DE102018124022A1

DE102018124022A1 - Hyaluronsäurestabilisator

Info

Publication number: DE102018124022A1
Application number: DE102018124022.8A
Authority: DE
Inventors: Jens Malte Baron; Sebastian Huth
Original assignee: Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Current assignee: Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2020-04-02
Also published as: WO2020065056A1; US20220118048A1; EP3856137A1

Abstract

Das Säugetierproteins ITIH5 wird als Stabilisator von Hyaluronsäure oder einem Salz davon offenbart. Bereitgestellt wird weiterhin eine Zusammensetzung, die das Säugetierprotein ITIH5 und Wasser enthält. Bereitgestellt wird auch ein in-vitro-Verfahren zur Identifizierung eines Verbindungskandidaten, der als Stabilisator von Hyaluronsäure oder eines Salzes davon geeignet ist.

Description

Gebiet
Die vorliegende Offenbarung betrifft einen Stabilisator der Hyaluronsäure und ihrer Salze, sowie seine Verwendung. Die Offenbarung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung, die Hyaluronsäure und den Stabilisator enthält. Die Offenbarung betrifft auch ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die als Stabilisator von Hyaluronsäure oder eines Salzes davon geeignet ist.
Hintergrund
Ein Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix (EZM) von Wirbeltieren ist Hyaluronsäure, nach neuer Nomenklatur Hyaluronan (HA). Es handelt sich dabei um ein negativ geladenes, lineares, hoch wasserlösliches Glykosaminoglykan, bestehend aus einer Wiederholung von n Disaccharideinheiten (-4GlcUAβ1-3GlcNAcβ1-), in denen D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-glucosamin mit alternierenden β-1,3- und β-1,4-glycosidischen Bindungen verbunden sind:
Im Gegensatz zu den meisten anderen Glykosaminoglykanen, die Proteoglykane bilden, ist Hyaluronan nicht an ein Kernprotein gebunden.
Hyaluronsäure ist ein wesentlicher Bestandteil des Bindegewebes und der Gelenkflüssigkeit. Hyaluronsäure wird von den meisten Hautzellen, hauptsächlich Fibroblasten in der Dermis und Keratinozyten in der Epidermis, dynamisch produziert (Maytin, E.V., Glycobiology (2016) 26, 553-559). Hyaluronsäure ist an einer Vielzahl an physiologischen Funktionen beteiligt, wie der Aufrechterhaltung der Elastoviskosität von flüssigem Bindegewebe wie Gelenkflüssigkeit in den Gelenken und dem Glaskörper des Auges, die Kontrolle der Gewebehydratation, des osmotischen Gleichgewichts und des Wassertransports, sowie der Zellproliferation, Adhäsion und Migration. Hyaluronsäure findet sich besonders ausgeprägt in der Embryogenese und in Geweben, die sich in der Reparatur befinden.
Hyaluronsäurelösungen sind auch hervorragende Gleitmittel und können eingesetzt werden, um Gewebeoberflächen übereinander gleiten zu lassen. Daher werden Hyaluronsäurepräparate manchmal auf Gewebe aufgetragen, um die Heilung zu fördern und/oder das Potential für eine postoperative Adhäsionsbildung zu verringern.
Aufgrund ihrer biologischen Eigenschaften und Funktionen ist Hyaluronsäure von hoher wirtschaftlicher Bedeutung, ihr kommerzieller Wert liegt weit über dem anderer natürlicher Polysaccharide. Anwendungen reichen vom medizinischen Bereich bis hin zu Kosmetika und Nahrungsergänzungsmitteln. Ihre viskoelastischen Eigenschaften, gepaart mit der völligen Abwesenheit von Toxizität oder Immunogenität haben zu vielfältigen und umfangreichen Anwendungen geführt. In der ästhetischen Dermatologie hat sich Hyaluronsäure zum beliebtesten Mittel für intradermale oder tiefere subkutane Injektionen zur Verbesserung von Falten und anderen kosmetischen Defekten entwickelt.
Hyaluronsäure und ihre Salze werden in Gegenwart von Hyaluronidasen und freien Radikalen abgebaut. Die Wirkung von Hyaluronan-Produkten kann in der Haut immerhin bis zu 12 Monate anhalten (Fakhari A & Berkland C. Acta biomater. 2013;9(7):7081-7092). Zur Erhaltung der Hautelastizität und des Feuchthaltevermögens wird dennoch seit Jahren nach Möglichkeiten gesucht, den Abbau von Hyaluronsäure und ihren Salzen zu verringern.
Um die Stabilität von Hyaluronan zu erhöhen, wird gemäß der internationalen Patentanmeldung WO 2005/110439 einer Hyaluronan-Lösung Polyethylenglykol zugesetzt. Die internationale Patentanmeldung WO 2011/110894 schlägt für diesen Zweck Mannit (Mannitol) vor. Die internationale Patentanmeldung WO 2003/043660 offenbart die Verwendung von Diethylentriaminpenta(methylenphosphonsäure) zur Verringerung der Zersetzungsrate von Natriumhyaluronat in Konzentrationen über 0,3%. US 2014/0004210 offenbart die Anwendung von Rosmarinextrakt und Vitamin A oder eines Vorläufers oder Derivats davon zur Hemmung von Hyaluronidasen. Die internationale Patentanmeldung WO 2018/118448 schlägt die Verwendung von Extrakt aus violettem Reis und Dikaliumglycyrrhizat ((3β,20β)-20-Carboxy-11-oxo-30-norolean-12-en-3-yl-2-O-β-D-glucopyranuronosyl-β-D-glucopyranosiduronsäure) zur Hemmung von Hyaluronidasen vor. WO 2014/23272 offenbart ein Derivat der Hyaluronsäure mit erhöhter Stabilität. Es handelt sich dabei um teilweise oxidierte Hyaluronsäure mit α,β-ungesättigten Aldehydgruppen.
Zusammenfassung
In einem ersten Aspekt ist hier das Säugetierprotein ITIH5 zur Anwendung in einem Verfahren zur Linderung oder Vorbeugung von Hautalterung und/oder faltiger Haut offenbart. Das Säugetierprotein ITIH5 ist auch zur Anwendung in einem Verfahren zur Linderung oder Vorbeugung von rauer Haut und/oder trockener Haut offenbart.
In einem zweiten Aspekt ist hier das Säugetierprotein ITIH5 zur Anwendung in einem Verfahren für die Behandlung einer Arthritis oder einer Gelenksarthrose bzw. für die Behandlung eines arthritischen und/oder arthrotischen Gelenks oder eines Gelenks mit arthrotischen Veränderungen offenbart.
In einem verwandten dritten Aspekt ist eine kosmetische, nicht-therapeutische Verwendung des Säugetierproteins ITIH5 als Stabilisator von Hyaluronsäure oder einem Salz davon offenbart.
In einigen Ausführungsformen nach dem ersten, dem zweiten oder dem dritten Aspekt ist das Protein ITIH5 das humane Protein, inklusive einer natürlich vorkommenden Variante oder einer natürlich vorkommenden Isoform davon. In einigen Ausführungsformen ist das Protein ITIH5 das murine Protein, inklusive einer natürlich vorkommenden Variante oder einer natürlich vorkommenden Isoform davon. In einigen Ausführungsformen ist das Protein ITIH5 ein rekombinantes Protein. In einigen Ausführungsformen ist das Protein ITIH5 ein gereinigtes Protein. In einigen Ausführungsformen ist die das Protein ITIH5 von medizinischer Qualität.
In einigen Ausführungsformen nach dem ersten oder dem dritten Aspekt zählt es zur Anwendung bzw. zur Verwendung, das Säugetierprotein ITIH5 auf und/oder in eine biologische keratinische Struktur wie keratinisches Gewebe zu applizieren. In einigen Ausführungsformen zählt es zur Anwendung, das Säugetierprotein ITIH5 auf und/oder in die Haut eines Subjekts zu applizieren. In einigen Ausführungsformen zählt es zu einem solchen Verfahren, das Säugetierproteins ITIH5 durch die Hautbarriere eines Subjekts, beispielsweise einer Person, zu applizieren. In einigen Ausführungsformen zählt es zu einem solchen Verfahren, eine Applikation des Säugetierproteins ITIH5 mit einer Laserbehandlung oder einer thermomechanischen Ablation zu kombinieren. In einigen Ausführungsformen zählt es zu einem solchen Verfahren, eine Applikation des Säugetierproteins ITIH5 mit einer Needlingbehandlung zu kombinieren.
In einigen Ausführungsformen nach dem zweiten oder dem dritten Aspekt zählt zur Anwendung bzw. zur Verwendung eine Applikation des Säugetierprotein ITIH5 in ein Gelenk, beispielsweise eine intraartikuläre Injektion von ITIH5.
In einem verwandten vierten Aspekt ist das Säugetierprotein ITIH5 zur Anwendung an einem Subjekt offenbart, das an verminderter Hyaluronsäure leidet. Dadurch, dass mittels einer hier offenbarten Anwendung Hyaluronsäure stabilisiert wird, wird ihr Abbau verringert und somit indirekt die Menge an Hyaluronsäure erhöht.
In einem verwandten fünften Aspekt ist ein Verfahren zur Linderung oder Vorbeugung eines oder mehrerer Hautprobleme offenbart. Bei dem oder den Hautproblem(en) kann es sich um Akne und/oder Akne-Narben handeln. Bei dem Hautproblem kann es sich auch um Hautatrophie handeln. Beispielsweise kann es sich um eine Nebenwirkung einer topischen Glukokortikoid-Behandlung handeln. Bei einem entsprechenden Hautproblem kann es sich auch um ein Druckgeschwür (Dekubitus) handeln. Zum Verfahren zählt die Verabreichung von ITIH5.
In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren nach dem fünften Aspekt, das Säugetierprotein ITIH5 auf und/oder in eine biologische keratinische Struktur wie keratinisches Gewebe zu applizieren. In einigen Ausführungsformen zählt es zur Anwendung, das Säugetierprotein ITIH5 auf und/oder in die Haut eines Subjekts zu applizieren. In einigen Ausführungsformen zählt es zu einem solchen Verfahren, das Säugetierprotein ITIH5 durch die Hautbarriere eines Subjekts, beispielsweise einer Person, zu applizieren. In einigen Ausführungsformen zählt es zu einem solchen Verfahren, eine Applikation des Säugetierproteins ITIH5 mit einer Laserbehandlung oder einer thermomechanischen Ablation zu kombinieren. In einigen Ausführungsformen zählt es zu einem solchen Verfahren, eine Applikation des Säugetierproteins ITIH5 mit einer Needlingbehandlung zu kombinieren.
In einigen Ausführungsformen des Verfahrens nach dem fünften Aspekt betrifft das Hautproblem bzw. betreffen die Hautprobleme ein Subjekt, dass an verminderter Hyaluronsäure leidet. Dadurch, dass mittels eines hier offenbarten Verfahrens Hyaluronsäure stabilisiert wird, wird ihr Abbau verringert und somit indirekt die Menge an Hyaluronsäure erhöht.
In einem sechsten Aspekt ist ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Arthrose und/oder Arthritis offenbart. Zum Verfahren zählt die Verabreichung von ITIH5. Zu diesem Verfahren kann eine Injektion in ein von Arthrose und/oder Arthritis betroffenes Gelenk zählen. Zu diesem Verfahren kann auch eine Injektion in ein Gelenk zählen, für das bekannt ist, dass es einem erhöhten Risiko ausgesetzt ist, von Arthrose und/oder Arthritis betroffen zu werden.
In einem siebten Aspekt ist eine Zusammensetzung offenbart, die das Säugetierprotein ITIH5 enthält. Bei dem Säugetierprotein ITIH5 handelt es sich um das reife Volllängenprotein. In einigen Ausführungsformen ist das Säugetierprotein ITIH5 von medizinischer Qualität.
Typischerweise definiert die Zusammensetzung eine Lösung, beispielsweise eine wässrige Lösung oder ein Gel. In einigen Ausführungsformen besteht die Zusammensetzung im Wesentlichen aus dem Säugetierprotein ITIH5 und Wasser. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung das Säugetierprotein ITIH5 und Wasser.
Die Zusammensetzung gemäß dem siebten Aspekt enthält in einigen Ausführungsformen 0,1 bis 25 Gewichtsprozent des Säugetierproteins ITIH5, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung.
In einigen Ausführungsformen der Zusammensetzung ist ITIH5 das entsprechende humane Protein. In einigen Ausführungsformen ist die Zusammensetzung nach dem siebten Aspekt eine pharmazeutische Formulierung. In einigen Ausführungsformen ist die Zusammensetzung nach dem siebten Aspekt eine kosmetische Zusammensetzung. In einigen Ausführungsformen ist die Zusammensetzung nach dem siebten Aspekt eine pharmazeutische oder kosmetische Formulierung.
In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin einen Füllstoff. Ein derartiger Füllstoff ist ein Material das in der Lage ist, Hautgewebe zu füllen. Ein solcher Füllstoff kann ein Protein, ein Polysaccharid oder ein Gemisch davon enthalten. Ein solcher Füllstoff kann auch aus Protein, aus einem Polysaccharid oder einem Gemisch davon bestehen. Ein solcher Füllstoff kann auch Kollagen und/oder Alginat enthalten. Ein entsprechender Füllstoff kann auch Dextran und/oder Elastin enthalten. Ein solcher Füllstoff kann auch Polyurethan und/oder Hyaluronsäure, ein Salz oder einen Ester davon enthalten. In einer Ausführungsform enthält die Zusammensetzung nach dem siebten Aspekt das Säugetierprotein ITIH5 und Hyaluronsäure, ein Salz oder einen Ester der Hyaluronsäure. In einer Ausführungsform besteht die Zusammensetzung im Wesentlichen aus dem Säugetierprotein ITIH5, Hyaluronsäure - oder einem Salz oder einen Ester davon - und Wasser. In einigen Ausführungsformen ist die Hyaluronsäure von medizinischer Qualität.
Die Zusammensetzung gemäß dem siebten Aspekt ist in einigen Ausführungsformen eine Formulierung zur Injektion. Dabei kann es sich um intradermale oder tiefere subkutane Injektion handeln. In einigen Ausführungsformen ist die Zusammensetzung eine pharmazeutisch zulässige injizierbare Formulierung. In einigen Ausführungsformen ist die Zusammensetzung eine intraartikuläre Formulierung zur Behandlung von Arthrose. Dabei kann es sich um Formulierung zur intraartikulären Injektion handeln. In einigen Ausführungsformen ist die Zusammensetzung eine Formulierung für die Einmal-Injektion.
In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung einen kosmetisch und/oder pharmazeutisch verträglichen Arzneiträgerstoff. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin ein Lokalanästhetikum. Beispiele eines geeigneten Lokalanästhetikums sind Lidocain und Mepivacain. In einer Ausführungsform ist Lidocain zu 0,3 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, in dieser enthalten.
In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung Hyaluronsäure, die ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 600 Kilodalton oder mehr oder von etwa 800 Kilodalton oder mehr hat. In einigen Ausführungsformen hat die in der Zusammensetzung enthaltene Hyaluronsäure ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 1000 Kilodalton oder mehr, inklusive beispielsweise von etwa 1500 Kilodalton oder mehr. In einigen Ausführungsformen hat die in der Zusammensetzung enthaltene Hyaluronsäure ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 3000 Kilodalton oder mehr.
In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung 0,05 bis 20 Gewichtsprozent Hyaluronsäure, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung 0,5 bis 15 Gewichtsprozent Hyaluronsäure, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung 1 bis 25 Gewichtsprozent Hyaluronsäure, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung 3 Gewichtsprozent oder mehr an Hyaluronsäure. Wenn nicht explizit anders angegeben, sind alle hier offenbarten Angaben in Gewichtsprozent, bezogen auf das Gesamtgewicht der jeweiligen Zusammensetzung.
In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung zu 0,1 bis 15 Gewichtsprozent das Säugetierprotein ITIH5, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung zu 1 bis 10 Gewichtsprozent das Säugetierprotein ITIH5, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung.
