TR2022003554A2 - Pluri̇potent kök hücrelerden mezenki̇mal kök hücreleri̇n eldesi̇nde kullanilabi̇lecek bi̇r yöntem ve kültür ortami formülasyonu - Google Patents

Abstract

Bu buluş, insan pluripotent kök hücrelerden mezenkimal kök hücrelerinin (MKH) elde edilmesine yönelik apelin içeren bir kültür ortamı (besiyeri) ve bu ortamın kullanıldığı bir yöntem ile ilgilidir. Ayrıca, mevcut buluş bu kültür ortamı ve bu yöntem ile gelişim biyolojisi evreleri taklit edilerek araştırma ve klinik uygulamalarda kullanılabilecek mezenkimal kök hücre eldesi ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME PLURIPOTENT KÖK HÜCRELERDEN MEZENKIMAL KÖK HÜCRELERIN ELDESINDE KULLANILABILECEK BIR YÖNTEM VE KÜLTÜR ORTAMI FORMÜLASYONU Teknik Alan Bu bulus, insan pluripotent kök hücrelerden mezenkimal kök hücrelerinin (MKH) elde edilmesine yönelik apelin içeren bir kültür ortami (besiyeri) ve bu ortamin kullanildigi bir yöntem ile ilgilidir. Ayrica, mevcut bulus bu kültür ortami ve bu yöntem ile arastirmada ve klinik uygulamalarda kullanilabilecek mezenkimal kök hücre eldesi ile ilgilidir. Önceki Teknik Kök hücreler, bir organizmanin dokularini olusturan çesitli hücrelere farklilasabilen ana hücrelerdir ve genellikle diger hücrelere dönüsmeden önce farklilasmamis hücrelere olarak adlandirilirlar. Mezenkimal kök hücreler bölünebilir, kendilerini yenileyebilir ve kemik, kikirdak, yag, kalp, kas vs. gibi mezoderm kökenli hücrelere farklilasarak birçok doku ve organin yenilenmesinde ve tedavisinde kullanilirlar. Mezenkimal kök hücreler, yetiskin kök hücre türlerindendir. Diger kök hücrelere göre mezenkimal kök hücrelerin kullanilmasi daha güvenli, kolay ve avantajli olsa da terapötik etki göstermesi için, fazla miktarda elde edilmesi ve üretilmesi gerekmektedir. Yeterli miktara ulasmak için ya kaynaktan çok fazla miktarda alinmasi ya da uzun sureli in vitro hücre bölünmesi gerekmektedir. Ancak sinirli ömürlerinden dolayi mezenkimal kök hücreler hizli yaslanmakta ve beraberinde çogalma, farklilasma ve hücre göçü gibi terapötik etki için gerekli fonksiyonlarin kaybi söz konusu olmaktadir. Bu nedenle in vitro kosullarda çok miktarda, saglikli mezenkimal kök hücre eldesini saglayacak yöntemlere ihtiyaç vardir. 25418.128 Mezenkimal kök hücreler yetiskin bireyden farkli dokulardan izole edilerek kültüre edilir, arastirma ve uygulama kapsaminda kullanilabilirler. Bu hücreleri pluripotent kök hücrelerden elde etmek ve kültürde fazla miktarda saglikli sekilde üretmek, heterojen hücre popülasyonu çogaltilmasinin önüne geçilmesi ve kisiye özgü hücresel tedaVi kaynagi üretilmesi bakimindan önemlidir. Pluripotent kök hücreler embriyonik kök hücreler ve indüklenmis pluripotent kök hücreler olarak siniflandirilir ve pluripotent özellikleri sayesinde pek çok hücre türüne farklilasabilmektedir. Bir kök hücre tedaVisi ürünü olarak tüm hücrelere farklilasabilen pluripotent insan kök hücrelerini kullanmak için çesitli girisimlerde bulunulmustur. Pluripotent kök hücrelerden mezenkimal kök hücre eldesi ile ilgili bugüne kadar birçok yöntem ve protokol gelistirilmistir. bFGF kullanarak farklilastirilan mezenkimal kök hücreler, orijinal mezenkimal kök hücrelere morfolojik ve belirteçlerin ekspresyonlari bakimindan oldukça benzerlik göstermektedir. Ancak farklilasma potansiyelleri basta adipojenik farklilasma olmak üzere sinirli olabilmektedir. Pluripotent kök hücre