CN106370850A - 一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒及其应用，该试剂盒包括荧光免疫层析检测装置和样品稀释液，所述荧光免疫层析检测装置含有由底板、样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成的试纸条，所述样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次交错固定于所述底板上，所述试剂垫包被有兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球，硝酸纤维素膜上的检测线包被有兔抗产气荚膜梭菌IgG，质控线包被有山羊抗兔IgG，所述样品稀释液为含有纳米银的溶液。该试剂盒灵敏度为10pg/L，线性范围为40～1000pg/L，测耗时短，无需特殊仪器设备和专业技术人员，可满足医院、海关、卫生检疫部门等单位对产气荚膜梭菌进行快速检测的需要。

Description

一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于免疫应用领域，涉及医疗机构、防疫检疫部门等单位诊断或检测产气荚膜梭菌的技术，具体涉及一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒及其应用。
背景技术
产气荚膜梭菌(C.perfringens)，曾称魏氏梭菌或产气荚膜杆菌，是临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，造成组织大面积坏死，加之本菌在体内能形成荚膜，故名产气夹膜梭菌，是人类气性坏疽的主要病原菌。1892年，美国病理学家W.H.Welch等自一尸体分出本菌，因而又称魏氏梭菌。根据产生毒素种类和致病性的不同，本菌有A～F 6个型，其中，有些菌株产生肠毒素，可引起食物中毒。本菌广泛存在于土壤、人和动物的肠道以及动物和人类的粪便中，常因深部创伤而感染。此外，产气荚膜梭菌能引起羔羊痢疾和羔羊、牛犊、仔猪、家兔、雏鸡等的坏死性肠炎。目前，针对产气荚膜梭菌的检测方法主要包括：厌氧菌培养、细菌生化特性鉴定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)等，这些方法有的耗费时间长，有的条件要求高，有的受外界因素影响较大而削弱了其实用价值，在临床检测方面受到了很大的限制。因此，研究快速检测产气荚膜梭菌的诊断试剂，以便对气性坏疽感染进行现场检测和及时监控。
免疫层析是出现于八十年代初期的一种独特的免疫分析方法，由于广泛使用胶体金作为指示剂，所以又被称为胶体金检测法。目前该方法广泛应用于样品初筛，但缺点是检测灵敏度较低，难以进行定量检测。荧光定量免疫层析技术是免疫荧光技术和传统免疫层析技术相结合发展创新的一种定量新型检测技术，该技术在保留胶体金免疫层析技术操作简便、检测快速等优点外，还通过荧光示踪增强技术实现了检测结果的精确定量。荧光定量免疫层析产品以功能化纳米微球载体技术，结合荧光标记物探针，仪器直接检测激发荧光信号而非传统金标定量所采用的CCD表层光密度扫描技术，因此具有较高的信噪比、更高的信号检测量和检测灵敏度。但是，荧光信号强度与荧光微球数量呈直线相关，荧光微球数量需要达到一定量才会具有较好的效果，因此，急需开发出一种无需太多荧光微球，也能有很好效果的荧光定量免疫层析技术，用于产气荚膜梭菌的检测。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于：(1)提供一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒；(2)一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒定量检测产气荚膜梭菌的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒，包括荧光免疫层析检测装置和样品稀释液，所述荧光免疫层析检测装置含有由底板、样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成的试纸条，所述样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次交错固定于所述底板上，所述试剂垫包被有兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球，所述硝酸纤维素膜上的检测线包被有兔抗产气荚膜梭菌IgG，质控线包被有山羊抗兔IgG，所述样品稀释液为含有纳米银的溶液。
进一步，所述试剂垫上兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球的浓度为1～2g/L；所述检测线上兔抗产气荚膜梭菌IgG的浓度为1～2g/L；所述质控线上山羊抗兔IgG的浓度为1～2g/L。
