CN114166812B - 一种羧基荧光微球表面活化方法及其应用 - Google Patents

一种羧基荧光微球表面活化方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种羧基荧光微球表面活化方法及其应用，表面活化方法包括如下步骤：S1：将羧基荧光微球置于MES缓冲液中超声分散；S2：分别配制含有DMTMM的微球活化缓冲液Ⅰ和含有PDH的微球活化缓冲液Ⅱ；S3：将步骤S2制备得到的微球活化缓冲液Ⅰ和微球活化缓冲液Ⅱ按照DMTMM和PDH质量比为1:（2‑4）的比例加入到步骤S1得到的羧基荧光微球中避光旋转活化1‑24h即得到表面活化的羧基荧光微球溶液。本发明将DMTMM和PDH组合使用用于活化羧基荧光微球，活化后的羧基荧光微球能够与抗原高效偶联，克服了现有技术中的一步法和两步法标记抗原偶联效果较差的缺点。

Description

一种羧基荧光微球表面活化方法及其应用
技术领域
本发明属于生化检测试剂领域，尤其是涉及一种羧基荧光微球表面活化方法及其应用。
背景技术
对某些抗原或特异性蛋白进行检测时，通常会应用到免疫标记技术。免疫层析技术作为POCT(Point of care testing，即时检测)的重要分支始于20世纪80年代，以胶体金标记作为代表大量应用于各种体外诊断场景，但是与酶联免疫/化学发光这些方法学比较其也有相应的短板，主要表现在精密度差，灵敏度不足；因此在二十世纪初各厂家为改善层析产品性能将胶体金更换为荧光物质，性能大幅提升。早期层析使用荧光素，后来逐渐转变为荧光微球，因为荧光微球含有更多的荧光物质，可有效放大荧光信号，提高检测灵敏度。荧光免疫层析技术中涉及用到微球标记抗原和抗体。微球标记抗原或抗体的方法主要是吸附法和共价偶联法，目的是将待测物质相对应的抗体或抗原包被在微球上，通过待测物质与包被了相应抗原抗体的微球反应后的特性进行检测提高试验的敏感性。共价偶联法中常用的微球表面偶联有功能基团-羧基。
目前羧基微球偶联氨基的通用方法有两种：一是以碳二亚胺（EDC）为交联剂的一步法，二是以碳二亚胺（EDC）与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）为交联剂的两步法。一步法的原理是首先与羧基反应形成中间产物，中间产物与氨基反应，然后脱去中间产物，实现羧基与氨基的偶联。两步法的原理是首先与羧基反应，然后与NHS反应形成中间产物，中间产物与氨基反应，然后脱去中间产物，实现羧基与氨基的偶联。
多糖是一类广泛存在于多种生物体内的高分子物质。而细菌和真菌的荚膜和细胞壁本质上是由特定重复单位的多糖结构组成的。无论是一步法还是两步法，都是中间产物与氨基进行反应，但是大部分真菌和细菌类抗原主要由多糖类物质组成，含有多糖分子，因此采用上述通用方法时，抗原标记效果较差，因此亟待需要找到一种适用于标记多糖类抗原的方法。
发明内容
有鉴于此本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种羧基荧光微球表面活化方法及其应用。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种羧基荧光微球表面活化方法，包括如下步骤：
S1：将羧基荧光微球置于MES缓冲液中超声分散；
S2：分别配制含有4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐（DMTMM）的微球活化缓冲液Ⅰ和含有庚二酸二酰肼（PDH）的微球活化缓冲液Ⅱ；