eldesi, karakterizasyonu, kültürü ve farklilastirilmasi kök hücre çalismalari için oldukça önemlidir. Klinikte uygulanabilecek protokollerin gelistirilmesi kök hücre tedaVisi temelli uygulamalarin temelini olusturacaktir. Pluripotent kök hücrelerin kültürde etkili sekilde farklilastirilamamasi klinikte uygulanabilecek terminal farklilasmasi gerçeklesmis hücrelerin elde edilmesini engellemektedir. Mezenkimal kök hücrelerin ana kaynagi somatik lateral plate mezoderm oldugundan, gerekli morfojenler kullanilarak ve mezoderm sinyal yolaklari göz önünde bulundurularak pluripotent hücreler önce mezoderme, sonrasinda ise mezenkimal kök hücrelere farklilastirilmistir. Bu yolla elde edilen mezenkimal kök hücrelerle orijinal mezenkimal kök hücreler morfolojik ve yüzey belirteçleri 25418.128 bakimindan ayni olmakla kalmayip, multipotensi ve düsük immun reaksiyon göstermistir. Klinik denemelerde pluripotent kök hücreden elde edilen mezenkimal kök hücrelerin orijinal mezenkimal kök hücreler yerine kullanilabilmesi için dikkat edilmesi gereken ve üstesinden gelinmesi gereken konulardan bir tanesi, uyarilmis pluripotent kök hücrelerin mezenkimal kök hücrelere farklilastirildiklarinda, onkolojik genlerde farklilasma olup olmadiginin test edilmesidir. Ayrica mezenkimal kök hücrelerin safligi ve kalitesi önemli oldugundan, mezenkimal kök hücre belirteçleri pozitif, pluripotent belirteçleri negatif olacak sekilde hücreler seçilip ayirilmali ve onkogenez riskini elimine etmek için klinige tasimadan önce hayvan modelleri üzerinde denemeler yapilmalidir. Bununla birlikte diger stabil olmayan faktörlerden kurtulup, xeno-free kültür ortaminda bütün asamalar gerçeklestirilmelidir. Literatürde, mezenkimal kök hücre kültürleme yöntemindeki problemleri çözmek ve mezenkimal kök hücreleri üretmek için insan pluripotent kök hücrelerinin kullanilabilecegine yönelik çalismalar yapilmistir. Insan pluripotent kök hücrelerinden mezenkimal kök hücrelere farklilasmasi genelde bir indüksiyon prosedürü gerektirmektedir. Ayrica bu yöntemler ile üretilen mezenkimal kök hücrelerin temel durumunu korumasi ve üretim verimliliginin düsük olmasi gibi zorluklar mevcuttur. Bu nedenlerden ötürü mezenkimal kök hücrelerin, rejeneratif tip ve hücre tedaVisi alanlarinda ideal hücre tedaVi ürünleri olarak kullanilmalarinda sinirlamalar vardir. Yeterli sayida mezenkimal kök hücre elde edilememesi, kök hücrelere ulasmak için invaziV metotlar kullanilmasi, farkli dokular ve bireyler arasi saglik durumu, yas gibi faktörler kaynakli gözlemlenen heterojenite, kültürde çogaltilirken hizli 25418.128 yaslanma ve allojenik tedavilerde gözlemlenen doku uyumsuzlugu mezenkimal kök hücre kültür ve tedavilerinde gözlemlenen problemlerdir. Pluripotent kök hücre kaynakli mezenkimal kök hücre eldesi bu problemleri ortadan kaldirabilecektir. Pluripotent kök hücre kaynakli mezenkimal kök hücre eldesi için kullanilan protokollerin optimizasyona ihtiyaci bulunmaktadir. Pluripotent kök hücre kaynakli mezenkimal kök hücre eldesi isleminin kültürde kisa sürede ve ucuz teknikler kullanilarak gerçeklestirilmesi tedavide uygulanabilecek hücre eldesi için çözülmesi gereken problemlerdir. Bu sebeple pluripotent kök hücre kaynakli mezenkimal kök hücre eldesi protokollerinin olusturulmasi ve elde edilen hücrelerin kök hücre özelliklerini koruyarak kültürde tutulmasi önemlidir ve tedavi protokolleri için gereklidir. Apelin ( APLN olarak da