进一步，所述试剂垫上兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球的喷量为1～2μl/cm；所述检测线上兔抗产气荚膜梭菌IgG的喷量为1～2μl/cm；所述质控线上山羊抗兔IgG的喷量为1～2μl/cm。
进一步，所述荧光微球为已羧基化的聚苯乙烯荧光微球。
进一步，所述荧光免疫层析检测装置还包括一卡壳，所述卡壳包括面板和底板，所述试纸条位于所述面板和底板之间，所述面板上设置有加样孔和检测孔，所述加样孔和检测孔位置分别与所述试纸条上试剂垫和硝酸纤维素膜位置对应。
进一步，所述样品稀释液由以下方法制得：
(1)纳米银溶液的制备：将硝酸银加入去离子水中，煮沸后分次加入柠檬酸三钠，搅拌至最后一次加入的柠檬酸三钠溶解后再煮沸1min，冷却至25℃后，定容至溶液中纳米银浓度为1～2mmol/L；
(2)样品稀释液的制备：向含有表面活性剂的缓冲液中加入步骤(1)中制得的纳米银溶液，定容至溶液中纳米银浓度为0.1～0.2mmol/L。
进一步，步骤(1)中，所述硝酸银与每次加入的柠檬酸三钠的质量比为1:2～1:5；所述分次为每隔1min加入一次，共3次。
进一步，步骤(2)中，所述表面活性剂为吐温-20，所述吐温-20的质量分数为1～2％；所述缓冲液为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的pH值为6.8～7.4。
2、一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒定量检测产气荚膜梭菌的方法，其中，所述试剂盒为上述的试剂盒；所述方法具体为：将样品与所述试剂盒中样品稀释液混合后，加入所述试剂盒中荧光免疫层析检测装置中进行免疫层析反应，层析反应结束后经荧光检测器荧光检测。
进一步，所述样品与样品稀释液的体积比为1:10～1:15。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种产气荚膜梭菌的荧光免疫层析检测试剂盒及其应用，通过确定兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球浓度及喷量、兔抗产气荚膜梭菌IgG浓度及喷量、山羊抗兔IgG浓度及喷量，组装制备了产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测装置，采用了免疫荧光定量检测技术和纳米银表面等离子荧光增强技术，以该荧光免疫层析检测装置配合本发明中制备的含有纳米银的样品稀释液，用于产气荚膜梭菌的定量检测，具有以下优点：(1)灵敏度高，可达到10pg/L(以产气荚膜梭菌菌体抗原计)；(2)线性范围宽，可达到40～1000pg/L；(3)特异性强，运用该方法以破伤风杆菌，铜绿假单胞菌，大肠埃希氏菌，金黄色葡萄球菌，普通变形杆菌，粪肠球菌6种菌做对照，其中所有菌均采用标准菌株培养、菌体抗原提取、调整菌体抗原浓度为100～200pg/L，以试剂本底做阴性对照，其荧光强度<100AU，结果显示产气荚膜梭菌荧光强度为1500AU左右，为阳性结果，其他6种菌的荧光强度均为100AU左右，为阴性结果，表明本试纸条具有很好的特异性；(4)该方法测耗时短，仅需10～15min，检测操作简便，无需特殊仪器设备和专业技术人员，可以满足医院、海关、卫生检疫部门等单位对产气荚膜梭菌进行快速检测的需要。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为产气荚膜梭菌荧光免疫层析试纸条的组装示意图；
图2为产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测卡示意图；
图3为产气荚膜试剂荧光免疫法的检测原理图；
图4为纳米银溶液的透射电镜图；
图5为纳米银颗粒的荧光增强性能分析图；
图6为产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒的灵敏度测试图；
图7为产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒的线性范围测试图；
图8为产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒的特异性测试图；
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
