CN116559426A - 一种卫星式结构PDAN-Au复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明本发明属于食品安全检测和医学检验领域，具体涉及一种卫星式结构PDAN‑Au复合材料及其制备方法和应用。该复合材料的制备方法包括以下步骤：将PDAN与氯金酸钠于溶液体系下混合，在50℃‑70℃的条件下反应，氯金酸钠被PDAN表面的酚羟基还原生成AuNP，最终制得卫星式结构PDAN‑Au复合材料。本发明首次以特定形貌结构的卫星式结构PDAN‑Au作为标记物用于免疫层析试方法中，相比于传统标记物20‑40 nm的AuNP，卫星式结构PDAN‑Au具有更强的吸收，且生物相容性好，稳定性强，检测灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测和医学检验领域，具体涉及一种卫星式结构PDAN-Au复合材料及其制备方法和应用。
背景技术
免疫层析方法是一种结合特异性免疫反应和层析技术的快速检测方法，因其操作简便、快速、操作成本低等优点广泛应用于食品安全检测和临床诊断等领域。建立灵敏免疫层析方法的关键是选择合适的标记物，目前比色型免疫层析方法常用的标记物多为有色纳米材料，如金属纳米材料（胶体金、胶体银、硒纳米粒子和磁性纳米粒子等）和非金属纳米材料（如纳米碳黑、碳纳米管等）。其中20-40 nm的胶体金纳米颗粒（AuNP）因其独特的等离子体吸收呈现出显眼的宝石红色得到了最为广泛的应用，无需借助额外设备，可直接对检测结果进行裸眼判读，也可借助试纸条读取仪读取信号进行定性检测。
但是受限于AuNP有限的信号输出，灵敏度低是显色型免疫层析方法应用的一大痛点。所以采用信号输出能力更强的纳米材料作为标记物，是提高免疫层析方法灵敏度的一种有效的策略。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种卫星式结构PDAN-Au复合材料及其制备方法和应用，具体采用以下的技术方案：
一种卫星式结构PDAN-Au复合材料的制备方法，包括以下步骤：将聚多巴胺微球（PDAN）与氯金酸钠于溶液体系下混合，在50 ℃-70 ℃的条件下反应，氯金酸钠被PDAN表面的酚羟基还原生成AuNP，最终制得所述卫星式结构PDAN-Au复合材料。
本发明为了解决上述现有技术中的不足，发明人采用PDAN与氯金酸钠通过表面生长的方法合成特定形貌结构的卫星式结构PDAN-Au复合材料，使单个PDAN上可负载数十甚至上百个AuNP，因AuNP具有独特的表面等离子体共振效应（在525 nm左右有紫外特征吸收峰），众多AuNP阵列在PDAN表面会产生等离子体耦合增强效应。故本发明的卫星式结构PDAN-Au复合材料紫外吸收能力（即显色能力）相比于单个AuNP或者聚多巴胺包菊花金（AuNC-PDA））纳米粒子得到了大大增强，显著提高了信号输出能力；将该复合材料应用于免疫层析方法中，可提高显色型免疫层析方法的检测灵敏度。目前，尚未有以特定形貌结构的卫星式结构PDAN-Au复合材料为标记物建立免疫层析方法的相关报道。
在一些优选的实施情况中，PDAN和氯金酸钠以溶液形式混合，PDAN溶液的浓度为0.5 mg/mL，氯金酸钠溶液的质量浓度为1%，氯金酸钠溶液与PDAN溶液的体积比为（0.5-1）mL：（50-80） mL；更优选为0.5 mL：50 mL。氯金酸钠溶液过少，则PDAN上生长的AuNP的数量少，等离子体耦合增强效应不足，无法有效提高紫外吸收能力（即显色能力）；PDAN表面酚羟基有限，氯金酸钠溶液过多易造成浪费。
其中，PDAN由盐酸多巴胺于碱性条件下氧化聚合形成；具体过程如下：将盐酸多巴胺、氨水和乙醇水溶液混合反应。更优选地，盐酸多巴胺、氨水和乙醇水溶液的比例为25mg：50 μL：15 mL；乙醇水溶液的质量浓度为25%。碱性条件下（pH=8.5左右）是盐酸多巴胺氧化聚合形成PDAN的最佳条件，氨水的作用是调反应的pH，乙醇的作用是减缓反应速度，使得合成的PDAN粒径更为均一。