bilinir), insanlarda APLN geni tarafindan kodlanan bir peptittir. Daha önceden US9982234B2 yayin numarali Birlesik Devletler patent dokümaninda, Apelin içeren bir besiyeri formülasyonu ile kök hücrelerin kültürlenmesiyle kök hücrelerin kendini yenileme kabiliyetlerinin, kök hücre özelliklerini koruyarak üremelerinin ve telomeraz aktivitelerinin arttigina dair bilgiler mevcuttur. Ancak pluripotent kök hücreden mezenkimal kök hücre farklilasmasinda Apelin kullanimina dair herhangi bir patent ya da makale yoktur. Bununla birlikte Apelinsin birçok hücreye farklilasmadaki rolü ve hücreleri koruyucu etkisi makalelerde bahsedilmistir. Fakat bu çalismalar pluripotent kök hücrelerden mezenkimal kök hücre (MKH) elde edilmesi ve kültürde potansiyelinin korunmasi ile ilgili degildir. Bulusun Kisa Açiklamasi Mevcut bulus, yukarida bahsedilen tüm sorunlarin üstesinden gelen ve ilgili teknik alana ilave avantajlar getiren insan pluripotent kök hücrelerinin 25418.128 mezenkimal kök hücrelerine (MKH) farklilasmasina yönelik apelin içeren bir kültür ortami (besiyeri) ve bu ortamin kullanildigi bir yöntem ile ilgilidir. Mevcut bulus, pluripotent kök hücrelerden mezenkimal kök hücre farklilasmasi için kullanilabilecek bir yöntem ile ilgili olup, yöntemde belirleyici olan kültür ortaminin apelin peptid içermesidir. Bulus, apelin içeren bir kültür ortaminin yöntem basamaklarinda belirli zaman araliklarinda kullanimi ile ilgilidir. Söz konusu bulusta bahsi geçen yöntem ile belirli zaman araliklarinda apelin reseptör sinyal yolagi aktive edilerek mezenkimal kök hücre elde edilmekte, çogalma ve karakteristiklerinin korumasi saglanmaktadir. Mevcut bulus ayrica, pluripotent kök hücrelerden mezenkimal kök hücre farklilasmasi için kullanilabilecek apelin içeren bir kültür ortaminin formülasyonu ile ilgilidir. Bu kapsamda apelin peptid uygulamasi ile mezenkimal kök hücre (MKH) farklilasma verimi ve elde edilen hücrelerin mezenkimal özelliklerinin devami saglanmaktadir. Bu patent, bu sekilde pluripotent kök hücrelerden mezenkimal kök hücre (MKH) elde edilmesi ve kültürde potansiyelinin korunmasi ile ilgilidir. Bulus ile elde edilen avantajlardan biri normal kosullarda yetiskin bireylerden sinirli miktarda elde edilen mezenkimal kök hücrelerin pluripotent kök hücrelerden sinirsiz eldesine olanak veren bir yöntem ve kültür ortami formülasyonu gerçeklestirmektir. 25418.128 Bulusun bir amaci, normal kosullarda yetiskin bireylerden elde edilen mezenkimal kök hücrelerin kültürde hizli yaslanmasinin önüne geçmek için pluripotent kök hücrelerden tekrarli eldesine olanak veren bir yöntem ve kültür ortami formülasyonu gerçeklestirmektir. Bulusun bir diger amaci, kültüre edilen mezenkimal kök hücrelerin kültürde senesense ugramadan, uzun süre pasajlanabilecegi bir yöntem ve kültür ortami formülasyonu gerçeklestirmektir. Mevcut bulusun temel amaci, pluripotent kök hücrelerden klinikte kullanilabilecek güvenli hücrelerin elde edilmesi için etkili bir farklilastirma yöntemi ile ilgilidir. Bulus, mezenkimal kök hücre (MKH) kaynakli hücre terapisi, terapötik klonlama ve yeniden progralama uygulamalarinda, mezenkimal kök hücre (MKH) kaynakli sekretom, büyüme faktörü, sitokin, kemokin uygulamalarinda, arastirma amaçli mezenkimal kök hücre (MKH) eldesi uygulamalarinda ve de hücre bankalama amaçli otolog ve alojenik bankalama uygulamalarinda kullanilabilmektedir. Mevcut bulus ile