材料及试剂：聚苯乙烯荧光微球(货号：L050L)，购于广州万孚生物技术公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、牛血清白蛋白、吐温-20，海藻糖、硝酸银，购于美国Sigma-Aldrich公司；聚酯纤维膜，购于南京微测生物科技公司；柠檬酸三钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，购于西亚试剂公司；兔抗产气荚膜梭菌IgG(货号：ab35023)、山羊抗兔IgG(货号：ab6702)，购于美国Abcam公司；气荚膜梭菌菌体抗原标准品(菌株来源：美国模式培养物集存库，American type culture collection，ATCC；编号：ATCC13124)、破伤风杆菌，铜绿假单胞菌，大肠埃希氏菌，金黄色葡萄球菌，普通变形杆菌，粪肠球菌(菌均来源于美国ATCC)；FIC-S2011-E2荧光免疫层析读数仪，上海飞测生物科技公司生产。
一、产气荚膜梭菌的荧光免疫层析检测卡的制备
(1)兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球及试剂垫的制备
取1.0ml浓度为1g/L已羧基化的聚苯乙烯荧光微球，加入20mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和12mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，37℃下孵育30min，然后4℃在以10000r/min离心1min，弃去上清，沉淀用1.0ml PBS重悬，重复重悬-离心-去上清3次后得沉淀，向所得沉淀加入200μl浓度为1.0g/L的产气荚膜梭菌抗体，混合后25℃下反应3h；然后加入10μl 10％牛血清白蛋白(BSA)，37℃下孵育1.5h，封闭荧光微球；最后在4℃下以10000r/min离心5min，弃去上清，沉淀用1.0ml PBS重悬，重复重悬-离心-去上清3次后得沉淀，沉淀用1.0ml含有1％BSA、2％Tween-20和25％海藻糖的PBS溶液重悬，即为制备好的兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球溶液，4℃保存备用。
将聚酯纤维膜用质量分数为0.1％吐温-20浸泡10min，60℃抽风烘干，将浓度为1.5g/L的兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球按1.5μl/cm喷于聚酯纤维膜上，37℃干燥1h后，制得试剂垫，25℃干燥环境下密封保存。
(2)硝酸纤维素膜上检测线和质控线的喷制
使用自动喷膜仪将浓度为1.5g/L的兔抗产气荚膜梭菌IgG按1μl/cm喷于硝酸纤维素膜(NC膜)上形成检测线(T线)，将浓度为1.5g/L的山羊抗兔IgG按1μl/cm喷于硝酸纤维素膜上形成质控线(C线)，37℃干燥1h后，25℃干燥环境下密封保存。
(3)检测卡的组装
将NC膜用切条机切割为17mm宽，黏贴在塑料底板的中心。然后，将试剂垫切割为10mm宽，搭接黏贴在NC膜的T线端，重叠部分的宽度为2mm，再将吸水纸切割为17mm宽，搭接黏贴在NC膜的C线端，重叠部分的宽度为2mm。最后，将样品垫切割为12mm宽，搭接黏贴在试剂垫的样品端，重叠部分的宽度为2mm，组装成型(如图1)，其中T线和C线之间的距离为5mm，T线和C线距NC膜边缘6mm。将检测试纸条置于37℃控温箱烘干1h后取出，切成4mm宽的试纸条，将试纸条装入卡壳中(如图2)，25℃干燥环境下密封保存。其中，该卡壳包括面板和底板，面板上设置有加样孔、检测孔和凸档，加样孔和检测孔的位置分别与免疫层析试纸条上试剂垫和NC膜的位置对应，凸档设置在卡壳操作端，便于插入检测仪和取出，底板设置有卡槽试，用于放置试纸。
二、含纳米银稀释液的制备
(1)纳米银溶液的制备
称取0.2g硝酸银加入500ml去离子水中，煮沸后按1次/min，1.0g/次的方式分3次加入柠檬酸三钠，搅拌至最后一次加入的柠檬酸三钠溶解后再煮沸1min，冷却至25℃后，加去离子水至1000ml，溶液中纳米银浓度为1mmol/L，制得本发明中应用的纳米银溶液，4℃保存备用。
1)纳米银颗粒的透射电镜分析
取100μl纳米银溶液，滴加在透射电镜(TEM)专用检测铜网上，干燥，TecnaiG2F20S-TWIN(200KV)型透射电子显微镜检测，检测结果图4所示，由图4可知，制得的纳米银颗粒形貌近似球形，粒径分布均匀，介于50～70nm，没有出现团聚现象，分散性良好。
2)纳米银颗粒的荧光增强性能分析
①样品分组：a：纳米银溶液(0.5ml样品+0.5ml水)；b：聚苯乙烯荧光微球(0.5ml样品+0.5ml水)；c：纳米银溶液(0.5ml)和聚苯乙烯荧光微球(0.5ml)混合液。
②日立(Hitachi)F-7000型荧光光谱仪上进行检测。激发波长：365nm，荧光检测波长：610nm。每个样品测5次。
检测结果如图5所示，由图5可知，在365nm激发波长下，纳米银溶液的荧光吸收峰强度极小，无明显的荧光干扰。加入纳米银溶液后，聚苯乙烯荧光微球混合液的荧光强度比单纯聚苯乙烯荧光微球的荧光强度明显增高，约为2.5～3.0倍，提示本发明制备的纳米银溶液的荧光增强效果显著。
(2)样品稀释液的制备