本发明基于上述卫星式结构PDAN-Au复合材料，还提供了一种免疫层析试纸条，包括底板，以及在底板上依次搭接粘贴的样本垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维垫上喷涂有待测物探针，所述待测物探针由上述卫星式结构PDAN-Au复合材料和待测物抗体制得。
其中，所述待测物探针的制备过程如下：向所述卫星式结构PDAN-Au复合材料的溶液中加入待测物抗体，混匀，室温反应1.5 h后加入封闭剂，室温反应1.5 h，离心取沉淀，复溶后得到所述待测物探针（具体为：离心的转速为4000-9000 r/min，时间为5-20 min，离心后得到的沉淀采用0.01 M、pH=7.4的磷酸盐缓冲液复溶）。加入待测物抗体后，待测物抗体的终浓度为10 μg/mL-100 μg/mL；加入封闭剂后，封闭剂的终质量浓度为1%-20%。其中，封闭剂为牛血清白蛋白、酪蛋白、卵清蛋白中的任意一种。
在向所述卫星式结构PDAN-Au复合材料溶液中加入所述待测物抗体前，先对所述卫星式结构PDAN-Au进行预处理，预处理的过程为：将所述卫星式结构PDAN-Au超声1-3min，再用0.02-0.2 M、pH=6-8的硼酸盐缓冲液调节所述卫星式结构PDAN-Au的浓度至0.01-0.05 mg/mL。
在上述免疫层析试纸条中，所述硝酸纤维素膜上喷涂有待测物人工偶联抗原或者抗体作为检测线，喷涂有抗鼠抗体或抗兔抗体作为质控线。所述硝酸纤维素膜的制备方法如下：
（1）使用0.01 M、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液分别调节待测物人工偶联抗原和二抗（抗鼠源抗体或抗兔源抗体）至浓度为0.01-1.0 mg/mL；
（2）将调整浓度后的待测物人工偶联抗原喷涂于硝酸纤维素膜上部作为检测线，将抗鼠源抗体或抗兔源抗体喷涂于硝酸纤维素膜下部作为质控线；其中，检测线和质控线之间间隔一定距离，二者的喷膜量均为0.4-0.8 μL/cm；
（3）将喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜于37 ℃干燥6 h后，在室温干燥箱保存备用。
检测原理：将样本液滴加到该免疫层析试纸条的样本垫上，样本液在吸水纸的作用下层析，当样本液中不含有待测物时，待测物探针会被检测线上的人工偶联抗原捕获，检测线显色，检测结果为阴性；当样本液中含有待测物时，由于待测物探针与待测物特异性结合，则无法被检测线上的人工偶联抗原捕获，检测线不显色，检测结果为阳性。
本发明的有益效果为：本发明首次以特定形貌结构的卫星式结构PDAN-Au作为标记物用于免疫层析试方法中，相比于传统标记物20-40 nm的AuNP，卫星式结构PDAN-Au具有更强的吸收，且生物相容性好，稳定性强且检测灵敏度高。
附图说明
图1所示为基于卫星式结构PDAN-Au复合材料的免疫层析试纸条结构示意图；
图2所示为卫星式结构PDAN-Au透射电镜表征图；
图3所示为卫星式结构PDAN-Au、AuNC-PDA和AuNP的紫外吸收图谱；
图4所示为基于卫星式结构PDAN-Au (A)、AuNC-PDA (B)和AuNP (C)检测AFM1的标准曲线；
图5所示为基于卫星式结构PDAN-Au (A) 、AuNC-PDA (B)和AuNP (C)检测AFM1的实物图；1-10分别代表AFM1浓度为：0、0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5ng/mL。
其中，1样本垫、2玻璃纤维垫、3 PDAN-Au抗体探针、4硝酸纤维素膜、5待测物人工偶联抗原、6抗鼠抗体或抗兔抗体、7吸水纸、8PVC底板、9检测线、10质控线。
具体实施方式
以下将结合实施例和附图对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。
实施例1：卫星式结构PDAN-Au复合材料的制备
1.PDAN的合成
将50 μL氨水和25 mg盐酸多巴胺加入至15 mL乙醇水溶液（质量浓度为25%）中，混合搅拌反应24 h，盐酸多巴胺于碱性条件下氧化聚合形成聚多巴胺，混合液离心弃上清，沉淀物复溶于50 mL超纯水中得PDAN。
2.卫星式结构PDAN-Au的合成
将0.5 mL氯金酸钠（质量浓度为1%）加入至50 mL PDAN溶液（0.5 mg/mL）中，加热至60 ℃搅拌反应30 min，氯金酸钠被PDAN表面的酚羟基还原生成大量的AuNP，然后冷却至室温；反应结束后离心（转速为5000 r/min，时间为20 min）弃上清，清洗沉淀物后将沉淀物复溶于超纯水中，即制得卫星式结构PDAN-Au，并于4 ℃保存。
其中，卫星式结构PDAN-Au的透射电镜表征图如图2所示；由图2可知，卫星式结构PDAN-Au复合材料均一性良好，其中PDAN的平均粒径为160 nm，其表面负载了大量约30 nm的AuNP。
卫星式结构PDAN-Au的紫外吸收图如图3所示；由图3可知，同等浓度下，卫星式结构PDAN-Au由于等离子体耦合增强效应，在525 nm处的紫外吸收强度相较于AuNC-PDA和AuNP分别提高了1.5和2.5倍左右，整体的吸光强度（在300-800 nm范围）分别提高了3倍和5倍左右，表明卫星式结构PDAN-Au相较于AuNC-PDA和AuNP具有更强的信号输出能力。
实施例2：基于卫星式结构PDAN-Au复合材料的免疫层析试纸条制备方法
1. 硝酸纤维素膜的制备
用0.01 M、pH=7.4的PBS稀释AFM1抗原和抗鼠抗体的浓度分别为0.3 mg/mL和0.4mg/mL，喷涂在硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线，两线的喷量均为0.74 μL/cm，检测线与膜顶边间隔10 mm，两线中间间隔5 mm，37 ℃烘干6 h，放置于干燥柜中保存备用。
2.卫星式结构PDAN-Au抗体探针玻璃纤维垫的制备
取0.2 mg PDAN-Au超声（实施例1制备得到）3 min，用pH=6.0的0.1 M硼酸盐缓冲液调节卫星式结构PDAN-Au浓度为0.02 mg/mL，振荡混匀后，1 mL 卫星式结构PDAN-Au中加入4 μg AFM1单克隆抗体，充分混合后，4 ℃搅拌反应1.5 h，加入100 μL浓度为2%的酪蛋白，室温封闭1.5 h，6000 r/min离心10 min，沉淀用100 μL的PBS（0.01 M pH 7.4）复溶，按照3.5 μL/cm体积喷涂到玻璃纤维垫上，真空干燥3 h。
3.组装试纸条
（1）样本垫，规格为0.8×30 cm；
（2）玻璃纤维垫，规格为0.7×30 cm；
（3）喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，规格为2.5×30 cm；
（4）吸水纸，规格为1.5×30 cm；
（5）PVC底板，规格为5.5×30 cm。
将以上材料按照如图1所示的试纸条结构示意图中各组分位置进行依次粘贴（其中，1样本垫、2玻璃纤维垫、3 PDAN-Au抗体探针、4硝酸纤维素膜、5待测物人工偶联抗原、6抗鼠抗体或抗兔抗体、7吸水纸、8PVC底板、9检测线、10质控线），组装好后用切刀裁切成4×55 mm的试纸条，装入自封袋中，加入干燥剂后，封口保存，室温环境保质期为6个月。
实施例3：基于卫星式结构PDAN-Au复合材料的免疫层析试纸条检测牛奶中的黄曲霉毒素M1
采用上述以卫星式结构PDAN-Au复合材料为标记物的免疫层析试纸条检测牛奶样本中黄曲霉毒素M1（AFM1）的方法，包括如下的步骤：
1.将牛奶样本用PBS（0.01 M pH 7.4）稀释10倍后作为样本液检测；
2.在试纸条加样孔中加入100 μL上述样本液，反应15 min；
3.用智能手机结合image J软件拍照读取试纸条T线的灰度值，根据建立的标准曲线，即可计算出样本中AFM1的含量，实现阳性样本的定量检测。
4.建立标准曲线：在阴性基质中加入标准品，AFM1浓度为：0、0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5 ng/mL，如图4和图5所示：以卫星式结构PDAN-Au复合材料为标记物的免疫层析试纸条建立的标准曲线，线性回归方程式为：y=-1479ln(x)-545.68（R²=0.9898），定量检测限为0.0076 ng/mL，定性检测限0.5 ng/mL。以AuNC-PDA为标记物的免疫层析试纸条建立的标准曲线，线性回归方程式为：y=-1635ln(x)+552.47 (R²=0.9803)，定量检测限为0.019 ng/mL，定性检测限为1.0 ng/mL。以AuNP为标记物的免疫层析试纸条建立的标准曲线，线性回归方程式为：y=-1506ln(x)+1149.2 (R²=0.9805)，定量检测限为0.031 ng/mL，定性检测限为2.5 ng/mL。
以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。
Claims (10)
1.一种卫星式结构PDAN-Au复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将聚多巴胺微球（PDAN）与氯金酸钠于溶液体系下混合，在50 ℃-70 ℃的条件下反应，氯金酸钠被PDAN表面的酚羟基还原生成AuNP，最终制得所述卫星式结构PDAN-Au复合材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，PDAN和氯金酸钠以溶液形式混合，PDAN溶液的浓度为0.5 mg/mL，氯金酸钠溶液的质量浓度为1%，氯金酸钠溶液与PDAN溶液的体积比为（0.5-1） mL：（50-80） mL。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，氯金酸钠溶液与PDAN溶液的体积比为0.5 mL：50 mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，PDAN由盐酸多巴胺于碱性条件下氧化聚合形成；具体过程如下：将盐酸多巴胺、氨水和乙醇水溶液混合反应。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，盐酸多巴胺、氨水和乙醇水溶液的比例为25 mg：50 μL：15 mL；乙醇水溶液的质量浓度为25%。
6.一种卫星式结构PDAN-Au复合材料，其特征在于，由权利要求1至5任一项所述的制备方法制得。
7.权利要求6所述的卫星式结构PDAN-Au复合材料在免疫层析试纸条中的应用。
8.一种免疫层析试纸条，其特征在于，包括底板，以及在底板上依次搭接粘贴的样本垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维垫上喷涂有待测物探针，所述待测物探针由权利要求6所述的卫星式结构PDAN-Au复合材料和待测物抗体制得。
9.根据权利要求8所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述待测物探针的制备过程如下：向所述卫星式结构PDAN-Au复合材料的溶液中加入待测物抗体，混匀，室温反应1.5 h后加入封闭剂，室温反应1.5 h，得到所述待测物探针。
10.根据权利要求9所述的免疫层析试纸条，其特征在于，加入待测物抗体后，待测物抗体的终浓度为10 μg/mL-100 μg/mL；加入封闭剂后，封闭剂的终质量浓度为1%-20%。
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