pluripotent kök hücrelerden bankalanabilir mezenkimal kök hücreler elde edilebilecektir. Gelistirilen yöntem ve kültür ortami formülasyonu içerigi farklilasmanin tetiklenmesi için bir kit haline getirilerek zamana bagli uygulanabilecek sekilde tasarlanmistir. Sekillerin Kisa Açiklamasi Bu bulusun amacina ulasmak için gerçeklestirilen "Pluri'potent Kök Hücrelerden Mezenki'mal Kök Hücrelerin Eldesi'nde Kullanilabilecek Bir Yöntem Ve Kültür Ortami F örmülasyönu" ekli sekillerde gösterilmis olup; bu sekillerden: 25418.128 Kisaltmalar: Pluripotent kök hücrenin Mezenkimal kök hücreye farklilasma sürecinde kullanilan kültür ortamlari formülasyonlari ve yöntem adimlarindaki süreler. Pluripotent kök hücrelerden Mezenkimal kök hücreye farklilastirilan hücrelerin 10. ve 24. günlerdeki morfolojileridir. Scale bar: 50um. Pluripotent kök hücrelerden Mezenkimal kök hücreye farklilastirilan hücrelerin 10. Gün (3A) ve 24. Gündeki (3B) yüzey belirteç analizleri ve yüzey belirteçlerinin pozitif ve negatif oranlaridir. Mezenkimal kök hücreye farklilasan gruplarda mezenkimal markerlarin gen anlatimi ile ölçümüdür. Elde edilen mezenkimal kök hücrelerde MTS ile hücre canliliginin ölçümüdür. * Elde edilen mezenkimal kök hücrelerde Trypan Blue ile hücre proliferasyonun ölçümüdür. Elde edilen mezenkimal kök hücrelerin bölünme süresi (iki katina çikma süresi) Kontrol ve Apelin MKH hücrelerinin kemik, kikirdak ve yag farklilasmasi sonrasi yapilan boyamalari. Von Kossa kalsiyum minerallerini boyamaktadir ve kemik farklilasma belirtecidir. Alcian Blue glikozaminoglikanlari boyamaktadir ve kikirdak farklilasma belirtecidir. Oil Red lipid granüllerini boyamaktadir ve yag farklilasma belirtecidir. N2B27: Kullanilan serumsuz besiyeri ismi, bFGF: Fibroblast büyüme faktörü (basic fibroblast growth faktör), CHIR: Wnt aktivatörü (CHIR99021), DMEM: glukoz orani azaltilmis besiyeri (Dulbecco's Modified Eagle Medium), 25418.128 G1-6: Grup1-6. DPSC: Dis kök hücresi Apeli-13: Apelin peptidi Bulusun Ayrintili Açiklamasi Bulusa konu olan çalismalarda, pluripotent kök hücrelerden mezoderm araciligi ile mezenkimal kök hücrelerin elde edilmesinde Aplnr sinyal yolaginin rolü belirlenmistir. Bu kapsamda Aplnr sinyal yolaginin mezoderm hücre göçü ve mezenkimal kök hücrelere farklilasmasi üzerindeki rolü pluripotent kök hücreler kullanilarak çalisilmis ve tespit edilmistir. Söz konusu bulus kapsaminda pluripotent kök hücrelerin etkin sekilde mezoderm ve mezenkimal kök hücrelere farklilastirilmasi üç boyutlu embriyoid küreciklerin eldesi ve sonrasinda tek tabakali kültür ortamina aktarilmasi ile mezenkimal kök hücre elde edilmesi basamaklarini kapsamaktadir. Bu durum gerçek embriyonik gelisimi taklit etmeye yönelik bir yöntem olarak etkili hücre farklilasmasinin gerçeklesmesine olanak vermektedir. Mevcut bulus, bu yöntemle üretilen mezenkimal kök hücreleri, mezenkimal kök hücreleri içeren hücre tedaVi ürünlerini ve insan pluripotent kök hücrelerinden mezenkimal kök hücrelerin üretilmesi için standartlastirilmis ve de klinik uygulamalarda kullanilabilecek, optimize hale getirilmis bir kültürleme yöntemi ve apelin içeren bir kültür ortami içermektedir. Burada kullanildigi sekliyle "kök hücreler" terimi, doku ve organlarin hücrelerini olusturmak için sinirsiz bir sekilde yenilenebilen ana hücreler anlamina gelmektedir. Kök hücreler totipotent, multipotent. pluripotent, oligopotent veya unipotent hücrelerdir. 