In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin eine oder mehrere Aminosäuren. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin Chondroitinsulfat oder Diglycerin. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin Erythrit. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin Fructose und/oder Glucose. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin Mannose und/oder Galactose. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin Laevulose und/oder Lactose. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin Glycerin und/oder ein Glycerinpolymer. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin Glycol und/oder 1,2,6-Hexantriol. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin Propylenglykol. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin Honig, inklusive hydrierten Honig. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin Trehalose und/oder Xylitol. Sorbit und/oder Saccharose. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin Inositol und/oder Lactitol. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin Maltit und/oder Maltose. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin Mannit. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin ein hydriertes Stärkehydrolysat. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin PEG-15 Butandiol. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin Polyglycerylsorbit und/oder Saccharidisomerat. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin ein oder mehrere Salze der Pyrrolidoncarbonsäure. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin Natriumglucuronat und/oder Harnstoff.
Die Zusammensetzung nach dem siebten Aspekt ist in einigen Ausführungsformen ein Hautpflegemittel zur topischen Anwendung oder ein Bestandteil eines solchen. In einigen Ausführungsformen ist die Zusammensetzung für eine Anwendung in injizierbarer Form geeignet. In einigen Ausführungsformen ist die Zusammensetzung ein Präparat zur intradermalen oder subkutanen Injektion oder ein Bestandteil eines solchen.
In einem achten Aspekt ist ein Verfahren zur kosmetischen Behandlung offenbart. In einigen Ausführungsformen handelt es sich um ein Verfahren zur kosmetischen Behandlung einer biologischen keratinischen Struktur wie z.B. keratinischem Gewebe. In solchen Ausführungsformen wird das Säugetierproteins ITIH5 auf und/oder in die biologische keratinische Struktur wie keratinisches Gewebe aufgebracht. In einigen Ausführungsformen zählt es zu diesem Verfahren, das Säugetierproteins ITIH5 auf eine Person aufzutragen. In einigen Ausführungsformen zählt es zu einem solchen Verfahren, das Säugetierproteins ITIH5 durch die Hautbarriere eines Subjekts, beispielsweise einer Person zu applizieren. In einigen Ausführungsformen handelt es sich bei dem Subjekt um eine Person, die an einer Verringerung der Hyaluronsäure leidet. Typischerweise wird in derartigen Ausführungsformen das Säugetierprotein ITIH5 auf oder in die Haut des entsprechenden Subjekts aufgetragen.
In einigen Ausführungsformen zählt es zu einem solchen Verfahren, eine Applikation des Säugetierproteins ITIH5 mit einer Laserbehandlung oder einer thermomechanischen Ablation zu kombinieren. In einigen Ausführungsformen zählt es zu einem solchen Verfahren, eine Applikation des Säugetierproteins ITIH5 mit einer Needlingbehandlung zu kombinieren.
Eine kosmetische Behandlung gemäß dem achten Aspekt kann in einigen Ausführungsformen zum Ziel haben, Hautqualität, Hauttonus und/oder Gesichtsvolumen zu verbessern. Eine kosmetische Behandlung gemäß dem achten Aspekt kann auch zum Ziel haben, der mit dem Alterungsprozess einhergehenden Abnahme von Hyaluronsäure in der Haut gegenzusteuern.
In einem neunten Aspekt wird ein Antikörper gegen ITIH5 zur Anwendung gegen eine Entzündungsreaktion offenbart. Eine derartige Entzündungsreaktion ist typischerweise eine Dermatitis.
In einigen Ausführungsformen wird ein Antikörper gegen ITIH5 zur Anwendung in einem Verfahren zur Linderung oder Vorbeugung von allergischer Kontaktdermatitis offenbart. In einigen Ausführungsformen wird ein Antikörper gegen ITIH5 zur Anwendung in einem Verfahren zur Linderung oder Vorbeugung von atopischer Dermatitis offenbart.
In einem zehnten Aspekt ist ein in-vitro-Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung offenbart, die als Stabilisator von Hyaluronsäure und/oder einem Salz davon geeignet ist. Zum Verfahren zählt es, in Gegenwart von Hyaluronsäure eines festgelegten Molekulargewichts oder einem Salz davon in einer Lösung, die ein Cu(II)-Salz und H₂O₂ enthält, eine zu prüfende Verbindung mit ITIH5 in Kontakt zu bringen. Zum Verfahren zählt es weiterhin, das Molekulargewicht der Hyaluronsäure oder des Salzes davon nach einem vorbestimmten Zeitintervall zu bestimmen. Eine im Vergleich zu einer Kontrolle verringerte Abnahme des Molekulargewichts der Hyaluronsäure zeigt an, dass die zu prüfende Verbindung als Stabilisator von Hyaluronsäure oder einem Salz davon geeignet ist.
Die im Vorangehenden beschriebene Zusammenfassung ist nicht einschränkend und weitere Merkmale und Vorteile des hier beschriebenen Verfahrens und der hier beschriebenen Verwendung sollten aus der folgenden ausführlichen Beschreibung, den Abbildungen und den Patentansprüchen ersichtlich sein.
Figurenliste

1 zeigt, dass ITIH5 EZM-Strukturen stabilisiert und die Genexpression moduliert. Die Analyse von EZM-Strukturen in 3D-Hautmodellen von Itih5^+/+- und Itih5^-/--Mäusen erfolgte mittels Van-Gieson-Färbung und einem Hyaluronan-bindenden protein (HABP). Es sind repräsentative Bilder gezeigt. 1A zeigt Itih5^+/+-Hautmodelle mit Van-Gieson-Färbung. 1B zeigt Itih5^+/+-Hautmodelle mit HABP. Im Originalbild enthaltene grüne und blaue Färbung sind unverändert gezeigt, wobei grün Hyaluronsäure und blau Nuklei zeigt. 1C zeigt Itih5^+/+-Hautmodelle mit HABP. Im Originalbild enthaltene blaue Färbung, die Nuklei zeigt, wurde durch Reduzieren der Farbintensität nahezu auf Dunkelheit reduziert. Somit zeigt 1C im Wesentlichen die im Originalbild enthaltene grüne Färbung, die Hyaluronsäure zeigt. 1D zeigt Itih5^+/+-Gewebe mit HABP. Signale der im Originalbild enthaltenen grünen Färbung, die Hyaluronsäure zeigt, wurden durch Reduzieren der Farbintensität nahezu auf Dunkelheit reduziert. 1D zeigt daher im Wesentlichen die im Originalbild enthaltene blaue Färbung, die Nuklei zeigt. 1E zeigt Itih5^-/--Hautmodelle mit Van-Gieson-Färbung. 1F zeigt Itih5^+/+-Hautmodelle mit HABP. Im Originalbild enthaltene grüne und blaue Färbung ist unverändert gezeigt, wobei auch hier grün Hyaluronsäure und blau Nuklei repräsentiert. 1G zeigt Itih5^-/--Hautmodelle mit HABP. Die Farbintensität der im Originalbild enthaltenen blauen Färbung, die Nuklei wiedergibt, wurde so weit reduziert, dass die Signale nahezu auf Dunkelheit reduziert sind. 1G zeigt somit im Wesentlichen die im Originalbild enthaltene grüne Färbung, die Hyaluronsäure wiedergibt. 1H zeigt Itih5^-/--Gewebe mit HABP. Im Originalbild enthaltene grüne Färbung, die Hyaluronsäure zeigt, ist durch Reduzieren der Farbintensität nahezu auf Dunkelheit reduziert. 1H zeigt daher im Wesentlichen die im Originalbild enthaltene blaue Färbung, die Nuklei zeigt. 11 zeigt eine Mikroarray-Analyse, die im Vergleich zu WT-Kontrollen unterschiedlich exprimierte Gene in Itih5^-/--Hautmodellen zeigt. Die Genexpression wurde mit dem Affymetrix® Mouse Gene 2.0 ST Array gemessen. 1K bis 1Q zeigen das Ergebnis einer TaqMan Echtzeit-PCR-Analyse ausgewählter Gene, nämlich CAR4 (1K), POSTN (1L), MMP19 (1M), LOR (1N), KRT10 (1O), RPTN (1P) und LCE3A (1Q). Es wurden die Mittelwerte zweier unabhängiger Experimente mit Dreifach-Werten +/- Standardabweichung angezeigt. *p<0.05, **p<0.01.
2 zeigt, dass ITIH5 den Hyaluronsäure-Abbau durch ROS in vitro hemmt. Eine stabilisierende/ schützende Wirkung von ITIH5 auf Hyaluronsäure wurde untersucht, indem ein Hyaluronsäure-Abbau-Assay durchgeführt wurde, bei dem ein CuSO₄/H₂O₂-System eingesetzt wurde, um ROS herzustellen, das Hyaluronsäure abbauen kann. Die unbehandelte Kontrolle des Hyaluronsäure-Natriumsalzes wird in Spur 1 dargestellt, nur mit CuSO₄ oder nur mit H₂O₂ behandelten Hyaluronsäure-Natriumsalz-Kontrollen in Spur 2 und 3. Während ROS das Hyaluronsäuresalz abbaute (Spur 4), hemmten verschiedene Konzentrationen von Itih5 den Abbau von Hyaluronsäure (Spuren 5-7). Es ist ein repräsentatives Gel von dreien gezeigt. Das Molekulargewicht von Hyaluronsäure nach der Inkubation wurde durch SDS-Gelelektrophorese und Färbung mit „Stains all“ analysiert.
3 zeigt, dass ein ITIH5-Knockdown die Zell-Matrix-Adhäsion von normalen humanen dermalen Fibroblasten (NHDFs) an Hyaluronsäure verringert. 3A und B zeigen die ITIH5-Proteinexpression (3A Western Blot und 3B densitometrische Analyse) in ITIH5-shRNA-Knockdown-Klonen und einer NT-shRNA-Kontrolle. β-Actin diente als Ladekontrolle. 3C zeigt die Zell-Matrix-Adhäsion von ITIH5-shRNA-Knockdown-Klonen und NT-shRNA-Kontrolle auf Hyaluronsäure/Hyaluronan-Substrat. Die Balkendarstellung in 3C stellt den Durchschnitt von drei unabhängigen Experimenten dar. ***p<0.001.
4 zeigt, dass Itih5 eine entscheidende Rolle bei allergischer Kontaktdermatitis spielt. 4A: Itih5^+/+- und Itih5^-/--Mäuse wurden mit TNCB (3%) oder Aceton als Lösungsmittelkontrolle sensibilisiert und 5 Tage später einer Belastung mit TNCB (1%) ausgesetzt. Itih5^-/--Mäuse zeigten keine Ohrenschwellung. Die Daten zeigen eine mittlere Zunahme der Ohrendicke ± Standardabweichung mit n=5 Mäusen/Gruppe, **p<0.01. 4B: Lymphknotenzellen, die aus TNCB-sensibilisierten Itih5^-/--Spendermäusen isoliert wurden, wurden adoptiv auf WT-Empfängermäuse übertragen. Die Daten zeigen eine mittlere Zunahme der Ohrendicke ± Standardabweichung mit n=3 Mäusen/Gruppe, *p<0.05, ns=nicht signifikant.
5 zeigt, dass die Injektion des rekombinanten ITIH5-Proteins zu einer Zunahme der Epidermisdicke in humanen 3D-Hautmodellen führt. 5A und B zeigen exemplarische Querschnitte eines unbehandelten 3D-Hautmodells (5A) und eines Models, in das rekombinantes ITIH5-Protein injiziert wurde (5B). 5C: In den Querschnitten wurde die Epidermisdicke an 6 verschiedenen Punkten vermessen. Die Auswertung zeigt, dass die Modelle, in die ITIH5 injiziert wurde, eine signifikant (p<0,01) höherer Epidermisdicke aufweisen.
6 zeigt tabellarisch Daten zur Gen-Ontologie-Analyse von Microarray-Daten von Itih5^-/- -Hautmodellen.
7 zeigt eine Mikroarray-Analyse, die im Vergleich zu unbehandelten 3D-Hautmodellen unterschiedlich exprimierte Gene in Hautmodellen zeigt, in die ITIH5 injiziert wurde. Die Genexpression wurde mit dem Clariom S Array gemessen.

Ausführliche Beschreibung
Soweit nicht anders angegeben, haben die folgenden Begriffe und Ausdrücke, wenn sie in diesem Dokument, inklusive Beschreibung und Patentansprüchen, verwendet werden, die im Folgenden angegebenen Bedeutungen.
Der Ausdruck „bestehend aus“ wie in diesem Dokument verwendet, bedeutet einschließend und begrenzt auf das, was auf den Begriff „bestehend aus“ folgt. Der Begriff „bestehend aus“, gibt somit an, dass aufgeführte Elemente erforderlich oder notwendig sind und dass keine weiteren Elemente vorhanden sein dürfen. Der Begriff „im Wesentlichen bestehend aus“ wird dahingehend verstanden, dass er bedeutet, dass jedwede Elemente, die nach dem Ausdruck definiert sind, umfasst sind und dass weitere Elemente, beispielsweise in einer Probe oder einer Zusammensetzung zugegen sein können, die die Aktivität oder Wirkung, die für die betreffenden Elemente in diesem Dokument angegeben sind, nicht verändern, also sie nicht beeinträchtigen und nicht zu ihr beitragen. Anders gesagt gibt der Ausdruck „im Wesentlichen bestehend aus“ an, dass die definierten Elemente notwendig oder erforderlich sind, dass aber weitere Elemente optional sind und zugegen sein können oder nicht, je nachdem, ob sie für die Wirkung oder Wirksamkeit der definierten Elemente von Belang sind oder nicht.
Das Wort „etwa“ bezieht sich, wenn hier verwendet auf einen Wert, der für einen bestimmten Wert, wie von einem Durchschnittsfachmann bestimmt, innerhalb eines akzeptablen Fehlerbereichs liegt. Dies wird teilweise davon abhängig sein, wie der jeweilige Wert ermittelt oder gemessen worden ist, d.h. von den Einschränkungen des Messsystems. „Etwa“ kann beispielsweise innerhalb einer Standardabweichung von 1 oder mehr bedeuten, je nach Gebrauch im jeweiligen Gebiet. Der Begriff „etwa“ wird auch verwendet um anzugeben, dass der Betrag oder Wert der bezeichnete Wert sein kann oder ein anderer Wert, der näherungsweise gleich ist. Der Begriff soll ausdrücken, dass ähnliche Werte gleichwertige Ergebnisse oder Wirkungen, wie in diesem Dokument offenbart, begünstigen. In diesem Zusammenhang kann „etwa“ sich auf einen Bereich von bis zu 10 % über und/oder unter einem bestimmten Wert beziehen. In einigen Ausführungsformen bezieht „etwa“ sich auf einen Bereich von bis zu 5 % über und/oder unter einem bestimmten Wert, wie etwa 2 % über und/oder unter einem bestimmten Wert. In einigen Ausführungsformen bezieht „etwa“ sich auf einen Bereich von bis zu 1 % über und/oder unter einem bestimmten Wert. In einigen Ausführungsformen bezieht „etwa“ sich auf einen Bereich von bis zu 0,5 % über und/oder unter einem bestimmten Wert. In einer Ausführungsform bezieht sich „etwa“ auf einen Bereich von bis zu 0,1 % über und/oder unter einem bestimmten Wert.
Der Begriff „im Wesentlichen identisch“, wenn hier im Zusammenhang mit zwei Nukleinsäuren oder Polypeptiden verwendet, bezieht sich auf eine Sequenz, die mindestens 95% Sequenzidentität mit einer Bezugssequenz aufweist. Die prozentuale Identität kann eine beliebige ganze Zahl von 95% bis 100% sein. In einigen Ausführungsformen liegt die Identität bei wenigstens 96 % oder bei wenigstens 97 %, verglichen mit einer Bezugssequenz unter Verwendung von BLAST mit Standardparametern. In einigen Ausführungsformen liegt die Identität bei wenigstens 98 % oder bei wenigstens 98,5 % unter Verwendung von BLAST mit Standardparametern. In einigen Ausführungsformen liegt die Identität bei wenigstens 99 % oder bei wenigstens 99,5 % verglichen mit einer Bezugssequenz unter Verwendung von BLAST mit Standardparametern.
Nukleinsäure- oder Proteinsequenzen, die im Wesentlichen identisch mit einer Bezugssequenz sind, enthalten in der Regel eine oder mehrere „konservativ modifizierte Varianten“. Bei Nukleinsäuresequenzen bezieht sich eine konservativ modifizierte Variante auf solche Nukleinsäuren, die identische oder im Wesentlichen identische Aminosäuresequenzen kodieren oder, wenn die Nukleinsäuresequenz keine Aminosäuresequenz kodiert, auf im Wesentlichen identische Sequenzen. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ergibt sich eine erhebliche Anzahl funktionell identischer Nukleinsäuren, die für ein bestimmtes Protein kodieren. Beispielsweise kodieren die Codons GCA, GCC, GCG und GCU alle die Aminosäure Alanin. So kann an jeder Stelle, an der ein Alanin durch ein Codon spezifiziert ist, das Codon in jedes der entsprechenden anderen Codons geändert werden, ohne dass sich das codierte Polypeptid verändern würde. Solche Nukleinsäuresequenzvarianten sind „stille Variationen“, die eine Form von konservativ modifizierten Variationen darstellen. Anhand jeder hier beschriebene Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid kodiert, lässt sich auch jede mögliche stille Variation der Nukleinsäure ermitteln. Dementsprechend ist jede stille Variation einer Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, in jeder beschriebenen Sequenz implizit offenbart.
Der Ausdruck „biologische keratinische Struktur“ bezieht sich allgemein auf biologische Strukturen, die zumindest zum Teil aus Keratin bestehen oder Keratin enthalten. Dabei kann es sich zum Beispiel um Haare und Nägel handeln. Es kann sich auch um ein Gewebe wie Haut handeln. Ein solches Gewebe kann ein körpereigenes Gewebe oder ein künstlich erzeugtes Gewebe sein.
Unter einer „wirksamen Menge“ einer hier offenbarten Zusammensetzungen wird eine Dosis verstanden, die, wenn sie einem bedürftigen Subjekt verabreicht wird, eine Konzentration erreicht, die eine positive biologische Wirkung bei der Behandlung, Vorbeugung oder Linderung von Hautproblemen und/oder Läsionen wie Wunden oder Geschwüren oder beispielsweise Narben oder bei der Behandlung von arthritischen Gelenken hat. Eine solche wirksamer Menge kann vom behandelnden Arzt eines Patienten oder vom Tierarzt eines betroffenen Tieres bestimmt werden und kann im Rahmen üblicher Techniken ermittelt werden. Zu den Faktoren, die die therapeutisch wirksame Menge beeinflussen, gehört beispielsweise die Art der Verabreichungen oder ggf. der Läsionstyp, wie mechanisch oder thermisch, Voll- oder Teildicke, und Größe und Tiefe einer Läsion. Auch das Alter des betroffenen Subjekts kann eine Rolle spielen.
Der Konjunktionalausdruck „und/oder“ zwischen mehreren Elementen, wenn hier verwendet, wird als sowohl individuelle als auch kombinierte Optionen umfassend verstanden. Sind beispielsweise zwei Elemente durch „und/oder“ verknüpft, betrifft eine erste Option den Einsatz des ersten Elements ohne das zweite. Eine zweite Option betrifft den Einsatz des zweiten Elements ohne das erste. Eine dritte Option betrifft den Einsatz des ersten und des zweiten Elements zusammen. Es wird verstanden, dass jede beliebige dieser Optionen unter die Bedeutung des Ausdrucks fällt und somit die Bedingungen des Begriffs „und/oder“, wie in diesem Dokument verwendet, erfüllt.
Der Begriff „reaktive Sauerstoffspezies“ bezieht sich auf chemisch reaktive Sauerstoff enthaltende Moleküle, inklusive Radikale und Ionen, die vom molekularem Sauerstoff abgeleitet sind. Beispiele sind Peroxide, das Hyperoxid-Anion (Superoxid-Anion) O₂·^-, das Hydroxylradikal OH-, das Hydroperoxyl-Radikal HOO·, Singulett-Sauerstoff ¹O₂ (angeregte Sauerstoffmoleküle), Ozon O₃ und Wasserstoffperoxid H₂O₂. Eine kommentierte Zusammenstellung einiger reaktiver Sauerstoffspezies findet sich in Tabelle 2 der internationalen Patentanmeldung WO 2011/110894 .
Reaktive Sauerstoffspezies entstehen in den Mitochondrien als Nebenprodukt der Zellatmung. Reaktive Sauerstoffspezies sind daneben Bestandteil der Tötungsantwort von Immunzellen auf mikrobielle Invasionen und fungieren als Botenstoff in der normalen Zellsignaltransduktion und im Zellzyklus. Umweltgifte und Zigarettenrauch sind weitere bedeutende Quellen für reaktive Sauerstoffspezies. Zellen besitzen eine Reihe von Abwehrmechanismen, um die schädlichen Auswirkungen reaktiver Sauerstoffspezies zu lindern. So katalysiert das Enzym Superoxiddismutase die Umwandlung von zwei Hyperoxidanionen in ein Molekül Wasserstoffperoxid und ein Molekül Sauerstoff. In den Peroxisomen eukaryontischer Zellen wandelt das Enzym Katalase Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff um.
Der Begriff „Subjekt“ bezieht sich auf einen lebenden Organismus, typischerweise auf ein Säugetier. Beispiele eines Subjekts sind ein Mensch oder ein Hund. Auch eine Kuh oder ein Pferd sind Beispiele eines Subjekts. Weitere Beispiele eines Subjekts sind ein Affe oder ein Schwein. Beispiele eines Subjekts sind auch eine Ratte oder eine Maus. Ein Meerschweinchen oder ein Hamster sind weitere Beispiele eines Subjekts. Auch eine Katze oder ein Kaninchen sind Beispiele eines Subjekts. Ein weiteres Beispiel eines Subjekts ist ein transgenes nichtmenschliches Tier. In einigen Fällen ist das Subjekt ein Mensch.
Singularformen wie „eine“, „ein“, „der“, „die“ oder „das“ schließen die Pluralform ein, wenn sie in diesem Dokument verwendet werden. So bezeichnet beispielsweise eine Bezugnahme auf „eine Zelle“ sowohl eine individuelle Zelle als auch eine Mehrzahl an Zellen. In einigen Fällen wird explizit der Ausdruck „ein oder mehrere“ verwendet, um im jeweiligen Fall darauf hinzuweisen, dass die Singularform die Pluralform mit umfasst. Derartige explizite Hinweise schränken die allgemeine Bedeutung der Singularform nicht ein. Falls nicht anders angegeben, werden die Begriffe „zumindest“, „mindestens“ und „wenigstens“, wenn sie eine Abfolge von Elementen vorangehen, dahingehend verstanden, dass sie sich auf jedes dieser Elemente beziehen. Die Begriffe „zumindest ein“, „mindestens ein(e)“, „wenigstens einer“ oder „wenigstens eine(r) von“ schließen beispielsweise ein, zwei, drei, vier oder mehr Elemente ein.
Bei einer hier offenbarten Anwendung/Verwendung von ITIH5 und einem Verfahren zur kosmetischen Behandlung der Haut oder eines Gelenks eines Subjekts mittels ITIH5 wird typischerweise die im Gewebe des behandelten Subjekts, beispielsweise in dessen Haut, vorhandene Hyaluronsäure stabilisiert. Für einen derartigen Einsatz kann es ausreichen, eine Lösung zu verwenden, die im Wesentlichen aus ITIH5 und Wasser besteht. Es sind in eine solchen Lösung ggf. ein oder mehrere Trägerstoffe vorhanden, die dazu beitragen, dass ITIH5 stabil in Lösung bleibt, beispielsweise ein Puffer. In einigen Ausführungsformen kann eine Creme oder ein Gel eingesetzt werden. Ein entsprechendes Gel kann im Wesentlichen aus einem Gelbilder, z.B. einen entsprechenden Verdickungs- und/oder Bindemittel und ITIH5 bestehen.
Eine Anwendung von ITIH5, sowie eine Verwendung einer hier offenbarten Zusammensetzung zu kosmetischen Zwecken dient in einigen Ausführungsformen der Verjüngung des Hautgewebes eines Subjekts. Dabei wird eine wirksame Menge von ITIH5 in oder auf die Haut eines Subjekts verbracht. Wenn eine hier offenbarte Zusammensetzung zu kosmetischen Zwecken eingesetzt wird, kann sie auf verschiede Weise in oder auf die Haut eines Subjekts verbracht werden. Beispielsweise kann eine entsprechende Lösung subepidermal, d.h. intradermal oder subkutan verabreicht werden. Dies kann mit Hilfe einer herkömmlichen Nadelspritze oder durch die dem Fachmann bekannte nadellose Spritzentechnologie erfolgen.
Auch eine medizinische Anwendung von ITIH5, sowie eine Verwendung einer hier offenbarten Zusammensetzung zu therapeutischen Zwecken kann der Behandlung von Hautalterungserscheinungen, beispielsweise auf Grund von Umwelteinflüssen oder als Nebenwirkung einer vorherigen Therapie, dienen. Als weiteres Beispiel kann eine medizinische Anwendung von ITIH5 und/oder einer hier offenbarten Zusammensetzung der Behandlung von Arthrose dienen. Eine medizinische Anwendung von ITIH5 und/oder einer hier offenbarten Zusammensetzung kann auch der Behandlung von Neurodermitis dienen. Auch im Falle einer medizinischen Anwendung von ITIH5 und einer Verwendung einer hier offenbarten Zusammensetzung zu therapeutischen Zwecken wird eine wirksame Menge von ITIH5 in oder auf die Haut eines Subjekts verbracht.
Eine medizinische Anwendung von ITIH5, sowie eine Verwendung einer hier offenbarten Zusammensetzung zu therapeutischen Zwecken kann auch der Behandlung von arthritischen und/oder arthrotischen Gelenken dienen. Hyaluronsäure stellt die Viskosität und Elastizität der Synovialflüssigkeit eines Gelenks bereit. Sie trägt zur Gelenkschmierung bei, puffert die Lastübertragung über die Gelenkflächen ab und verleiht der Synovialflüssigkeit entzündungshemmende Eigenschaften. Bei Arthrose sind das Molekulargewicht und die Menge an Hyaluronsäure in der Synovialflüssigkeit vermindert, was die Fähigkeit der Synovialflüssigkeit, effektiv zu funktionieren, beeinträchtigt. Eine Stabilisierung der Hyaluronsäure mittels ITIH5 erhöht die Menge an vorhandener Hyaluronsäure in der Synovialflüssigkeit und führt daher zu einer therapeutischen Verbesserung. Offenbart ist in diesem Zusammenhang ITIH5 zur Anwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung einer Knorpeldegeneration und einer Arthrose- oder Arthritiserkrankung. Offenbart ist auch eine ITIH5 enthaltende Formulierung ITIH5 zur Anwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung einer Knorpeldegeneration und einer Arthrose- oder Arthritiserkrankung.
Wie bereits zuvor erwähnt, wird ITIH5 bzw. die Zusammensetzung in einigen Ausführungsform einem Subjekt topisch verabreicht. Die Epidermis stellt für eine Anwendung an der Haut eine Barriere dar, die den Eintritt von ITIH5 in intradermale und subkutane Hautschichten verringert. Daher wird ITIH5 bzw. die Zusammensetzung in einigen Ausführungsform einem Subjekt intradermal oder subkutan verabreicht. Es stehen dem Fachmann in dieser Hinsicht verschiedene Techniken zur Verfügung, mit denen ITIH5 über die Hautbarriere transportiert werden kann. So kann eine Injektionsvorrichtung oder beispielsweise eine Rollvorrichtung für die transmukosale oder transepidermale Verabreichung eingesetzt werden. Eine geeignete minimal-invasive Technik ist das Microneedling. Wie beispielsweise von Singh und Yadav (Singh, A., Yadav, S., Indian Dermatol Online J (2016) 7, 244-254) beschrieben, können mittels eines Dermarollers, der Mikronadeln enthält, in kontrollierter Weise minimale Hautverletzungen erzeugt werden, ohne die Epidermis zu schädigen. Dafür wird zuvor oder gleichzeitig eine örtliche Betäubung vorgenommen. Dermaroller sind seit Jahren in verschiedenen Varianten kommerziell erhältlich, wie auch von Singh und Yadav beschrieben.
Eine weitere geeignete minimal-invasive Technik ist ein lasergestütztes ablatives Verfahren wie das ablative fraktionale Resurfacing. Hier werden, wie z.B. von Haedersdal et al. beschrieben (Haedersdal, M., et al., Lasers in Surgery and Medicine (2010) 42, 113-122), mikroskopische vertikale Löcher bzw. Kanäle erzeugt. Durch diese lasergenerierten Kanäle kann eine Diffusion in die umgebende Dermis erfolgen. Geeignete Lasersysteme, beispielsweise mit einem CO₂-Laser, einem Erbium-Laser oder einem Erbium:Yttrium-Aluminium-Granat (Er:YAG)-Laser, sind kommerziell erhältlich, wie von Haedersdal et al. beschrieben. Auch ein nicht-sequentieller fraktionierter gepulster CO₂-Laser lässt sich einsetzen, wie beispielsweise von Huth et al. (Huth, S. et al., Exp Dermatol. (2016) 25, 12, 997-999) beschrieben.
In einigen Ausführungsformen beinhaltet das Anwenden/Verwenden von ITIH5 bzw. einer hier offenbarten Zusammensetzung den Einsatz eines Lokalanästhetikums. In einigen Ausführungsformen enthält eine hier offenbarte Zusammensetzung ein Lokalanästhetikum. Die Zusammensetzung kann beispielsweise ein Lokalanästhetikum vom Aminoamid-Typ enthalten wie z.B. Lidocain oder Ropivacain. Weitere Beispiele eines geeigneten Lokalanästhetikums vom Aminoamid-Typ sind Prilocain und Articain. Auch Bupivacain und sein S-Enantiomer Levobupivacain sind geeignete Beispiele eines Lokalanästhetikums vom Aminoamid-Typ. Weitere Beispiele eines geeigneten Lokalanästhetikums vom Aminoamid-Typ sind Etidocain und Dyclonin. Dibucain (Cinchocain) und Trimecain sind ebenfalls geeignete Beispiele eines Lokalanästhetikums vom Aminoamid-Typ. In einigen Ausführungsformen wird eine hier offenbarte Formulierung von ITIH5 in Form eines Kits mit einem Lokalanästhetikum bereitgestellt. Ein solches Kit enthält einen ersten Behälter, in dem sich die Formulierung von ITIH5 befindet. Das Kit enthält einen zweiten Behälter, in dem sich eine Formulierung eines Lokalanästhetikums befindet. In einigen Ausführungsformen kann ein solches Kit weiterhin eine Vorrichtung zur Injektion in oder durch die Haut oder eine Mikroperforationsvorrichtung für die Haut enthalten.
In einigen Ausführungsformen enthält eine hier offenbarte Zusammensetzung ein Lokalanästhetikum vom Aminoester-Typ. Die Zusammensetzung kann beispielsweise Procain oder Benzocain enthalten. Weitere Beispiele eines geeigneten Lokalanästhetikums vom Aminoester-Typ sind 2-Chlorprocain oder Oxybuprocain. Auch Proxymetacain (Proparacaine) und Tetracain sind geeignete Beispiele eines Lokalanästhetikums vom Aminoester-Typ. Als weiteres Beispiel kann eine hier offenbarte Zusammensetzung das Lokalanästhetikum Fomocain enthalten.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung der Erfinder, dass das Protein ITIH5 die Stabilität von Hyaluronsäure und ihren Salzen erhöht. So wurde beispielsweise in Abwesenheit von ITIH5 keine Faserstruktur in der Haut sowie eine Störung der Epidermis-Entwicklung und der Organisation der extrazellulären Matrix beobachtet. Auch wurde gefunden, dass die Gegenwart von rekombinantem ITIH5-Protein eine Oxidation von Hyaluronsäure bzw. ihres Natriumsalzes durch reaktive Sauerstoffspezies hemmt. Weiterhin wurde in Abwesenheit von ITIH5 eine deutlich geringere Adhäsion von Fibroblasten and die EZM beobachtet. Für diese Untersuchungen wurde erstmals rekombinantes ITIH5 hergestellt und isoliert. Auch wurde beobachtet, dass eine Injektion von rekombinantem ITIH5 im Hautmodell zu einer Änderung des Expressionsmusters von Genen führt, die mit der Änderung des Expressionsmusters vergleichbar ist, die eine Injektion von Hyaluronsäure-Präparaten bewirkt (7). Nach Zufügen des rekombinanten ITIH5 wurden in Hautmodellen Differenzierungsgene herunterreguliert. Nach Zugabe des rekombinanten ITIH5 nahm auch die Epidermisdicke zu (5).
Für eine medizinische Anwendung von ITIH5 oder eine kosmetische Verwendung davon wird in einigen Ausführungsformen eine Lösung von ITIH5 eingesetzt. Dabei handelt es sich in der Regel um eine sterile Lösung. In einigen Ausführungsformen wird eine entsprechende sterile Lösung als sterile Fertigspritze bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen wird eine sterile Lösung von ITIH5 in steriler Form in einer Ampulle bereitgestellt, die beispielsweise für Microneedling, z.B. für einen Dermaroller, verwendet werden können. In einigen Ausführungsformen wird ein steriles Gel oder ein steriles Viskoelastikum bereitgestellt.
In einer hier offenbarten Zusammensetzung ist ITIH5 in einer wirksamen Menge enthalten. In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 in einer hier offenbarten Zusammensetzung in einer Menge vorhanden, die ausreicht, um Hyaluronsäure in einem Umfang zu stabilisieren, dass der Zustand einer Säugetierhaut, beispielsweise menschlicher Haut, verbessert wird. Dabei kann die Menge zum Beispiel ausreichen, die Hydratation oder die Elastizität der Haut zu verbessern.
ITIH5 ist eine Proteinkette und ein Mitglied der gewebespezifischen Hyaluronsäurebindenden Proteine (HABP), auch Hyaladherine genannt, mit denen sich Hyaluronsäure zu großen Komplexen zusammenschließen kann und damit viele Aspekte des Zellverhaltens regulieren kann (Knudson, C.B., und Knudson W., FASEB J. (1993) 7, 1233-1241; Triggs-Raine, B., und Natowicz, M.R., World J. Biol. Chem. (2015) 6, 110-120). ITIH5 ist dabei eine schwere Kette eines Mitglieds der Proteinfamilie der Inter-α-trypsinhibitoren (ITI). Von den identifizierten HABPs sind die Mitglieder dieser Proteinfamilie insofern einzigartig, als sie im Gegensatz zu allen anderen HABPs kovalent an Hyaluronsäure gebunden sind. ITIs bestehen aus einer einheitlichen leichten Kette und fünf bisher beschriebenen homologen schweren Ketten (ITIH1 bis ITIH5) (Bost, F., et al., Eur. J. Biochem. (1998) 252, 339-346; Himmelfarb, M., et al., Cancer Lett. (2004) 204, 69-77; Zhuo, L., et al., J. Biol. Chem. (2004) 279, 38079-38082). Die leichte Kette ist ein Chondroitinsulfat-Proteoglycan, dessen Kernprotein Bikunin genannt wird und das dem Gesamtmolekül eine Protease-Inhibitor-Funktion verleiht. Ein Bikunin-Molekül ist typischerweise mit einem oder zwei schweren Ketten über eine Esterbindung verbunden.
Die posttranslationale Prozessierung von Vorläufer-ITIH-Proteinen an einer konservierten Spaltstelle legt eine C-terminale Aminosäure frei, die die Bindung an Hyaluronsäure ermöglicht und so zu „kabelartigen Strukturen“ aggregiert (Salier, J.P., et al., Biochem. J. (1996) 315 (Pt 1), 1-9; Zhuo et al., 2004, supra). Diese Vernetzung von Hyaluronsäure ist ein überzeugender Mechanismus zur Stabilisierung der EZM. So deuten zahlreiche Hinweise in Richtung einer entzündungshemmenden Wirkung der EZM-Komplexierung durch die Bindung von ITIH an Hyaluronsäure hin (Day, A.J., und de la Motte, C.A., Trends Immunol. (2005) 26, 637-643; Zhuo et al., 2004, supra).
In einer hier offenbarten Verwendung oder Anwendung, einem hier offenbarten Verfahren und einer hier offenbarten Zusammensetzung wird in der Regel ITIH5 als reifes Volllängenprotein eingesetzt. Dabei handelt es sich typischerweise um die posttranslational prozessierte Proteinkette. Wie im Vorangehenden erläutert, ist von diese Proteinkette ist ein Teil des C-Terminus der entstandenen Vorläuferkette für die Bindung an Hyaluronsäure abgespalten (Huth, S., et al., Exp. Dermatol. (2015) 24, 9, 663-668; Himmelfarb et al., 2004, supra). Hyaluronsäure bindet an die demaskierte Carboxylgruppe des Aspartats am freien Ende der Proteinkette.
In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine schwere Kette H5 des humanen Inter-alpha-trypsininhibitors mit der Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer Q86UX2, Version 2 der Sequenz vom 29. April 2008, Version 115 des Datenbankeintrags vom 12. September 2018. In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine Proteinkette, deren Sequenz mit der Sequenz der vorangehenden Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer Q86UX2, Version 2 der Sequenz, im Wesentlichen identisch ist. Es sind vier Isoformen bekannt, die im Datenbankeintrag mit der Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer Q86UX2 als Isoform 1 (Identifikator: Q86UX2-1), Isoform 2 (Identifikator: Q86UX2-2), Isoform 3 (Identifikator: Q86UX2-3) und Isoform 4 (Identifikator: Q86UX2-4) bezeichnet sind. Im Vergleich zur Isoform 1 mit 942 Aminosäuren fehlen der Isoform 2 die Aminosäuren 695-942 und es liegt eine Substitution des vorangehenden Bereichs der Aminosäuren 667-694 vor. Isoform 2 hat somit eine Länge von 694 Aminosäuren. Im Vergleich zur Isoform 1 mit 942 Aminosäuren fehlen der Isoform 3 die Aminosäuren 1-214 und im sich anschließenden Bereich der Aminosäuren 215-218 liegt eine Substitution vor. Isoform 3 hat somit eine Länge von 728 Aminosäuren. Im Vergleich zur Isoform 1 fehlen der Isoform 4 die Aminosäuren 1-449 sowie 694-942. In den sich anschließenden Bereichen der Aminosäuren 450-473 und 678-693 liegt jeweils eine Substitution vor.
Das im Rahmen einer hier offenbarten Anwendung, Verwendung oder Zusammensetzung oder eines hier offenbarten Verfahrens eingesetzte Protein ITIH5 ist in einigen Ausführungsformen die Isoform 1 oder die Isoform 2 der Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer Q86UX2, Version 115 des Datenbankeintrags vom 12. September 2018, basierend auf Version 2 der Sequenz. In einigen Ausführungsformen hat das Protein ITIH5 eine Proteinkette, deren Sequenz mit der Sequenz der Isoform 1 oder der Isoform 2 der vorangehenden Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer Q86UX2 im Wesentlichen identisch ist. In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 die Isoform 3 oder die Isoform 4 der Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer Q86UX2, Version 115 des Datenbankeintrags vom 12. September 2018. In einigen Ausführungsformen hat das Protein ITIH5 eine Proteinkette, deren Sequenz mit der Sequenz der Isoform 3 oder der Isoform 4 der vorangehenden Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer Q86UX2 im Wesentlichen identisch ist.
In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine natürlich vorkommende Variante der schwere Kette H5 mit der Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer Q86UX2, Version 2 der Sequenz vom 29. April 2008, Version 115 des Datenbankeintrags vom 12. September 2018. Dieser Datenbankeintrag nennt die Varianten VAR_042847, VAR_042848, VAR_042849, VAR_042850, VAR_055973, VAR_055974 und VAR_061276. In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine Proteinkette, deren Sequenz mit der Sequenz einer der vorangehenden Varianten VAR_042847, VAR_042848, VAR_042849, VAR_042850, VAR_055973, VAR_055974 und VAR_061276 im Wesentlichen identisch ist.
In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine schwere Kette H5 des murinen Inter-alpha-trypsininhibitors mit der Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer Q8BJD1, Version 1 der Sequenz vom 01. März 2003, Version 110 des Datenbankeintrags vom 12. September 2018. In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine Proteinkette, deren Sequenz mit der Sequenz der vorangehenden Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer Q8BJD1, Version 1 der Sequenz, im Wesentlichen identisch ist. In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine schwere Kette H5 des bovinen Inter-alpha-trypsininhibitors mit der Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer A2VE29, Version 1 der Sequenz vom 20. März 2007, Version 58 des Datenbankeintrags vom 25. Oktober 2017. In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine Proteinkette, deren Sequenz mit der Sequenz der vorangehenden Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer A2VE29, Version 1 der Sequenz, im Wesentlichen identisch ist.
In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 Isoform 3 einer schwere Kette H5 des Inter-alpha-trypsininhibitors aus dem Rhesusaffen (Macaca mulatta). Es finden sich entsprechende Proteine mit den Swissprot/Uniprot-Zugangsnummern H9FIN1, Version 1 der Sequenz vom 16. Mai 2012, Version 16 des Datenbankeintrags vom 25. Oktober 2017, sowie H9FEW0, Version 1 der Sequenz vom 16. Mai 2012, Version 15 des Datenbankeintrags vom 30. August 2017. In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine Proteinkette, deren Sequenz mit der Sequenz der vorangehenden Swissprot/Uniprot-Zugangsnummern H9FIN1 und H9FEW0, jeweils Version 1 der Sequenz, im Wesentlichen identisch ist.
In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine schwere Kette H5 des Inter-alpha-trypsininhibitors aus dem Sumatra-Orangutan (Pongo abelii) mit der Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer Q5RER0, Version 1 der Sequenz vom 21. Dezember 2004, Version 51 des Datenbankeintrags vom 25. Oktober 2017. In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine Proteinkette, deren Sequenz mit der Sequenz der vorangehenden Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer Q5RER0, Version 1 der Sequenz, im Wesentlichen identisch ist.
In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine schwere Kette H5 des Inter-alpha-trypsininhibitors aus dem Meerschweinchen (Cavia porcellus) mit der Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer H0VH12, Version 1 der Sequenz vom 22. Februar 2012, Version 34 des Datenbankeintrags vom 12. September 2018. In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine Proteinkette, deren Sequenz mit der Sequenz der vorangehenden Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer H0VH12, Version 1 der Sequenz, im Wesentlichen identisch ist.
In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 die Isoform X3 der schweren Kette H5 des Inter-alpha-trypsininhibitors aus der Ratte (Rattus norvegicus) mit der GenBank-Zugangsnummer XP_001069890, Version 2 der Sequenz vom 2. April 2010, Datenbankeintrag vom 26. Juli 2016. In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine Proteinkette, deren Sequenz mit der Sequenz der vorangehenden GenBank-Zugangsnummer XP_001069890, Version 2 der Sequenz, im Wesentlichen identisch ist.
In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine schwere Kette H5 des Inter-alpha-trypsininhibitors aus dem Goldhamster (Mesocricetus auratus) mit der Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer A0A1U7Q7F4, Version 1 der Sequenz vom 10. Mai 2017, Version 7 des Datenbankeintrags vom 20. Juni 2018. In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine Proteinkette, deren Sequenz mit der Sequenz der vorangehenden Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer A0A1U7Q7F4, Version 1 der Sequenz, im Wesentlichen identisch ist.
In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine schwere Kette H5 des Inter-alpha-trypsininhibitors aus dem Kaninchen (Oryctolagus cuniculus) mit der Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer G1TCP6, Version 2 der Sequenz vom 13. November 2013, Version 34 des Datenbankeintrags vom 12. September 2018. In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine Proteinkette, deren Sequenz mit der Sequenz der vorangehenden Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer G1TCP6, Version 2 der Sequenz, im Wesentlichen identisch ist.
In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine schwere Kette H5 des Inter-alpha-trypsininhibitors aus dem Hund, die von der Nukleinsäuresequenz mit der GenBank-Zugangsnummer XM_005617202, Version 2 der Sequenz vom 5. September 2017, kodiert wird. Dabei kann es sich um die Proteinkette mit der Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer F1PDN8, Version 2 der Sequenz vom 31. Oktober 2012, Version 32 des Datenbankeintrags vom 12. September 2018, handeln. In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine Proteinkette, deren Sequenz mit der Sequenz der vorangehenden Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer F1PDN8, Version 2 der Sequenz, im Wesentlichen identisch ist.
In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine schwere Kette H5 des Inter-alpha-trypsininhibitors aus der Katze (Felis catus), die von der Nukleinsäuresequenz mit der GenBank-Zugangsnummer XM_011283573, Version 2 der Sequenz vom 12. Dezember 2017, kodiert wird. Dabei kann es sich um die Proteinkette mit der Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer M3WEM7, Version 2 der Sequenz vom 28. Februar 2018, Version 33 des Datenbankeintrags vom 12. September 2018, handeln. In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine Proteinkette, deren Sequenz mit der Sequenz der vorangehenden Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer M3WEM7, Version 2 der Sequenz, im Wesentlichen identisch ist.
In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine schwere Kette H5 des Inter-alpha-trypsininhibitors aus dem Schwein (Sus scrofa) mit der Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer F1RUM0, Version 2 der Sequenz vom 22. November 2017, Version 39 des Datenbankeintrags vom 12. September 2018 oder mit der Swissprot/Uniprot-Zugangsnummer K9J4W0, Version 1 der Sequenz vom 06. Februar 2013, Version 21 des Datenbankeintrags vom 31. Januar 2018. In einigen Ausführungsformen ist ITIH5 eine Proteinkette, deren Sequenz mit der Sequenz der vorangehenden Swissprot/Uniprot-Zugangsnummern F1RUM0, Version 2 der Sequenz, und K9J4W0, Version 1 der Sequenz, im Wesentlichen identisch ist.
ITIH5 lässt sich nach den dem Fachmann bekannten Standardverfahren herstellen. Das in einer Formulierung verwendete ITIH5-Protein kann beispielsweise in CHO-Zellen oder HEK-Zellen exprimiert und durch einen oder mehrere Chromatographieschritte gereinigt werden. Dabei kann beispielsweise in einem Bereich des ITIH5-Voläuferproteins, der bei der Reifung abgespalten wird, ein Affinität-Tag vorgesehen werden, auf der Basis dessen eine Affinitätschromatographie durchgeführt werden kann. Als weiters Beispiel kann die reife Form des ITIH exprimiert und durch eine Abfolge von Chromatographieschritten gereinigt werden.
Bereitgestellt wird unter anderem eine flüssige wässrige pharmazeutische Formulierung, die aus einer therapeutisch und/oder kosmetisch wirksamen Menge ITIH5 in einer gepufferten Lösung besteht. In einigen Ausführungsformen wird eine flüssige wässrige pharmazeutische Formulierung bereitgestellt, die aus ITIH5 und einer therapeutisch und/oder kosmetisch wirksamen Menge Hyaluronsäure in einer gepufferten Lösung besteht. In einigen Ausführungsformen wird eine flüssige wässrige pharmazeutische Formulierung bereitgestellt, die aus einer therapeutisch und/oder kosmetisch wirksamen Menge ITIH5 und einer therapeutisch und/oder kosmetisch wirksamen Menge Hyaluronsäure in einer gepufferten Lösung besteht.
Bereitgestellt wird auch eine flüssige wässrige pharmazeutische Formulierung, die eine therapeutisch und/oder kosmetisch wirksame Menge ITIH5 in einer gepufferten Lösung enthält. In einigen Ausführungsformen wird eine flüssige wässrige pharmazeutische Formulierung bereitgestellt, die ITIH5 und eine therapeutisch und/oder kosmetisch wirksame Menge Hyaluronsäure in einer gepufferten Lösung enthält. In einigen Ausführungsformen wird eine flüssige wässrige pharmazeutische Formulierung bereitgestellt, die eine therapeutisch und/oder kosmetisch wirksame Menge ITIH5 und eine therapeutisch und/oder kosmetisch wirksame Menge Hyaluronsäure in einer gepufferten Lösung enthält.
Eine hier offenbarte Zusammensetzung ist in einigen Ausführungsformen frei von Hyaluronsäure. Eine hier offenbarte Zusammensetzung enthält in einigen Ausführungsformen Hyaluronsäure. Typischerweise handelt es sich um zumindest im Wesentlichen unverzweigte Hyaluronsäure. In einigen Ausführungsformen ist auch verzweigte Hyaluronsäure vorhanden. In einigen Ausführungsformen ist verzweigte Hyaluronsäure nicht nachweisbar. In einigen Ausführungsformen enthält eine hier offenbarte Zusammensetzung Hyaluronsäure in einer Konzentration von 2 mg/ml oder mehr, inklusive 4 mg/ml oder mehr. In einigen Ausführungsformen enthält eine hier offenbarte Zusammensetzung Hyaluronsäure in einer Konzentration von 5 mg/ml oder mehr, wie z.B. 7,5 mg/ml oder mehr. Eine hier offenbarte Zusammensetzung kann Hyaluronsäure auch in einer Konzentration von 10 mg/ml oder mehr enthalten, inklusive einer Konzentration von 12,5 mg/ml oder mehr. In einigen Ausführungsformen enthält eine hier offenbarte Zusammensetzung Hyaluronsäure in einer Konzentration von 15 mg/ml oder mehr, inklusive 17,5 mg/ml oder mehr. In einigen Ausführungsformen kann eine hier offenbarte Zusammensetzung Hyaluronsäure in einer Konzentration von 20 mg/ml oder mehr enthalten, beispielsweise in einer Konzentration von 22,5 mg/ml oder mehr.
In einigen Ausführungsformen, in denen die Zusammensetzung Hyaluronsäure enthält, hat diese ein Molekulargewicht von 500 kD oder mehr, wie z.B. 700 kD oder mehr. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von 800 kD oder mehr, inklusive z.B. 1000 kD oder mehr. Die Zusammensetzung kann auch Hyaluronsäure enthalten, die ein Molekulargewicht von 1200 kD oder mehrhat, wie z.B. 1500 kD oder mehr. In einigen Ausführungsformen kann die in der Zusammensetzung enthaltene Hyaluronsäure ein Molekulargewicht von 1700 kD oder mehr haben, wie z.B. ein Molekulargewicht von 2000 kD oder mehr. In einigen Ausführungsformen hat die in der Zusammensetzung enthaltene Hyaluronsäure ein Molekulargewicht von 2500 kD oder mehr, wie z.B. 2800 kD oder mehr. Die in der Zusammensetzung enthaltene Hyaluronsäure kann in einigen Ausführungsformen ein Molekulargewicht von 3000 kD oder mehr haben, wie z.B. 3500 kD oder mehr. In einigen Ausführungsformen kann die in der Zusammensetzung enthaltene Hyaluronsäure ein Molekulargewicht von 4000 kD oder mehr haben, wie z.B. 4200 kD oder mehr. In einigen Ausführungsformen hat die in der Zusammensetzung enthaltene Hyaluronsäure ein Molekulargewicht von 4500 kD oder mehr, wie z.B. 5000 kD oder mehr.
In einigen Ausführungsformen ist Hyaluronsäure oder ein Salz davon in einer hier offenbarten Zusammensetzung in einer Menge vorhanden, die ausreicht, um den Zustand einer Säugetierhaut, beispielsweise menschlicher Haut, zu verbessern. Dabei kann die Menge zum Beispiel ausreichen, die Hydratation oder die Elastizität der Haut zu verbessern.
In einigen Ausführungsformen enthält eine hier offenbarte Zusammensetzung biokompatible Mikropartikel, beispielsweise aus Keramik/Glas, wie in WO 2008/031194 beschrieben. Eine hier offenbarte Zusammensetzung enthält typischerweise eine physiologisch und pharmazeutisch verträgliche Pufferverbindung. Eine solche Pufferverbindung kann beispielsweise im Bereich von bis zu 2 Gewichtsprozent der Zusammensetzung vorhanden sein. Ein Beispiel einer geeigneten Pufferverbindung ist ein Phosphatbuffer, beispielsweise ein Natriumphosphatpuffer. Eine weitere geeignete Pufferverbindung ist ein Boratbuffer, beispielsweise ein Natriumboratpuffer. Eine weitere geeignete Pufferverbindung ist Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane).
Eine hier offenbarte Zusammensetzung liegt in einigen Ausführungsformen in flüssiger Form vor, beispielsweise als Gel, als Creme, als Lotion, als Serum oder als Spray.
Eine hier offenbarte Zusammensetzung kann einen oder mehrere weitere komplementäre Inhaltsstoffe enthalten wie beispielsweise Vitamin A, ein Carotinoid, Beta-Carotin, Vitamin D, ein Tocopherol, Tocopherylacetat, Vitamin K, Vitamin C, Thiamin, Riboflavin, Niacin, Vitamin B6, Vitamin B12, Pantothensäure, Folsäure, Biotin, Coenzym Q10, Idebenon, Zink, Kupfer, Retinol, ein Peptid, und/oder eine Alpha-Hydroxysäure wie z.B. Zitronensäure, Milchsäure oder Äpfelsäure. Eine hier offenbarte Zusammensetzung kann auch eine Beta-Hydroxysäure, Azelainsäure, Ursolsäure, Oleanolsäure und/oder 4-Butylresorcinol enthalten.
Als weitere Beispiele kann eine hier offenbarte Zusammensetzung ein Lactat, Harnstoff, Glycerin, Propylenglykol, 1,2-Pentandiol, 1,2-Hexandiol und/oder 1,2-Octandiol enthalten. Eine hier offenbarte Zusammensetzung kann auch Kollagen, Elastin, Diacyladipat, Petrolatum, Urocansäure, Lecithin, Allantoin, Panthenol, Phytantriol und/oder Lycopin enthalten. Eine hier offenbarte Zusammensetzung kann auch ein Ceramid und/oder ein Pseudo-Ceramid enthalten. Beispielsweise kann eine solche Zusammensetzung Ceramid 2 enthalten. Eine hier offenbarte Zusammensetzung kann auch Hydroxypropylbispalmitamid MEA, Cetyloxypropylglycerylmethoxypropylmyristamid, N-(1-Hexadecanoyl)-4-hydroxy-L-prolin (1-hexadecyl)ester und/oder Hydroxyethylpalmityl oxyhydroxypropylpalmitamid) enthalten. Eine hier offenbarte Zusammensetzung kann auch ein Glykosphingolipid, Cholesterin, ein Phytosterin, Chitosan und/oder Chondroitinsulfat enthalten.
Eine hier offenbarte Zusammensetzung kann auch einen oder mehrere kosmetisch und/oder pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe (Trägerstoffe) enthalten. Zahlreiche Trägerstoffe sind in Kosmetika üblich, beispielsweise Feuchthaltemittel, Konservierungsmittel, Antioxidantien, Komplexbildner, Lösungsmittel, Duftstoffe, Bakterizide, Geruchsabsorber, Vitamine, Selbstbräuner und Anti-Falten-Wirkstoffe. Derartige Hilfsstoffe können in üblichen Mengen vorliegen, z.B. von 0,01 % bis 20 % des Gesamtgewichts der Zusammensetzung.
Die Wahl des jeweiligen Trägers hängt wesentlich davon ab, welche weiteren Inhaltsstoffe in der Zusammensetzung enthalten sind. Inhaltsstoffe mit lipophilen oder amphiphilen Löslichkeitseigenschaften bedürfen des Zusatzes von lösungsvermittelnden Trägerstoffen. Beispiele geeigneter Träger sind ein Glykol, ein Alkyl- oder Alkenylalkohol, ein aliphatischer Ester, ein Polyethylenglykolester und ein Polyethylenglykolether.
Diese Hilfsstoffe können je nach Art in eine Fettphase, in eine wässrige Phase und/oder in Form von oder mittels Lipidvesikeln eingebracht werden. Weitere Hilfsstoffe, die beispielsweise für die Verwendung mit einem Gel im Sinne der vorliegenden Offenbarung geeignet sind, sind beispielsweise wasserlösliche oder mit Wasser mischbare Lösungsmittel oder Co-Lösungsmittel. Sind lipophile Substanzen in der Zusammensetzung enthalten, so können auch öllösliche oder mit Öl mischbare Lösungsmittel oder Co-Lösungsmittel sinnvoll sein.
Auch Verbindungen, die beim Bereitstellen einer wässrigen Lösung eingesetzt werden, werden als Träger bezeichnet. Illustrative Beispiele sind 0,9% Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung oder physiologisch verträgliche Puffer. Die Zusammensetzung kann mit herkömmlichen Techniken sterilisiert werden. Eine erhaltene wässrige Lösung kann zur Verwendung verpackt oder unter aseptischen Bedingungen gefiltert und gefriergetrocknet werden, wobei eine gefriergetrocknete Zubereitung vor der Verabreichung in der Regel in einer sterilen wässrigen Lösung aufgelöst wird.
In einigen Ausführungsformen kann eine hier offenbarte Zusammensetzung weiterhin Wachstumsfaktoren enthalten wie z.B. TGF-alpha, EGF, KGF, bFGF, SCF, ET-1, IGF-1 sowie Kombinationen davon. In einigen Ausführungsformen kann eine hier offenbarte Zusammensetzung weiterhin Natrium-Kupferchlorophyllinkomplex, Natriumisochlorin e4, oxidiertes Natriumisochlorin e4, Natriumkupferisochlorin e4, oxidiertes Natriumkupferisochlorin e4, Natriummagnesiumisochlorin e4 und/oder oxidiertes Natriummagnesiumisochlorin e4 oder ein wasserlösliches Salz davon, enthalten. Natrium-Kupferchlorophyllinkomplex, auch bekannt als Natrium-Kupfer-Chlorophyllin-Komplex, Kupfer-Chlorophyllin-Komplex und Kupfer-Chlorophyllin (abgekürzt „CHLcu“) bezieht sich auf einen Komplex von wasserlöslichen Kupfer-Porphyrin-Verbindungen, die ein oder mehrere von Natrium-Isochlorin e4, oxidiertem Natrium-Isochlorin e4, Natrium-Kupfer-Isochlorin e4 und/oder oxidiertem Natrium-Kupfer-Isochlorin e4 enthalten. Näheres findet sich in der internationalen Patentanmeldung WO 2017/027177 , die auch auf eine stabilisierende Wirkung derartiger Komplexe auf Hyaluronsäure eingeht.
Wie bereits vorangehend angegeben, kann in Ausführungsformen einer hier offenbarten Verwendung, einer hier offenbarten Zusammensetzung und eines hier offenbarten Verfahrens ITIH5 in einer Zusammensetzung in flüssiger Form vorliegen, z.B. als Gel, als Creme, als Lotion, als Serum oder als Spray. Eine entsprechende Zusammensetzung kann injizierbar sein. In einigen Ausführungsformen wird eine entsprechende Zusammensetzung als Bestandteil eines Pflasters oder einer anderen festen Darreichungsform bereitgestellt.
Aufgrund seiner stabilisierenden Eigenschaften in Bezug auf Hyaluronsäure und ihre Salze kann ITIH5 in zahlreichen kosmetischen Verwendungen und therapeutischen Anwendungen und Verfahren eingesetzt werden, in denen bislang Hyaluronsäure verwendet wurde. Dabei kann in einigen Ausführungsformen ITIH5 eingesetzt werden, um körpereigene Hyaluronsäure und ihre Salze zu stabilisieren. In einigen Ausführungsformen kann eine Kombination aus Hyaluronsäure und ITIH5 eingesetzt werden. Dabei kann ITIH5 dazu dienen, gleichzeitig oder auch zeitversetzt gegebene „körperfremde“ Hyaluronsäure und/oder Hyaluronsäuresalze zu stabilisieren. Daneben kann ITIH5 auch dazu dienen, körpereigene Hyaluronsäure und ihre Salze zu stabilisieren. Es ist in diesem Zusammenhang zu beachten, dass sich körpereigene und „körperfremde“ Hyaluronsäure und Hyaluronsäuresalze strukturell allenfalls im Molekulargewicht unterscheiden können, es sich aber grundsätzlich um identisch aufgebaute Moleküle handelt.
Zu kosmetischen Anwendungen und therapeutischen Anwendungen und Verfahren, in denen bislang Hyaluronsäure und ihre Salze eingesetzt wurden und in denen auch entweder nur ITIH5 oder eine Kombination von ITIH5 und Hyaluronsäure und/oder ein Salz davon verwendet werden können, zählen beispielsweise die Pflege, die Behandlung oder die Vorbeugung von Hautalterung. Ebenso kann zur Pflege, Behandlung oder Vorbeugung von trockener und/oder rauer Haut entweder nur ITIH5 oder eine Kombination von ITIH5 und Hyaluronsäure und/oder ein Salz davon verwendet werden.
Auch können ITIH5 oder eine Kombination von ITIH5 und Hyaluronsäure in der Wundbehandlung eingesetzt werden und beispielsweise die Narbenbildung verringern. Im Verlauf der fetalen Wundheilung die narbenfrei ist, ist Hyaluronsäure in hohem Grade zugegen. In der späteren erwachsenen Wundheilung, die oft durch Narbenbildung gekennzeichnet ist, ist dagegen Hyaluronsäure verringert. Tatsächlich ist dies einer der Hauptunterschiede zwischen fetalen Wunden und erwachsenen Wunden. Glucocorticoide wie Hydrocortison, das in der Behandlung von z.B. adrenokortikaler Insuffizienz, adrenogenitalem Syndrom, bei hohem Blutkalzium, Thyreoiditis, rheumatoider Arthritis, Dermatitis, Asthma und COPD eingesetzt wird, verringern den Hyaluronsäuregehalt der Haut. Zur Behandlung dieser Nebenwirkung, ggf. nach Beenden der entsprechenden Therapie, kann daher ITIH5 oder eine Kombination von ITIH5 und Hyaluronsäure und/oder ein Salz davon verwendet werden, um den verringerten Hyaluronsäuregehalt zu kompensieren.
Offenbart ist auch eine therapeutische Anwendung eines Inhibitors oder eines Bindungsreagenzes von ITIH5. Ein entsprechendes Bindungsreagenz kann ein Immunglobulin, ein Immunglobulinfragment oder ein proteinartiges Bindungsmolekül mit antikörperähnlichen Funktionen sein, das in der Lage ist, ITIH5 spezifisch zu binden. Ein derartiges Bindungsmolekül kann beispielsweise eine EGF-ähnliche Domäne, eine Kringle-Domäne, eine Fibronektin-Typ-I-Domäne, eine Fibronektin-Typ-II-Domäne, eine Fibronektin-Typ-III-Domäne, eine PAN-Domäne, eine Gla-Domäne, eine SRCR-Domäne, eine Kunitz/Bovine Pankreas-TrypsinInhibitor-Domäne sein, Tendamistat, eine Serinprotease-Inhibitor-Domäne vom Kazal-Typ, eine Trefoil-Domäne (P-Typ), eine von Willebrand-Faktor-C-Domäne, eine Anaphylatoxin-ähnliche Domäne, eine CUB-Domäne, ein Thyreoglobulin-Typ-I-Repeat, eine LDL-Rezeptor-Klasse-A-Domäne, eine Sushi-Domäne, eine Link-Domäne, eine Thrombospondin-Typ-I-Domäne, eine Immunglobulindomäne oder eine immunglobulinähnliche Domäne (zum Beispiel ein Domänen-Antikörper oder ein Kamel-Antikörper mit schwerer Kette), eine C-Typ-Lectin-Domäne, eine MAM-Domäne, eine von Willebrand Faktor Typ A Domäne, eine Somatomedin B Domäne, eine WAP-Typ Vier-Disulfid-Kerndomäne, eine F5/8 Typ C Domäne, eine Hemopexin Domäne, eine SH2 Domäne, eine SH3 Domäne, eine Laminin-Typ EGF-ähnliche Domäne, eine C2 Domäne, ein „Kappabody“ (Ill. et al.., Protein Eng (1997) 10, 949-957), ein „Minibody“ (Martin et al., EMBO J (1994) 13, 5303-5309), ein „Diabody“ (Holliger et al., PNAS U.S.A. (1993) 90, 6444-6448), ein „Janusin“ (Traunecker et al., EMBO J (1991) 10, 3655-3659 bzw. Traunecker et al., Int J Cancer (1992) Suppl 7, 51-52), ein Nanobody, ein Adnectin, ein Tetranectin, ein Mikrobody, ein Affilin, ein Affibody oder ein Ankyrin, ein Kristallin, ein Knottin, Ubiquitin, ein Zink-Finger-Protein, ein Ankyrin- oder Ankyrin-Repeatprotein oder ein leucinreiches Repeatprotein.
Ein solcher Inhibitor bzw. ein solches Bindungsreagenz von ITIH5 kann dazu eingesetzt werden, die physiologische Menge an ITIH5 lokal zu verringern. Dies kann bei der Behandlung einer Dermatitis sinnvoll sein. Dabei kann es sich beispielsweise um eine allergische Kontaktdermatitis handeln. Die Erfinder haben beobachtet, dass in Abwesenheit von ITIH5 eine deutlich verminderte Entzündungsreaktion auftrat und ITIH5 somit eine wesentliche Rolle in Entzündungsreaktionen spielt. Mittels eine gegen ITIH5 gerichteten Bindungsreagenzes, beispielsweise eines anti-ITIH5-Immunglobulins, kann sich eine Entzündungsreaktion daher verringern lassen.
Anorganische und organische Chemikalien verursachen bei vielen Menschen bei wiederholtem Hautkontakt eine allergische Kontaktdermatitis, eine vom Immunsystem verursachte entzündliche Hauterkrankung. Im Mausmodell für Kontakthypersensitivität (CHS), dem Äquivalent der allergischen Kontaktdermatitis bei der Maus, wurde von den Erfindern überraschenderweise beobachtet, dass ITIH5 in der Sensibilisierungsphase dieser Hauterkrankung eine Rolle spielt.
Offenbart wird hier auch ein Verfahren zur Identifizierung eines Verbindungskandidaten zum Stabilisieren von Hyaluronsäure oder einem Salz davon. Das Verfahren umfasst es, eine zu testende Verbindung mit ITIH5 und Hyaluronsäure unter oxidierenden Bedingungen in Kontakt zu bringen. Das Verfahren umfasst weiterhin, das Molekulargewicht der Hyaluronsäure oder des Salzes davon nach einem vorbestimmten Zeitintervall zu bestimmen. Das Verfahren umfasst auch, das Molekulargewicht der Hyaluronsäure oder des Salzes davon nach dem vorbestimmten Zeitintervall mit dem Molekulargewicht der Hyaluronsäure oder des Salzes davon in einer Referenzprobe zu vergleichen, in der sich keine Verbindung zum Stabilisieren von Hyaluronsäure oder einem Salz davon befunden hat. Wenn das Molekulargewicht der Hyaluronsäure oder des Salzes davon nach dem vorbestimmten Zeitintervall höher ist als in der Referenzprobe, in der sich keine Verbindung zum Stabilisieren von Hyaluronsäure oder einem Salz davon befunden hat, wird die zu prüfende Verbindung als Verbindungskandidat zum Stabilisieren von Hyaluronsäure oder einem Salz davon eingestuft. Ist das Molekulargewicht der Hyaluronsäure nach dem vorbestimmten Zeitintervall höher ist als in der Referenzprobe, so erlaubt dies den indirekten Rückschluss darauf, dass die zu testende Verbindung ein Kandidat ist, um die stabilisierende Wirkung von ITIH5 auf Hyaluronsäure zu verstärken.
In einigen Ausführungsformen kann eine zu testende Verbindung innerhalb eines Bereichs von verschiedenen Konzentrationen desselben mit ITIH5 und Hyaluronsäure unter oxidierenden Bedingungen in Kontakt gebracht werden. In einigen Ausführungsformen kann der Schritt, eine zu testende Verbindung mit ITIH5 und Hyaluronsäure unter oxidierenden Bedingungen in Kontakt zu bringen, innerhalb eines Bereiches von verschiedenen Konzentrationen desselben wiederholt werden. In einigen Ausführungsformen kann die zu testende Verbindung als Verbindungskandidat zum Verstärken der Wirkung von ITIH5 beim Stabilisieren von Hyaluronsäure oder einem Salz davon eingestuft werden, wenn in dem Bereich der Konzentrationen für die zu testende Verbindung das Molekulargewicht der Hyaluronsäure oder des Salzes davon nach dem vorbestimmten Zeitintervall höher ist als in der Referenzprobe.
In einigen Ausführungsformen kann ein Bereich an vorbestimmten Zeitintervallen festgelegt sein, für die eine zu testende Verbindung mit ITIH5 und Hyaluronsäure unter oxidierenden Bedingungen in Kontakt belassen wird. In einigen Ausführungsformen kann der Schritt, eine zu testende Verbindung mit ITIH5 und Hyaluronsäure unter oxidierenden Bedingungen in Kontakt zu bringen, innerhalb eines Bereiches von verschiedenen Zeitintervallen, für die eine zu testende Verbindung mit ITIH5 und Hyaluronsäure unter oxidierenden Bedingungen in Kontakt belassen wird, wiederholt werden. In einigen Ausführungsformen kann die zu testende Verbindung als Kandidat zum Verstärken der stabilisierenden Wirkung von ITIH5 auf Hyaluronsäure oder ein Salz davon eingestuft werden, wenn in dem Bereich an vorbestimmten Zeitintervallen für das in Kontakt Belassen der zu testenden Verbindung mit ITIH5 und Hyaluronsäure unter oxidierenden Bedingungen das Molekulargewicht der Hyaluronsäure oder des Salzes davon höher ist als in der Referenzprobe.
Ein Verfahren, eine Anwendung, eine Verwendung und eine Zusammensetzung, die hier veranschaulichend beschrieben sind, können in geeigneter Weise ohne ein einzelnes Element oder Elemente, Beschränkung oder Beschränkungen ausgeführt und eingesetzt werden, die hier nicht explizit offenbart sind. Die hier verwendeten Begriffe und Ausdrücke sind ferner als beschreibende Begriffe und nicht als Einschränkung verwendet, und es besteht keine Absicht, beim Verwenden solcher Begriffe und Ausdrücke irgendwelche Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon auszuschließen. Es wird erkannt, dass verschiedene Abwandlungen im Umfang der beanspruchten Erfindung möglich sind. So sollte daher verstanden werden, dass der Fachmann auf Abwandlungen und Variationen der offenbarten Ausführungsformen zurückgreifen kann, obwohl das hier offenbarte Verfahren, die hier offenbarte Anwendung, die hier offenbarte Verwendung und die hier offenbarte Zusammensetzung für den Fachmann in ausreichendem Detail beschrieben und veranschaulicht sind, um sie einzusetzen, und dass solche Abwandlungen und Variationen als innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung befindlich anzusehen sind.
Es soll verstanden werden, dass mit der vorhergehenden Beschreibung beabsichtigt ist, den Umfang der Erfindung, der durch den Umfang der sich anschließenden Schutzansprüche definiert ist, zu veranschaulichen und nicht zu beschränken. Weitere Ausführungsformen fallen unter den Umfang der folgenden Schutzansprüche.
Die Erfindung ist hier ausgedehnt und allgemein beschrieben worden. Jede der engeren Spezies und Subgenus-Gruppierungen, die unter die allgemeine Offenbarung fallen, bilden ebenfalls einen Teil des Verfahrens, der Anwendung, der Verwendung und der Zusammensetzung. Das schließt die allgemeine Beschreibung des Verfahrens, der Anwendung, der Verwendung und der Zusammensetzung mit einer Bedingung oder einer negativen Beschränkung ein, die einen Gegenstand aus dem Genus ausschließen, unabhängig davon, ob der ausgeschlossene Gegenstand hier explizit wiedergegeben ist.
Weitere Ausführungsformen sind in den nachfolgenden Patentansprüchen wiedergegeben. Sind Merkmale oder Aspekte der Erfindung in Form von Markush-Gruppen angegeben, wird der Fachmann erkennen, dass der entsprechende Gegenstand auf diese Weise auch hinsichtlich jedes individuellen Mitglieds oder jeder individuellen Untergruppe von Mitgliedern von Markush-Gruppen beschrieben ist.
Weitere Ausführungsformen sind in den nachfolgenden Patentansprüchen wiedergegeben. Sind Merkmale oder Aspekte der Erfindung in Form von Markush-Gruppen angegeben, wird der Fachmann erkennen, dass der entsprechende Gegenstand auf diese Weise auch hinsichtlich jedes individuellen Mitglieds oder jeder individuellen Untergruppe von Mitgliedern von Markush-Gruppen beschrieben ist.
BEISPIELE
Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die Durchführung einer Anwendung, einer Verwendung, eines Verfahrens, inklusive im Zusammenhang mit der hier offenbarten Zusammensetzung. Beschrieben ist unter anderem die Gewinnung und Isolierung von rekombinantem murinen ITIH5. Entsprechend lässt sich ein ITIH5-Protein einer anderen Spezies, beispielsweise humanes ITIH5 erhalten.
Sofern nicht anders angegeben, wurden etablierte Verfahren in der Zellkultur und zu rekombinantem genetischen Material eingesetzt.
Materialien und Verfahren
Mäuse
Itih5^-/--Mäuse, auf BALB/c-Grundlage generiert, wurden von TaconicArtemis (Köln, Deutschland) wie zuvor beschrieben erhalten (Huth, et al., 2015, supra). Alle Tierversuche wurden nach dem Bundesgesetz über den Tierschutz durchgeführt. Die Protokolle wurden vom Landesamt für Umwelt, Natur und Verbraucherschutz (LANUV, Recklinghausen, Deutschland) genehmigt.
Mäusezellen und Zellkultur
Die Isolierung und Kultivierung von epidermalen Keratinozyten und dermalen Fibroblasten aus Mäusen erfolgte wie zuvor beschrieben (Huth et al., 2015, supra).
Murine Hautäquivalente
3D-Maus-Hautmodelle wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (Huth et al., 2015, supra). Kurzgefasst wurden Rinderkollagengele polymerisiert, mit konfluenten Maus-Hautfibroblasten beschickt und über einen Zeitraum von 3 Tagen wachsen gelassen. Anschließend wurden Keratinozyten auf die Geloberfläche aufgebracht und für 3 Tage weiter in Derma Life K (Life Line Cell Technology) kultiviert. Am folgenden Tag wurden die Hautäquivalente an die Luft-Flüssigkeitsgrenze gehoben und für 7 Tage kultiviert.
Humane 3D-Hautmodelle
Humane 3D-Hautmodelle wurden äquivalent zu den murinen Hautmodellen hergestellt. Verwendet wurden humane Keratinozyten und Fibroblasten. Kurzgefasst wurden Rinderkollagengele polymerisiert, mit konfluenten humanen Hautfibroblasten beschickt und über einen Zeitraum von 3 Tagen wachsen gelassen. Anschließend wurden Keratinozyten auf die Geloberfläche aufgebracht und für 3 Tage weiter kultiviert. Am folgenden Tag wurden die Hautäquivalente an die Luft-Flüssigkeitsgrenze gehoben und für 7 Tage kultiviert. An Tag 8 der Kultivierung wurden 12µl des ITIH5 Proteins (Konzentration: 1µg/ml) mit einer Spritze in die Modelle injiziert. Nach 5 weiteren Tagen wurden die Modelle geerntet und H&E-Färbungen der Querschnitte erstellt.
Stabiler ITIH5-Knockdown in NHDF-Zellen
NHDF-Zellen wurden mit MISSION™ Lentiviral Transduction-Partikeln aus dem Target-Set SHVRS-NM_001001851 transduziert, das die folgenden Klon-IDs enthielt: TRCN0000118262 (shRNA#1), TRCN0000118263 (shRNA#2), TRCN0000118264 (shRNA#3), TRCN0000118265 (shRNA#4), TRCN0000118266 (shRNA#5) (Sirion Biotech GmbH, München, DE). Jeder der Lentivirus-Vektoren exprimierte eine bestimmte shRNA, die auf die humane ITIH5 mRNA abzielt (GenBank-Zugangsnummer NM_001001851, Version 2 der Sequenz vom 15. Mai 2010). Stabile shRNA-exprimierende Zellen wurden durch eine 10-tägige Selektion in 0,5 µg/ml Puromycin erzeugt, gefolgt von 5 Tagen Massenselektion in 0,25 µg/ml Puromycin enthaltendem Wachstumsmedium. Als Kontrolle wurden NHDF-Zellen mit lentiviralen Nicht-Target (NT)-Kontrol (ctrl)-Partikeln (SHC002V) transduziert.
Zur Verifizierung des Knockdowns wurde von den fünf massenselektierten NHDF-Zellen die ITIH5-mRNA-Expression durch qRTPCR mit einem LightCycler480 (Roche) im Vergleich zu Kontrollzellen quantifiziert.
RNA-Isolierung aus murinen und humanen Hautmodellen und qRT-PCR
Gesamt-RNA wurde mittels des „high-pure RNA isolation kit“ (Roche, Mannheim, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Die RNA wurde mittels photometrischer Messung (Nanodrop, Erlangen, Deutschland) quantifiziert, and die Integrität mit Hilfe des 2100 Bioanalyzers (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) nachgewiesen. Gereinigte RNA wurde mit dem „TaqMan Reverse Transcription Reagents kit“ (Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) mit willkürlichen Hexameren als Primer revers transkribiert. TaqMan-Versuche wurden auf einem „ABI PRISM 7000 Sequence Detection System“ (Applied Biosystems) mit Hilfe von Assay-auf-Abruf-Genexpressionsprodukten für Car4 (Mm00483021_m1), Postn (Mm01284919_m1), Mmp19 (Mm00491296_m1), Lce3a (Mm02763895_s1), Rptn (Mm00485857_m1), Krt10 (Mm03009921_m1), Lor (Mm01219285_m1) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Ein Assay-auf-Abruf-Produkt für Hprt rRNA (Mm00446968_m1) wurde als interne Referenz verwendet, um die Target-Transkripte zu normieren.
Analyse der Genexpression in murinen Hautmodellen mit Hilfe von Exon-Expressions-Arrays
Gereinigte mRNA wurde mit dem „GeneChip® Whole Transcript (WT) Sense Target Labelling Assay“ (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers verarbeitet. Das „RiboMinus Human/Mouse Transcriptome Isolation Kit“ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) wurde verwendet, um gemäß dem technischen Handbuch gereinigte Sinnstrang-cDNA mit eingebautem dUTP zu erzeugen. Die Hybridisierung wurde mit dem „GeneChip® Mouse Gene 2.0 ST Array“ durchgeführt. Arrays wurden mit dem „Affymetrix GeneChip® Scanner 3000 7G“ gescannt, der von der GeneChip® Operating Software (GCOS, Version 1.4) gesteuert wird, um CEL-Intensitätsdateien zu erzeugen. Die Expressionswerte von Itih5^-/--Hautmodellen wurden mit der „GeneSpring GX“-Software (Agilent Technologies, Böblingen, Deutschland, Version 13.1.1) verglichen. Eine Gen-Ontologie-Analyse erfolgte mit Hilfe von http://www.gene-ontology.org/.
Analyse der Genexpression in humanen Hautmodellen mit Hilfe von Exon-Expressions-Arrays
Gereinigte mRNA wurde mit dem „GeneChip® Whole Transcript (WT) Sense Target Labelling Assay“ (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers verarbeitet. Das „RiboMinus Human/Mouse Transcriptome Isolation Kit“ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) wurde verwendet, um gemäß dem technischen Handbuch gereinigte Sinnstrang-cDNA mit eingebautem dUTP zu erzeugen. Die Hybridisierung wurde mit dem „Clariom S“ Array durchgeführt. Arrays wurden mit dem „Affymetrix GeneChip® Scanner 3000 7G“ gescannt, der von der GeneChip® Operating Software (GCOS, Version 1.4) gesteuert wird, um CEL-Intensitätsdateien zu erzeugen. Die Expressionswerte von ITIH5-behandelten und unbehandelten Hautmodellen wurden mit der „GeneSpring GX“-Software (Agilent Technologies, Böblingen, Deutschland, Version 14.9) ausgewertet und verglichen.
Immunhistochemie
Van Gieson-Färbung wurde mit dem „Elastica van Gieson Färbeset“ (Merck, Darmstadt, Deutschland) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gefasst, wurden die in Paraffin eingebetteten 4 µm-Abschnitte jedes Modells in einer absteigenden Alkoholreihe (100 %, 96 %, 70 %) von Paraffin befreit und für 10 min in Elastin inkubiert. Anschließend wurden die Abschnitte in Leitungswasser gewaschen und dann für 5 min in Weigert's Lösung inkubiert, erneut in Leitungswasser gewaschen und anschließend für 2 min in einer Picrofuchsin-Lösung inkubiert. Die Abschnitte wurden in einer abgestuften Alkoholreihe (70%, 90% und 100%) entwässert und mit Xylol geklärt. Abschließend wurden die Profile mit Deckgläsern montiert. Die Untersuchung und Fotodokumentation erfolgte mit einem inversen Photomikroskop (LEICA DMIL, Wetzlar, Deutschland).
Immunfluoreszenz
Kryoschnitte des Mäuse-Hautmodells von 4 µm Dicke wurden für 10 Minuten in Aceton fixiert und bei 4 °C an der Luft getrocknet. Die Abschnitte wurden mit 25 µg/ml eines biotinylierten Hyaluronan-Bindungsproteins (bHABP; Merck, Darmstadt, Deutschland) inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger dreimal für 10 min mit PBS gewaschen und anschließend 1 Stunde lang mit einem sekundären FITC-konjugierten Ziegen-Antikörper (Alexa 546, Invitrogen), 1:200 in Antikörper-Verdünnungslösung (Dako) verdünnt, inkubiert. Dias wurden dreimal mit PBS gewaschen, mit DAPI (Applichem, Darmstadt, Deutschland) gebeizt, erneut mit PBS gewaschen und mit fluoreszierendem Montagemedium (Dako) abgedeckt.
Zelladhäsionsassay
Sechs-Well-Platten wurden mit dem Natriumsalz der Hyaluronsäure (100 µg/ml; Sigma-Aldrich) beschichtet und Zellen (3 × 10⁵ Zellen/Well) für 30 min bei 37 °C auf der Oberfläche inkubiert. Angeheftete Zellen wurden für 10 min mit 70% Ethanol fixiert und mit 0,1% Kristallviolett gefärbt. Nach 20 Minuten wurden die Zellen gründlich mit Wasser gewaschen und über Nacht getrocknet. Der Farbstoff wurde in 0,002% Triton X-100 in 100% Isopropanol gelöst und in eine 96-Well-Platte zur Messung der optischen Dichte bei 590 nm mit einem ELISA-Reader (SpectraMax 340, Molecular Devices, CA, USA) überführt.
Western Blot
Die Westem-Blot-Analyse wurde wie zuvor beschrieben (Huth et al., 2015, supra) mit einem maßgeschneiderten ITIH5-Antikörper durchgeführt, der dem C-Terminus (NH₂- Cys-Tyr-Leu-Ala-Ser-His-Pro-Phe-Asp-Thr-Gly-Met-Thr-Leu-Gly-Arg-Gly-Met-Ser-Arg-Glu-Leu-COOH, SEQ ID NO: 1) des menschlichen ITIH5-Proteins entspricht (Pineda, Berlin, Deutschland). Eine gleichmäßige Proteinbeladung wurde mit Hilfe von β-Actin-spezifischen Antikörpern geprüft.
Rekombinantes Itih5 aus Maus
Rekombinantes Itih5-Mausprotein wurde durch transiente Transfektion humaner Embryo-Nierenzellen (HEK-293) mit einem mit FLAG-tag versehenen Itih5-Expressionsvektor (Applied Biological Materials Inc, Richmond, Kanada) unter Verwendung von FuGENE^® HD (Promega, Mannheim, Deutschland) gemäß den Empfehlungen des Herstellers hergestellt. Die Reinigung aus dem Überstand erfolgte mit „ANTI-FLAG^® M2 Affinity Gel“ (Sigma-Aldrich) gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Die Konzentrationen von rekombinantem Itih5 wurden mit einem BCA Protein Assay (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) bestimmt.
HA-Abbau-Assay
Für den Abbau von Hyaluronsäure wurde die Bildung von ROS durch das zuvor beschriebene Cu(II)/H₂O₂-System induziert (Esser PR, et al., PLoS One (2012) 7, e41340). Kurz gesagt, wurde die ROS-Bildung durch Inkubation in 0,1 M NaH₂PO₄ (Merck) pH 7,4, das 50 mM CuSO₄ (Sigma-Aldrich) enthielt, mit 100 mM H₂O₂ (Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland) induziert. Unterschiedliche Konzentrationen eines humanen rekombinanten ITIH5-Proteins wurden für 1h bei Raumtemperatur zu 20 µg hochmolekularer (HMW) Hyaluronsäure (Natriumsalz, Calbiochem) und ROS-induzierenden Reagenzien hinzugefügt. Die Proben wurden mittels Elektrophorese in einem 7%igen Polyacrylamid-Gel analysiert und über Nacht mit 0,005% „Stains-All“-Farbstoff (Sigma-Aldrich) in 50%igem Ethanol visualisiert.
CHS-Maus-Modell
Zur Induktion der Kontakt-Hypersensitivität (eng. contact hypersensitivity, CHS) wurden WT- oder Itih5^-/--Mäusen 100µl TNCB (3% w/v) oder das entsprechende Volumen an Aceton als Vehikelkontrolle am rasierten Abdomen von 5 Mäusen pro Gruppe eingesetzt. Die Ohrendicke wurde am 5. Tag mit einem Dickenmessgerät (HITEC Messtechnik GmbH, Magstadt, Deutschland) gemessen und die Kontaktallergie bei den Mäusen wurde durch Verabreichen von 20 µl TNCB (1%) oder Aceton an den Ohren ausgelöst. 24 h später wurde der Anstieg der Ohrendicke gemessen.
Adoptives CHS
WT- oder Itih5^-/--Mäuse wurden sensibilisiert, indem die rasierte Haut des Abdomens entweder mit 100 µl von 3% TNCB oder Aceton als Lösungsmittelkontrolle und beide Ohren mit 20 µl von 3% TNCB oder Aceton bemalt wurden. Aurikuläre, axilläre,maxilläre und oberflächliche Leistenlymphknoten wurden 5 Tage später entnommen. Es wurden Einzelzellensuspensionen hergestellt und 1 × 10⁶ Lymphknotenzellen i.v. in naive WT-Empfängermäuse injiziert. Die Dicke beider Ohren der Empfänger wurde 24 h nach dem adoptiven Zelltransfer vor dem Aufbringen von 20 µl 1% TNCB gemessen. Die Zunahme der Ohrenschwellung wurde 24 Stunden nach der Belastung gemessen.
Statistische Analyse
Die Daten werden als arithmetisches Mittel ± Standardabweichung angegeben. Mann-Whitney U Test wurde mit GraphPad PRISM Version 7 (La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Werte von *p<0,05, **p<0,01 und ***p<0,001 wurden als signifikant angesehen und sind in den Abbildungen angegeben.
Ergebnisse
ITIH5 stabilisiert EZM-Strukturen und reguliert biologische Prozesse in murinen Hautmodellen
Für TSG6, ein Mitglied der ITIH-Familie, ist bereits zuvor postuliert worden, dass es Hyaluransäure quervernetzen könnte (Zhuo et al., 2004, supra). Es war das Ziel der Erfinder, mit Hilfe von 3D-Hautmodellen, die dermale Fibroblasten und epidermale Keratinozyten aus entweder Itih5^-/-- oder WT-Mäusen enthalten, den Einfluss von ITIH5 auf EZM-Strukturen zu untersuchen. Um die EZM-Strukturen in diesen Hautmodellen zu visualisieren, verwendeten sie van Gieson-Färbung und ein biotinyliertes Hyaluronan-Bindungsprotein (bHABP) (1A-1H). Während Hautmodelle mit WT-Zellen ein ausgeprägtes fibrilartiges Muster zeigten (1A bis F), zeigten Hautmodelle von Itih5^-/- Mäusen ein diffuses Muster von EZM-Strukturen (1E bis H).
Zur Beurteilung der biologischen Relevanz von ITIH5 in der Haut wurde außerdem ein transkriptomisches Microarray-Profiling der murinen Hautmodelle durchgeführt (1B). Es wurde eine starke Hochregulation von Genen festgestellt, die mit Gewebeumbau und Wundheilung verbunden sind (d.h. Car4, Postn, Mmp19, Mmp10, Mmp9 und Mmp3) sowie eine Abwärtsregulierung der Differenzierungsmarker einschließlich der Mitglieder der LCE-Proteinfamilie (Lce3a), Lce3b, Lce3c, Lce3f, Lcelb, Lcelc und Lcele), Loricrin, Keratin 10, Keratin 13 und Keratin 23 sowie repetin (Rptn) und Arachidonat12-Lipoxygenase (Alox12b). Zusätzlich bestätigten RT-PCR-Analysen die Array-Ergebnisse für ausgewählte Gene ( 1C). Die Analyse der Gen-Ontologie (GO) ergab einen Einfluss von ITIH5 auf biologische Prozesse (BP) (6) wie „Epidermis-Entwicklung“, „extrazelluläre Matrixorganisation“ und „Glykosaminoglykan-Stoffwechselprozess“.
Diese Daten belegen eine stabilisierende Wirkung von ITIH5 auf EZM-Strukturen und geben einen ersten Einblick in die molekulare Funktion von ITIH5 bei der Regulation der Hautbildung und EZM-Homöostase.
Rekombinantes Itih5-Protein kann HMW-HA vor ROS-vermitteltem Abbau schützen
Pro-inflammatorische LMW-Hyaluronsäure-Fragmente können durch oxidativen Abbau von HMW-Hyaluronsäure mit reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) hergestellt werden (Esser et al., 2012). In diesem Zusammenhang postulierten frühere Studien eine EZM-stabilisierende Wirkung für schwere ITI-Ketten durch Vernetzung von Hyaluronsäure, die als Schutzmechanismus bei Entzündungen angesehen wird (Chen, L, et al., J Biol Chem (1994) 269, 28282-28287; Day, A.J., und de la Motte, C.A., Trends Immunol (2005) 26, 637-643; Zhuo et al., 2004, supra; Zhuo, L., und Kimata, K., Connect Tissue Res (2008) 49, 311-320).
Um zu testen, ob ein rekombinantes ITIH5-Protein in der Lage ist, Hyaluronsäure vor ROS-vermitteltem Abbau zu schützen, wurde ein ROS produzierendes Cu(II)SO₄/H₂O₂-System wie zuvor beschrieben verwendet (Esser et al., 2012, supra; Gao et al., J Biol Chem (2008) 283, 6058-6066). 2 zeigt das Natriumsalz von HMW-Hyaluronsäure (Spur 1-3) und dessen Abbau durch ROS zum Natriumsalz von LMW-Hyaluronsäure-Fragmenten (Spur 4). Ein murines rekombinantes Itih5-Protein konnte den Abbau von HMW-Hyaluronsäure dosisabhängig hemmen (Spuren 5-7). Diese Ergebnisse zeigen die Fähigkeit von ITIH5, Hyaluronsäure zu stabilisieren, indem sie den oxidativen Hyaluronsäure-Abbau verhindern.
ITIH5-Expression beeinträchtigt die Haftung von NHDFs auf HA
In ihrer vorherigen Studie haben die Erfinder festgestellt, dass normale humane dermale Fibroblasten (NHDFs) die Hauptexpressionsstelle von ITIH5 in der menschlichen Haut sind (Huth et al., 2015, supra). Um die Rolle von ITIH5 in der Haut genauer zu untersuchen, wurden mit einem stabilen shRNA-vermittelten Knockdown von ITIH5, der auf Protein- und mRNA-Ebene bestätigt wurde, NHDFs generiert (3A und 3B). Experimentell zeigten stabile ITIH5-shRNA-exprimierende NHDF-Zellen eine veränderte Zell-Matrix-Adhäsionsdynamik in vitro. Unter Verwendung von Hyaluronsäure als Substrat zur Nachahmung der EZM führte der Knockdown von ITIH5 zu einer deutlich geringeren Zell-Matrix-Adhäsion im Vergleich zu Kontrollzellen (3C).
ITIH5 moduliert Entzündungsreaktionen bei allergischer Kontaktdermatitis
Zuvor haben die Erfinder gezeigt, dass ITIH5 in der allergischen Kontaktdermatitis (ACD) signifikant hochreguliert ist (Huth et al., 2015, supra). Um die Rolle von ITIH5 in der ACD genauer zu verstehen, wurde das CHS-Mausmodell verwendet, bei dem die Intensität der Ohrschwellungsreaktion als Maß für die Entzündungsreaktion verwendet wird. Die Untersuchungen zeigten, dass Itih5^-/--Mäuse nach 2,4,6-Trinitrochlorbenzol (TNCB) im Vergleich zu WT-Kontrollen (n=5) signifikant geringere Schwellungsreaktionen zeigten (4A). Diese Daten deuten daraufhin, dass ITIH5 für CHS-Antworten unerlässlich ist, ohne speziell zwischen Sensibilisierungs- und Erregungsphase zu unterscheiden. Deshalb wurden adoptive CHS-Experimente (Trans-Sensibilisierung oder passive CHS) durchgeführt, um die Rolle von ITIH5 bei der Sensibilisierung weiter zu untersuchen (4B). Die vorliegenden Ergebnisse zeigten, dass keine TNCB-induzierte Ohrschwellung beobachtet werden konnte, wenn Lymphknotenzellen, die aus TNCB-sensibilisierten Itih5^-/--Donor-Mäusen isoliert wurden, adoptiv auf WT-Empfängermäuse übertragen wurden, im Vergleich zu Vehikelkontrollen (n=3). Diese Ergebnisse belegen eine funktionelle Rolle von ITIH5 in der Sensibilisierungsphase von CHS.
Einfluss von ITIH5 auf die Epidermisdicke
Wurde eine Lösung des rekombinanten ITIH5-Proteins in ein humanes 3D-Hautmodell injiziert, so wurde eine Zunahme der Epidermisdicke beobachtet (5A-C).
Wirkung von ITIH5 auf die Genepression
Die Injektion von ITIH5 in humane Hautmodelle zeigte ähnliche Effekte auf die Genexpression, wie sie auch bei der Injektion eines Hyaluronsäurepräparates beobachtet wurden (7). Hierbei zeigte sich insbesondere eine Hochregulation von Genen, die mit Gewebeumbau und Immunantwort verbunden sind (TIMP3, MMP3, CCL20, CXCLs) sowie eine Abwärtsregulierung von Differenzierungsmarkem (z.B. FLG, LOR, IVL) und proinflammatorischen Zytokinen (IL36G, IL36RN, IL36B). Diese Daten deuten auf eine gesteigerte Proliferation epidermaler Zellen hin.
Diskussion
Hyaluronsäure ist ein wichtiger Bestandteil der EZM und spielt eine wichtige Rolle im Stoffwechsel der Haut, wo der Großteil der Hyaluronsäure produziert und abgelagert wird (Kavasi, R.M. et al., Food and Chemical Toxicology: an international journal published for the British Industrial Biological Research Association (2017) 101, 128-138; Keen, M.A., Skinmed (2017) 15, 441-448). Die Eigenschaften von Hyaluronsäure sind abhängig vom Molekulargewicht. In diesem Zusammenhang führt der Abbau von Hyaluronsäure zu biologisch aktiven Oligosacchariden, die mit entzündlichen Hauterkrankungen assoziiert sind (Esser, PR,et al., PLoS One (2012) 7, e41340; Kavasi et al., 2017, supra). Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass die Bindung an Hyaladherine Hyaluronsäure in einer Vielzahl von molekularen Architekturen organisieren kann, die unterschiedliche Eigenschaften wie die Stabilisierung der EZM oder entzündungshemmende Effekte bieten (Day and de la Motte, 2005, supra). Bereits zuvor haben die Erfinder gezeigt, dass ITIH5 das wichtigste ITIH-Familienmitglied in der menschlichen Haut darstellt, während ITIH1-4 kaum exprimiert werden (Huth et al., 2015, supra). Frühere Studien haben bereits gezeigt, dass ITIH1-3 kovalente Esterbindungen mit Hyaluronsäure bilden kann, die ITIH-HA-Komplexe ergeben, die die EZM durch Vernetzung von Hyaluronsäure stabilisieren können (Sanggaard, K.W., et al., J Biol Chem (2008) 283, 18530-18537; Zhao, M., et al., J Biol Chem (1995) 270, 26657-26663; Zhuo et al., 2004, supra). Auch wenn die Existenz einer stabilisierenden Interaktion zwischen ITIH5 und der EZM-Komponente Hyaluronsäure noch nicht im Detail nachgewiesen ist, weist ITIH5 alle strukturellen Eigenschaften von ITIH1-3 auf, die für die Hyaluronsäure-Komplexierung notwendig sind (Himmelfarb, M., et al., Cancer Lett (2004) 204, 69-77).
Die vorliegenden Daten zeigten Hautmodelle von Itih5^-/--Mäusen ein diffuses Muster von EZM-Strukturen im Vergleich zu Kontrollen. Diese phänotypische Anomalie deutet darauf hin, dass in diesen Modellen eine Itih5-vermittelte Hyaluronsäure-Vernetzung fehlt, die für die Stabilisierung der EZM, wie sie für ITIH1-3 beschrieben wurde (Zhu, L., et al., Connect Tissue Res (2008) 49, 48-55), wesentlich ist. Als weiterer Beweis für eine Interaktion zwischen ITIH5 und Hyaluronsäure haben die Erfinder gezeigt, dass Fibroblasten mit einem shRNA-vermittelten Knockdown von ITIH5 eine verminderte Adhäsion zu Hyaluronsäure aufweisen. Diese Beobachtungen entsprechen den Ergebnissen von Zhuo et al. (Zhuo, L., et al., J Biol Chem (2006) 281, 20303-20314), die gezeigt haben, dass ITIHs die Adhäsion von CD44-positiven Zellen an Hyaluronsäure potenzieren. In diesem Zusammenhang zeigte eine aktuelle Studie, dass CD44 das Fibroblastenverhalten durch Modulation von Zell-Matrix-Interaktionen beeinflusst (Tsuneki, M., und Madri, J.A., J Cell Physiol (2016) 231, 731-743).
Basierend auf diesen Erkenntnissen ist es wahrscheinlich, dass die von den Erfindern beobachtete verminderte Adhäsion von ITIH5 Knockdown-Fibroblasten an Hyaluronsäure auf eine beeinträchtigte CD44-HA-Verbindung zurückzuführen ist. Diese Ergebnisse unterstützen allerdings eine aktuelle Studie, die darauf hindeutet, dass die ITIH5-HA-Interaktion über CD44 einerseits phänotypische Veränderungen in Fibroblasten auslöst und andererseits die Bildung einer perizellulären Hyaluronsäure-Matrix bedingt (Martin, J, et al., J Biol Chem (2016) 291, 13789-13801).
Die ITIH1-3-vermittelte Vernetzung von Hyaluronsäure wurde früher als Schutzmechanismus gegen den Abbau von Hyaluronsäure bei entzündlichen Prozessen vorgeschlagen (Day and de la Motte, 2005, supra), da ITIH-HA-Komplexe in Synovialflüssigkeiten von Arthritis-Patienten identifiziert wurden (Yingsung, W., et al., J Biol Chem (2003) 278, 32710-2718).
Mit einem ROS-vermittelten Degradationstest wird der erste Nachweis bereit gestellt, dass ITIH5 in der Lage ist, Hyaluronsäure vor einem Abbau zu schützen. In diesem Zusammenhang hat eine vorherige Studie der Erfinder gezeigt, dass ITIH5 bei entzündlichen Hauterkrankungen signifikant hochreguliert ist (Huth et al., 2015, supra). Diese Hochregulierung könnte ein Ausgleichsmechanismus sein, um die Hyaluronsäure zu stabilisieren und so die Ansammlung von entzündungsförderndem LMW-HA zu verhindern und möglicherweise die Immunantwort zu erleichtern.
Um die biologische Funktion von ITIH5 in der Haut weiter aufzuklären, haben die Erfinder Hautäquivalente von Itih5^-/--Mäusen einer Gen-Microarray- und RT-PCR-Analyse unterzogen. Die Ergebnisse zeigten ein hochreguliertes Expressionsniveau von Genen (z.B. Car4 und Postn), die mit Wundheilung und Gewebeumbau in Itih5^-/--Hautmodellen verbunden sind. Während Kohlensäureanhydrase 4 (Car4) die Geweberegeneration fördert und die Wundheilung beschleunigt (Barker, H., et al., Experimental & Molecular Medicine (2017) 49, e334), zeigten frühere Studien, dass Periostin (Postn) beim EZM-Remodeling prominent exprimiert wird (Zhou, L., et al., J Biol Chem (2010) 279, 38079-38082). Darüber hinaus konnten die Erfinder eine erhöhte Expression verschiedener Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) in murinen Hautmodellen ohne Itih5 feststellen. MMPs sind die wichtigsten EZM-Enzyme, die für den Abbau von im Wesentlichen allen EZM-Komponenten verantwortlich sind (Jablonska-Trypuc, A., et al., Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry (2016) 31, 177-183; Kähäri, V.M., und Saarialho-Kere, U., Exp Dermatol (1997) 6, 199-213). Interessanterweise zeigten mehrere Studien, dass HMW-HA die Expression verschiedener MMPs unterdrücken kann (Pohlig, F., et al., PLoS One (2016) 11, e0150020; Shimizu, M., et al., J Rheumatol (2003) 30, 1164-1172; Takahashi, K., et al., Osteoarthritis and Cartilage (1999) 7, 182-190). Das Fehlen von Itih5 wurde weiter mit der Abwärtsregulierung von Genen, die für die epidermale Differenzierung kodieren, in Verbindung gebracht. Insgesamt passen diese Genregulationen zu den beobachteten phänotypischen Anomalien bezüglich diffuser EZM-Muster und epidermaler Störungen in Itih5^-/--Hautmodellen. In Übereinstimmung mit den ermittelten Genregulationen fanden die Erfinder einen Einfluss von ITIH5 auf biologische Prozesse wie „Epidermisbildung“, „extrazelluläre Matrixorganisation“ und „Glykosaminoglykan-Stoffwechselprozess“. Gemeinsam unterstützen und betonen die Expressionsdaten die funktionelle Relevanz von ITIH5 für biologische Hautprozesse wie EZM-Organisation, Hauthomöostase und epidermale Differenzierung.
In ihren vorherigen Studien haben die Erfinder gezeigt, dass ITIH5 bei ACD signifikant hochreguliert ist (Huth et al., 2015, supra). Anhand des CHS-Modells, bei dem kürzlich eine Rolle für den Hyaluronsäure-Abbau bei der Modulation der Entzündungsreaktion beschrieben wurde (Esser, P.R., et al., PLoS One (2012) 7, e41340), konnten die Erfinder feststellen, dass Itih5^-1--Mäuse signifikant reduzierte CHS-Reaktionen zeigten. Diese Ergebnisse passten nicht zur ersten Annahme, dass ITIH5 als Hyaluronsäure-Stabilisator den Hyaluronsäure-Abbau und damit die CHS-Reaktionen verhindert. In diesem Fall sollten Itih5^-/--Mäuse im Vergleich zu Kontrollen noch ausgeprägtere CHS-Reaktionen zeigen. Die Erfinder spekulieren, dass die früher postulierte ITIH-abhängige CD44-HA-Interaktion eine Erklärung für ihre Beobachtungen sein könnte. Der Hyaluronsäure-Rezeptor CD44 wird für eine vollständige Entzündungsreaktion auf Hyaluronsäure-Fragmente in vitro benötigt (Taylor, K.R., et al., J Biol Chem (2007) 282, 18265-18275) und ist für eine optimale Kontaktallergie aufgrund von Leukozytenparavasation in Entzündungsstellen notwendig (Camp, R.L., et al., J Exp Med (1993) 178, 497-507). Frühere Studien zeigten, dass ITIH1-3 die CD44-vermittelte Leukozytenadhäsion an HA und damit die Leukozytenmigration an Entzündungsstellen, an denen Hyaluronsäure akkumuliert ist, potenziert (Lauer, M.E., et al., J Biol Chem (2013) 288, 423-431; Zhuo et al., 2006, supra). Ohne Itih5 als die wichtigste schwere Kette in der Haut könnte die CD44-vermittelte Leukozytenrekrutierung bei den sensibilisierten Itih5^-/--Mäusen geringer sein, wodurch die CHS-Antworten reduziert werden. In diesem Zusammenhang zeigten Muto und Kollegen, dass der HA-Abbau bei HYAL1 überexprimierenden Mäusen die CHS-Antwort aufgrund der Depletion von dendritischen Zellen (DCs) aus der Haut verringert (Muto, J., et al., J Clin Invest (2014) 124, 1309-1319). Da DCs CD44 exprimieren, gehen die Autoren davon aus, dass der Verlust von Hyaluronsäure aus der EZM die CHS-Reaktionen durch fehlende Interaktionen zwischen CD44 und HA beim Leukozytentransport verändert. Die vorliegenden Daten deuten insgesamt daraufhin, dass ITIH5 ein neuartiger Schlüsselspieler bei Entzündungsreaktionen der Haut sein könnte. Die detaillierte Wirkung von ITIH5 in der Sensibilisierungsphase von CHS muss in weiteren Studien aufgeklärt werden.
Die Injektion von ITIH5 in humane Hautmodelle zeigt im Vergleich zu Hyaluronsäure ähnliche Effekte auf die Epidermisdicke sowie Genexpressionsmuster. Diese Beobachtungen sprechen dafür, dass ITIH5 in der Lage ist die in der Haut natürlich vorkommende Hyaluronsäure zu unterstützen.
Zusammenfassend liefern diese Daten den ersten Nachweis, dass ITIH5 mit Hyaluronsäure interagiert und damit einerseits biologische Prozesse in der Haut einschließlich EZM-Stabilisierung und epidermaler Differenzierung beeinflusst sowie die epidermale Proliferation fördert und andererseits CHS-assoziierte Entzündungsreaktionen moduliert. Die vorliegenden Ergebnisse bieten neue Therapieoptionen für Patienten mit epidermaler Dysfunktion und Hyaluronsäure-basierten altersbedingten Hautveränderungen wie Falten und Epidermis-Verdünnung, bei denen ITIH5 als Stabilisator von Hyaluronsäure diesen Störungen entgegenwirken kann.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2005/110439 [0008]
WO 2011/110894 [0008, 0047]
WO 2003/043660 [0008]
US 2014/0004210 [0008]
WO 2018/118448 [0008]
WO 2014/23272 [0008]
WO 2008/031194 [0084]
WO 2017/027177 [0092]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Fakhari A & Berkland C. Acta biomater. 2013;9(7):7081-7092 [0007]
Singh, A., Yadav, S., Indian Dermatol Online J (2016) 7, 244-254 [0055]
Haedersdal, M., et al., Lasers in Surgery and Medicine (2010) 42, 113-122 [0056]
Huth, S. et al., Exp Dermatol. (2016) 25, 12, 997-999 [0056]
Bost, F., et al., Eur. J. Biochem. (1998) 252, 339-346 [0062]
Himmelfarb, M., et al., Cancer Lett. (2004) 204, 69-77 [0062]
Zhuo, L., et al., J. Biol. Chem. (2004) 279, 38079-38082 [0062]
Salier, J.P., et al., Biochem. J. (1996) 315 (Pt 1), 1-9 [0063]
Ill. et al.., Protein Eng (1997) 10, 949-957 [0097]
Martin et al., EMBO J (1994) 13, 5303-5309 [0097]
Holliger et al., PNAS U.S.A. (1993) 90, 6444-6448 [0097]
Traunecker et al., Int J Cancer (1992) [0097]
Himmelfarb, M., et al., Cancer Lett (2004) 204, 69-77 [0137]
Zhu, L., et al., Connect Tissue Res (2008) 49, 48-55 [0138]
Tsuneki, M., und Madri, J.A., J Cell Physiol (2016) 231, 731-743 [0138]
Barker, H., et al., Experimental & Molecular Medicine (2017) 49, e334 [0142]
Zhou, L., et al., J Biol Chem (2010) 279, 38079-38082 [0142]
Pohlig, F., et al., PLoS One (2016) 11, e0150020 [0142]
Shimizu, M., et al., J Rheumatol (2003) 30, 1164-1172 [0142]
Takahashi, K., et al., Osteoarthritis and Cartilage (1999) 7, 182-190 [0142]
Taylor, K.R., et al., J Biol Chem (2007) 282, 18265-18275 [0143]
Camp, R.L., et al., J Exp Med (1993) 178, 497-507 [0143]
Lauer, M.E., et al., J Biol Chem (2013) 288, 423-431 [0143]
Muto, J., et al., J Clin Invest (2014) 124, 1309-1319 [0143]

Claims

Das Säugetierprotein ITIH5 a) zur Anwendung in einem Verfahren zur Linderung oder Vorbeugung von Hautalterung, faltiger Haut, rauer Haut, trockener und rauer Haut, Akne, eine Aknenarbe, Hautatrophie und/oder einem Druckgeschwür (Dekubitus), b) zur Anwendung in einem Verfahren für die Behandlung eines arthritischen und/oder arthrotischen Gelenks oder von arthrotischen Veränderungen eines Gelenks und/oder c) zur Anwendung an einem Subjekt, das an verminderter Hyaluronsäure leidet.
Kosmetische Verwendung des Säugetierproteins ITIH5 als Stabilisator von Hyaluronsäure oder einem Salz oder Ester davon.
Zusammensetzung aufweisend das Säugetierprotein ITIH5 und Wasser.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei ITIH5 das humane Protein ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 3 oder 4, weiterhin einen kosmetisch und/oder pharmazeutisch verträglichen Arzneiträgerstoff aufweisend.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, weiterhin ein Lokalanästhetikum aufweisend.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, weiterhin Hyaluronsäure, ein Salz oder einen Ester davon aufweisend.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 7 a) zur Anwendung in einem Verfahren zur Linderung oder Vorbeugung von Hautalterung, faltiger Haut, rauer Haut, trockener und rauer Haut, Akne, eine Aknenarbe, Hautatrophie und/oder einem Druckgeschwür (Dekubitus), b) zur Anwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines arthritischen und/oder arthrotischen Gelenks oder von arthrotischen Veränderungen eines Gelenks und/oder c) zur Anwendung an einem Subjekt, das an verminderter Hyaluronsäure leidet.
Verfahren zur kosmetischen Behandlung der Haut einer Person, aufweisend das Applizieren des Säugetierproteins ITIH5 auf oder in die Haut der Person.
Verfahren nach Anspruch 9 oder Zusammensetzung zur Anwendung nach Anspruch 8, wobei die Person bzw. das Subjekt an einer Verringerung der Hyaluronsäure leidet.
Antikörper gegen ITIH5 zur Anwendung gegen eine Dermatitis.
Antikörper zur Anwendung nach Anspruch 11, wobei die Dermatitis eine allergische Kontaktdermatitis und/oder eine atopische Dermatitis ist.
In-vitro-Verfahren zur Identifizierung eines Verbindungskandidaten, der als Stabilisator von Hyaluronsäure oder eines Salzes davon geeignet ist, aufweisend in Gegenwart von Hyaluronsäure eines bestimmten Molekulargewichts oder eines Salzes davon in einer Lösung, die ein Cu(II)-Salz und H₂O₂ enthält, eine zu prüfende Verbindung mit ITIH5 in Kontakt bringen und das Molekulargewicht der Hyaluronsäure oder des Salzes davon nach einem vorbestimmten Zeitintervall bei einer vorbestimmten Temperatur bestimmen, wobei im Vergleich zu einer Kontrolle eine verminderte Abnahme des Molekulargewichts der Hyaluronsäure anzeigt, dass die zu prüfende Verbindung als Kandidat für einen Stabilisator von Hyaluronsäure oder eines Salzes davon geeignet ist.