CZ2010687A3 - Zpusob prípravy vysoce substituovaných amidu kyseliny hyaluronové - Google Patents
Zpusob prípravy vysoce substituovaných amidu kyseliny hyaluronové Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2010687A3 CZ2010687A3 CZ20100687A CZ2010687A CZ2010687A3 CZ 2010687 A3 CZ2010687 A3 CZ 2010687A3 CZ 20100687 A CZ20100687 A CZ 20100687A CZ 2010687 A CZ2010687 A CZ 2010687A CZ 2010687 A3 CZ2010687 A3 CZ 2010687A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- hyaluronic acid
- added
- process according
- reaction
- reaction mixture
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Zpusob prípravy vysoce substituovaných amidu kyseliny hyaluronové s kontrolovatelným stupnem substituce, pripravených v polárním aprotickém prostredí z kyselé formy kyseliny hyaluronové v prítomnosti ethylchlorformiátu, pomocí primárního aminu.
Description
(57) Anotace:
Způsob přípravy vysoce substituovaných amidů kyseliny hyaluronové s kontrolovatelným stupněm substituce, připravených v polárním aprotickém prostředí z kyselé formy kyseliny hyaluronové v přítomnosti cthylchlorformiátu. pomocí primárního aminu.
CZ 2010-687 A3
Způsob přípravy vysoce substituovaných amidů kyseliny hyaluronové
Oblast techniky
Technické řešení se týká způsobu přípravy amidových derivátů kyseliny hyaluronové s vysokým stupněm substituce, které jsou dále použitelné v medicíně, farmacii a pro přípravu hydrogelů v tkáňovém inženýrství.
Dosavadní stav techniky
Kyselina hyaluronová je lineami heteropolysacharid skládající se z opakujících se disacharidových jednotek kyseliny D-glukuronové a 7V-acetyl-D-glukosaminu. Jedná se o nerozvětvený polysacharid, který pokud je izolovaný z přírodního zdroje, může dosahovat molekulové hmotnosti v rozmezí od 50 000 do 5 000 000 Da v závislosti na způsobu izolace a výchozím materiálu.
Kyselina hyaluronová je hlavní složkou mezibuněčné hmoty a díky svým viskoelastickým vlastnostem je důležitou součástí Teologických, fyziologických a biologických funkcí v těle. Díky své vysoké lubrikační kapacitě, schopnosti vysoké sorpce a zadržování vody je často aplikována v oční chirurgii. Likviduje volné kyslíkové radikály a ovlivňuje proliferaci i diferenciaci buněk. Dále zabraňuje ukládání kolagenu a tím podporuje hojení ran a zamezuje vzniku jizev.
Pro široké klinické použití nativní kyseliny hyaluronové je problematická především její velmi rychlá degradace v roztoku a poměrně špatné mechanické vlastnosti. Zlepšení těchto vlastností a zároveň zvýšení odolnosti proti degradaci lze dosáhnout chemickou modifikací hyaluronanu.
Z tohoto důvodu byla v posledních letech pozornost zaměřena na přípravu syntetických hyaluronových derivátů, které jsou rozpustné ve vodných roztocích, a po určitých úpravách mohou být aplikovatelné jako biodegradabilní a biokompatibilní materiály v medicíně, chirurgii a tkáňovém inženýrství. Jednou z vhodných úprav materiálu jsou síťovací reakce, kdy se z modifikované kyseliny hyaluronové vytváří hydrogely.
• · · • · * • · · • · · • · · · ·
Hydrogely jsou hydrofílní sítě polymerů, které mohou být používány pro kontrolní distribuci léků, bioaktivních a jiných látek v organismu, jako skafoldy nebo kožní plniva. Důležitou podmínkou pro přípravu hydrogelů je stabilita derivátů, které jsou použity jako vstupní prekurzory pro síťovací reakci.
Pro tvorbu hydrogelů byla vyzkoušena řada modifikovaných derivátů hyaluronanu. Jedněmi z nich byly i amidové deriváty. Tyto deriváty si zasloužily velkou pozornost z důvodu jejich poměrně vysoké stability vůči degradaci a hydrolýze ve fyziologických podmínkách v prostředí bez enzymatické aktivity.
Současný stav přípravy amidových derivátů hyaluronanu pro následnou gelaci je založen na používání různých reakčních podmínek, které však vedou pouze k relativně nízkým stupňům amidace (do 30%) (WO/2000/001733 (AI)). Velkou nevýhodou některých současných postupů je především to, že vlastní amidaci předchází deacetylace hyaluronanu (WO/2000/001733 (AI)). Amidový derivát hyaluronanu je následovně síťován až do vzniku hydrogelů. Síťování azidů a alkinů, které jsou navázány na polysacharid přes amidickou vazbu, je nejčastěji katalyzováno měďnými kationty, které jsou toxické. Čím nižší je stupeň substituce amidových derivátů vstupujících do reakce, tím větší množství katalyzátoru musí být použito (WO/2008/031525A1).
Podstata vynálezu
Nízký stupeň amidových derivátů hyaluronanu může být navýšen aplikací specifických reakčních podmínek. Hlavní podstatou tohoto vynálezu je postup přípravy amidů kyseliny hyaluronové, při kterém dochází k selektivní amidaci karboxylové skupiny kyseliny hyaluronové za vzniku vysoce substituovaných produktů. Princip reakce spočívá v aktivaci karboxylové skupiny hyaluronanu pomocí ethylchlorformiátu, v přítomnosti báze, přičemž vzniklý intermediát - aktivovaný hyaluronan - následně reaguje s primárním aminem R-NHí za vzniku amidu kyseliny hyaluronové podle schématu 1:
aprotické prostředí, báze, RNH2 o
Schéma 1 Amidace kyseliny hyaluronové kde R je alkylový lineární nebo rozvětvený řetězec Ct - C3o, volitelně s obsahem aromatických nebo heteroaromatických skupin. Příprava probíhá s výhodou v polárním aprotickém prostředí, zejména v dimethylsulfoxidu. Kyselina hyaluronová je s výhodou v kyselé formě a má hmotnostně střední molekulovou hmotnost v rozmezí 10 až 500 kDa, zejména 350 až 500 kDa.
Ve výhodném provedení vynálezu probíhá reakce při teplotě 25 °C po dobu 8 až 24 hod, s výhodou po dobu 12 hod.
Stupeň substituce kyseliny hyaluronové ve způsobu přípravy podle vynálezu je s výhodou řízen molámím množstvím přidaného aminu R-NII2, přičemž primární amin se s výhodou přidá do reakce v čase 0,1 až 2 hod po přídavku ethylchlorformiátu a v molámím množství 3 až 5 ekvivalentů vzhledem k látkovému množství dimeru hyaluronanu. Primárním aminem R-NH2 může být například CH=C-CH2-NH2, NH2-CH2-CH2-CH2-N3 nebo NH2(CH2)5-CH3.
Ve výhodném provedení vynálezu je látkové množství přidaného ethylchlorformiátu v molámím poměru 3 až 5 ekvivalentů vzhledem k látkovému množství dimeru hyaluronanu.
Bází použitou ve způsobu podle vynálezu může být trialkylamin, například triethylamin, a to s výhodou v látkovém množství v molámím poměru 3 až 5 ekvivalentů báze vzhledem k látkovému množství dimeru hyaluronanu.
Výhodou oproti známým analogům je volitelně vysoký stupeň substituce, který vede k výrazné změně fyzikálně-chemických vlastností. Blokování karboxylové skupiny hyaluronanu v síťovaných produktech má za následek nižší bobtnavost, a tudíž lepší mechanickou stabilitu připravených síťovaných produktů.
·· · ·
. · · · • · ·· ··
Amidové deriváty hyaluronanu připravené tímto způsobem vykazují kontrolovatelný stupeň substituce v rozmezí 10-99 %. Stupeň substituce je kontrolovaný molárním poměrem primárního aminu, ethyl chlorformiátu a báze.
Amidové deriváty jsou vysoce stabilní vůči degradaci a hydrolýze, a proto mohou být použity pro tvorbu stabilních hydrogelů. V případě vysokého stupně substituce jek síťovací reakci třeba jen velmi malé množství katalyzátoru.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Amidace kyseliny hyaluronové propargylaminem
0,5 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 100 kDa a polydisperzitě 1,9 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (5 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (3 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,125 g (1,36 mmol) hydrochloridu propargylaminu a reakční směs se míchá dalších 24 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCO3 (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.
Výtěžek reakce: 0,3957 g
Mw derivátu po reakci: 80 kDa.
Stupeň substituce ~ 44%.
1II NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, 5 ppm):
2,01 (s, 3H,8a), 3,36 (bs, 1H, 2b), 3,46 (bs, 1H, 5a,), 3,54(bs, lH,4a), 3,70 (bs, 2H, 3a a 3b), 3,83 (bs, 1H, 4b), 3,90 (bs, lH,5b), 3,91 (d,lH, la) 4,10 (d,lH, 1 β), 4,50 (bs,2H, laa lb)
DOSY NMR:
log D (2,03 ppm CHj-CO-NH-Polymer) —10,5 m2/s log D(2,7 ppm -CH2 NH-R) -10,5 m2/s • * ·· ··
-5• · · · · ·· • *··*· · ·, • · · · ·· • · ·· ··· ·· log D(3,0 ppm -CH2NH-R) — 10,5) m2/s
Příklad 2
Amidace kyseliny hyaluronové propargylaminem
0,5 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 248 kDa a polydisperzitě
1,6 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (5 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (3 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,125 g (1,36 mmol) hydrochloridu propargylaminu a reakční směs se míchá dalších 24 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCO3 (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.
Výtěžek reakce: 0,3957 g
Mw derivátu po reakci: 120 kDa
Stupeň substituce = 98 %.
!H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm): viz příklad 1
DOSY NMR: viz příklad 1
Příklad 3
Amidace kyseliny hyaluronové propargylaminem
0,5 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 366 kDa a polydisperzitě
1,6 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (3 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (3 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,125 g (1,36 mmol) hydrochloridu propargylaminu a reakční směs se míchá dalších 12 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku
-6• ··· ·
NaCl a NaHCO3 (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.
Výtěžek reakce: 0,3957 g
Mw derivátu po reakci: 177,4 kDa
Stupeň substituce = 50 %.
]H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm): viz příklad 1
DOSY NMR: viz příklad 1
Příklad 4
Amidace kyseliny hyaluronové propargylaminem
0,5 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 393 kDa a polydisperzitě
1,6 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (5 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (3 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,111 g (1,32 mmol) hydrochloridu propargylaminu a reakční směs se míchá dalších 12 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCO3 (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.
Výtěžek reakce: 0,4452 g
Mw derivátu po reakci: 240 kDa
Stupeň substituce = 60 %, lH NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm): viz příklad 1
DOSY NMR: viz příklad 1
Příklad 5
Amidace kyseliny hyaluronové propargylaminem
0,5 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 485 kDa a polydisperzitě
1,6 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (5 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (3 eq ) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,111 g (1,32 mmol) hydrochloridu propargylaminu a reakční směs se míchá dalších 12 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCCh (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.
Výtěžek reakce: 0,4452 g
Mw derivátu po reakci: 133,4 kDa
Stupeň substituce = 88 %.
’H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm): viz příklad 1
DOSY NMR: viz příklad 1
Příklad 6
Amidace kyseliny hyaluronové 3-azidopropylaminem
1,0 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 42 kDa a polydisperzitě
1,6 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (3 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (3 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,228 g (2,65 mmol) 3-azidopropylaminu a reakční směs se míchá dalších 12 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCO3 (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.
-s-
Výtěžek reakce: 0,8001 g
Mw derivátu po reakci: 20 kDa
Stupeň substituce = 75 %.
lH NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm):
5H,6a,3b,4b,3a,5b), 4,50( bs,2H, laalb)
DOSY NMR:
log D (2,03 ppm CT/j-CO-NH-Polymer) —10,5 m2/s log D(2,7 ppm -CH2 NH-R) -10,5 m2/s log D(3,0 ppm -CH2NH-R) -10,5) m2/s
Příklad 7
Amidace kyseliny hyaluronové 3-azidopropylaminem
1,0 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 42 kDa a polydisperzitě
1,6 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (3 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (4 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,228 g (2,65 mmol) 3-azidopropylaminu a reakční směs se míchá dalších 12 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do díalyzačních střev (cut-off 12-14 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCC>3 (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.
Výtěžek reakce: 0,8067 g
Mw derivátu po reakci: 20 kDa
Stupeň substituce = 50 %.
’H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm): viz příklad 6
DOSY NMR: viz příklad 6
Příklad 8
Amidace kyseliny hyaluronové 3-azidopropylaminem
1,0 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 42 kDa a polydisperzitě
1.6 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (3 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (5 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,228 g (2,65 mmol) 3-azidopropylaminu a reakční směs se míchá dalších 12 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCCh (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.
Výtěžek reakce: 0,8067 g
Mw derivátu po reakci: 20 kDa
Stupeň substituce = 40 %.
*H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, 6 ppm): viz příklad 6
DOSY NMR: viz příklad 6
Příklad 9
Amidace kyseliny hyaluronové 3-azidopropylaminem
1,0 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 72 kDa a polydisperzitě
1.7 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (3 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (5 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,228 g (2,65 mmol) 3-azidopropylaminu a reakční směs se míchá dalších 24 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCOa (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.
Výtěžek reakce: 0,7826 g
-10« · • · • · • «
Mw derivátu po reakci: 52 kDa
Stupeň substituce = 54 %.
]H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm): viz příklad 6
DOSY NMR: viz příklad 6
Příklad 10
Amidace kyseliny hyaluronové 3-azido propylaminem
1,0 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 70 kDa a polydisperzitě
1,7 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (3 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (5 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,228 g (2,65 mmol) 3-azidopropylaminu a reakční směs se míchá dalších 24 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCCh (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.
Výtěžek reakce: 0,7826 g
Mw derivátu po reakci: 35 kDa
Stupeň substituce = 60 %.
’H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm): viz příklad 6
DOSY NMR: viz příklad 6
Příklad 11
Amidace kyseliny hyaluronové 3-azidopropylaminem
1,0 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 393 kDa a polydisperzitě
1,7 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (3 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (3 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi
| • | ·♦ | ·· | • ·· | |||
| • | • · | • * | • A | A | A | |
| • | • | ♦ · | • · | • | • | • |
| ·· | • · · | ··· · | • | • | • | |
| • | • « | « | • | A | • | |
| * | * | «« | ♦ · | 4« A | A A |
- 11 přidá 0,228 g (2,65 mmol) 3-azidopropy laminu a reakční směs se míchá dalších 8 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCC^ (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.
Výtěžek reakce: 0,7826 g
Mw derivátu po reakci: 165 kDa
Stupeň substituce = 85 %.
!H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm): viz příklad 6
DOSY NMR: viz příklad 6
Příklad 12
Amidace kyseliny hyaluronové 3-azidopropylaminem
1,0 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 485 kDa a polydisperzitě
1,7 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (3 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (3 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,228 g (2,65 mmol) 3-azidopropylaminu a reakční směs se míchá dalších 10 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCOj (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.
Výtěžek reakce: 0,7826 g
Mw derivátu po reakci: 177 kDa
Stupeň substituce = 98 %.
’H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm): viz příklad 6
DOSY NMR: viz příklad 6
- 12·· ·· • · · * • · · • ··· · • · ·· ·· ·
Příklad 13
Amidace kyseliny hyaluronové hexyl aminem
1,0 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 485 kDa a polydisperzitě
1,7 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (5 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (3 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,253 g (2,5 mmol) hexylaminu a reakční směs se míchá dalších 12 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 1214 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCI a NaHCCh (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.
Výtěžek reakce: 0,7826 g
Mw derivátu po reakci: 200 kDa
Stupeň substituce = 88 %.
*H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm):
0,8 (bs, 2H, 6), 1,2 (bs, 2H, 5), l,45(bs, 6H,3, 4 a 5), 1,8 (q,3H, 8), 2,01 (s, 3H,8a), 3,19 (bs, 1H, lot), 3,30(bs, 1H, 2b), 3,36(bs, 2H,3), 3,50 (bs, 3H,ip,6a,5a), 3,57(bs, lH,3b), 3,70 (bs, 4H, 6a,3b,4b,3a), 3,89 (bs, 5H,6a,3b,4b,3a,5b), 4,50( bs,2H, la a lb) DOSY NMR:
log D (2,03 ppm CV/j-CO-NH-Polymer) —10,5 m2/s log D(2,7 ppm -CH2NH-R) -10,5 m2/s logD(3,0ppm -CH2NH-R)-10,5) m2/s
Uvedené příklady provedení jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují ani ne vyčerpávají všechny varianty provedení vynálezu.
Claims (11)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob přípravy amidových derivátů kyseliny hyaluronové, vyznačující se tím, že se nejprve v přítomnosti báze aktivuje skupina COOH kyseliny hyaluronové ethylchlorformiátem za vzniku reaktivního intermediátu, který následně reaguje s primárním aminem R-NH2 za vzniku amidu kyseliny hyaluronové dle schématu 1:aprotické prostředí, báze, RNHZ oSchéma 1 kde R je alkylový lineární nebo rozvětvený řetězec Ci - C30, volitelně s obsahem aromatických nebo heteroaromatických skupin.
- 2. Způsob přípravy podle nároku 1, vyznačující se tím, že probíhá v polárním aprotickém prostředí, zejména v dimethylsulfoxidu.
- 3. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že kyselina hyaluronová je v kyselé formě a má hmotnostně střední molekulovou hmotnost v rozmezí 10 až 500 kDa, zejména 350 až 500 kDa.
- 4. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že reakce probíhá při teplotě 25 °C po dobu 8 až 24 hod, s výhodou po dobu 12 hod.
- 5. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že stupeň substituce kyseliny hyaluronové je řízen molámím množstvím přidaného aminu R-NH2.
- 6. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že primární amin se přidá do reakce v čase 0,1 až 2 hod po přídavku ethylchlorformiátu.
- 7. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že primární amin se přidá do reakce v molámím množství 3 až 5 ekvivalentů vzhledem k látkovému množství dimem hyaluronanu.
- 8. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že primárním aminem R-NH2 je CHOCH2-NH2, NH2-CH2-CH2-CH2-N3 nebo NH2(CH2)5-CH3.
• « ·« • # v r» t » « · • · · · • · • · • · « < ·« ·· * * · · # • · · • • · · 4 * * ♦ · + * fc '* · - 9. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že látkové množství přidaného ethylchlorformiátu je v molámím poměru 3 až 5 ekvivalentů vzhledem k látkovému množství dimeru hyaluronanu.
- 10. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že bází je trialkyl amin, zejména triethylamin.
- 11. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že látkové množství přidané báze je v molámím poměru 3 až 5 ekvivalentů vzhledem k látkovému množství dimeru hyaluronanu.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2010-687A CZ305040B6 (cs) | 2010-09-14 | 2010-09-14 | Způsob přípravy vysoce substituovaných amidů kyseliny hyaluronové |
| PCT/CZ2011/000089 WO2012034544A2 (en) | 2010-09-14 | 2011-09-08 | Method of preparation of highly substituted hyaluronic acid amides |
| ARP110103318A AR082965A1 (es) | 2010-09-14 | 2011-09-13 | Metodo de preparacion de amidas de acido hialuronico altamente sustituidas |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2010-687A CZ305040B6 (cs) | 2010-09-14 | 2010-09-14 | Způsob přípravy vysoce substituovaných amidů kyseliny hyaluronové |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2010687A3 true CZ2010687A3 (cs) | 2012-03-21 |
| CZ305040B6 CZ305040B6 (cs) | 2015-04-08 |
Family
ID=45047494
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2010-687A CZ305040B6 (cs) | 2010-09-14 | 2010-09-14 | Způsob přípravy vysoce substituovaných amidů kyseliny hyaluronové |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| AR (1) | AR082965A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ305040B6 (cs) |
| WO (1) | WO2012034544A2 (cs) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ2014451A3 (cs) | 2014-06-30 | 2016-01-13 | Contipro Pharma A.S. | Protinádorová kompozice na bázi kyseliny hyaluronové a anorganických nanočástic, způsob její přípravy a použití |
| CZ309295B6 (cs) | 2015-03-09 | 2022-08-10 | Contipro A.S. | Samonosný, biodegradabilní film na bázi hydrofobizované kyseliny hyaluronové, způsob jeho přípravy a použití |
| CZ306479B6 (cs) | 2015-06-15 | 2017-02-08 | Contipro A.S. | Způsob síťování polysacharidů s využitím fotolabilních chránicích skupin |
| CZ306662B6 (cs) | 2015-06-26 | 2017-04-26 | Contipro A.S. | Deriváty sulfatovaných polysacharidů, způsob jejich přípravy, způsob jejich modifikace a použití |
| CZ307511B6 (cs) | 2015-12-23 | 2018-10-31 | Contipro A.S. | Fluorescenční konjugát kyseliny hyaluronové nebo jeho sůl, hydrofobizovaný konjugát, způsoby jejich přípravy a použití |
| CZ308106B6 (cs) | 2016-06-27 | 2020-01-08 | Contipro A.S. | Nenasycené deriváty polysacharidů, způsob jejich přípravy a jejich použití |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITPD980169A1 (it) | 1998-07-06 | 2000-01-06 | Fidia Advanced Biopolymers Srl | Ammidi dell'acido ialuronico e dei suoi derivati e processo per la loro preparazione. |
| KR20040009891A (ko) * | 2002-07-26 | 2004-01-31 | 주식회사 엘지생명과학 | 히알루론산의 유도체 겔 및 그 제조방법 |
| US8143391B2 (en) * | 2004-09-07 | 2012-03-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Process for producing water-soluble hyaluronic acid modification |
| ITMI20061726A1 (it) * | 2006-09-11 | 2008-03-12 | Fidia Farmaceutici | Derivati crosslinkati a base di acido ialuronico reticolato via click chemistry |
| CN101367884A (zh) * | 2008-09-25 | 2009-02-18 | 复旦大学 | 一种半胱胺修饰的巯基化透明质酸偶合物及其制备方法和应用 |
-
2010
- 2010-09-14 CZ CZ2010-687A patent/CZ305040B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-09-08 WO PCT/CZ2011/000089 patent/WO2012034544A2/en active Application Filing
- 2011-09-13 AR ARP110103318A patent/AR082965A1/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ305040B6 (cs) | 2015-04-08 |
| AR082965A1 (es) | 2013-01-23 |
| WO2012034544A3 (en) | 2012-05-03 |
| WO2012034544A2 (en) | 2012-03-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Park et al. | RGD-conjugated chitosan-pluronic hydrogels as a cell supported scaffold for articular cartilage regeneration | |
| US8512752B2 (en) | Hyaluronic acid derivatives obtained via “click chemistry” crosslinking | |
| JP7015784B2 (ja) | 炭水化物架橋剤 | |
| JP5746617B2 (ja) | キトサン混合物を形成する注入可能なヒドロゲル | |
| CZ2010687A3 (cs) | Zpusob prípravy vysoce substituovaných amidu kyseliny hyaluronové | |
| Shi et al. | Characterization of ph-and thermosensitive hydrogel as a vehicle for controlled protein delivery | |
| Sun et al. | Covalently crosslinked hyaluronic acid‐chitosan hydrogel containing dexamethasone as an injectable scaffold for soft tissue engineering | |
| CZ303485B6 (cs) | Zpusob výroby zesítených polysacharidu | |
| JP2002519481A (ja) | ヒアルロン酸アミドおよびそれらの誘導体、並びにそれらの製造法 | |
| NZ511306A (en) | Cross-linked hyaluronic acids obtained by reaction of activated carboxy groups of hyaluronic acid (HY) with a polyamine | |
| Ngwabebhoh et al. | Preparation and characterization of injectable self-antibacterial gelatin/carrageenan/bacterial cellulose hydrogel scaffolds for wound healing application | |
| CN112812329B (zh) | 巯基改性高分子化合物的水凝胶及其制备方法和用途 | |
| EP2529226A1 (en) | Silylated biomolecules | |
| CN112516075B (zh) | 一种载有泼尼松的透明质酸-壳聚糖温敏水凝胶及其制备方法 | |
| CN111247174B (zh) | 在炎症状态的治疗中的官能化的透明质酸或其衍生物 | |
| RU2708327C2 (ru) | Производные сульфатированных полисахаридов, их способ получения, модификация и применение | |
| CN111333869A (zh) | 一种抗新型冠状病毒的可降解缓释凝胶的制备方法 | |
| WO2013164782A1 (en) | Shape-memory cross-linked polysaccharides | |
| WO2023157150A1 (ja) | 多糖誘導体の用途 | |
| WO2022034889A1 (ja) | 多糖誘導体、多糖誘導体－薬物コンジュゲート、その製造方法 | |
| CA2956658C (en) | Composition comprising polyglucosamine-glyoxylate solutions mixed with hyaluronan | |
| CN113906055A (zh) | 官能化的透明质酸的交联的聚合物及其在炎症状态的治疗中的用途 | |
| Trifan et al. | STRATEGIES OF HYALURONAN CHEMICAL MODIFICATIONS FOR BIOMEDICAL APPLICATIONS | |
| López-Saucedo et al. | Hydrogels Based on Natural and/or Synthetic Polymers | |
| Apryatina et al. | Biocompatible compositions based on chitosan and collagen with high strength characteristics |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20160914 |