25418.128 Burada kullanildigi sekliyle "pluripotent kök hücreler" terimi, canli bir Vücudu olusturan üç germ katmaninin tamamina farklilasabilen pluripotent kök hücrelere karsilik gelir ve bunlarin örnekleri olarak embriyonik kök hücreleri ve indüklenmis pluripotent kök (iPS) hücreleri içerir. Burada kullanildigi sekliyle "farklilasma" terimi, gerek embriyonik gelisim gerek yetiskin bireyde hücrelerin bölünmesi, çogalmasi, büyümesi sirasinda hücrelerin yapi veya isleVde özellestigi bir proses anlamina gelmektedir. Burada kullanildigi sekliyle "mezenkimal kök hücre" terimi, Yetiskin bireyde farkli dokularda yer alan yetiskin kök hücrelerini ve pluripotent kök hücreler kullanilarak mezoderm germ tabakasindan farklilastirilmis mezenkimal kök hücreleri ifade etmektedir. Burada kullanildigi sekliyle "embriyoid kürecik" terimi, pluripotent kök hücrelerin farklilasmasi indüklenerek olusan bir agregati ifade eder. 3 boyutlu yapilardir. Söz konusu bulus, insan pluripotent kök hücrelerinin mezenkimal kök hücrelerine (MKH) farklilasmasina için bir kültür ortaminin kullanimi olup, burada kültür ortami apelin peptidi içermektedir. Kültür ortamina apelin peptid ilavesi kullanilacak hücre türüne göre 0.1 micromolar ile 1 micromolar arasinda degisen sekilde ayarlanabilir. Tercihen kültür ortamindaki apelin peptid konsantrasyonu 0,5 micromolar (uM),dir. Bahsi geçen ve hazirlandiktan sonra apelin peptidi ilave edilen kültür ortamlari; N2B27 ve DMEM kültür ortamlarindan herhangi biridir. 25418.128 N2B27 kültür ortami, tercihen, L-Glutamin, bFGF (basic fibroblast growth factor; temel fibroblast büyüme faktörü) ve CHIR (CHIR99021; Wnt yolak aktivatörü) grubundan en az birini veya karisimlarini içermektedir. Bulusun tercih edilen uygulamasinda, N2B27 kültür ortami L-Glutamin, bFGF ve CHIR içermekte olup; mevcut konsantrasyonlari (hacim/toplam hacim olarak) %1 L-Glutamine, 8- 12 ng/ml (tercihen 8ng/ml,10ng/ml veya 12ng/ml) araliginda bFGF, 3uM CHIR seklindedir. DMEM kültür ortami, glukoz içermekte olup; mevcut konsantrasyonu, tercihen, lg/L glukoz seklindedir. Mevcut bulusta, apelin peptidi bu kültür ortamlarindan en az birine ilave edilerek apelin içeren "kültür ortami" olusturulmaktadir. Burada ifade edildigi sekli ile Söz konusu bulus ayni zamanda, insan pluripotent kök hücrelerinin mezenkimal kök hücrelerine (MKH) farklilasmasina için apelin peptidi içeren kültür ortami kullanilarak kök hücrelerin kültürlenmesi için bir yöntemdir. Apelin vasitasi ile hücrelerin pluripotent fazdan çiktiktan sonra farklilasma sürecinde farkli asamalarda kullanilarak mezenkimal kök hücre elde etme potansiyeli arttirilmistir. Bu sekilde apelinin eklenebilecegi zaman araligi belirlenmistir. Elde edilen hücrelerin mezenkimal kök hücre özelliklerinin arttigi ve bu özellikleri koruduklari gözlemlenmistir. Apelin bu süreçte mezoderme gidis ve buradan da mezenkimal e gidis yani farklilasmayi artirici bir rol oynamaktadir. 