S3：将步骤S2制备得到的微球活化缓冲液Ⅰ和微球活化缓冲液Ⅱ按照DMTMM和PDH质量比为1:（2-4）的比例加入到步骤S1得到的羧基荧光微球中避光旋转活化1-24h即得到表面活化的羧基荧光微球溶液。
优选的，所述步骤S1的羧基荧光微球与MES缓冲液的体积比（V/V）为1：（1-20），更优选1：（4-10）。
优选的，所述步骤S3中微球活化缓冲液Ⅰ和微球活化缓冲液Ⅱ按照DMTMM和PDH质量比为1:2的比例加入到步骤S1得到的羧基荧光微球中。
优选的，所述羧基荧光微球与微球活化缓冲液Ⅰ和微球活化缓冲液Ⅱ总量的体积比（V/V）为1：（0.01-5），更优选1：（0.05-1）。
优选的，所述微球活化缓冲液Ⅰ中DMTMM的浓度为10-500 mg/mL；更优选为50-200mg/mL。
优选的，所述微球活化缓冲液Ⅱ中PDH的浓度为10-500 mg/mL；更优选为50-200mg/mL。
优选的，所述羧基荧光微球的粒径范围为100-300nm，更优选为100-200nm。
优选的，所述MES缓冲液的浓度为10-200mM，pH值为4.5-9.0，更优选的，所述MES缓冲液的浓度为50mM，pH值为6.0。
第二方面，本发明还提供一种由上述方法得到的表面活化的羧基荧光微球。
第三方面，本发明还提供了一种应用上述表面活化的羧基荧光微球标记多糖类抗原的方法，所述方法包括如下步骤：
a、向表面活化的羧基荧光微球溶液中添加浓度为5-30μg/mL的抗原溶液进行标记，避光反应1-24h；
b、加入含有1-10%（w/v）BSA的封闭液避光旋转混匀，封闭时间为1-24 h；
c、用磷酸盐缓冲液洗去未参与反应的抗原，反复清洗2-5遍；
d、将微球标记物保存在微球复溶液中即得到羧基荧光微球标记的多糖类抗原。
优选的，所述步骤b中封闭液为含1-10%（w/v）BSA的50mM MES缓冲液，pH值为6.0。
更优选的，所述步骤b中封闭液中含有10%（w/v）BSA，封闭时间为1-2h。
第四方面，本发明还提供了上述方法得到的羧基荧光微球标记的多糖类抗原。
第五方面，本发明还提供了包含上述羧基荧光微球标记的多糖类抗原的荧光免疫层析试纸条。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
（1）本发明将DMTMM和PDH组合使用用于活化羧基荧光微球，活化后的羧基荧光微球能够与多糖类抗原高效偶联，克服了现有技术一步法和两步法标记抗原偶联效果差的缺点。
（2）本发明的多糖类抗原标记方法反应条件温和，采用MES缓冲液即可完成整个标记过程。
（3）本发明提供的荧光免疫层析试纸条，采用间接法检测抗体，具有较好的敏感性、特异性和稳定性。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明创造。
实施例1：羧基荧光微球的活化效果比较
1、羧基荧光微球标记多糖抗原
（1）微球超声分散：取13个1.5mL EP管，分别加入100μL羧基荧光微球（1%固含量，下简称微球），分别补加400μL的50mM MES缓冲液，移液器吹吸混匀，再用超声破碎机超声分散。
（2）如下表1所示分别配制4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐（DMTMM）、庚二酸二酰肼（PDH）、己二酸二酰肼（ADH）三种活化溶液，这些溶液皆为现配现用。
