) y carnosina en donde el grupo amino del péptido está implicado en un enlace amida con el carboxilo de algunas de las unidades de ácido glucurónico presentes en la cadena del polisacárido (documento EP3174555). Se ha demostrado una mejora interesante en la resistencia a la acción de la carnosinasa sérica humana (CN-1) para este conjugado. También se ha divulgado que la HA conjugada con carnosina a través de un enlace amida y con un alto grado de derivatización es útil en el tratamiento de osteoartritis (OA), artritis reumatoide (AR) y una serie de trastornos directamente derivados de la misma (documento WO2019/069258). Sin embargo, el enlace amida que caracteriza los conjugados de HA-carnosina descritos en los documentos EP3174555 y WO2019/069258 es susceptible a la acción de la hidrólisis por peptidasas no específicas, limitando considerablemente la duración del efecto beneficioso de dichos compuestos.
El conjugado de fórmula (1) de acuerdo con la invención se caracteriza por la presencia, entre carnosina y HA, de un fuerte enlace químico covalente que no se disuelve en solución acuosa como lo hace el enlace iónico descrito en el documento EP2648715. En el conjugado (1) descrito aquí, el enlace entre carnosina y HA se efectúa por medio de un puente de amina, que no es susceptible de hidrólisis por enzimas que poseen actividad de peptidasa. La conjugación de HA y carnosina proporciona inesperadamente una mayor resistencia a la degradación por hialuronidasas, dando así al conjugado (1) características superiores a las de los compuestos descritos en los documentos EP2648715 y EP3174555.
Descripción detallada de la invención
El objeto de la invención es un derivado de carnosina (p-alanil-L-histidina) de fórmula (1), obtenido por funcionalización del ácido hialurónico con carnosina.
Figure imgf000004_0001
El conjugado de fórmula (1) de dipéptido de carnosina con ácido hialurónico tiene un enlace de amina entre el grupo amino libre de carnosina y el átomo de carbono en la posición 6 del residuo de acetilglucosamina del ácido hialurónico. En la fórmula (1), el índice n es el número de unidades de disacárido (cada una de las cuales consiste en un ácido glucurónico y un residuo de acetilglucosamina) no conjugadas con carnosina que están presentes en el polisacárido.
La presente invención divulga un conjugado entre HA y carnosina que tiene la fórmula (1) que se puede obtener por procesos conocidos. La purificación del conjugado (1) convenientemente no requiere etapas de cromatografía; en particular, no requiere etapas de cromatografía en columna, que son costosas y requieren el uso de grandes cantidades de disolventes, ni requiere etapas de cromatografía de intercambio iónico. A modo de ejemplo, el conjugado (1) puede obtenerse mediante un proceso de preparación que comprende las siguientes etapas:
a) oxidación regioselectiva a aldehído de una o más funciones de alcohol primario, presentes en la cantidad de 1 por unidad de disacárido, enlazadas al carbono en la posición 6 de cada residuo de acetilglucosamina de HA;
b) formación de un enlace aldimina entre el grupo amino libre NH2 de carnosina y uno o más grupos aldehído del derivado aldehído del ácido hialurónico;
c) conversión in situ del puente de aldimina resultante a un puente de amina utilizando un agente reductor adecuado; d) purificación del producto mediante una etapa de diálisis.
El HA utilizado en la presente invención puede provenir de cualquier fuente, como crestas de gallo (documento EP138572), fermentación (de Streptococcus equi o zooepidemicus, documento EP0716688), o procesos biotecnológicos (de Bacillus, documentos EP2614088, EP2614087), y puede ser purificado por diversas técnicas (documentos EP3491027, WO2019016699). El HA se obtiene preferentemente por fermentación a partir de Streptococcus equi o zooepidemicus (documento EP0716688). El peso molecular promedio en peso de HA para las aplicaciones descritas aquí puede oscilar entre 1*104 y 3*10® Da, preferiblemente entre 1*105 Da y 1*10® Da, y lo más preferiblemente en el intervalo de 130-230 kDa o en el intervalo de 500-750 kDa y mezclas de los mismos. El HA con un peso molecular promedio en peso (MW) que oscila entre 130 y 230 kDa generalmente se abrevia como "HA con un peso molecular promedio en peso de 200 kDa". "Peso molecular promedio" aquí significa el MW promedio en peso calculado por el método de "viscosidad intrínseca" (Terbojevich et al., Carbohydr Res, 198®, 363-377).