25418.128 Mevcut bulus, insan pluripotent kök hücrelerinden embriyoid küreciklerin olusumunu ve bu küreciklerden mezenkimal kök hücre olusumunu içermektedir. Embriyoid küreciklerin mezenkimal kök hücrelere farklilasmasinin saglanmasi için indüklenmesi gerekmektedir. Sekil lsdeki protokol ile apelinden bagimsiz sekilde mezenkimal kök hücre indüklemesi yapilmaktadir. Mevcut bulus, insan pluripotent kök hücrelerinin mezenkimal kök hücrelerine (MKH) farklilasmasi için apelin peptidi içeren kültür ortami kullanilarak kök hücrelerin kültürlenmesi için bir yöntem olup; asagidaki adimlari içermektedir: a) insan pluripotent kök hücrelerinden süspanse kültür ortaminda embriyoid küreciklerin olusturulmasi, b) olusan embriyoid küreciklerin kültür ortaminda bir yüzeye tutundurulmasi, c) embriyoid küreciklerin mezenkimal kök hücrelere farklilasmasinin saglanmasi için serumsuz N2B27 besiyeri ortaminda baslayan indüklemenin serumlu DMEM besiyeri ortaminda mezenkimal kök hücre farklilasmasina yönlendirilmesi, d) mezenkimal kök hücrelerin varligini sürdürürken kültür ortamina apelin eklenmesidir. Bulus konusu yöntemin (a) adiminda insan pluripotent kök hücrelerinden embriyoid kürecikler olusturulmaktadir. Bu asamada, insan pluripotent kök hücrelerinin, embriyoid kürecik olusturmaya elverisli kosullar altinda kültürlenmesi saglanmaktadir. Söz konusu embriyoid kürecikleri olusturmak için insan pluripotent kök hücreleri %1 L-Glutamin, 12ng/ml bFGF, 3uM CHIR eklenerek hazirlanan N2B27 kültür ortami içerisinde ve süspanse kültürde 3 gün boyunca 37° C sicaklik ve 5% COZ atmosferine sahip inkübatörde kültürlenmesi saglanmaktadir. (Sekil 1). Bulus konusu yöntemin (b) adiminda (a) adiminda olusan embriyoid küreciklerin bir yüzeye tutundurulmasi saglanmaktadir. Bu adim, embriyoid küreciklerin 3 25418.128 boyutlu kültürden 2 boyutlu kültüre transferine olanak saglamaktadir. Olusan embriyoid kürecikler 3. Günde ((c) adimina geçilir iken) 1% L-Glutamine ve 10ng/ml bFGF eklenmis N2B27 kültür ortami içerisinde jelatin ile kaplanmis yüzeye aktarilmakta ve 5. güne kadar inkübatörde bekletilmektedir. Bu sekilde hücreler 3 gün süspanse kültürden sonra yüzeye yapisarak farklilasma yapacaklardir (Sekil 1). Bulus konusu yöntemin (c) adiminda 5. Günde 1% L-Glutamine ve 8ng/ml bFGF eklenmis N2B27 kültür ortami içerisinde kültürlenme islemine devam edilmektedir. 8. güne kadar inkübe edildikten sonra 1g/L glukoz DMEM besiyeri verilmektedir. Bu adimda (c), hücre farklilasmasi (24. Güne kadar) ve kültür basamaklarinda DMEM (1 g/L glukoz içeren) kültür ortami kullanilmistir. Bu sekilde hücrelerin mezenkimal kök hücre fenotipine geçisi hedeIlenmistir. Protokol basamaklari bu sekilde geçislere sahiptir ve 24 günlük bir protokoldür (Sekil 1). Bulus konusu yöntemin (c) adiminda mezenkimal kök hücreler varligini sürdürürken kültür ortamina apelin eklenmektedir. Kültür ortamina 0,5 uM apelin peptid ilave edilmektedir. Peptid ilavesi 6 farkli deney grubu olusturulacak sekilde, gruplara bagli olarak farkli zaman araliklarinda gerçeklestirilmistir (Sekil Mevcut bulusta söz edilen yöntem 24 günlük bir protokol olup, kültür ortamina apelin ilavesi olup 3. Günden itibaren ((c) adimindan itibaren) gerçeklestirilmektedir. G1 grubu için yapilmamistir ve bu grup kontrol grubudur. G2 grubu için 3. gün ve 5.gün araliginda, G3 grubu için 5. gün ve 8. gün araliginda, G4 grubu için 8. gün ve 10. gün araliginda, G5 grubu için 10. gün ve 24. gün araliginda, G6 grubu için 3. gün ve 24. gün araliginda, uygulanmistir. 25418.128 Apelin uygulamalari her bir grup için kendi zaman araligini kapsayacak sekilde tek uygulamadir. G6 grubu için protokol belirlenmis gün araliklarinda tek sefer (o gün araligini kapsayacak sekilde) ve onuncu gün ve yirmi dördüncü gün araliginda ise iki günde bir yenileme seklinde uygulanmistir. Söz konusu bulusta, kültür ortamina apelin ilavesi, 3. günden itibaren diger bir deyisle (c) adimindan itibaren verilerek en az 2 gün (yöntemde 5. Gün) en çok 21 gün (yöntemde 24.gün) boyunca 0,5 uM olacak sekilde verilerek 24. Güne kadar uygulanmaktadir. Bulusun tercih edilen bir uygulamasinda, 10. ila 24. Gün araligindaki grup için iki günde bir 0,5 uM apelin uygulanmistir. Bu kültür ortamlarina çesitli gün araliklarinda hücrelerin mezenkimal özellikleri karsilastirilmistir ve 3. Ila 5. Gün araliklarinda ile 3. Ila 24. Gün araliklarinda 0.5uM Apelin eklenen grup (G6) en iyi mezenkimal kök hücre özelligi gösteren gruplar olarak seçilmistir. Mezenkimal kök hücre fenotipi olan fibroblast hücre morfolojisi ve plastic adherence Gl (kontrol grubu), G2 ve G6 icin hem 10. hem de 24. günde gözlenmistir (Sekil 2). Protokol optimizasyonu kapsaminda 10 ve 24 günde yüzey marker analizleri yapildi ve mezenkimal kök hücre eldesi için 24 günlük protokolün uygunluguna karar verildi (Sekil 3). 10. günde erken mezenkimal kök hücre olusumu ve 24. günde yetiskin mezenkimal kök hücre olusumu mevcuttur. 24 gün sonunda sürekli Apelin uygulanan G6 grubunda gen boyutunda CD73, CD90 ve CD105 mezenkimal markerlari Apelin uygulanmayan Gl grubuna kiyasla belirgin bir artis göstermistir (Sekil 4). Hücrelerin canliliklari MTS yapilarak, çogalmasi ise 72 saat boyunca her gün Trypan blue ile sayilarak ölçülmüs ve Apelin eklenen grupta hem canlilikta hem de çogalmada belirgin bir artis gözlenmistir (Sekil 5 ve 6). Ek olarak hücrelerin Apelin uygulamasi (G6) sonrasi bölünme süresi (iki katina çikma süresi) kisalmistir. Hücreler esit miktarda 25418.128 ekilerek 48 saat boyunca iki kez sayilmis ve bölünme zamani hesaplanmistir. Bu durum sürpriz bir sekilde Apelin uygulamasinin hücre çogalma ve bölünme hizini da etkiledigi ve pozitif etkisi oldugunu göstermistir (Sekil 7). Mevcut bulusa ait yöntemle üretilen mezenkimal kök hücreler tedavide kullanilabilecek karakteristiklere sahiptir. Mevcut bulusa ait yöntemle üretilen mezenkimal kök hücreler, bulusun tercih edilen uygulamasinda, adipositlere, osteositlere, kondrositlere, epitel, endotel ve miyositlere, nörostilere ve kardiyomiyositlere farklilastirilabilir. Ek olarak mevcut bulus, mevcut bulusa ait yöntem ile elde edilen mezenkimal kök hücrelerinin hücre tedavi ürünlerinde kullanimini içermektedir. Spesifik olarak bahsi geçen hücre tedavi ürünleri; adipositler, osteositler, kondrositler, miyositler, nörositler ve kardiyomiyositlerin olusumu ve ortamlara göre çesitli hücrelere farklilasmasi için kullanilabilecektir. Ek olarak mevcut bulus, mevcut bulusa ait yöntem ile elde edilen mezenkimal kök hücrelerinin eksozom, sitokin, büyüme faktörü, kemokin gibi salgilarinin hücre tedavi ürünlerinde kullaniminin önünü açabilecektir. Asagidaki örnekler bulus konusunu daha iyi anlatmak için olup bulus konusu, bu örneklerle sinirli degildir. TR TR TR TR TR TR

Claims (1)

