CN118010985A - 一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents
一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118010985A CN118010985A CN202410187562.5A CN202410187562A CN118010985A CN 118010985 A CN118010985 A CN 118010985A CN 202410187562 A CN202410187562 A CN 202410187562A CN 118010985 A CN118010985 A CN 118010985A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- test strip
- antibody
- mpnfm
- metal
- markers
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 31
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 title claims abstract description 31
- 239000002184 metal Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 title abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 18
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 10
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 8
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 7
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N gallic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 1-O-galloyl-3,6-(R)-HHDP-beta-D-glucose Natural products OC1C(O2)COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC1C(O)C2OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000001263 FEMA 3042 Substances 0.000 claims description 3
- LRBQNJMCXXYXIU-PPKXGCFTSA-N Penta-digallate-beta-D-glucose Natural products OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-PPKXGCFTSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 235000015523 tannic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N tannic acid Chemical compound OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N 0.000 claims description 3
- 229940033123 tannic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 229920002258 tannic acid Polymers 0.000 claims description 3
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- PFTAWBLQPZVEMU-ZFWWWQNUSA-N (+)-epicatechin Natural products C1([C@@H]2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C[C@@H]2O)=CC=C(O)C(O)=C1 PFTAWBLQPZVEMU-ZFWWWQNUSA-N 0.000 claims description 2
- PFTAWBLQPZVEMU-UKRRQHHQSA-N (-)-epicatechin Chemical compound C1([C@H]2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C[C@H]2O)=CC=C(O)C(O)=C1 PFTAWBLQPZVEMU-UKRRQHHQSA-N 0.000 claims description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 2
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 claims description 2
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 claims description 2
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 claims description 2