Conjugado (1) de acuerdo con la invención se caracteriza por un grado de derivatización (es decir, funcionalización) de Ha con carnosina por medio de la formación del enlace amina entre el grupo amino libre de carnosina y el átomo de carbono en la posición 6 del residuo de acetilglucosamina del enlace de HA a un hidroxilo primario, que puede oscilar entre 0.1 y 80 %, preferiblemente entre 5 y 60 %, más preferiblemente entre 10 y 30 %, y lo más preferiblemente entre 10 y 15 %. “Grado de derivatización” (es decir, funcionalización) aquí significa el porcentaje de átomos de carbono en la posición 6 de las unidades de N-acetilglucosamina de HA que se conjugaron con carnosina mediante la formación de un puente de amina. Por ejemplo, un conjugado de acuerdo con la invención con un grado de derivatización del 3 % tendrá 3 residuos de acetilglucosamina conjugados con carnosina cada 100 unidades de disacárido presentes en el polisacárido.
Otro objeto de la invención es el conjugado de fórmula (1) en la forma de un complejo de cobre Cu(II). El cobre tiene propiedades angiogénicas y antibacterianas, y actividad tipo SOD en complejos con carnosina. Ambos conjugados (1) y su complejo con Cu(II) presentan una baja susceptibilidad a la degradación por la enzima hialuronidasa y una mayor capacidad para estimular la viabilidad celular que la carnosina sola.
Conjugado (1) de acuerdo con la invención se caracteriza por una resistencia mejorada a la degradación enzimática, en particular por la peptidasa e hialuronidasa. La carnosina, al permanecer en su forma conjugada, es resistente a la acción de la carnosinasa sérica. Además, el aumento de la resistencia por conjugado (1) a la degradación por la hialuronidasa se ha demostrado, con el resultado de que el conjugado (1) mantiene la carnosina enlazada e intacta durante un tiempo suficiente para que alcance su sitio de acción. Conjugado (1) es por tanto más estable que los derivados del ácido hialurónico con carnosina descritos anteriormente, permitiendo una acción sinérgica entre HA y carnosina, como se demostrará a continuación.
La invención también se relaciona con composiciones farmacéuticas, cosméticas o nutracéuticas que comprenden el conjugado de fórmula (1) como ingrediente activo. En vista de sus propiedades antioxidantes, cicatrizantes y quelantes de los metales de transición, las composiciones que comprenden el conjugado de fórmula (1) se puede utilizar para el tratamiento o la prevención de diversas condiciones patológicas, incluidos los trastornos caracterizados por daño oxidativo a células y tejidos: el conjugado de fórmula (1) se puede usar en el tratamiento y/o prevención de trastornos caracterizados por daño oxidativo tales como cáncer, trastornos cardíacos y neurológicos, trastornos oftálmicos, complicaciones de diabetes tales como retinopatía diabética y lesiones de los órganos internos tales como úlceras gástricas. El uso del conjugado (1) también ha demostrado ser ventajoso en el tratamiento de condiciones patológicas caracterizadas por la presencia de heridas crónicas, úlceras, cortes, quemaduras o abrasiones, en donde se necesita promover la cicatrización de heridas. Conjugado (1) también es útil en la prevención y/o tratamiento de estados inflamatorios de las articulaciones resultantes de la degeneración de las mismas, en particular en la prevención y tratamiento de la osteoartritis (OA) y tratamiento de la artritis reumatoide (RA), así como en el tratamiento de trastornos causado directamente por RA o indirectamente correlacionado con/dependiente de RA.
Composiciones farmacéuticas, cosméticas o nutracéuticas que comprenden el conjugado de fórmula (1) como ingrediente activo puede tomar diversas formas farmacéuticas, incluyendo soluciones, ungüentos, polvo, gel, gotas oftálmicas y similares. Dichas composiciones farmacéuticas, cosméticas o nutracéuticas se pueden formular ventajosamente con excipientes, estabilizantes, agentes controladores de la viscosidad y/o conservantes conocidos por la persona experimentada, para aplicación tópica y oftálmica, oral, intraarticular o parenteral, o aplicable quirúrgicamente en el sitio de tratamiento. En particular, las composiciones que comprenden conjugado (1) se puede utilizar en el campo de los apósitos avanzados para la cicatrización de heridas y úlceras, incluidas las crónicas. Para este propósito, las composiciones que comprenden conjugado (1) se puede utilizar para impregnar o se puede depositar sobre gasas, vendajes, apósitos adhesivos, parches o estructuras tridimensionales o armazones de diversa índole. Pueden depositarse por métodos convencionales o innovadores, tales como métodos que explotan la tecnología de plasma conocida.
Las dosis y métodos de administración dependen de una serie de factores que, en general, determinará la persona experimentada sobre la base de las propiedades farmacológicas del conjugado (1). Las dosis serán ventajosamente inferiores a las normalmente requeridas para carnosina, en vista de la mayor actividad y menor susceptibilidad a la degradación enzimática que presenta el conjugado (1) y sus complejos de Cu(II).
A menos que se indique lo contrario, en todos los ejemplos descritos se utilizaron reactivos comercialmente disponibles.
Ejemplo 1. Síntesis de conjugado de ácido hialurónico (200 kDa)-carnosina con un grado de derivatización del 10 %.
Diseño de prueba. En un proceso de síntesis típico, se añadieron secuencialmente 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxilo (TEMPO; 4.12 mg) y ácido tricloroisocianúrico (TCCA; 122.6 mg) a una solución de ácido hialurónico (200 kDa) (1 g) se disolvió en 100 ml de DMF/agua (70:30, v/v) y, tras ajustar el pH a 8 con NaOH 0.1 N, la mezcla resultante se dejó a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se añadieron 3 ml de metanol para extinguir la reacción y la posterior adición de 1 L de acetona provocó la precipitación del componente polisacárido. Se disolvió 1 g del derivado aldehído del ácido hialurónico resultante en 100 ml de agua, previamente ajustada a pH 8 mediante la adición de una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio. A continuación, se añadieron a dicha solución 179 mg de carnosina (0.79 mmoles) y, transcurridos 30 minutos, 497.4 mg (7.9 mmoles) del agente reductor cianoborohidruro de sodio. A continuación, la mezcla resultante se dejó a temperatura ambiente durante 12 horas. Transcurrido dicho tiempo, la mezcla de reacción se dializó contra agua durante 48 horas utilizando una membrana de diálisis con MWCO de 12-14 kDa. El dializado se recuperó y se liofilizó para proporcionar el conjugado esperado (985 mg), que se sometió a análisis espectroscópico. El espectro 1H-RMN se registró en un instrumento Varian a 500 MHz (Inova 500), utilizando como frecuencia de referencia la de HOD, y se muestra en Figura 1.
Análisis de resultados. En el espectro 1H-RMN del amino-conjugado (D2O) ilustrado en Figura 1 están presentes las señales relativas a los protones del anillo de imidazol a 8.62 y 7.30 ppm, mientras que los protones anoméricos y los del grupo metino del residuo de histidina se superponen entre 4.60 y 4.45 ppm. Otras señales que pertenecen a los protones de la cadena de polisacáridos caen en la región entre 3.3 y 4.0 ppm. Además de las señales a 3.8 y 3.9 ppm, correspondientes a los protones diastereotópicos del grupo metileno en la posición 6 del residuo de acetilglucosamina no derivatizada, el espectro muestra señales a 2.78 y 3.15 asignables a los análogos de metileno (en la posición 6 del residuo de acetilglucosamina) que ahora están involucrados en la formación del puente de amina del conjugado. Este cambio a campos superiores confirma la formación del enlace covalente entre el grupo amino de carnosina y el átomo de carbono en la posición 6 del residuo de acetilglucosamina del ácido hialurónico. Las señales de los protones diastereotópicos en a en el grupo amino de los residuos de p-alanina se superponen con las de los grupos metileno en la posición 6 de los residuos de glucosamina, mientras que los protones de los grupos metileno en a en el grupo carbonilo de los residuos de p-alanina producen una señal a 2.75 ppm. La cantidad de carnosina conjugada con ácido hialurónico se calculó en base a la proporción entre el área del pico correspondiente a los protones del anillo de imidazol y el área del pico correspondiente a los protones de los grupos metilo de las unidades de acetilglucosamina. El grado de derivatización resultó ser del 10 %.
Ejemplo 2. Preparación de complejos de cobre de ácido hialurónico y conjugado de HA-carnosina.
Diseño de prueba. En un procedimiento típico para la preparación de complejos de cobre, los liofilizados de HA y del conjugado de HA-carnosina, preparados como se describe en el Ejemplo 1, se disolvieron a la concentración de 10 mg/mL en agua ultrapura Millipore (resistividad 18.2 MQcm a 25 ° C, valores de TOC por debajo de 5 ppb). Para asegurar la completa solubilización del polímero, las muestras se mantienen bajo agitación durante 2 horas a temperatura ambiente (23 ° C). A continuación, se ajusta el pH a 7.4 y se añade sulfato de cobre (CuSO4) para obtener las siguientes concentraciones finales en iones de cobre: 1.36 10-3 M, 2.72-10'3 M y 5.44-10'3 M, correspondiente a [Cu(II)]: [carnosina] proporciones molares en el conjugado de 1:2, 1:1 y 2:1 respectivamente. Finalmente, se comprueba de nuevo el pH y se corrige si es necesario al valor de 7.4.
Ejemplo 3. Hidrólisis enzimática por hialuronidasa testicular ovina.
Diseño de prueba. La estabilidad de los complejos de cobre Cu(II) del conjugado (1) frente a la hialuronidasa testicular ovina (HyAse) se evaluó mediante un ensayo de hidrólisis enzimática. Se utilizó regulador de fosfato (23 mM, con adición de NaCl 150 mM) a pH = 6.4 para solubilizar la enzima (concentración de HyAse = 70 mg/ml) y para disolver ácido hialurónico de 200 kDa, utilizado como control, y conjugado (1), preparado como se describe en el Ejemplo 1 (concentración de ácido hialurónico, solo o conjugado con carnosina, para un total de 2 mg/ml; concentración de carnosina en el conjugado para un total de 5.44-10'4 M). Para preparar los complejos de Cu(II), sulfato de cobre CuSO4, a la concentración [Cu(II)] = [carnosina] = 5.44-10'4 M, se añadió a soluciones de ácido hialurónico y conjugado (1) en regulador de fosfato, utilizando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 2. Se añadieron 25 pl de HyASE a 250 pl de cada muestra para dar 4000 UI de enzima en el medio de reacción. Después de la incubación a 37 ° C durante 4 horas bajo agitación (300 rpm en Eppendorf ThermoMixer), la reacción enzimática se interrumpió agregando tetraborato de potasio (50 pl de una solución 2.8 M preparada en KOH 1.39 M) seguido de un choque térmico (5 minutos a 100 ° C, luego 2 minutos a 0 ° C). El análisis espectrofotométrico de los oligosacáridos producidos tras la digestión enzimática con HyAse de los complejos de Cu(II) del conjugado (1) o ácido hialurónico libre se realizó mediante determinación colorimétrica, de acuerdo con el procedimiento descrito por Schanté y colaboradores (Schanté et al., Carbohydrate Polymers, 2011, 85:469-89), que utiliza la reacción de Morgan-Elson. El producto púrpura obtenido de la reacción se analizó por espectroscopia UV-vis, midiendo el pico de absorción a la longitud de onda de 586 nm. Todos los reactivos utilizados se obtuvieron de Sigma Aldrich. Inmediatamente antes del inicio de la reacción de Morgan-Elson, se añadieron750 pl de una solución de dimetilaminobenzaldehído (DMAB, preparada disolviendo 200 mg del producto en 250 pl de HCl y 4.75 ml de CH3COOH) a la solución resultante. Después de 60 minutos de incubación a la temperatura de 37 ° C en un Thermomixer (300 rpm), los espectros UV-vis se registraron con un espectrofotómetro Beckman DU 650 o Lambda2S (Perkin Elmer, e E. UU.). La reacción de Morgan-Elson produce un producto púrpura que exhibe un pico de absorción a 586 nm, indicativo de la degradación del ácido hialurónico por la enzima HyAse. Todas las medidas se realizaron a 25 ± 0.2 ° C utilizando cubetas con un camino óptico de 0.5 cm.
Análisis de resultados. Los espectros registrados se muestran en la Figura 2, donde se puede notar que el espectro correspondiente al producto degradado derivado del complejo de Cu(II) de conjugado (1) muestra una intensidad menor que el espectro correspondiente al complejo Cu(II) de HA en todas las longitudes de onda A consideradas, en particular en el intervalo que incluye el pico de absorción del producto púrpura encontrado, que va de 550 a 600 nm. Como la ley de Beer-Lambert establece que la absorbancia detectada a una determinada longitud de onda Aa, y la concentración c de la especie química cuyo espectro se registra, son directamente proporcionales entre sí, se puede concluir que el nivel de degradación encontrado para A entre 550 y 600 nm del complejo de Cu(II) del conjugado (1) es aproximadamente un 35 % más bajo que el del complejo de Cu(II) de HA, después de la exposición a la enzima hialuronidasa. Por lo tanto, este hallazgo demuestra que el conjugado (1) se degrada aproximadamente 35 % en menos de HA no conjugado en presencia de hialuronidasa.
Ejemplo 4. Efectos del conjugado (1) sobre la viabilidad celular.
Diseño de prueba. Se determinó la respuesta celular del conjugado (1) en términos de viabilidad celular in vitro realizando el ensayo MTT (Mosmann T, J Immunol Methods 1983; 65:55-63) en la línea celular HFF1 (que consta de fibroblastos derivados de la piel humana). Las células se sembraron en placas 20-23, se cultivaron a 37 ° C y 5 % de CO2 en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con glucosa integrada y añadido con FBS (1 %). Para realizar el ensayo MTT, las células se sembraron en placas de múltiples pozos de 96 pozos (7000 células por pozo) en medio de cultivo DMEM con glucosa integrada y se les añadió FBS al 1 %; después de 48 horas se trataron con medio de control, o con medio que contenía alternativamente carnosina, conjugado (1) preparados como se describe en el Ejemplo 1, o complejos de conjugado (1) con Cu(II), durante 5 horas de incubación a 37 ° C y CO2 al 5 %. Cada tratamiento se realizó por triplicado. Para preparar los complejos de Cu(II) probados en este experimento, se utilizó sulfato de cobre CuSO4 a la concentración de [Cu(II)] = [carnosina] = 5.44-10'5 M, correspondiente a una concentración de ácido hialurónico en el conjugado (1) de 0.2 mg/ml. Transcurrido el tiempo de incubación, cada uno de los pozos que contenían las células se trató con 100 pL de reactivo de bromuro de 3-2,5-difeniltetrazolio (5 mg/ml en DMEM) durante 90 minutos. Después de retirar el líquido de cada pozo y agregar DMSO (100 pl), la absorbancia de la sal de formazán (azul) producida por la reacción de escisión del anillo de tetrazolio de MTT (amarillo) por la enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa presente en las células viables se midió en un lector multiplaca (Synergy™ 2 Lector de microplacas multimodo) a la longitud de onda de 570 nm. Los resultados se exponen en Figura 3.
Análisis de resultados. Como se muestra en el gráfico de Figura 3, el análisis MTT demuestra que el conjugado (1) da lugar a un aumento de la viabilidad celular. Dicho aumento de viabilidad respecto al control es significativo y de considerable magnitud, siendo algo superior al 25 % en el caso del conjugado (1) y sus complejos con Cu(II), demostrando así la sinergia entre el ácido hialurónico y la carnosina. Por el contrario, el tratamiento de las mismas células con carnosina sola no condujo a ningún aumento de la viabilidad celular.
Breve descripción de las figuras.
Figura 1: Espectro de 1H RMN del conjugado de HA-carnosina (1), en D2O, en donde son exhibidas tanto las señales que caracterizan el conjugado (■, □, o) como las señales utilizadas para calcular el porcentaje de carga de carnosina (o, •, *).
Figura 2: Estabilidad a la hialuronidasa de los complejos de Cu(II) de conjugado (1) (en rojo, símbolo: cuadrado) y HA no conjugado (en azul, símbolo: círculo) evaluados por la reacción de Morgan-Elson de dimetilaminobenzaldehído (DMAB) con los productos de degradación enzimática de oligosacáridos, que produce un producto púrpura que exhibe un pico de absorción a una longitud de onda de 586 nm. La absorción del reactivo DMAB solo se muestra en el gráfico (en negro, símbolo: diamante) como control del experimento.
Figura 3: Viabilidad celular medida por el ensayo MTT (medida espectrofotométrica de la absorbancia, a la longitud de onda de 570 nm, de la solución de formazán formada al hacer reaccionar bromuro de 3-2,5-difeniltetrazolio con la enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa, que juega un papel clave en el metabolismo celular) en células HFF1 incubadas durante 5 horas con medio de control (CTRL) o medio que contiene alternativamente carnosina (0.136 mM, es decir, 1.36-10'4 M), conjugado (1) (a la concentración de 0.2 mg/mL, o sus complejos de Cu(II) a la proporción [carnosina]:[Cu] = 1:1). Los valores mostrados son la media ± S.E.M. de cada experimento, realizado por triplicado. Significación estadística calculada con la prueba ANOVA de una vía (** = p < 0.01, vs CTRL).

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Conjugado de fórmula (1),
Figure imgf000008_0001
de dipéptido de carnosina con ácido hialurónico mediante la formación de un enlace amina entre el grupo amino libre de carnosina y el átomo de carbono en la posición 6 del residuo de acetilglucosamina de ácido hialurónico.
2. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ácido hialurónico tiene un peso molecular promedio en peso que oscila entre 1x104 y 3*10® Da, preferiblemente entre 1*105 Da y 1*10® Da, y lo más preferiblemente en el intervalo de 130-230 kDa o en el intervalo de 500-750 kDa y mezclas de los mismos.
3. Conjugado de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, en donde el grado de derivatización del ácido hialurónico, mediante la formación del enlace amina con carnosina, oscila entre 0.1 a 80 %, preferentemente entre 5 a 60 %, más preferentemente entre 10 y 30 %, y lo más preferiblemente del 10 al 15 %.
4. Conjugado de acuerdo con una o más de las reivindicaciones anteriores, en donde el conjugado de fórmula (1) está en forma de un complejo de Cu(II).
5. Composiciones farmacéuticas, cosméticas o nutracéuticas, que comprenden el conjugado de fórmula (1) de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 como ingrediente activo.
6. Composiciones de acuerdo con la reivindicación 5, en forma de soluciones, ungüentos, polvo, gel o gotas oftálmicas.
7. Composiciones de acuerdo con la reivindicación 5, para aplicación tópica, oftálmica, oral, intraarticular, parenteral o quirúrgica.
8. Composiciones de acuerdo con la reivindicación 5, utilizadas para impregnar o depositar sobre gasas, vendas, apósitos adhesivos, emplastos o estructuras tridimensionales o armazones.
9. Composiciones de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, para uso en el tratamiento y/o prevención de trastornos caracterizado por daño oxidativo, como cáncer, trastornos cardíacos y neurológicos, trastornos oftálmicos, complicaciones de diabetes como retinopatía diabética y lesiones de órganos internos como úlceras gástricas.
10. Composiciones de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, para uso en el tratamiento de heridas crónicas, úlceras, cortes, quemaduras o abrasiones.
11. Composiciones de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, para uso en la prevención y tratamiento de osteoartritis (OA) y en el tratamiento de artritis reumatoide (RA).
ES21177893T 2020-06-11 2021-06-07 Nuevos derivados obtenidos de ácido hialurónico y carnosina Active ES2940343T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT102020000014017A IT202000014017A1 (it) 2020-06-11 2020-06-11 Nuovi derivati ottenuti da acido ialuronico e carnosina

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2940343T3 true ES2940343T3 (es) 2023-05-05

Family

ID=72644563

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES21177893T Active ES2940343T3 (es) 2020-06-11 2021-06-07 Nuevos derivados obtenidos de ácido hialurónico y carnosina

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP3922268B1 (es)
ES (1) ES2940343T3 (es)
IT (1) IT202000014017A1 (es)

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0138572B1 (en) 1983-10-11 1990-07-25 FIDIA S.p.A. Hyaluronic acid fractions having pharmaceutical activity, methods for preparation thereof, and pharmaceutical compositions containing the same
IT1263393B (it) 1993-07-30 1996-08-05 Fidia Advanced Biopolymers Srl Processo per la preparazione e purificazione di acido ialuronico ad alto peso molecolare
IT1270905B (it) 1993-10-15 1997-05-13 Bruschettini Srl Composizioni farmaceutiche contenenti n-acetilcarnosina per il trattamento della cataratta
IT1318640B1 (it) 2000-07-25 2003-08-27 Univ Catania Derivati di carnosina, procedimento per la loro preparazione ecomposizioni farmaceutiche che li contengono.