（3）微球活化：微球溶液一边振荡一边逐滴加入如下表1所示的不同活化溶液。锡箔纸包裹避光，室温旋转仪40r/min活化1h。
（4）微球洗涤：10℃ 18000g离心20min，弃上清，微球沉淀分别加入500μL的MES缓冲液，移液器吹吸混匀，再用超声破碎机超声分散。
（5）微球标记：向每管微球溶液中分别加入如下表2所示抗原，加入抗原浓度如下表所示，加入抗原后混匀。室温旋转仪40r/min避光过夜反应（约16h）。
（6）微球封闭：每管微球加入55μL封闭液，室温旋转仪40r/min避光反应2h。
（7）微球洗涤：18000g 10℃离心20min，弃上清，微球沉淀加入1mL PBST缓冲液，移液器吹吸混匀。再重复两遍上述洗涤操作。
（8）微球保存：沉淀用200μL微球复溶液复溶，再用超声破碎机超声分散，然后置于4℃冰箱避光保存。
表1 羧基荧光微球活化方案
Figure 978298DEST_PATH_IMAGE001
表2 羧基荧光微球标记抗原名称及标记浓度
Figure 364280DEST_PATH_IMAGE002
2、微球标记后效果验证
（1）白色念珠菌甘露聚糖-羧基荧光微球
1）羧基荧光微球标记后，将鸡IgY-微球和白色念珠菌甘露聚糖-微球按1:1混合，混合后使用复溶液稀释50倍，喷涂荧光垫。T线用2 mg/mL羊抗人IgG抗体划线，待干燥后，组装，切条。将人源化白色念株菌甘露聚糖IgG抗体用样本稀释液按4000倍稀释后进行检测。比较荧光值，荧光值越高，表明微球标记效果越好。
2）羧基荧光微球标记后，将鸡IgY-微球和白色念珠菌甘露聚糖-微球按1:1混合，混合后使用复溶液稀释50倍，喷涂荧光垫。T线用2 mg/mL羊抗人IgG抗体划线，待干燥后，组装，切条。检测部分企业内部参考品，37℃放置10天，检测部分企业内部参考品。筛选阳性样本（P1、P4、P7、P9、L2、L3）加速前后浓度值的平均相对偏差（相对偏差=|加速前浓度值-加速后浓度值|÷加速前浓度值）较小且阴阳性参考品符合率较高的微球活化方案。
（2）曲霉半乳甘露聚糖-羧基荧光微球
1）羧基荧光微球标记后，将鸡IgY-微球和曲霉半乳甘露聚糖-微球按1:1混合，混合后使用复溶液稀释50倍，喷涂荧光垫。T线用2 mg/mL羊抗人IgG抗体划线，待干燥后，组装，切条。将人源化曲霉半乳甘露聚糖IgG抗体用样本稀释液按4000倍稀释后进行检测。比较荧光值，荧光值越高，表明微球标记效果越好。
2）羧基荧光微球标记后，将鸡IgY-微球和曲霉半乳甘露聚糖-微球按1:1混合，混合后使用复溶液稀释50倍，喷涂荧光垫。T线用2 mg/mL羊抗人IgG抗体划线，待干燥后，组装，切条。检测部分企业内部参考品，37℃放置10天，检测部分企业内部参考品。筛选阳性样本（P1、P4、P7、P9、L2、L3）加速前后浓度值的平均相对偏差（相对偏差=|加速前浓度值-加速后浓度值|÷加速前浓度值）较小且阴阳性参考品符合率较高的微球活化方案。
（3）隐球菌荚膜多糖-羧基荧光微球
羧基荧光微球标记后，将鸡IgY-微球和隐球菌荚膜多糖-微球按1:1混合，混合后使用复溶液稀释50倍，喷涂荧光垫。T线用2 mg/mL羊抗鼠IgG抗体划线，待干燥后，组装，切条。将隐球菌荚膜多糖抗体（鼠源）用0.1M PBS按2000倍稀释后进行检测。比较荧光值，荧光值越高，表明微球标记效果越好。
（4）1,3-β-D-葡聚糖-羧基荧光微球
羧基荧光微球标记后，将鸡IgY-微球和1,3-β-D-葡聚糖-微球按1:1混合，混合后使用复溶液稀释50倍，喷涂荧光垫。T线用2 mg/mL羊抗兔IgG抗体划线，待干燥后，组装，切条。将1,3-β-D-葡聚糖抗体（兔源）用0.1M PBS按2000倍稀释后进行检测。比较荧光值，荧光值越高，表明微球标记效果越好。
（5）光滑念珠菌甘露聚糖-羧基荧光微球
羧基荧光微球标记后，将鸡IgY-微球和光滑念珠菌甘露聚糖-微球按1:1混合，混合后使用复溶液稀释50倍，喷涂荧光垫。T线用2 mg/mL羊抗兔IgG抗体划线，待干燥后，组装，切条。将光滑念株菌甘露聚糖抗体（兔源）用0.1M PBS按2000倍稀释后进行检测。比较荧光值，荧光值越高，表明微球标记效果越好。
实施例2 制备念珠菌甘露聚糖IgG抗体检测试剂盒（荧光免疫层析法）
该试剂盒包括以下组分和制备方法：
1、微球标记抗原抗体：
微球标记念珠菌甘露聚糖：标记量为：8 μg/mL，标记反应时间3 h，封闭反应时间16 h。
微球标记鸡IgY抗体：采用NHS+EDC常规方法标记，标记量：5 μg/mL，标记反应时间3 h，封闭反应时间16 h。
2、荧光垫制备：鸡IgY-微球和念珠菌甘露聚糖-微球1:1混合。混合后使用复溶液稀释50倍。微球工作液喷涂量：8 μL/cm。干燥方式：30～37℃烘干1-4 h。
3、检测线包被：包被稀释液为pH 7.4的0.1M PB溶液，包被浓度为2 mg/mL羊抗人IgG抗体。
4、质控线包被：包被稀释液为pH 7.4的0.1M PB溶液，包被浓度为2 mg/mL羊抗鸡IgY抗体。
5、NC膜干燥工艺：干燥方式为30-37℃烘干1-4 h。
6、样品垫
样品垫处理液组分：0.1M Tris、1%BSA、0.5%PVP K-30，pH8.5。
样品垫干燥参数：30-37 ℃烘干1-4 h。
7、反应体系
样本稀释液液配方：含1%酪蛋白钠、0.05%Tween-20、0.05%Proclin 300的0.1M PB的缓冲液。
样本稀释倍数：200倍；
加样量：90~100 μL；
试剂读数时间为15～20 min；
试剂反应条件为10～40℃的室温条件，湿度<80%。
本实施例念珠菌甘露聚糖IgG抗体检测试剂盒（荧光免疫层析法）的制备方法中，除以下试剂外，其余均按照常规方法制备。
1）配制复溶液
称取Tris 2.42g、蔗糖100.00g、海藻糖50.00g、BSA 10.00g放入烧杯中，加入800mL工艺用水，使用磁力搅拌器搅拌溶解后，加入0.1M HCl调节pH至8.5，充分混匀后，定容至1000mL，即得复溶液。
2）配制样品垫处理液
称取Tris 12.11g、BSA 10g、PVP K-30 5g放入烧杯中，加入800mL工艺用水，使用磁力搅拌器搅拌溶解后，加入0.1M HCl调节pH至8.5，充分混匀后，加入工艺用水定容至1000mL，即得样品垫处理液。
3）配制样本稀释液
称取10g酪蛋白钠，量取500μL Tween-20，500μL Proclin 300，加入800mL 0.1MPB，使用磁力搅拌器搅拌溶解后，加入0.1M PB定容至1000mL，即得样本稀释液。
4）0.01M PBS缓冲液配制
称取氯化钠8.00 g，氯化钾0.20 g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，加入800mL 工艺用水，充分混匀后，定容至1000mL即可。
5）PBST缓冲液配制
量取800mL 0.01M PBS，加入500μL Tween 20，充分混匀后，定容至1000mL，即得PBST缓冲液。
6）鸡IgY抗体微球标记方法
a. 微球超声分散：取1mg微球，加入50mM MES缓冲液，超声分散。
b. 微球活化：微球溶液一边振荡一边逐滴加入30μL 10mg/mL EDC溶液、30μL10mg/mL NHS溶液，锡箔纸包裹避光，室温旋转仪40r/min活化20min。
c. 微球洗涤：10℃ 18000g离心20min，弃上清，微球沉淀加入1000μL 25mM HEPES缓冲液，移液器吹吸混匀，再用超声破碎机超声分散。
d. 微球标记：添加鸡IgY抗体溶液进行标记，标记浓度为5μg/mL，要求避光过夜反应。
e. 微球封闭：微球中加入封闭液，锡箔纸包裹避光，室温旋转封闭2h。
f. 微球洗涤：用25mM HEPES缓冲液洗去未参与反应的鸡IgY抗体，共清洗2遍。
g. 标记物保存：将微球标记物保存在微球复溶液中。
实施例3 制备曲霉半乳甘露聚糖IgG抗体检测试剂盒（荧光免疫层析法）
该试剂盒包括以下组分和制备方法：
1、微球标记抗原抗体
微球标记曲霉半乳甘露聚糖：标记量为：15μg/mL，标记反应时间3 h，封闭反应时间16 h。
微球标记鸡IgY抗体：采用NHS+EDC常规方法标记，标记量：5 μg/mL，标记反应时间3 h，封闭反应时间16 h。
2、荧光垫制备
鸡IgY抗体-微球复合物和曲霉半乳甘露聚糖-微球复合物按照1:1等体积混合，用复溶液将微球复合物50倍稀释。微球工作液喷涂量：8 μL/cm。干燥方式：30～37℃烘干1-4h。
3、检测线包被
包被稀释液为pH 7.4的0.1M PB溶液，包被浓度为2 mg/mL羊抗人IgG抗体。
4、质控线包被
包被稀释液为pH 7.4的0.1M PB溶液，包被浓度为2 mg/mL羊抗鸡IgY抗体。
5、NC膜干燥工艺
干燥方式为30-37℃烘干1-4 h。
6、样品垫
样品垫处理液组分：0.1M Tris、1%BSA、0.5%PVP K-30，pH8.5。
样品垫干燥参数：30-37 ℃烘干1-4 h。
7、反应体系
样本稀释液液配方：含1%BSA、0.05%Tween-20、0.05%Proclin300的0.1M PB的缓冲液。
样本稀释倍数：200倍。
加样量：90~100 μL。
试剂读数时间为15～20 min；
试剂反应条件为10～40℃的室温条件，湿度<80%。
本实施例试剂盒的制备方法与实施例1中的基本一致，不再赘述。
检测结果如下：
1、白色念珠菌甘露聚糖-羧基荧光微球
（1）白色念珠菌甘露聚糖-羧基荧光微球标记检测结果
按照前述的方法检测荧光值，结果如下：
表3白色念珠菌甘露聚糖-羧基荧光微球标记荧光值检测结果
Figure 347280DEST_PATH_IMAGE003
从上表的数据可以看出，组合4-7的荧光值相对于组合1-3和8-13较高，其中组合5的荧光值最高。
（2）念珠菌甘露聚糖IgG抗体检测试剂盒（荧光免疫层析法）
1）念珠菌甘露聚糖IgG抗体检测试剂盒（荧光免疫层析法）抗原标记效果验证
按照上述研究资料所述的方案标记念珠菌甘露聚糖抗原后，制备念珠菌甘露聚糖IgG抗体检测试纸条，通过检测部分企业内部参考品，验证标记效果。检测结果如下表所示：
表4 不同方法标记念珠菌甘露聚糖检测结果
Figure DEST_PATH_IMAGE004
备注：浓度值＜135AU/mL为阴性，浓度值≥135AU/mL为阳性。
表5 不同方法标记念珠菌甘露聚糖检测结果（37℃放置10天）
Figure 476910DEST_PATH_IMAGE005
备注：浓度值＜135AU/mL为阴性，浓度值≥135AU/mL为阳性。
表6 不同方法标记念珠菌甘露聚糖检测结果（加速前后浓度值的变化）
Figure DEST_PATH_IMAGE006
备注：上述数据为加速前后浓度值的相对偏差，相对偏差=|加速前浓度值-加速后浓度值|÷加速前浓度值。相对偏差越小表明试纸条稳定性越好。
从上表可知，组合5加速前后浓度值的相对偏差最小，稳定性最好，且加速前后阴阳性参考品的符合率均为100%。
2）使用组合5的方案，进行念珠菌甘露聚糖IgG抗体检测试剂盒（荧光免疫层析法）性能验证，验证结果见下表。
表7 念珠菌甘露聚糖IgG抗体检测试剂盒验证结果
Figure 963386DEST_PATH_IMAGE007
备注：浓度值＜135AU/mL为阴性，浓度值≥135AU/mL为阳性。
从上述测定结果可知，按照上述研究确定生产工艺及反应体系制备的试剂，检测企业内部参考品全部合格，符合预期结果。
2、曲霉半乳甘露聚糖-羧基荧光微球
（1）曲霉半乳甘露聚糖-羧基荧光微球标记检测结果
按照前述的方法检测荧光值，结果见下表：
表8曲霉半乳甘露聚糖-羧基荧光微球标记荧光值检测结果
Figure 254690DEST_PATH_IMAGE008
从上表的数据可以看出，组合4-7的荧光值相对于组合1-3和8-13较高，其中组合5的荧光值最高。
（2）曲霉半乳甘露聚糖IgG抗体检测试剂盒（荧光免疫层析法）
1）曲霉半乳甘露聚糖IgG抗体检测试剂盒（荧光免疫层析法）抗原标记效果验证
按照上述研究资料所述的方案标记曲霉半乳甘露聚糖抗原后，制备曲霉半乳甘露聚糖IgG抗体检测试纸条，通过检测部分企业内部参考品，验证标记效果。检测结果如下表所示：
表9 不同方法标记曲霉半乳甘露聚糖检测结果
Figure 990565DEST_PATH_IMAGE009
备注：浓度值＜135AU/mL为阴性，浓度值≥135AU/mL为阳性。
表10 不同方法标记曲霉半乳甘露聚糖检测结果（37℃放置10天）
Figure 455044DEST_PATH_IMAGE010
备注：浓度值＜135AU/mL为阴性，浓度值≥135AU/mL为阳性。
表11 不同方法标记曲霉半乳甘露聚糖检测结果（加速前后浓度值的变化）
Figure DEST_PATH_IMAGE011
备注：上述数据为加速前后浓度值的相对偏差，相对偏差=|加速前浓度值-加速后浓度值|÷加速前浓度值。相对偏差越小表明试纸条稳定性越好。
从上表可知，组合5加速前后浓度值的相对偏差最小，稳定性最好，且加速前后阴阳性参考品的符合率均为100%。因此选择DMTMM和PDH质量为1：2的组合。
2）使用组合5的方案，进行曲霉半乳甘露聚糖IgG抗体检测试剂盒（荧光免疫层析法）性能验证，验证结果见下表：
表12 曲霉半乳甘露聚糖IgG抗体检测试剂盒验证结果
Figure 793097DEST_PATH_IMAGE012
从上述测定结果可知，按照上述研究确定生产工艺及反应体系制备的试剂，检测企业内部参考品全部合格，符合预期结果。
（3）隐球菌荚膜多糖-羧基荧光微球
按照前面的方法检测荧光值，结果如下：
表13隐球菌荚膜多糖-羧基荧光微球荧光值检测结果
Figure DEST_PATH_IMAGE013
从上表的数据可以看出，组合4-6的荧光值相对于组合1-3和9-13较高，其中组合5的荧光值最高。
（4）1,3-β-D-葡聚糖-羧基荧光微球
按照前面的方法检测荧光值，结果如下：
表14 1,3-β-D-葡聚糖-羧基荧光微球荧光值检测结果
Figure 520882DEST_PATH_IMAGE014
从上表的数据可以看出，组合4-6的荧光值相对于组合1-3和9-13较高，其中组合5的荧光值最高。
（5）光滑念珠菌甘露聚糖-羧基荧光微球
按照前面的方法检测荧光值，结果如下：
表15光滑念珠菌甘露聚糖-羧基荧光微球荧光值检测结果
Figure 478473DEST_PATH_IMAGE015
从上表的数据可以看出，组合5-7的荧光值相对于组合1-4和8-13较高，其中组合5的荧光值最高。
试验结论：从表1-15的数据结果可以看出DMTMM与PDH复配进行羧基荧光微球的活化，活化后的羧基荧光微球标记多糖类抗原效果优于单一组分和DMTMM与ADH复配，可见DMTMM与PDH具有协同作用，同时还可以看出，DMTMM和PDH质量比为1：2时，标记的多糖类抗原荧光值最高，且标记的多糖类抗原制得的IgG抗体检测试剂盒（荧光免疫层析法）具有较好的敏感性、特异性和稳定性。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种羧基荧光微球标记多糖类抗原的方法，其特征在于：包括羧基荧光微球活化步骤以及标记多糖类抗原步骤；
其中，羧基荧光微球活化步骤具体包括如下步骤：
S1：将羧基荧光微球置于MES缓冲液中超声分散；
S2：分别配制含有DMTMM的微球活化缓冲液Ⅰ和含有PDH的微球活化缓冲液Ⅱ；
S3：将步骤S2制备得到的微球活化缓冲液Ⅰ和微球活化缓冲液Ⅱ按照DMTMM和PDH质量比为1:（2-4）的比例加入到步骤S1得到的羧基荧光微球中避光旋转活化1-24h即得到表面活化的羧基荧光微球溶液；
标记多糖类抗原步骤具体包括如下步骤：
a、向表面活化的羧基荧光微球溶液中添加浓度为5-30μg/mL的抗原溶液进行标记，避光反应1-24h；
b、加入含有1-10%（w/v）BSA的封闭液避光旋转混匀，封闭时间为1-24 h；
c、用磷酸盐缓冲液洗去未参与反应的抗原，反复清洗2-5遍；
d、将微球标记物保存在微球复溶液中即得到羧基荧光微球标记的多糖类抗原。
2.根据权利要求1所述的羧基荧光微球标记多糖类抗原的方法，其特征在于：所述步骤S1中所述羧基荧光微球与MES缓冲液的体积比（V/V）为1：（1-20）。
3.根据权利要求1所述的羧基荧光微球标记多糖类抗原的方法，其特征在于：所述步骤S3中微球活化缓冲液Ⅰ和微球活化缓冲液Ⅱ按照DMTMM和PDH质量比为1:2的比例加入到步骤S1得到的羧基荧光微球中；所述羧基荧光微球与微球活化缓冲液Ⅰ和微球活化缓冲液Ⅱ总量的体积比（V/V）为1：（0.01-5）。
4.根据权利要求1所述的羧基荧光微球标记多糖类抗原的方法，其特征在于：所述步骤S2中所述微球活化缓冲液Ⅰ中DMTMM的浓度为10-500 mg/mL；所述微球活化缓冲液Ⅱ中PDH的浓度为10-500 mg/mL。
5.根据权利要求1所述的羧基荧光微球标记多糖类抗原的方法，其特征在于：所述羧基荧光微球的粒径范围为100-300nm。
6.根据权利要求1所述的羧基荧光微球标记多糖类抗原的方法，其特征在于：所述MES缓冲液的浓度为10-200mM，pH值为4.5-9.0。
7.根据权利要求1所述的羧基荧光微球标记多糖类抗原的方法，其特征在于：所述步骤b中封闭液为含10%（w/v）BSA的50mM MES缓冲液，pH值为6.0封闭时间为1-2h。
8.权利要求1-7任一所述的方法制备得到的羧基荧光微球标记的多糖类抗原。
9.一种包含权利要求8所述的羧基荧光微球标记的多糖类抗原的荧光免疫层析试纸条。
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