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- FDPIMTJIUBPUKL-UHFFFAOYSA-N dimethylacetone Natural products CCC(=O)CC FDPIMTJIUBPUKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- LPTRNLNOHUVQMS-UHFFFAOYSA-N epicatechin Natural products Cc1cc(O)cc2OC(C(O)Cc12)c1ccc(O)c(O)c1 LPTRNLNOHUVQMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000012734 epicatechin Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000004515 gallic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940074391 gallic acid Drugs 0.000 claims description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001333951 Escherichia coli O157 Species 0.000 description 3
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000000593 microemulsion method Methods 0.000 description 2
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 241001646719 Escherichia coli O157:H7 Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010020147 Protein Corona Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000011247 coating layer Substances 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002558 medical inspection Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229920001690 polydopamine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000006557 surface reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明公开了一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条及其制备方法和应用。该方法以MPNFM为标记材料，不仅标记速度快，而且蛋白偶联率高，十分有利于提高免疫层析方法的检测灵敏度。通过将样本垫、喷涂有MPNFM待测物抗体探针的玻璃纤维垫、喷涂有待测物人工偶联抗原和喷涂有抗鼠抗体或抗兔抗体作为质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸依次搭接粘贴在底板上，然后用切条机切成4 mm宽的试纸条，即可用于实际检测样品，该方法相较于传统以胶体金为标记物免疫层析检测方法的定性和定量灵敏度更高、更稳定。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验领域，具体涉及一种以金属多酚网络荧光微球MPNFM为标记物的免疫层析试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
荧光免疫层析方法是将荧光纳米材料与免疫层析技术相结合的新型快速检测方法，被广泛应用于医疗诊断、毒品检测、食品安全、环境监控等领域。荧光纳米材料的生物相容性是影响荧光免疫层析方法灵敏度的关键。目前荧光微球的制备方法主要包括微乳液法、溶胀法等，但这些合成方法制备的荧光微球的生物相容性仍不尽人意，无法实现高效的抗体偶联。
为了提高荧光微球的生物相容性，通常要对荧光微球进行表面功能化修饰，例如修饰羧基基团，便于用EDC法共价结合偶联抗体，或者是增加中间体，例如聚合物链或细胞表面蛋白（protein G），以便于实现抗体的定向偶连；然而，这种化学偶联的过程可能会导致抗体降低活性甚至失去与抗原结合的能力，且封闭时蛋白质冠的吸附可能会覆盖化学偶联的抗体靶向识别位点。
与广泛应用的化学偶联相比，抗体通过静电作用能够实现稳定和强大的覆盖，是一种更容易、更灵活和更高效的探针靶向过程。所以有研究通过在荧光微球表面增加具有强粘附性的包覆层，例如聚多巴胺，以便于直接通过静电吸附偶联抗体，但该方法额外的预处理操作繁琐复杂，稳定性不好，且对荧光有淬灭，灵敏度差。
发明内容
基于此，本发明的目的是提出一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条及其制备方法和应用，以解决传统方法制得的荧光微球生物相容性差的问题，有效提高免疫层析检测灵敏度与稳定性。
根据本发明提出的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条包括底板，以及依次搭接在底板上的样本垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；