1.STEMLER . Insan pluripotent kök hücrelerinin mezenkimal kök hücrelerine farklilasmasi için bir kültür ortaminin kullanimi olup, özelligi; kültür ortaminin 0,1 ila 1 ”M konsantrasyonunda apelin peptidi içermesidir. . Istem 1,e göre bir kültür ortaminin kullanimi olup, özelligi apelin peptidi konsantrasyonunu 0,5 uM olmasidir. . Istem 23ye göre bir kültür ortaminin kullanimi olup, özelligi apelin içeren kültür ortaminin N2B27 ve DMEM kültür ortamlarindan herhangi birisi olmasidir. . Istem 3,e göre bir kültür ortaminin kullanimi olup özelligi, apelin içeren kültür ortaminin N2B27 olmasidir. . Istem 4,e göre bir kültür ortaminin kullanimi olup özelligi, N2B27 kültür ortaminin ilaveten L-Glutamin, bFGF ve CHIRSden en az birini veya karisimlarini içermesidir. . Istem 5,e göre bir kültür ortaminin kullanimi olup özelligi, N2B27 kültür ortaminin L-Glutamin, bFGF ve CHIR içermesidir. . Istem 63ya göre bir kültür ortaminin kullanimi olup özelligi, N2B27 kültür ortaminin %1 L-Glutamine, 8 ila 12 ng/ml araliginda bFGF ve 3uM CHIR içermesidir. . Istem 7Sye göre bir kültür ortaminin kullanimi olup özelligi, N2B27 kültür ortaminin 8ng/ml,10ng/ml veya 12ng/ml bFGF içermesidir. 9. Istem 3,e göre bir kültür ortaminin kullanimi olup, özelligi apelin içeren kültür ortaminin DMEM olmasidir. 10. Istem 9,a göre bir kültür ortaminin kullanimi olup özelligi, DMEM kültür ortaminin ilaveten lg/L glukoz içermesidir. 11.Insan pluripotent kök hücrelerinin mezenkimal kök hücrelerine (MKH) farklilasmasi için apelin peptidi içeren kültür ortami kullanilarak kök hücrelerin kültürlenmesi için bir yöntem olup; asagidaki adimlari içermektedir: insan pluripotent kök hücrelerinden süspanse kültür ortaminda embriyoid küreciklerin olusturulmasi, olusan embriyoid küreciklerin kültür ortaminda bir yüzeye tutundurulmasi, embriyoid küreciklerin mezenkimal kök hücrelere farklilasmasinin saglanmasi için serumsuz N2B27 besiyeri ortaminda baslayan indüklemenin serumlu DMEM besiyeri ortaminda mezenkimal kök hücre farklilasmasina yönlendirilmesi, mezenkimal kök hücrelerin varligini sürdürürken kültür ortamina apelin eklenmesidir. 12.Istem ne göre bir yöntem olup özelligi, c) adiminda eklenen apelin peptid konsantrasyonunun 0,5 uM olmasidir. 13. Istem 123ye göre bir yöntem olup özelligi, c) adimindan itibaren belirlenen gün araliginda tek sefer olarak 0,5 uM apelin uygulanmasidir. Istem 13,e göre bir yöntem olup özelligi, a) adiminin 3. gün kadar, b) adiminin 3. Gün, c) adiminin 3. günden itibaren 8 ila 24. güne kadar devam etmesidir. Istem 14,e göre bir yöntem olup özelligi, yöntemin toplamda 24 gün sürme sidir. Istem 15,e göre bir yöntem olup özelligi, kültür ortamina apelin ilavesinin 3. günden itibaren diger bir deyisle (c) adimindan itibaren verilerek en az 2 gün (yöntemde 5. Gün) en çok 21 gün (yöntemde 24.gün) boyunca 0,5 uM olacak sekilde verilerek 24. Güne kadar uygulamasidir. Istem 163ya göre bir yöntem olup özelligi, (a) adiminda yer alan kültür ortaminin N2B27 olmasidir. Istem 173ye göre bir yöntem olup özelligi, (a) adiminda yer alan kültür ortaminin N2B27 kültür ortaminin ilaveten L-Glutamin, bFGF ve CHIRSden en az birini veya karisimlarini içermesidir. Istem 18,e göre bir yöntem olup özelligi, (a) adiminda yer alan N2B27 kültür ortaminin %1 L-Glutamin, 12ng/ml bFGF, 3uM CHIR içermesidir. Istem 19,a göre bir yöntem olup özelligi, (a) adiminin kültür ortaminda hücrelerin 3 gün boyunca 37° C sicaklik ve %5 COZ inkübatöründe kültürlenmesi islemi olmasidir. Istem 203ye göre bir yöntem olup özelligi, (c) adiminda kültür ortaminin 3 ila 5. Gün araliklarinda 1% L-Glutamine ve 10 ng/ml bFGF içeren N2B27 kültür ortami olmasidir. 22. Istem 21,e göre bir yöntem olup özelligi, (c) adiminda kültür ortaminin 5. Ila 8. Gün araliginda 1% L-Glutamine ve 8ng/ml bFGF eklenmis N2B27 kültür ortami olmasi ve 8. Günden itibaren lg/L glukoz içeren DMEM kültür ortami olmasidir. TR TR TR TR TR TR