称取71.6g磷酸氢二钠和31.2g磷酸二氢钠加入500ml去离子水中，配成pH值为6.8的PBS缓冲液，然后向所得缓冲液中加入20ml质量分数为2％的吐温-20及100ml上述纳米银溶液，加去离子水至1000ml，溶液中纳米银浓度为0.1mmol/L，制得本发明中的样品稀释液，4℃保存备用。
三、产气荚膜梭菌的荧光免疫层析检测试剂盒定性及定量检测产气荚膜梭菌
产气荚膜梭菌的荧光免疫层析检测试剂盒定性及定量检测产气荚膜梭菌的原理如图3所示，将待检测的样品与试剂盒中样品稀释液混合后，取混合溶液滴入试剂盒中检测卡上的加样孔，混合溶液经试纸条上样品垫过滤后，样品中的产气荚膜梭菌菌体抗原与试剂垫中的兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球结合，通过层析作用先与NC膜上的兔抗产气荚膜梭菌IgG结合形成双抗夹心复合物后形成检测线(T线)，未结合完的兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球继续层析与山羊抗兔IgG结合，形成质控线(C线)。同时，样品稀释液中的纳米银颗粒也同步进行了免疫层析，并分别到达T线和C线位置。
1)产气荚膜梭菌的荧光免疫层析检测试剂盒定性检测产气荚膜梭菌
①若T线和C线在紫外激发光照射下同时显现绿色荧光印迹，表示检测结果为阳性，说明被检测样本中含有产气荚膜梭菌菌体抗原。
②若在紫外激发光照射下T线无绿色荧光印迹，C线显现绿色荧光印迹，表示检测结果为阴性，说明被检测样本中不含产气荚膜梭菌菌体抗原，或其浓度小于10pg/L。
③若在紫外激发光照射下C线无绿色荧光印迹，本次检测无效，需分析失败原因并重新检测。若将荧光免疫层析检测卡与荧光定量检测仪连用，可实现定量检测。
2)产气荚膜梭菌的荧光免疫层析检测试剂盒定量检测产气荚膜梭菌
①荧光定量检测：激发波长：365nm；荧光检测波长：610nm。
②标准曲线方程式的测定：梯度浓度的产气荚膜梭菌样品：取产气荚膜梭菌菌体抗原标准品，配制浓度分别为1，2，4，8，16，32，64，128，256，612，1024pg/L的样品。加样：分别取20μl样品，加入250μl样品稀释液中，混匀，1min后取100μl混合液滴加在产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测卡。免疫层析：加样后的免疫层析检测卡在25℃下放置5min，进行免疫层析。荧光检测：采用荧光检测仪进行免疫荧光分析。每个样品测二次荧光，取平均值。标准曲线的制定：将样品浓度与检测的荧光值进行直线回归分析，得到标准曲线方程式。
③产气荚膜梭菌定量检测：加样：分别取20μl样品，加入250μl样品稀释液中，混匀，1min后取100μl混合液滴加在产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测卡上。免疫层析：加样后的免疫层析检测卡在25℃下放置5min，进行免疫层析。荧光检测：采用荧光免疫层析读数仪进行荧光分析。每个样品测二次荧光，取平均值。定量报告结果：将样品检测的荧光值代入标准曲线方程式中，得到产气荚膜梭菌浓度，重复测二次，取平均值报告结果。
四、产气荚膜梭菌的荧光免疫层析检测试剂盒的性能评价
1)灵敏度测试
检测样品按照100，80，60，40，20，10，8，6，4，2，1pg/L梯度稀释，分别取20μl样品，加入250μl样品稀释液中，混匀，1min后取100μl混合液滴加在产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测卡上，进行免疫层析及采用荧光免疫层析读数仪进行荧光分析，每个样品重复检测5次。测试结果如图6所示，由图6可知，10pg/L以上浓度的产气荚膜梭菌有明显的荧光信号(100～500AU)，10pg/L以下浓度则荧光信号迅速下降(20～50AU)。按照参考方法检测限(LOD，Limit of detection)为基质空白所产生的仪器背景信号的3倍值的相应量，本检测方法的最低检测限为10pg/L左右。
2)线性范围测试
检测样品按照2000，1000，500，250，125，70，40，20，10pg/L梯度稀释，分别取20μl样品，加入250μl样品稀释液中，混匀，1min后取100μl混合液滴加在产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测卡上，进行免疫层析及采用荧光免疫层析读数仪进行荧光分析，每个样品重复检测5次。测试结果如图7所示，由图7可知，10～2000pg/L梯度浓度的产气荚膜梭菌均有相应的荧光信号(100～5000AU)，其中40pg/L以下浓度则荧光信号迅速下降，1000pg/L以上浓度则荧光信号上升速率明显减缓(图7a)。按照线性回归方程的相关系数R>0.95(R2>0.90)计，本检测方法的线性范围为40～1000pg/L(图7b)。