其中，所述玻璃纤维垫上喷涂有MPNFM标记待测物抗体制备的探针，所述硝酸纤维素膜上依次设置喷涂有待测物人工偶联抗原或者抗体的检测T线和喷涂有抗鼠抗体或抗兔抗体的质控C线。
进一步地，所述MPNFM通过将金属离子与多酚水溶液混合配位后，加入至溶解在有机溶剂的荧光染料溶液中搅拌反应，再加入Tris缓冲溶液将pH调至8-10后，将混合液离心弃上清，沉淀物用超纯水清洗两边后复溶得到。
进一步地，所述探针通过向所述MPNFM中分别加入待测物抗体，混匀后室温反应0.4-0.6 h，加入封闭剂，室温反应0.8-1.2 h，离心取沉淀，复溶后得到。
进一步地，所述金属离子为Fe（III），Fe（II），Co（II），Ni（II），Cu（II），Zn（IIII），Zr（II），Mg（II），Mn （II），Ca（II）中的一种。
进一步地，所述多酚为单宁酸、没食子酸、花青素、表儿茶素中的一种。
进一步地，所述有机溶剂为四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、吡啶、1,4-二氧六环、二甲基亚砜、丙酮中的一种。
进一步地，加入所述待测物抗体后的所述待测物抗体终浓度为1-5 μg/mL，加入所述封闭剂后的所述封闭剂的终浓度为1-20%，所述封闭剂为牛血清白蛋白、酪蛋白、卵清蛋白中的任意一种。
进一步地，所述离心时转速为10000-15000 r/min，时间为15-30 min，离心后得到的沉淀采用0.01 M、pH=7.4的磷酸盐缓冲液进行复溶。
根据本发明第二方面，还提供一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条的制备方法，用于制备上述的免疫层析试纸条，所述制备方法包括：
S01、硝酸纤维素膜的制备：
（1）使用0.01 M、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液分别调节待测物人工偶联抗原和二抗（抗鼠源抗体或抗兔源抗体）至浓度为0.01-1.0 mg/mL；
（2）将调整浓度后的不同待测物人工偶联抗原喷涂于硝酸纤维素膜上部作为检测线，将抗鼠源抗体或抗兔源抗体喷涂于硝酸纤维素膜下部作为质控线；其中，检测线和质控线之间间隔一定距离，二者的喷膜量均为0.3-0.8 μL/cm；
（3）将喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜于37℃干燥4 h后，在室温干燥箱保存备用。
S02、MPNFM抗体探针玻璃纤维垫的制备；
S03、组装试纸条；
S04、裁切、装袋、干燥、封口保存。
根据本发明第三方面，还提供上述免疫层析试纸条在免疫层析检测中的应用。
综上，根据本发明提出的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条及其制备方法和应用，具有以下优点：
（1）由于荧光染料开始分散溶解于有机溶剂中，在加入水相后由于疏水作用自聚成核，金属离子与多酚在水相中配位形成3D交联的金属多酚网络，在形成的荧光染料纳米聚集体表面沉积，从而形成核壳型MPNFM；MPNFM表面的金属多酚网络具有很强的吸附作用和优异的生物相容性，显著提高了其抗体偶联效率。
（2）本发明制备的以MPNFM为标记物的免疫层析方法首次以MPNFM作标记物，相比于传统方法制备的荧光微球，MPNFM具有更高的抗体偶联效率，可提高其检测灵敏度，且生物相容性好，制备得到的以MPNFM为标记物的免疫层析方法稳定性强。目前，尚未有以MPNFM为标记物建立免疫层析方法的相关报道。
附图说明
图1为以MPNFM为标记物的免疫层析试纸条结构示意图；
图2为以MPNFM为标记物的免疫层析试纸条制备方法流程图；
图3为MPNFM透射电镜表征图；
图4为MPNFM、微乳液法荧光微球、溶胀法荧光微球的抗体偶联率对比结果；
图5为基于MPNFM (A)和AuNP (B)检测大肠杆菌O157：H7的标准曲线。
如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1MPNFM的制备
MPNFM的合成：将2 mL 0.25 mM Zr（IIII）和2 mL 1 mM单宁酸水溶液混合配位，加入至溶于四氢呋喃的荧光染料(1 mg/mL)中，加入1 mL 0.05 M的Tris缓冲溶液(pH=9)，混合搅拌反应2 h，混合液离心弃上清，沉淀物用超纯水清洗两遍后复溶于1 mL超纯水中得MPNFM。
需要说明的是，由于荧光染料开始分散溶解于有机溶剂中，在加入水相后由于疏水作用自聚成核，金属离子与多酚在水相中配位形成3D交联的金属多酚网络，在形成的荧光染料纳米聚集体表面沉积，从而形成核壳型MPNFM。MPNFM表面的金属多酚网络具有很强的吸附作用和优异的生物相容性，显著提高了其抗体偶联效率，将MPNFM作为标记物应用于构建荧光免疫层析方法中，可提高其检测灵敏度。目前，尚未有以MPNFM为标记物建立免疫层析方法的相关报道。
进一步地，MPNFM的透射电镜表征图如图3所示；由图3可知，核壳型MPNFM均一性良好，平均粒径为100 nm左右，金属多酚网络壳层厚度大约10 nm。
进一步地，MPNFM、微乳液法荧光微球、溶胀法荧光微球的抗体偶联效率对比如图4所示；由图4可知，MPNFM在10 min即可达到93.4%的抗体偶联效率，而微乳液法荧光微球、溶胀法荧光微球在240 min后的抗体偶联效率分别为81.2%和78.7%，MPNFM不仅偶联抗体时间短，抗体偶联率也更高，是一种可高效偶联抗体的荧光材料。
实施例2
请参阅图2，所述为本发明第二实施例提出的一种以MPNFM为标记物的免疫层析检测方法试纸条的制备方法流程图，该方法包括步骤S01至步骤S04，其中：
步骤S01、硝酸纤维素膜的制备：
用0.01 M、pH=7.4的PBS稀释大肠杆菌O157：H7抗体和抗鼠抗体的浓度分别为0.5mg/mL和0.2 mg/mL喷涂在硝酸纤维素膜上分别作为检测T线和质控C线，两线的喷量均为0.74 μL/cm，检测线与膜顶边间隔10 mm，两线中间间隔5 mm，37℃烘干4 h，放置于干燥柜中保存备用。