ITMI20060690A1 (it) 2006-04-07 2007-10-08 Univ Catania Coniugato di trealpsio con carnlsina ad attivita'antiossidante stabile all'idrolisi enzimatica procedimenti per la sua preparazione e composizioni farmaceutiche cosmetiche e nutraceutiche che lo contengono
IT1402385B1 (it) 2010-09-09 2013-09-04 Fidia Farmaceutici Processo per la produzione di acido ialuronico in escherichia coli o bacillus subtilis
IT1402384B1 (it) 2010-09-09 2013-09-04 Fidia Farmaceutici Processo per la produzione di acido ialuronico in escherichia coli o bacillus megaterium
IT1407283B1 (it) 2010-12-06 2014-04-04 Paoli Ambrosi De Nuovo composto di carnosina
CN106573957B (zh) 2014-07-31 2021-10-26 塞巴斯蒂安诺·舒托 由透明质酸和肌肽得到的衍生物
IT201600079633A1 (it) 2016-07-28 2018-01-28 Fidia Farm Spa Procedimento di preparazione e purificazione del sale sodico dell’acido ialuronico
CZ2016826A3 (cs) * 2016-12-22 2018-07-04 Contipro A.S. Léčivý prostředek s nosičem na bázi hyaluronanu a/nebo jeho derivátů, způsob výroby a použití
IT201700081449A1 (it) 2017-07-18 2019-01-18 Fidia Farm Spa Procedimento di purificazione dell'acido ialuronico
IT201700110784A1 (it) 2017-10-03 2019-04-03 Fidia Farm Spa Composizioni farmaceutiche contenenti Acido Ialuronico e Carnosina e relativo uso

Also Published As

Publication number Publication date
EP3922268B1 (en) 2023-02-22
IT202000014017A1 (it) 2021-12-11
EP3922268A1 (en) 2021-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Li et al. Bioactive polysaccharides from natural resources including Chinese medicinal herbs on tissue repair
US7651702B2 (en) Crosslinking hyaluronan and chitosanic polymers
Jeong et al. Cisplatin‐incorporated hyaluronic acid nanoparticles based on ion‐complex formation
Dong et al. Pharmacokinetics and biodegradation mechanisms of a versatile carboxymethyl derivative of chitosan in rats: in vivo and in vitro evaluation
US20080031854A1 (en) Thiolated macromolecules and methods of making and using thereof
Serban et al. Synthesis, characterization and chondroprotective properties of a hyaluronan thioethyl ether derivative
CA2951808C (en) Derivatives obtained from hyaluronic acid and carnosine
JP2002527408A (ja) ドラッグデリバリー用ヒドロゲル及び水溶性ポリマーキャリアー
Picotti et al. Hyaluronic acid lipoate: synthesis and physicochemical properties
AU2007280846B2 (en) Branched hyaluronic acid and method of manufacture
ES2248322T3 (es) Esteres polisacaridos de derivados n- del acido glutamico.
Nakagawa et al. A biocompatible calcium salt of hyaluronic acid grafted with polyacrylic acid
ES2371232T3 (es) Glicosaminoglicanos derivados del polisacárido k5 que tienen alta actividad antitrombina y procedimiento para su preparación.
KR20100092494A (ko) 산성 다당체의 부티르산-포름산 에스테르 혼합물, 및 그의 제조 및 피부 화장료로서의 용도
JP2000502141A (ja) 低い多分散指数を有するヒアルロン酸分画の調製方法
US20160067275A1 (en) Co-crosslinked phosphated native and/or functionalized polysaccharide-based hydogel
Montanari et al. Halting hyaluronidase activity with hyaluronan-based nanohydrogels: Development of versatile injectable formulations
ES2940343T3 (es) Nuevos derivados obtenidos de ácido hialurónico y carnosina
Hassan et al. Nitric oxide products degrade chondroitin sulfates
WO2019002369A1 (en) GLYCOSAMINOGLYCAN HYDROGEL WITH DEXTRANE OR GRAFT CYCLODEXTRIN
Pitarresi et al. Injectable in situ forming microgels of hyaluronic acid-g-polylactic acid for methylprednisolone release
Rafigh et al. Sulfated xanthan: Synthesis, characterization and biological evaluation
Sun et al. Sulfated polysaccharide heparin used as carrier to load hydrophobic lappaconitine
RU2642612C2 (ru) Комплексы на основе хондроитина для чрескожного всасывания
EP3142749B1 (en) Viscosupplement composition comprising ulvan for treating arthritis