3)特异性测试
①样品分组：阴性对照，产气荚膜梭菌，6种伤口感染常见病原菌(破伤风杆菌，铜绿假单胞菌，大肠埃希氏菌，金黄色葡萄球菌，普通变形杆菌，粪肠球菌)。所有菌均采用标准菌株培养、菌体抗原提取、调整菌体抗原浓度为100～200pg/L。
②分别取20μl样品，加入250μl样品稀释液中，混匀，1min后取100μl混合液滴加在产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测卡上，进行免疫层析及采用荧光免疫层析读数仪进行荧光分析，每个样品重复检测5次。
检测结果如图8所示，由图8可知，阴性对照荧光强度<100AU，为试剂本底；产气荚膜梭菌荧光强度为1500AU左右，为阳性结果；其他6种菌的荧光强度均为100AU左右，为阴性结果。结果显示，本荧光检测卡与伤口感染常见病原菌无明显交叉反应，有良好的特异性。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒，包括荧光免疫层析检测装置和样品稀释液，所述荧光免疫层析检测装置含有由底板、样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成的试纸条，所述样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次交错固定于所述底板上，所述试剂垫包被有兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球，所述硝酸纤维素膜上的检测线包被有兔抗产气荚膜梭菌IgG，质控线包被有山羊抗兔IgG，所述样品稀释液为含有纳米银的溶液。
2.如权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述试剂垫上兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球的浓度为1～2g/L；所述检测线上兔抗产气荚膜梭菌IgG的浓度为1～2g/L；所述质控线上山羊抗兔IgG的浓度为1～2g/L。
3.如权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述试剂垫上兔抗产气荚膜梭菌IgG标记的荧光微球的喷量为1～2μl/cm；所述检测线上兔抗产气荚膜梭菌IgG的喷量为1～2μl/cm；所述质控线上山羊抗兔IgG的喷量为1～2μl/cm。
4.如权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述荧光微球为已羧基化的聚苯乙烯荧光微球。
5.如权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述荧光免疫层析检测装置还包括一卡壳，所述卡壳包括面板和底板，所述试纸条位于所述面板和底板之间，所述面板上设置有加样孔和检测孔，所述加样孔和检测孔位置分别与所述试纸条上试剂垫和硝酸纤维素膜位置对应。
6.如权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液由以下方法制得：
(1)纳米银溶液的制备：将硝酸银加入去离子水中，煮沸后分次加入柠檬酸三钠，搅拌至最后一次加入的柠檬酸三钠溶解后再煮沸1min，冷却至25℃后，定容至溶液中纳米银浓度为1～2mmol/L；
(2)样品稀释液的制备：向含有表面活性剂的缓冲液中加入步骤(1)中制得的纳米银溶液，定容至溶液中纳米银浓度为0.1～0.2mmol/L。
7.如权利要求6所述的一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，步骤(1)中，所述硝酸银与每次加入的柠檬酸三钠的质量比为1:2～1:5；所述分次为每隔1min加入一次，共3次。
8.如权利要求6所述的一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，步骤(2)中，所述表面活性剂为吐温-20，所述吐温-20的质量分数为1～2％；所述缓冲液为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的pH值为6.8～7.4。
9.一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒定量检测产气荚膜梭菌的方法，其特征在于，所述试剂盒为权利要求1～8任一项所述的试剂盒；所述方法具体为：将样品与所述试剂盒中样品稀释液混合后，加入所述试剂盒中荧光免疫层析检测装置中进行免疫层析反应，层析反应结束后经荧光检测器荧光检测。
10.如权利要求9所述的一种产气荚膜梭菌荧光免疫层析检测试剂盒定量检测产气荚膜梭菌的方法，其特征在于，所述样品与样品稀释液的体积比为1:10～1:15。
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