步骤S02、MPNFM抗体探针玻璃纤维垫的制备：
取0.5 mg MPNFM超声3 min，用pH=6.0的0.1 M硼酸盐缓冲液调节MPNFM浓度为0.1mg/mL，振荡混匀后，5 mL MPNFM中加入20 μg 大肠杆菌O157：H7单克隆抗体，充分混合后，4℃搅拌反应0.5 h，加入500 μL浓度为1%的酪蛋白，室温封闭1 h，12000 r/min离心15 min，沉淀用500 μL的PBS（0.01 M pH 7.4）复溶，按照3 μL/cm体积喷涂到玻璃纤维垫上，真空干燥4 h后即得。
需要说明的是，向MPNFM中加入所述待测物抗体前，先对所述MPNFM进行预处理，预处理的过程为：将所述MPNFM超声3 min，再用0.02-0.2 M、pH=5-9的硼酸盐缓冲液调节所述MPNFM的浓度至0.01-0.05 mg/mL。
步骤S03、组装试纸条：
（1）样本垫，规格为0.8×30 cm；
（2）玻璃纤维垫，规格为0.7×30 cm；
（3）喷涂有检测T线和质控C线的硝酸纤维素膜，规格为2.5×30 cm；
（4）吸水纸，规格为1.5×30 cm；
（5）PVC底板，规格为5.5×30 cm。
将以上材料按照如图1所示的试纸条结构示意图中各组分位置进行依次粘贴，组装
步骤S04、裁切、装袋、干燥、封口保存：
组装好后用切刀裁切成4×55 mm的试纸条，装入自封袋中，加入干燥剂后，封口保存，室温环境保质期为6个月。
实施例3基于MPNFM的免疫层析试纸条检测牛奶中的大肠杆菌O157：H7
采用上述以MPNFM为标记物的免疫层析试纸条检测牛奶样本中大肠杆菌O157：H7的方法，包括如下的步骤：
1.将牛奶样本用PBS（0.01 M pH 7.4）稀释10倍后作为样本液检测；
2.在试纸条加样孔中加入100 μL上述样本液，反应15 min；
3.用荧光读取仪读取试纸条T线的灰度值，根据建立的标准曲线，即可计算出样本中大肠杆菌O157：H7的含量，实现阳性样本的定量检测。
4.建立标准曲线：在阴性基质中加入标准品，大肠杆菌O157：H7浓度为：0、1×102、2.5×102、5×102、1×103、2.5×103、5×103、1×104、2.5×104、5×104、1×105、2.5×105、5×105、1×106、1×107CFU/mL，如图5所示：以MPNFM为标记物的免疫层析试纸条建立了标准曲线，线性回归方程式为：y= -1527.9ln(x)-12086（R²=0.9932），最低检测限为3.14×103CFU/mL。
以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。
Claims (10)
1.一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其特征在于，所述免疫层析试纸条包括底板，以及依次搭接在底板上的样本垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；
其中，所述玻璃纤维垫上喷涂有MPNFM标记待测物抗体制备的探针，所述硝酸纤维素膜上依次设置喷涂有待测物人工偶联抗原或者抗体的检测T线和喷涂有抗鼠抗体或抗兔抗体的质控C线。
2.根据权利要求1所述的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其特征在于，所述MPNFM通过将金属离子与多酚水溶液混合配位后，加入至溶解在有机溶剂的荧光染料溶液中搅拌反应，再加入Tris缓冲溶液将pH调至8-10后，将混合液离心弃上清，沉淀物用超纯水清洗两边后复溶得到。
3.根据权利要求1所述的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其特征在于，所述探针通过向所述MPNFM中分别加入待测物抗体，混匀后室温反应0.4-0.6h，加入封闭剂，室温反应0.8-1.2 h，离心取沉淀，复溶后得到。
4.根据权利要求2所述的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其特征在于，所述金属离子为Fe（III），Fe（II），Co（II），Ni（II），Cu（II），Zn（IIII），Zr（II），Mg（II），Mn （II），Ca（II）中的一种。
5.根据权利要求2所述的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其特征在于，所述多酚为单宁酸、没食子酸、花青素、表儿茶素中的一种。
6.根据权利要求2所述的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其特征在于，所述有机溶剂为四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、吡啶、1,4-二氧六环、二甲基亚砜、丙酮中的一种。
7.根据权利要求3所述的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其特征在于，加入所述待测物抗体后的所述待测物抗体终浓度为1-5 μg/mL，加入所述封闭剂后的所述封闭剂的终浓度为1-20%，所述封闭剂为牛血清白蛋白、酪蛋白、卵清蛋白中的任意一种。
8.根据权利要求3所述的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其特征在于，所述离心时转速为10000-15000 r/min，时间为15-30 min，离心后得到的沉淀采用0.01 M、pH=7.4的磷酸盐缓冲液进行复溶。
9.一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条的制备方法，用于制备权利要求1-8任一项所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述制备方法包括：
S01、硝酸纤维素膜的制备；
S02、MPNFM抗体探针玻璃纤维垫的制备；
S03、组装试纸条；
S04、裁切、装袋、干燥、封口保存。
10.根据权利要求1-8任一项所述的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条在免疫层析检测中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410187562.5A CN118010985A (zh) | 2024-02-20 | 2024-02-20 | 一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410187562.5A CN118010985A (zh) | 2024-02-20 | 2024-02-20 | 一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118010985A true CN118010985A (zh) | 2024-05-10 |
Family
ID=90950055
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410187562.5A Pending CN118010985A (zh) | 2024-02-20 | 2024-02-20 | 一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118010985A (zh) |
-
2024
- 2024-02-20 CN CN202410187562.5A patent/CN118010985A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109633144B (zh) | 一种以聚集诱导发光荧光微球为信标载体制备的荧光免疫层析试纸条 | |
| CN114166812B (zh) | 一种羧基荧光微球表面活化方法及其应用 | |
| CN112415193B (zh) | 基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶的快检新方法 | |
| CN111551724A (zh) | 一种荧光探针、检测四环素的方法及应用 | |
| CN112345753A (zh) | 一种以聚多巴胺包菊花金纳米粒子为信标载体制备的免疫层析试纸条 | |
| EP1020726A1 (en) | Immunologic test method and immunologic test kit | |
| CN114778819A (zh) | 一种多模式聚集诱导荧光免疫层析试纸及其制备方法 | |
| CN114989823B (zh) | 一种疏水量子点纳米材料、纳米探针及其制备方法和应用 | |
| US20160341723A1 (en) | Au nanoparticles encapsulated in nanocompoites and applications thereof in rapid detection of an analyte | |
| Shao et al. | Interface coordination achieving excellent optical properties of three-dimensional dendritic gold nanoparticles for immunochromatographic performance | |
| CN118010985A (zh) | 一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条及其制备方法和应用 | |
| CN114720437A (zh) | 基于Fe-PDAN的高效荧光淬灭试纸条及其制备方法和检测方法 | |
| JP3930970B2 (ja) | 免疫学的検査方法および免疫学的検査用キット | |
| JP2000028614A (ja) | 免疫学的検査方法および免疫学的検査キット | |
| CN114113592B (zh) | 一种基于巯基苯硼酸功能化金纳米颗粒的侧流层析试纸及其检测方法 | |
| CN115248308B (zh) | 聚左旋多巴纳米颗粒在制备免疫层析检测试纸条中的应用 | |
| CN116559426A (zh) | 一种卫星式结构PDAN-Au复合材料及其制备方法和应用 | |
| CN114636817B (zh) | 一种基于聚丙烯胺盐酸盐介导的铜生长增强检测大肠杆菌o157:h7试剂盒及检测方法 | |
| CN118206694A (zh) | 一种彩色乳胶微球及其制备方法与应用 | |
| JP3841558B2 (ja) | 免疫学的検査方法および免疫学的検査キット | |
| CN118256228A (zh) | 一种金属-多酚网络涂层修饰发光微球及其制备方法和应用 | |
| JP2000028612A (ja) | 免疫学的検査方法および免疫学的検査キット | |
| CN116840469A (zh) | 一种单次检测多种真菌毒素的免疫金标速测卡及其制备方法 | |
| JP3841555B2 (ja) | 免疫学的検査方法および免疫学的検査用キット | |
| CN118033110A (zh) | 一种抗原偶联氨基磁珠的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |