WO2018056301A1 - 癌幹細胞阻害剤及びその使用 - Google Patents

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foxo3
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stem cell
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Definitions

  • the present invention relates to a cancer stem cell inhibitor and use thereof. More specifically, the present invention relates to a cancer stem cell inhibitor, a pharmaceutical composition for inhibiting cancer stem cells, and a screening method for cancer stem cell inhibitors.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2016-184692 filed in Japan on September 21, 2016, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • Cancer is one of the leading causes of death in modern society. Many efforts have been made to develop cancer therapies, but they are still often difficult to cure, with the exception of early cancers that can be surgically removed.
  • cancer stem cell hypothesis has been proposed as a cause of cancer recurrence and metastasis (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • cancer stem cell hypothesis there are stem cells similar to normal tissues in tumor tissue, and they have the ability to replicate themselves, and the ability to form tumors similar to the original tumor tissue with only a few. It is thought to have. And since cancer stem cells have resistance to anticancer drugs and radiation, they are likely to remain during treatment and are considered to cause recurrence and metastasis.
  • an object of this invention is to provide a cancer stem cell inhibitor.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a cancer stem cell inhibitor which is contained as an active ingredient.
  • [3] The cancer stem cell inhibitor according to [1] or [2], wherein the inhibitor of FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway is a cyclic guanosine monophosphate (cGMP) production inducer.
  • cGMP cyclic guanosine monophosphate
  • 67LR laminin receptor
  • cancer stem cell inhibitor according to any one of [1] to [5], wherein the cancer stem cells are pancreatic cancer stem cells or lung cancer stem cells.
  • a cancer stem cell inhibition kit comprising the cancer stem cell inhibitor according to any one of [1] to [6] and a phosphodiesterase inhibitor.
  • a pharmaceutical composition for inhibiting cancer stem cells comprising the cancer stem cell inhibitor according to any one of [1] to [6] and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a peptide for cancer stem cell inhibition that induces the production of a 67LR agonist antibody that inhibits the FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway.
  • the peptide consists of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence obtained by deleting, substituting, or adding one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the test substance inhibits cancer stem cells.
  • a method of screening for a cancer stem cell inhibitor comprising the step of determining that the agent is an agent.
  • a step of measuring the activity of FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ , PDHA1 or MARCH8 in the presence of a test substance, and the expression of FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ or PDHA1 in the absence of the test substance A step of determining that the test substance is a cancer stem cell inhibitor if the test substance is reduced compared to the amount or if the activity of MARCH8 is increased compared to the activity in the absence of the test substance And a screening method for a cancer stem cell inhibitor.
  • a cancer metastasis inhibitor comprising, as an active ingredient, an inhibitor of FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway.
  • a cancer stem cell inhibitor can be provided.
  • FIG. (A)-(c) is a graph which shows the measurement result of the spheroid formation ability in Experimental example 1.
  • FIG. (A) is a graph which shows the measurement result of the change of the tumor volume in Experimental example 2.
  • FIG. (B) is a graph showing the results of measuring the number of tumors metastasized to the liver in Experimental Example 2.
  • (C) is a representative photograph of the livers of nude mice in the Bay 41-2272 administration group and the control group (Vehicle) in Experimental Example 2.
  • (A)-(c) is a graph which shows the result of the colony assay in Experimental example 4.
  • FIG. (D) to (f) are graphs showing the results of the spheroid assay in Experimental Example 4.
  • (A) is a photograph showing the results of Western blotting in Experimental Example 5.
  • (B) to (f) are graphs obtained by quantifying the results of (a).
  • (A) is a graph which shows the measurement result of the tumor volume in Experimental example 6.
  • FIG. (B) is a graph showing the results of measuring the number of tumors metastasized to the liver in Experimental Example 6.
  • (C) is a graph showing the results of measuring the number of tumors metastasized to the liver in the study of the cancer treatment model of Experimental Example 6.
  • (A) is a graph which shows the analysis result of accession ID GSE28735 in Experimental example 7.
  • FIG. (B) is a graph which shows the analysis result of accession ID GSE21501 in Experimental example 7.
  • FIG. (A) to (c) are photographs showing the results of fluorescent immunostaining in Experimental Example 8.
  • (A) And (b) is a photograph which shows the result of the fluorescence immuno-staining in Experimental example 9.
  • FIG. (A) to (d) are photographs showing the results of Western blotting in Experimental Example 10.
  • (A) is a graph which shows the result of the colony assay in Experimental example 11.
  • FIG. (B) to (d) are graphs showing the results of the spheroid assay in Experimental Example 11.
  • (A) to (d) are photographs showing the results of Western blotting in Experimental Example 12.
  • (A)-(c) is a graph which shows the result of the colony assay in Experimental example 13.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of Western blotting in Experimental Example 14.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of Western blotting in Experimental Example 14.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of Western blotting in Experimental Example 14.
  • FIG. 1 is a graph which shows the result of the colony assay in Experimental example 16.
  • FIG. (D) to (f) are graphs showing the results of the spheroid assay in Experimental Example 16.
  • 18 is a photograph showing the results of immunoprecipitation and Western blotting in Experimental Example 17.
  • (A) And (b) is a graph which shows the result of the spheroid assay in Experimental example 18.
  • FIG. 20 is a photograph showing the results of Western blotting in Experimental Example 19.
  • B is a fluorescence micrograph showing the results of fluorescent immunostaining in Experimental Example 19.
  • C to (e) are graphs showing the results of the spheroid assay in Experimental Example 19.
  • A And (b) is the photograph which shows the result of the Western blot in Experimental example 20.
  • FIG. It is a graph which shows the result of having measured change of tumor volume in example 21 of an experiment. In Experimental example 21, it is a graph which shows the result of having measured the number of the tumors which metastasized to the liver.
  • A is a graph which shows the survival rate of the nude mouse of each group in Experimental example 22.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of the FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway revealed by the inventors.
  • the present invention provides a cancer stem cell inhibitor comprising an inhibitor of FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway as an active ingredient.
  • FIG. 25 is a schematic diagram of the FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway, which is a cancer stem cell maintenance pathway revealed by the inventors.
  • FOXO3 is one type of transcription factor called a forkhead transcription factor.
  • the RefSeq ID of human FOXO3 mRNA is NM_001455 and the RefSeq ID of mouse FOXO3 mRNA is NM_019740.
  • LKB1 is a kind of protein kinase also referred to as Serine / threonine kinase 11 (STK11).
  • the RefSeq ID of human LKB1 mRNA is NM_000455 and the RefSeq of mouse LKB1 mRNA.
  • the ID is NM_001301853, NM_001301854, NM_011492 or the like.
  • PGC-1 ⁇ is a kind of nuclear receptor cofactor.
  • the RefSeq ID of human PGC-1 ⁇ mRNA is NM — 001172698, NM — 001172699, NM — 133263, etc.
  • the RefSeq ID of mouse PGC-1 ⁇ mRNA is NM — 133249, etc.
  • PDHA1 is an enzyme present in the mitochondrial matrix. PDHA1 is an enzyme that catalyzes the oxidative decarboxylation of pyruvate and purifies acetyl CoA and carbon dioxide.
  • the RefSeq ID of human PDHA1 mRNA is NM_000284, NM_001173454, NM_001173455, NM_001173456, and the RefSeq ID of the mouse PDHA1 mRNA is NM_008810.
  • MARCH8 is a kind of membrane-bound E3 ubiquitin ligase.
  • RefSeq ID of human PGC-1 ⁇ mRNA is NM_001002265, NM_001002266, NM_001282866, etc.
  • RefSeq ID of mouse PGC-1 ⁇ mRNA is NP_001289312, NM_001302383, NP_001289313, NM_001302384, etc.
  • the function of cancer stem cells can be inhibited by inhibiting the FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway. More specifically, when the activity of any of FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ , and PDHA1 is inhibited, ubiquitination of CD44 by MARCH8 is promoted, and the abundance of CD44 decreases. As a result, the function of cancer stem cells is inhibited.
  • the cancer stem cell inhibitor means a substance that inhibits the function of cancer stem cells.
  • the function of cancer stem cells can be said to be a function of forming a tumor similar to the original tumor tissue with a small number.
  • the function of cancer stem cells can be measured by spheroid assay, colony assay, measurement of metastasis ability of cancer, etc. described later in the Examples. That is, the function of cancer stem cells can be said to be a function of forming spheroids, a function of forming colonies, a function of metastasizing cancer, and the like.
  • the function of cancer stem cells may be referred to as cancerous.
  • a cell has a function of a cancer stem cell, and a cell has a cancer stem cell property.
  • the cancer stem cell inhibitor of this embodiment can be called a cancer metastasis inhibitor, a cancer therapeutic agent, and the like.
  • cancer stem cells can also be referred to as cancer cells that highly express CD44.
  • high expression of CD44 means that the expression level of CD44 is higher than that of control cells.
  • Control cells include normal cells.
  • a cancer stem cell can be a cell having a spheroid-forming ability, a cell having a colony-forming ability, or a cell having the ability to metastasize and form a tumor in vivo.
  • the FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway inhibitor may be a FOXO3 inhibitor, an LKB1 inhibitor, or a PGC-1 ⁇ . It may be an inhibitor or a PDHA1 inhibitor.
  • the inhibitor of FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ or PDHA1 may be an expression inhibitor of FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ or PDHA1, or may have an activity of FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ or PDHA1. It may be a substance to suppress.
  • FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ or PDHA1 expression inhibitor examples include siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, antisense nucleic acid, low molecular weight compound and the like.
  • the expression of FOXO3 can be suppressed by administration of a cGMP production inducer.
  • the FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway is inhibited. Therefore, it can be said that the cGMP production inducer is also an expression inhibitor of FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ or PDHA1.
  • Examples of the cGMP production inducer include Bay 41-2272 (CAS number: 256376-24-6).
  • siRNA small interfering RNA
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • sense strand and antisense strand oligonucleotides are respectively synthesized by a DNA / RNA automatic synthesizer and denatured in an appropriate annealing buffer at 90-95 ° C. for about 1 minute, and then at 30-70 ° C. For about 1-8 hours.
  • ShRNA short hairpin RNA
  • shRNA is a hairpin RNA sequence used for gene silencing by RNA interference.
  • shRNA may be introduced into cells by a vector and expressed by U6 promoter or H1 promoter, or an oligonucleotide having shRNA sequence may be synthesized by a DNA / RNA automatic synthesizer and self-annealed in the same manner as siRNA. May also be prepared.
  • the shRNA hairpin structure introduced into the cell is cleaved into siRNA and binds to the RNA-induced silencing complex (RISC). This complex binds to and cleaves mRNA having a sequence complementary to siRNA. This suppresses gene expression in a sequence-specific manner.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • MiRNA is a functional nucleic acid encoded on the genome and finally converted into a microRNA of about 20 bases through a multi-step production process. miRNAs are classified as functional ncRNAs (non-coding RNAs, non-coding RNAs: generic names for RNAs that are not translated into proteins) and play an important role in life phenomena that regulate the expression of other genes. Yes. By administering miRNA having a specific base sequence to a living body, the expression of FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ or PDHA1 can be inhibited.
  • Ribozyme is RNA having catalytic activity. Although some ribozymes have various activities, research on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made it possible to design ribozymes for the purpose of site-specific cleavage of RNA.
  • the ribozyme may be a group I intron type, a size of 400 nucleotides or more such as M1 RNA contained in RNaseP, or may be about 40 nucleotides called a hammerhead type, a hairpin type, or the like.
  • An antisense nucleic acid is a nucleic acid complementary to a target sequence.
  • Antisense nucleic acid inhibits transcription initiation by triplex formation, suppresses transcription by hybridization with a site where an open loop structure is locally formed by RNA polymerase, inhibits transcription by hybridization with RNA that is being synthesized, Inhibition of splicing by hybridization at the junction of intron and exon, suppression of splicing by hybridization with spliceosome formation site, suppression of transition from nucleus to cytoplasm by hybridization with mRNA, capping site and poly (A) addition site Suppression of splicing by hybridization with a protein, suppression of translation initiation by hybridization with a translation initiation factor binding site, suppression of translation by hybridization with a ribosome binding site near the initiation codon, translation region of mRNA and polysome binding site Hybridization outgrowth inhibitory peptide chain by the, by gene silencing due hybridization interaction site between a nucleic acid and a
  • SiRNA, shRNA, miRNA, ribozyme and antisense nucleic acid may contain various chemical modifications in order to improve stability and activity.
  • the phosphate residue may be substituted with a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, phosphorodithionate, and the like.
  • PS phosphorothioate
  • methylphosphonate phosphorodithionate
  • you may comprise at least one part with nucleic acid analogs, such as a peptide nucleic acid (PNA).
  • PNA peptide nucleic acid
  • the inventors have clarified that by inducing cGMP production in cancer cells, the expression of FOXO3 in cancer cells is suppressed and the function of cancer stem cells is inhibited.
  • the cancer stem cell inhibitor of the present embodiment may be a substance that induces cGMP production in cancer cells.
  • the cancer stem cell inhibitor of this embodiment may be a substance that suppresses the activity of FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ , or PDHA1.
  • Examples of the substance that suppresses the activity of FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ or PDHA1 include specific binding substances for FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ or PDHA1.
  • specific binding substances include antibodies, antibody fragments, aptamers, low molecular compounds, and the like.
  • An antibody can be produced, for example, by immunizing an animal such as a mouse with FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ or PDHA1 protein or a fragment thereof as an antigen. Alternatively, for example, it can be prepared by screening a phage library. Examples of antibody fragments include Fv, Fab, scFv and the like. The above antibody is preferably a monoclonal antibody. A commercially available antibody may also be used.
  • An aptamer is a substance having a specific binding ability to a target substance.
  • examples of aptamers include nucleic acid aptamers and peptide aptamers.
  • a nucleic acid aptamer having a specific binding ability to a target substance is, for example, a systematic evolution of It can be selected by a ligand by exponential enrichment (SELEX) method or the like.
  • Peptide aptamers having specific binding ability to the target substance can be selected by, for example, the two-hybrid method using yeast.
  • More specific inhibitors of the FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway include, for example, a 67 kDa laminin receptor (hereinafter sometimes referred to as “67LR”) agonist.
  • 67LR 67 kDa laminin receptor
  • 67LR expression may be increased in cancer cells, and when a 67LR agonist binds to 67LR, Akt is activated and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) is activated. It is revealed that the production of nitric oxide (NO) and cGMP is induced, the protein kinase C ⁇ (PKC ⁇ ) is activated, and the produced sphingomyelinase (ASM) is activated, resulting in cell death. I made it.
  • a 67LR agonist can induce intracellular cGMP production and inhibit the FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway.
  • 67LR agonist can inhibit the FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway in vitro or in vivo.
  • 67LR agonists include epigallocatechin-O-gallate (hereinafter sometimes referred to as “EGCG”), which is one of the main catechins contained in green tea, EGCG derivatives, oolong tea polymerized polyphenols, oolong tea polymerized polyphenol derivatives. And anti-67LR antibody (67LR agonist antibody) and the like.
  • EGCG epigallocatechin-O-gallate
  • anti-67LR antibody 67LR agonist antibody
  • Examples of the EGCG derivative include methylated EGCG, and more specifically a compound represented by the following formula (1).
  • Oolong tea polymerized polyphenol is a generic name for compounds in which catechins are bound in a complex manner formed by enzymatic reaction or thermal polymerization reaction in a unique method of producing oolong tea called semi-fermentation.
  • catechin dimer catechin Class of trimers and the like.
  • catechin dimers include oolong homobisflavans such as oolong homobisflavan A, monodesgaloyl oolong homobisflavan A, oolong homobisflavan B, oolong homobisflavan C, and the like.
  • phosphodiesterase (PDE) inhibitors are substances that inhibit enzymes that hydrolyze cyclic phosphate diesters such as cAMP and cGMP.
  • PDE phosphodiesterase
  • Non-selective PDE inhibitors and selective PDE inhibitors are known as PDE inhibitors.
  • the PDE inhibitor may be a non-selective PDE inhibitor or a selective PDE inhibitor.
  • non-selective PDE inhibitors examples include caffeine, theophylline, theobromine, 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), pentoxyphyllin, and the like.
  • selective PDE inhibitors include PDE1 inhibitors such as 8-methoxy-3-isobutyl-1-methylxanthine, erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) adenine hydrochloride (EHNA hydrochloride), etc.
  • PDE2 inhibitors cilostamide
  • PDE3 inhibitors such as milrinone and trexin
  • etazolate hydrochloride and PDE4 inhibitors such as denbufylline, and dendofylline Sildenafil, zaprinast, tadalafil, dipyridamole (d pyridomole), 4- ⁇ [3 ′, 4 ′-(methylenedioxy) benzyl] amino ⁇ -6-methoxyquinazoline, and 1- (3-chloroanilino) -4-phenylphthalazine (MY-5445). Inhibitors are mentioned.
  • the cancer stem cell capable of inhibiting the function of the cancer stem cell inhibitor of the present embodiment is not particularly limited as long as it is a cancer stem cell, and examples thereof include pancreatic cancer stem cells and lung cancer stem cells.
  • cancer stem cell inhibitor of this embodiment By administering the cancer stem cell inhibitor of this embodiment, the function of these cancer stem cells can be inhibited. For this reason, as will be described later in Examples, cancer can be effectively treated, and the risk of recurrence and metastasis can be reduced.
  • the present invention provides a cancer stem cell inhibition kit comprising the above-described cancer stem cell inhibitor and a PDE inhibitor.
  • the cancer stem cell inhibitor is preferably one that promotes cGMP production.
  • the PDE inhibitor can synergistically enhance the effect of the cancer stem cell inhibitor by suppressing the degradation of cGMP.
  • the PDE inhibitor the same ones as described above can be used.
  • the cancer stem cell inhibitor and the PDE inhibitor may be mixed and accommodated in a single container, or may be accommodated in separate containers.
  • cancer stem cell inhibitor and the PDE inhibitor may be administered simultaneously, or may be administered with a time difference.
  • a cancer stem cell inhibitor or a PDE inhibitor may be administered first.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer stem cells, comprising the aforementioned cancer stem cell inhibitor and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the above-mentioned pharmaceutical composition is administered orally, for example, in the form of tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., or parenterally in the form of injections, suppositories, external preparations for skin, etc. Can do. More specifically, examples of the external preparation for skin include dosage forms such as ointments and patches.
  • binders such as gelatin, corn starch, gum tragacanth and gum arabic; excipients such as starch and crystalline cellulose; swelling agents such as alginic acid; solvents for injections such as water, ethanol and glycerin; Examples thereof include adhesives such as rubber adhesives and silicone adhesives.
  • the pharmaceutical composition may contain an additive.
  • Additives include lubricants such as calcium stearate and magnesium stearate; sweeteners such as sucrose, lactose, saccharin and maltitol; flavoring agents such as peppermint and red mono oil; stabilizers such as benzyl alcohol and phenol; phosphoric acid Buffers such as salts and sodium acetate; Solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol; Antioxidants; Preservatives and the like.
  • lubricants such as calcium stearate and magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose, saccharin and maltitol
  • flavoring agents such as peppermint and red mono oil
  • stabilizers such as benzyl alcohol and phenol
  • phosphoric acid Buffers such as salts and sodium acetate
  • Solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol
  • Antioxidants Preservatives and
  • the pharmaceutical composition may be formulated by appropriately combining the above-described cancer stem cell inhibitor, pharmaceutically acceptable carrier and additives and mixing them in a unit dosage form generally required for pharmaceutical practice. it can.
  • the dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the patient's symptoms, body weight, age, sex, etc., and cannot be generally determined, but in the case of oral administration, for example, 0.1-100 mg / kg body weight per dosage unit form
  • An active ingredient (cancer stem cell inhibitor) may be administered.
  • 0.01 to 50 mg of active ingredient may be administered per dosage unit form.
  • the daily dose of the pharmaceutical composition varies depending on the patient's symptoms, body weight, age, sex, etc., and cannot be determined unconditionally. For example, an effective dose of 0.1-100 mg / kg body weight per day for an adult
  • the components may be administered once a day or divided into 2 to 4 times a day.
  • the cancer stem cell inhibitor may be a 67LR agonist.
  • the 67LR agonist those similar to those described above can be used.
  • the pharmaceutical composition for inhibiting cancer stem cells of the present embodiment may further contain a PDE inhibitor.
  • a PDE inhibitor the same ones as described above can be used.
  • the present invention provides a peptide for cancer stem cell inhibition that induces the production of a 67LR agonist antibody that inhibits the FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway.
  • a 67LR agonist antibody can be induced by administering the peptide of the present embodiment to a living body.
  • the induced 67LR antibody binds to 67LR expressed in cancer stem cells and inhibits the FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway.
  • the peptide of the present embodiment is a peptide for suppressing cancer metastasis.
  • the peptide of this embodiment can be used as a peptide vaccine for cancer stem cell inhibition.
  • the peptide of this embodiment may be used in combination with a carrier protein such as keyhole limpet hemocyanin (KLH), as in a normal peptide vaccine.
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • the above peptide corresponds to the binding region with EGCG in the 67LR amino acid sequence.
  • the above peptide may be a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, one or more amino acids are deleted, substituted, or added. And a peptide having binding ability to EGCG.
  • the number of one or more may be 1 to 10, for example, 1 to 5, for example 1 to 3, for example 1 to 2. May be.
  • More specific peptides include peptides consisting of the amino acid sequences set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 16.
  • mice with the above-described peptides induced the production of 67LR agonist antibodies (see, for example, JP-A-2016-145200).
  • the present invention includes a step of measuring the expression level of FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ , PDHA1, or MARCH8 in a cell in the presence of a test substance, and FOXO3, LKB1, When the expression level of PGC-1 ⁇ or PDHA1 is lower than the expression level in the absence of the test substance, or the expression level of MARCH8 measured in the step is in the absence of the test substance
  • a method of screening for a cancer stem cell inhibitor comprising the step of determining that the test substance is a cancer stem cell inhibitor when the expression level is increased compared to the expression level. It can also be said that the screening method of this embodiment is a screening method for a cancer metastasis inhibitor.
  • a cancer cell line can be used as the cell. More preferably, the cells are cancer stem cells or contain cancer stem cells.
  • the cancer stem cells are the same as those described above, and may be cancer cells that highly express CD44, for example. Or the cell which has spheroid formation ability may be sufficient.
  • the test substance is not particularly limited, and for example, a compound library can be used.
  • the expression level of FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ , PDHA1 or MARCH8 may be measured at the gene level by, for example, microarray, real-time PCR, etc. You may measure by level.
  • a substance that decreases the expression level of FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ or PDHA1 can inhibit the function of cancer stem cells. Therefore, it becomes a more effective cancer therapeutic agent.
  • a substance that increases the expression level of MARCH8 can inhibit the function of cancer stem cells. Therefore, it becomes a more effective cancer therapeutic agent.
  • Wnt / ⁇ -catenin pathway, Hedgehog pathway, Notch pathway and the like are known as cancer stem cell maintenance mechanisms.
  • any mouse that knocks out these factors is known to be embryonic lethal. Therefore, these factors are considered to have important functions in normal stem cells.
  • FOXO3 knockout mice show infertility in the middle age, but there are no differences in survival time, carcinogenesis, and body weight from wild-type mice. For this reason, it can be said that FOXO3 is a relatively safe drug discovery target.
  • the present invention provides a step of measuring the activity of FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ , PDHA1 or MARCH8 in the presence of a test substance, and FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ or When the activity of PDHA1 is reduced as compared with the activity in the absence of the test substance, or the activity of MARCH8 measured in the step is increased as compared with the activity in the absence of the test substance
  • a screening method for a cancer stem cell inhibitor comprising the step of determining that the test substance is a cancer stem cell inhibitor. It can also be said that the screening method of this embodiment is a screening method for a cancer metastasis inhibitor.
  • a substance that inhibits the activity of FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ or PDHA1 can be screened.
  • a substance that increases the activity of MARCH8 can be screened.
  • examples of the activity of FOXO3 include transcriptional activity of a target gene.
  • examples of the activity of LKB1 include an activity of phosphorylating a target substrate.
  • examples of the activity of PGC-1 ⁇ include an activity of activating ERR (estrogen related receptor, estrogen-related receptor) which is a nuclear receptor.
  • ERR estrogen related receptor
  • PDHA1 include an activity of oxidative decarboxylation of pyruvate which is a substrate.
  • activity of MARCH8 the activity etc. which promote the ubiquitination of CD44 etc. are mentioned, for example.
  • the screening method of the present embodiment may be performed at the cell level or at a non-cell level (test tube level).
  • a substance that decreases the activity of FOXO3, LKB1, PGC-1 ⁇ or PDHA1 can inhibit the function of cancer stem cells. Therefore, it becomes a more effective cancer therapeutic agent.
  • a substance that increases the activity of MARCH8 can inhibit the function of cancer stem cells. Therefore, it becomes a more effective cancer therapeutic agent.
  • the present invention provides a cancer metastasis inhibitor comprising an inhibitor of FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway as an active ingredient.
  • cancer metastasis can be suppressed by administering the cancer metastasis inhibitor of this embodiment to a living body.
  • the inhibitor of FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway is the same as that in the cancer stem cell inhibitor described above.
  • the cancer metastasis inhibitor of this embodiment is effective in suppressing metastasis of pancreatic cancer, lung cancer and the like.
  • the cancer metastasis inhibitor of this embodiment may be formulated as a pharmaceutical composition by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier in the same manner as the cancer stem cell inhibitor described above.
  • the pharmaceutical composition may further contain a phosphodiesterase inhibitor.
  • the present invention provides a method of inhibiting cancer stem cells comprising administering an effective amount of an inhibitor of FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway to a patient in need of treatment. .
  • the method for inhibiting cancer stem cells of the present embodiment includes a method for inhibiting cancer stem cell cancer stem cell properties, a method for inhibiting cancer stem cell spheroid formation ability, a method for suppressing the expression of cancer stem cell markers in cancer stem cells, and a method for inhibiting cancer metastasis. It can also be referred to as a method for treating cancer or a method for treating cancer.
  • examples of the FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway inhibitor include those described above.
  • the FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway inhibitor may be used alone or in combination of two or more. Moreover, you may use together with the existing anticancer agent.
  • the present invention provides an inhibitor of the FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway for the inhibition of cancer stem cells.
  • inhibitor of cancer stem cells means “inhibition of cancer stem cell properties”, “inhibition of cancer stem cell functions”, “inhibition of spheroid formation ability”, “suppression of expression of cancer stem cell markers”, “cancer metastasis” It can also be called “inhibition of cancer” and “treatment of cancer”.
  • examples of the FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway inhibitor include those described above.
  • the present invention provides the use of an inhibitor of FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway for the manufacture of a cancer stem cell inhibitor.
  • examples of the inhibitor of FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway include those described above.
  • the invention requires an effective amount of a peptide for inhibiting cancer stem cells that induces the production of a 67LR agonist antibody that inhibits the FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway.
  • a method of inhibiting cancer stem cells comprising administering to a patient is provided.
  • the peptides described above can be used.
  • the method for inhibiting cancer stem cells of the present embodiment includes a method for inhibiting cancer stem cell cancer stem cell properties, a method for inhibiting cancer stem cell spheroid formation ability, a method for suppressing the expression of cancer stem cell markers in cancer stem cells, and a method for inhibiting cancer metastasis. It can also be called a method of treating, a method of treating cancer, a method of preventing cancer and the like.
  • the present invention provides a peptide for inducing production of a 67LR agonist antibody that inhibits the FOXO3 / LKB1 / PGC-1 ⁇ / PDHA1 / MARCH8 pathway, the peptide comprising the amino acid set forth in SEQ ID NO: 1.
  • a peptide comprising a sequence, or a peptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and having binding ability to epigallocatechin gallate .
  • Specific examples of the peptide of this embodiment are the same as those described above.
  • induction of 67LR agonist antibody production means “inhibition of cancer stem cells”, “inhibition of cancer stem cell properties”, “inhibition of cancer stem cell function”, “inhibition of spheroid formation ability”, “cancer stem cell marker” It can also be called “suppression of expression”, “suppression of cancer metastasis”, “treatment of cancer”, “prevention of cancer”, and the like.
  • the present invention provides the use of a peptide for the production of a peptide vaccine for inhibiting cancer stem cells, wherein the peptide consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or the sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence it is a peptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added, and having binding ability to epigallocatechin gallate. Specific examples of the peptide in this embodiment are the same as those described above.
  • Panc-1, BxPC-3, and MIA Paca-2 cell lines were B27 (50-fold diluted, Invitrogen), EGF (20 ng / mL, BD Biosciences), bFGF (10 ng / mL, The cell density was adjusted to 1000 cells / mL with a serum-free RPMI 1640 medium containing BD Bioscience). Subsequently, Bay 41-2272 having a final concentration of 0, 2.5 or 5 ⁇ M was added, and the cells were seeded on Ultra Low Cluster Plate (24 well, Costar), which is a low adhesion plate, and cultured for 21 days. Thereafter, the number of spheroids was measured under a microscope.
  • FIG. 1 (a) to 1 (c) are graphs showing the results of measuring spheroid-forming ability.
  • FIG. 1 (a) shows the results of the Panc-1 cell line
  • FIG. 1 (b) shows the results of the BxPC-3 cell line
  • FIG. 1 (c) shows the results of the MIA Paca-2 cell line.
  • the vertical axis represents the spheroid formation ability (the number of spheroids measured).
  • FIG. 2 (a) is a graph showing the results of measuring changes in tumor volume. As a result, it was found that the tumor volume was significantly reduced in nude mice to which Bay 41-2272 was administered, compared to the control (Vehicle).
  • each nude mouse was killed 36 days after the start of administration of Bay 41-2272, and the number of tumors metastasized to the liver was measured.
  • FIG. 2 (b) is a graph showing the results of measuring the number of tumors that have metastasized to the liver. As a result, it was revealed that metastasis to the liver of the tumor was significantly reduced in the nude mice administered Bay41-2272 compared to the control (Vehicle).
  • FIG. 2 (c) is a representative photograph of the liver of nude mice in the Bay 41-2272 administration group and the control group (Vehicle). An enlarged photograph of each liver is shown in the lower right of each photograph. As a result, a tumor metastasized to the liver was observed at the position of the arrow in the mouse photograph of the control group. In the enlarged photograph of the liver, a tumor metastasized to the liver was found in the circled area. In contrast, no tumor was observed in the liver of nude mice in the Bay 41-2272 administration group.
  • pancreatic cancer stem cells was suppressed in vivo by inducing cGMP production. This result further supports that the function of pancreatic cancer stem cells is suppressed by inducing cGMP production.
  • Panc-1 cells which are human pancreatic cancer cell lines and pancreatic cancer patient-derived primary pancreatic cancer cells were prepared in a 10% FCS-RPMI1640 medium to a cell density of 5 ⁇ 10 4 cells / mL, Seeded in 5 mL dishes. Subsequently, after pre-culturing for 24 hours, the medium was replaced with 1% FCS-RPMI1640 medium, RNAimax (Life technology) 15 ⁇ L and 10 nM si-FOXO3 (Sigma Aldrich) 15 ⁇ L and RPMI1640 medium 200 ⁇ L were added and cultured for 48 hours. Cells were collected. Si-FOXO3 is a siRNA against FOXO3.
  • FOXO3-siRNA (catalog number “Hs_FOXO3 — 9127”, Sigma Aldrich) and FOXO3-siRNA (ii) (catalog number “Hs_FOXO3 — 9128”, sigma sequence, Sigma) Two different types were used. As a control, scrambled siRNA (Scr-siRNA) (catalog number “Misson_Negative control SIC-001”, Sigma Aldrich) was used.
  • ⁇ Spheroid assay> The collected cells were 1000 cells / mL in serum-free RPMI1640 medium containing B27 (50-fold dilution, Invitrogen), EGF (20 ng / mL, BD Bioscience), bFGF (10 ng / mL, BD Bioscience). The density was adjusted, seeded on a low adhesion plate, Ultra Low Cluster Plate (24 well, Costar), and cultured for 21 days. Thereafter, the number of spheroids was measured under a microscope.
  • FIGS. 3A to 3C are graphs showing the results of the colony assay.
  • the vertical axis in FIGS. 3 (a) to 3 (c) indicates colony forming ability (number of colonies measured).
  • FIGS. 3D to 3F are graphs showing the results of the spheroid assay.
  • the vertical axes in FIGS. 3D to 3F show the spheroid-forming ability (the number of spheroids measured).
  • Pan-1 in FIGS. 3 (a) and 3 (d) indicates the result of the Panc-1 cell line.
  • Patient No. 1 in FIGS. 1 shows the result of 1-derived primary pancreatic cancer cells.
  • Patient No. 2 in FIGS. It shows that it is a result of 2 origin primary pancreatic cancer cells.
  • pancreatic cancer patient-derived primary pancreatic cancer cells were adjusted to a cell density of 5 ⁇ 10 4 cells / mL with 10% FCS-RPMI1640 medium and seeded in a 5 mL dish. Subsequently, after pre-culture for 24 hours, the medium was replaced with 1% FCS-RPMI1640 medium, and 15 ⁇ L of RNAimax (Life technology), 15 ⁇ L of 10 nM si-FOXO3 (Sigma Aldrich) and 200 ⁇ L of RPMI1640 medium were added and cultured for 48 hours.
  • Si-FOXO3 is a siRNA against FOXO3, and FOXO3-siRNA (i) (catalog number “Hs_FOXO3_9127”, Sigma Aldrich) in Experimental Example 3 was used.
  • As a control scrambled siRNA (Scr-siRNA) (catalog number “Misson_Negative control SIC-001”, Sigma Aldrich) was used.
  • cancer stem cell markers were evaluated by Western blot.
  • CD44 As a cancer stem cell marker, CD44, ⁇ -catenin (CTNNB), POU Class 5
  • CNNB ⁇ -catenin
  • POU Class 5 The expression of Homebox 1 (POU5F1) and c-Myc (MYC) was detected.
  • POU5F1 is also called OCT-4.
  • ⁇ -actin expression was detected as a loading control.
  • FIG. 4 (a) is a photograph showing the results of Western blotting.
  • FIGS. 4B to 4F are graphs in which the results of FIG. 4 (b) shows the result of FOXO3, FIG. 4 (c) shows the result of CD44, FIG. 4 (d) shows the result of ⁇ -catenin, FIG. 4 (e) shows the result of POU5F1, FIG. 4F shows the result of c-Myc.
  • Pant No. 1 is the pancreatic cancer patient No. 1 shows the result of primary pancreatic cancer cells derived from No. 1
  • “Patient No. 2” is a pancreatic cancer patient no. 2 shows the result of primary pancreatic cancer cells derived from No. 2
  • S shows the result of control scrambled siRNA (Scr-siRNA)
  • (i) shows the result of FOXO3-siRNA (i) Indicates that
  • FIG. 5 (a) is a graph showing the measurement results of the tumor volume.
  • “FOXO3-sh” indicates the result of the Panc-1 cell line infected with Sh-RNA lentivirus against FOXO3
  • “Scr-sh” indicates the control scrambled Sh-RNA. The results are shown for the Panc-1 cell line infected with lentivirus.
  • FIG. 5 (b) is a graph showing the results of measuring the number of tumors that have metastasized to the liver.
  • “FOXO3-sh” indicates the result of the Panc-1 cell line infected with the Sh-RNA lentivirus against FOXO3
  • “Scr-sh” indicates the control scrambled Sh-RNA. The results are shown for the Panc-1 cell line infected with lentivirus.
  • pancreatic cancer stem cells is suppressed by suppressing the expression of FOXO3.
  • Sh-RNA lentivirus against FOXO3 (catalog number “TRCN000003589”, Sigma Aldrich) or scrambled Sh-RNA lentivirus (catalog number “SHC002”, Sigma every 4 days) Aldrich) was administered intratumorally. Subsequently, each nude mouse was killed 36 days after the start of lentiviral administration, and tumor metastasis to the liver was evaluated.
  • FIG. 5 (c) is a graph showing the results of measuring the number of tumors that have metastasized to the liver.
  • “FOXO3-sh” indicates the result of intratumoral administration of Sh-RNA lentivirus against FOXO3
  • “Scr-sh” indicates that control scrambled Sh-RNA lentivirus is intratumoral. This shows the result of administration.
  • accession IDs GSE28735 and GSE21501 which are microarray data of patients with invasive pancreatic duct cancer (PDAC), which is the most common pancreatic cancer and has a poor prognosis, were used.
  • FIG. 6A is a graph showing an analysis result of the accession ID GSE28735.
  • FIG. 6B is a graph showing the analysis result of the accession ID GSE21501.
  • a human pancreatic cancer tumor array As a tissue specimen of pancreatic cancer, a human pancreatic cancer tumor array (US biomax) was used.
  • anti-CD44 antibody Miltenyi Biotec
  • anti-FOXO3 antibody CST
  • FIG. 7 (a) is a photograph showing the result of detecting the expression of CD44 by fluorescent immunostaining.
  • FIG.7 (b) is a fluorescence micrograph which shows the result of having detected the expression of FOXO3 in the same visual field as Fig.7 (a).
  • FIG. 7C is a fluorescence micrograph showing the result of detecting nuclei by the fluorescence of Hoechst 33342 in the same visual field as FIG.
  • CD44 positive cells express FOXO3. That is, it was revealed that FOXO3 is highly expressed in pancreatic cancer stem cells.
  • Panc-1 cells a human pancreatic cancer cell line
  • FCS-RPMI1640 medium a cell density of 2.5 ⁇ 10 4 cells / mL with 10% FCS-RPMI1640 medium
  • FCS-RPMI1640 medium 1% FCS-RPMI1640 medium supplemented with Bay 41-2272 (5 ⁇ M)
  • the cells were fixed after 48 hours (FOXO3) and 72 hours (CD44).
  • FOXO3 and CD44 were immunostained using the fixed cells.
  • an anti-FOXO3 antibody CST
  • an anti-CD44 antibody abcam
  • FIG. 8A is a fluorescence micrograph showing the result of detecting the expression of FOXO3.
  • FIG. 8B is a fluorescence micrograph showing the result of detecting the expression of CD44.
  • the human pancreatic cancer cell lines Panc-1, BxPC-3, and MIA Paca-2 were first adjusted to a cell density of 5 ⁇ 10 4 cells / mL with 10% FCS-RPMI1640 medium, Sowing. Subsequently, after pre-culture for 24 hours, the medium was replaced with 1% FCS-RPMI1640 medium, RNAimax (Life technology) 15 ⁇ L and 10 nM si-FOXO3 (Sigma Aldrich) 15 ⁇ L and RPMI1640 medium 200 ⁇ L were added, and further cultured for 48 hours. did.
  • FOXO3-siRNA (catalog number “Hs_FOXO3 — 9127”, Sigma Aldrich) and FOXO3-siRNA (ii) (catalog number “Hs_FOXO3_9128”, Sigma Aldrich) used in Experimental Example 4 were used.
  • scrambled siRNA (Scr-siRNA) (catalog number “Misson_Negative control SIC-001”, Sigma Aldrich) was used.
  • LKB1 is also called Serine / threonine kinase 11 (STK11).
  • FIGS. 9A to 9D are photographs showing the results of Western blotting.
  • 9 (a) and 9 (b) show the results of Panc-1 cells
  • FIG. 9 (c) shows the results of BxPC-3 cells
  • FIG. 9 (d) shows the results of MIA Paca-2 cells. .
  • Panc-1 cells a human pancreatic cancer cell line, were prepared at a cell density of 5 ⁇ 10 4 cells / mL with 10% FCS-RPMI1640 medium and seeded in a 5 mL dish. Subsequently, after pre-culturing for 24 hours, the medium was replaced with 1% FCS-RPMI1640 medium, RNAimax (Life technology) 15 ⁇ L and 10 nM si-LKB1 (Sigma Aldrich) 15 ⁇ L and RPMI1640 medium 200 ⁇ L were added, and the cells were cultured for 48 hours. Cells were collected.
  • Si-LKB1 is an siRNA against LKB1, LKB1-siRNA (i) (catalog number “Hs_STK11 — 2687”, Sigma Aldrich) and LKB1-siRNA (ii) (catalog number “Hs_STK11 — 2688”, Sigma Aldrich) Two different types were used. As a control, scrambled siRNA (Scr-siRNA) (catalog number “Misson_Negative control SIC-001”, Sigma Aldrich) was used.
  • the collected cells were seeded in a 5 mL dish at a cell density of 1000 cells / mL with 1% FCS-RPMI medium, cultured for 21 days, and the number of colonies was measured.
  • ⁇ Spheroid assay> Human pancreatic cancer cell lines Panc-1, BxPC-3, and MIA Paca-2 cells were prepared at a cell density of 5 ⁇ 10 4 cells / mL with 10% FCS-RPMI1640 medium, and seeded in a 5 mL dish. Subsequently, after pre-culturing for 24 hours, the medium was replaced with 1% FCS-RPMI1640 medium, RNAimax (Life technology) 15 ⁇ L and 10 nM si-LKB1 (Sigma Aldrich) 15 ⁇ L and RPMI1640 medium 200 ⁇ L were added, and the cells were cultured for 48 hours. Cells were collected.
  • si-LKB1 As si-LKB1, two different types of sequences of LKB1-siRNA (i) (catalog number “Hs_STK11 — 2687”, Sigma Aldrich) and LKB1-siRNA (ii) (catalog number “Hs_STK11 — 2689”, Sigma Aldrich) are used. used. As a control, scrambled siRNA (Scr-siRNA) (catalog number “Misson_Negative control SIC-001”, Sigma Aldrich) was used.
  • Scr-siRNA scrambled siRNA
  • the collected cells were 1000 cells / mL in serum-free RPMI 1640 medium containing B27 (50-fold dilution, Invitrogen), EGF (20 ng / mL, BD Bioscience), bFGF (10 ng / mL, BD Bioscience).
  • the density was adjusted, seeded on Ultra Low Cluster Plate (24 wells, Costar), which is a low adhesion plate, and cultured for 21 days. Thereafter, the number of spheroids was measured under a microscope.
  • FIG. 10 (a) is a graph showing the results of a colony assay using the Panc-1 cell line.
  • shaft of Fig.10 (a) shows colony formation ability (the number of the measured colonies).
  • FIGS. 10B to 10D are graphs showing the results of the spheroid assay.
  • the vertical axis in FIGS. 10B to 10D shows the spheroid formation ability (the number of spheroids measured).
  • FIG. 10 (b) shows the results for the Panc-1 cell line
  • FIG. 10 (c) shows the results for the BxPC-3 cell line
  • FIG. 10 (d) shows the results for the MIA Paca-2 cell line.
  • the human pancreatic cancer cell lines Panc-1, BxPC-3, and MIA Paca-2 were first adjusted to a cell density of 5 ⁇ 10 4 cells / mL with 10% FCS-RPMI1640 medium, Sowing. Subsequently, after pre-culture for 24 hours, the medium was replaced with 1% FCS-RPMI 1640 medium, RNAimax (Life technology) 15 ⁇ L, 10 nM si-LKB1 (Sigma Aldrich) 15 ⁇ L, and RPMI 1640 medium 200 ⁇ L were added, and further cultured for 48 hours. did.
  • LKB1-siRNA (i) (catalog number “Hs_STK11 — 2687”, Sigma Aldrich) and LKB1-siRNA (ii) (catalog number “Hs_STK11 — 2689”, Sigma Aldrich) in Experimental Example 11 were used.
  • scrambled siRNA (Scr-siRNA) (catalog number “Misson_Negative control SIC-001”, Sigma Aldrich) was used.
  • FIGS. 11 (a) to (d) are photographs showing the results of Western blotting.
  • 11 (a) and (b) show the results of Panc-1 cells
  • FIG. 11 (c) shows the results of BxPC-3 cells
  • FIG. 11 (d) shows the results of MIA Paca-2 cells. .
  • Panc-1, BxPC-3, and MIA Paca-2 which are human pancreatic cancer cell lines, were prepared at a cell density of 5 ⁇ 10 4 cells / mL in 10% FCS-RPMI1640 medium, and 5 mL The seeds were sown. Subsequently, after pre-culture for 24 hours, the medium was replaced with 1% FCS-RPMI1640 medium, RNAimax (Life technology) 15 ⁇ L, 10 nM si-PGC-1 ⁇ (Sigma Aldrich) 15 ⁇ L, and RPMI1640 medium 200 ⁇ L were added for 48 hours. Cells were collected after culture.
  • si-PGC-1 ⁇ (catalog number “Hs_PPARGC1B — 2923”, Sigma) is an siRNA against PGC-1 ⁇ .
  • scrambled siRNA (Scr-siRNA) (catalog number “Misson_Negative control SIC-001”, Sigma Aldrich) was used.
  • ⁇ Spheroid assay> Each collected cell was diluted with serum-free RPMI 1640 medium containing B27 (50-fold dilution, Invitrogen), EGF (20 ng / mL, BD Bioscience), bFGF (10 ng / mL, BD Bioscience) at 1000 cells / mL. The cell density was adjusted, seeded on a low adhesion plate, Ultra Low Cluster Plate (24 well, Costar), and cultured for 21 days. Thereafter, the number of spheroids was measured under a microscope.
  • FIGS. 12A to 12C are graphs showing the results of the colony assay.
  • the vertical axes in FIGS. 12 (a) to 12 (c) indicate colony forming ability (the number of colonies measured).
  • FIGS. 12D to 12F are graphs showing the results of the spheroid assay.
  • the vertical axes in FIGS. 12D to 12F show the spheroid formation ability (the number of spheroids measured).
  • FIGS. 12 (a) and (d) show the results for the Panc-1 cell line
  • FIGS. 12 (b) and (e) show the results for the BxPC-3 cell line
  • FIGS. 12 (c) and (f) The results of the MIA Paca-2 cell line are shown.
  • BxPC-3 which is a human pancreatic cancer cell line
  • FCS-RPMI1640 medium was replaced with 1% FCS-RPMI1640 medium, RNAimax (Life technology) 15 ⁇ L and 10 nM si-FOXO3 (Sigma Aldrich) 15 ⁇ L and RPMI1640 medium 200 ⁇ L were added, and further cultured for 48 hours. did.
  • FOXO3-siRNA (i) (Catalog number “Hs_FOXO3 — 9127” in Sigma Aldrich) in Experimental Example 4 was used.
  • scrambled siRNA (Scr-siRNA) (catalog number “Misson_Negative control SIC-001”, Sigma Aldrich) was used.
  • the mitochondrial membrane potential of each cell was measured using a flow cytometer.
  • FIG. 13 (a) is a photograph showing the results of Western blotting.
  • FIG. 13B is a graph showing measurement results of mitochondrial membrane potential.
  • human pancreatic cancer cell lines BxPC-3, MIA Paca-2, Panc-1 were adjusted to a cell density of 5 ⁇ 10 4 cells / mL with 10% FCS-RPMI1640 medium, and a 5 mL dish. Sowing. Subsequently, after pre-culture for 24 hours, the medium was replaced with 1% FCS-RPMI1640 medium, RNAimax (Life technology) 15 ⁇ L, 10 nM si-PGC-1 ⁇ (Sigma Aldrich) 15 ⁇ L and RPMI1640 medium 200 ⁇ L were added, and further 48 Incubate for hours.
  • PGC-1 ⁇ -siRNA (catalog number “Hs_PPARGC1B — 2923”, Sigma) and PGC-1 ⁇ -siRNA (ii) (catalog number “Hs_PPARGC1B — 2924”, Sigma) having different sequences 2 Used types.
  • scrambled siRNA (Scr-siRNA) (catalog number “Misson_Negative control SIC-001”, Sigma Aldrich) was used.
  • FIG. 14 (a) to (c) are photographs showing the results of Western blotting.
  • FIG. 14 (a) shows the results for BxPC-3 cells
  • FIG. 14 (b) shows the results for MIA Paca-2 cells
  • FIG. 14 (c) shows the results for Panc-1 cells.
  • Panc-1, BxPC-3, and MIA Paca-2 which are human pancreatic cancer cell lines, were prepared at a cell density of 5 ⁇ 10 4 cells / mL in 10% FCS-RPMI1640 medium, and 5 mL The seeds were sown. Subsequently, after pre-culturing for 24 hours, the medium was replaced with 1% FCS-RPMI1640 medium, RNAimax (Life technology) 15 ⁇ L and 10 nM si-PDHA1 (Sigma Aldrich) 15 ⁇ L and RPMI1640 medium 200 ⁇ L were added, and the cells were cultured for 48 hours. Cells were collected. Si-PDHA1 is a siRNA against PDHA1.
  • PDHA1-siRNA (catalog number “Hs_PDHA1 — 2458”, Sigma Aldrich) and PDHA1-siRNA (ii) (catalog number “Hs_PDHA1 — 2242”, Sigma Aldrich) were used.
  • scrambled siRNA (Scr-siRNA) (catalog number “Misson_Negative control SIC-001”, Sigma Aldrich) was used.
  • ⁇ Spheroid assay> Each collected cell was diluted with serum-free RPMI 1640 medium containing B27 (50-fold dilution, Invitrogen), EGF (20 ng / mL, BD Bioscience), bFGF (10 ng / mL, BD Bioscience) at 1000 cells / mL. The cell density was adjusted, seeded on a low adhesion plate, Ultra Low Cluster Plate (24 well, Costar), and cultured for 21 days. Thereafter, the number of spheroids was measured under a microscope.
  • FIGS. 15A to 15C are graphs showing the results of the colony assay.
  • the vertical axes in FIGS. 15 (a) to 15 (c) indicate colony forming ability (the number of colonies measured).
  • FIGS. 15D to 15F are graphs showing the results of the spheroid assay.
  • the vertical axes in FIGS. 15D to 15F show the spheroid formation ability (the number of spheroids measured).
  • FIGS. 15 (a) and (d) show the results of the Panc-1 cell line
  • FIGS. 15 (b) and (e) show the results of the BxPC-3 cell line
  • FIGS. 15 (c) and (f) The results of the MIA Paca-2 cell line are shown.
  • Panc-1 a human pancreatic cancer cell line
  • FCS-RPMI1640 medium 10% FCS-RPMI1640 medium
  • the medium was replaced with 1% FCS-RPMI1640 medium, and RNAimax (Life technology) 15 ⁇ L, 10 nM each of si-FOXO3, si-PDHA1 or si-MARCH8 (Sigma Aldrich) 15 ⁇ L, and RPMI1640 medium 200 ⁇ L were added. And cultured for 24 hours.
  • the above-mentioned FOXO3-siRNA (i) (catalog number “Hs_FOXO3_9127”, Sigma Aldrich) was used.
  • the si-PDHA1-siRNA (i) described above (catalog number “Hs_PDHA1 — 2458”, Sigma Aldrich) was used.
  • si-MARCH8-siRNA (i) (catalog number “sc-90432”, Santa Cruz) was used.
  • Scr-siRNA scrambled siRNA (Scr-siRNA) (catalog number “Misson_Negative control SIC-001”, Sigma Aldrich) was used.
  • MG132 which is a proteasome inhibitor
  • Ub anti-ubiquitin antibody
  • MARCH8 anti-MARCH8 antibody
  • CD44 anti-CD44 antibody
  • FIG. 16 is a photograph showing the results of immunoprecipitation and Western blotting. As a result, it was revealed that when FOXO3 or PDHA1 was knocked down, the interaction between MARCH8 and CD44 increased and CD44 ubiquitination was promoted as compared with the control.
  • Panc-1 a human pancreatic cancer cell line
  • FCS-RPMI1640 medium a cell density of 5 ⁇ 10 4 cells / mL with 10% FCS-RPMI1640 medium and seeded in a 5 mL dish.
  • the medium was replaced with 1% FCS-RPMI1640 medium, RNAimax (Life technology) 15 ⁇ L, 10 nM si-FOXO3 (Sigma Aldrich) or si-MARCH8 (Sigma Aldrich) 15 ⁇ L and RPMI1640 200 ⁇ L of medium was added, and the cells were collected after 48 hours of culture.
  • si-FOXO3 the above-mentioned FOXO3-siRNA (i) was used.
  • MARCH8-siRNA (catalog number “sc-90432”, Santa Cruz) and MARCH8-siRNA (ii) (catalog number “Hs_MARCH8_4952”, Sigma Aldrich) with different sequences 2 Used types.
  • scrambled siRNA (Scr-siRNA) (catalog number “Misson_Negative control SIC-001”, Sigma Aldrich) was used.
  • the collected cells were 1000 cells / mL in serum-free RPMI 1640 medium containing B27 (50-fold dilution, Invitrogen), EGF (20 ng / mL, BD Bioscience), bFGF (10 ng / mL, BD Bioscience).
  • the density was adjusted, seeded on Ultra Low Cluster Plate (24 wells, Costar), which is a low adhesion plate, and cultured for 21 days. Thereafter, the number of spheroids was measured under a microscope.
  • FIGS. 17A and 17B are graphs showing the results of the spheroid assay.
  • shaft of Fig.10 (a) and (b) shows spheroid formation ability (the number of measured spheroids).
  • PKC ⁇ sphingomyelinase
  • the phosphodiesterase (PDE) inhibitor is a substance that inhibits an enzyme that hydrolyzes a cyclic phosphodiester such as cAMP and cGMP, by using a PDE inhibitor together with EGCG, It was revealed that the degradation was suppressed and the activity of EGCG could be synergistically enhanced.
  • the expression level of 67LR in the human pancreatic cancer cell line Panc-1 was examined by Western blot.
  • normal human fibroblasts were used.
  • ⁇ -actin expression was detected as a loading control.
  • FIG. 18 (a) is a photograph showing the results of Western blotting. As a result, it was revealed that the expression of 67LR was increased in pancreatic cancer cells compared to normal human fibroblasts.
  • pancreatic cancer tissues were examined by fluorescent immunostaining.
  • a tissue specimen of pancreatic cancer a human pancreatic cancer tumor array (US biomax) was used.
  • anti-CD44 antibody Miltenyi Biotec
  • anti-PDE3 antibody CST
  • FIG. 18 (b) is a fluorescence micrograph showing the result of fluorescent immunostaining. As a result, it was revealed that PDE3 is highly expressed in pancreatic cancer tissues.
  • ⁇ Spheroid assay> Human pancreatic cancer cell lines Panc-1, BxPC-3, and MIA Paca-2 were mixed with B27 (50-fold dilution, Invitrogen), EGF (20 ng / mL, BD Bioscience), bFGF (10 ng / mL, BD Bioscience). ), SOD (5 U / mL), and serum-free RPMI 1640 medium containing Catalase (200 U / mL), and adjusted to a cell density of 1000 cells / mL, EGCG (10 ⁇ M) and Pquinine inhibitor Trequinsin (2. 5 ⁇ M) and added to a low adhesion plate, Ultra Low Cluster Plate (24 well, Costar), and cultured for 21 days. Thereafter, the number of spheroids was measured under a microscope.
  • FIGS. 18C to 18E are graphs showing the results of the spheroid assay.
  • the vertical axes in FIGS. 18C to 18E indicate the spheroid formation ability (the number of spheroids measured).
  • FIG. 18 (c) shows the results for the Panc-1 cell line
  • FIG. 18 (d) shows the results for the BxPC-3 cell line
  • FIG. 18 (e) shows the results for the MIA Paca-2 cell line.
  • Panc-1 a human pancreatic cancer cell line
  • FCS-RPMI1640 medium containing SOD (5 U / mL) and Catalase (200 U / mL)
  • EGCG 10 ⁇ M
  • PDE3 inhibitor 200 U / mL
  • Some Trequinsin 2.5 ⁇ M was added.
  • the expression levels of FOXO3 after 48 hours
  • CD44 after 72 hours were examined by Western blot.
  • ⁇ -actin expression was detected as a loading control.
  • 19 (a) and 19 (b) are photographs showing the results of Western blotting.
  • 19 (a) and 19 (b) “control” shows the result of the group to which neither EGCG nor Trequinsin was added, “EGCG” shows the result of the group to which only EGCG was added, and “Trequinsin” is only Trequinsin.
  • the results of the group to which EGCG and Trequinsin were added are shown as “EGCG + Trequinsin”.
  • FIG. 19 (a) shows the results of examining the expression of FOXO3
  • FIG. 19 (b) shows the results of examining the expression of CD44.
  • EGCG EGCG
  • Preq3in a PDE3 inhibitor
  • Gemcitabine an anticancer agent
  • the dose of EGCG was 10 mg / kg once every two days.
  • the dose of Trequinsin was 5 mg / kg once every two days.
  • the dose of Gemcitabine was 100 mg / kg once every 6 days.
  • Tumor volume (mm 3 ) (minor axis) 2 ⁇ major axis ⁇ 0.5 (F1)
  • FIG. 20 is a graph showing the results of measuring the change in tumor volume. As a result, it has been clarified that the increase in tumor volume is markedly inhibited by administering EGCG and a PDE inhibitor in combination.
  • each nude mouse was killed 36 days after the start of administration of EGCG, Trequinsin, or Gemcitabine, and the number of tumors metastasized to the liver was measured.
  • FIG. 21 is a graph showing the results of measuring the number of tumors metastasized to the liver. As a result, it was revealed that metastasis to the liver of the tumor was significantly reduced in nude mice administered with EGCG and a PDE inhibitor in combination.
  • pancreatic cancer stem cells is suppressed in vivo by administering EGCG and a PDE inhibitor in combination. This result further supports that the combined use of EGCG and a PDE inhibitor suppresses the function of pancreatic cancer stem cells.
  • nude mice were randomly grouped, and EGCG or an EGCG derivative (Compound No. 19) was intraperitoneally administered once every two days at a dose of 5 mg / kg.
  • the chemical formula of the EGCG derivative (compound No. 19) used in the following formula (1) is shown.
  • the survival rate of nude mice was examined. The death point was the death of nude mice. Tukey's test was used for statistical processing of the experimental results, and a significance level of less than 5% was considered significant.
  • FIG. 22 (a) is a graph showing the survival rate of nude mice in each group. As a result, it was revealed that the EGCG derivative has a remarkable effect of extending the survival time.
  • BxPc-3 which is a human pancreatic cancer cell line, was adjusted to a cell density of 2.5 ⁇ 10 4 cells / mL with 10% FCS-RPMI1640 medium, and seeded in a 10 mL dish. Subsequently, after pre-culture for 24 hours, the medium was replaced with 1% FCS-RPMI1640 medium containing SOD (5 U / mL) and Catalase (200 U / mL), and EGCG (10 ⁇ M) or an EGCG derivative (compound) No. 19) (2.5 ⁇ M) was added, seeded in a 96-well plate, and incubated for 3 hours. To the control, only an equal volume of solvent was added. Thereafter, the amount of intracellular cGMP was measured using a commercially available kit (trade name “cGMP EIA kit”, manufactured by Cayman Chemical Co., Ltd.).
  • FIG. 22 (b) is a graph showing the measurement results of intracellular cGMP. As a result, it was revealed that the addition of EGCG derivative (Compound No. 19) significantly increased intracellular cGMP production.
  • the A549 cell line is 1000 in serum-free RPMI 1640 medium containing B27 (50-fold dilution, Invitrogen), EGF (20 ng / mL, BD Biosciences), bFGF (10 ng / mL, BD Bioscience).
  • B27 50-fold dilution, Invitrogen
  • EGF 20 ng / mL, BD Biosciences
  • bFGF 10 ng / mL, BD Bioscience.
  • the cell density was adjusted to cells / mL.
  • Bay 41-2272 with a final concentration of 0, 0.5, 1, or 2.5 ⁇ M was added, seeded on a low adhesion plate, Ultra Low Cluster Plate (24 wells, Costar) and cultured for 21 days. . Thereafter, the number of spheroids was measured under a microscope.
  • FIG. 23 is a graph showing the results of the spheroid assay.
  • the vertical axis represents the spheroid formation ability (the number of spheroids measured).
  • “**” indicates that there is a significant difference when the risk rate is less than 5%
  • “***” indicates that there is a significant difference when the risk rate is less than 1%.
  • A549 a human lung cancer cell line
  • FCS-RPMI1640 medium a human lung cancer cell line
  • FCS-RPMI1640 medium a human lung cancer cell line
  • FOXO3-siRNA (i) (Catalog number “Hs_FOXO3 — 9127” in Sigma Aldrich) in Experimental Example 4 was used.
  • a group to which scrambled siRNA (Scr-siRNA) (catalog number “Misson_Negative control SIC-001”, Sigma Aldrich) was added was prepared.
  • the group which did not add siRNA was prepared as a control.
  • each collected cell was seeded in a 5 mL dish at a cell density of 1000 cells / mL with 1% FCS-RPMI medium and cultured for 21 days, and the number of colonies was measured.
  • FIG. 24 is a photograph showing the results of the colony assay. As a result, it has been clarified that when the expression of FOXO3 is suppressed with siRNA, the colony forming ability of cancer cells is significantly reduced. From this result, it was revealed that the function of lung cancer stem cells is suppressed by suppressing the expression of FOXO3.
  • a cancer stem cell inhibitor can be provided.

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Abstract

Ｆｏｒｋｈｅａｄ　ｂｏｘ　Ｏ３（ＦＯＸＯ３）／Ｌｉｖｅｒ　ｋｉｎａｓｅ　Ｂ１（ＬＫＢ１）／ＰＰＡＲγ　ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ　１β（ＰＧＣ－１β）／Ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　α１（ＰＤＨＡ１）／Ｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｒｉｎｇ－ＣＨ－ｔｙｐｅ　ｆｉｎｇｅｒ　８（ＭＡＲＣＨ８）経路の阻害剤を有効成分として含有する、癌幹細胞阻害剤。

Description

癌幹細胞阻害剤及びその使用
　本発明は、癌幹細胞阻害剤及びその使用に関する。より具体的には、癌幹細胞阻害剤、癌幹細胞阻害用医薬組成物及び癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法に関する。本願は、２０１６年９月２１日に、日本に出願された特願２０１６－１８４６９２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　癌は現代社会における主要な死亡原因の１つである。癌の治療法の開発のために多くの取り組みがなされているが、外科的切除が可能な初期の癌を除き、依然として治癒が困難な場合が多い。
　手術不能な癌の多くは、化学療法又は放射線療法で治療される。しかしながら、腫瘍細胞を完全に排除することは極めて難しく、多くの場合、治療抵抗性細胞が出現し、再発してしまう。
　癌の再発や転移の原因として近年提唱されているのが、癌幹細胞仮説である（例えば、非特許文献１を参照）。癌幹細胞仮説では、腫瘍組織中にも、正常組織と同様な幹細胞が存在し、それらは自己を複製する能力を持つとともに、少数存在するだけで元の腫瘍組織と同様の腫瘍を形成する能力を有すると考えられている。そして、癌幹細胞は抗癌剤や放射線への抵抗性を有するため、治療の際に残存しやすく、再発や転移の原因となっていると考えられている。
Viale A., et al., Oncogene ablation-resistant pancreatic cancer cells depend on mitochondrial function, Nature, 514 (7524), 628-632, 2014.
　このような背景のもと、癌幹細胞を標的とした、再発や転移のリスクが少ない癌治療法の確立が求められている。そこで、本発明は、癌幹細胞阻害剤を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］Ｆｏｒｋｈｅａｄ　ｂｏｘ　Ｏ３（ＦＯＸＯ３）／Ｌｉｖｅｒ　ｋｉｎａｓｅ　Ｂ１（ＬＫＢ１）／ＰＰＡＲγ　ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ　１β（ＰＧＣ－１β）／Ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　α１（ＰＤＨＡ１）／Ｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｒｉｎｇ－ＣＨ－ｔｙｐｅ　ｆｉｎｇｅｒ　８（ＭＡＲＣＨ８）経路の阻害剤を有効成分として含有する、癌幹細胞阻害剤。
［２］ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤が、ＦＯＸＯ３阻害剤、ＬＫＢ１阻害剤、ＰＧＣ－１β阻害剤又はＰＤＨＡ１阻害剤である、［１］に記載の癌幹細胞阻害剤。
［３］ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤が、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）産生誘導剤である、［１］又は［２］に記載の癌幹細胞阻害剤。
［４］ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤が、６７ｋＤａラミニンレセプター（６７ＬＲ）アゴニストである、［１］～［３］のいずれかに記載の癌幹細胞阻害剤。
［５］前記６７ＬＲアゴニストが下記式（１）で表される化合物である、［４］に記載の癌幹細胞阻害剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 ［６］前記癌幹細胞が、膵臓癌幹細胞又は肺癌幹細胞である、［１］～［５］のいずれかに記載の癌幹細胞阻害剤。
［７］［１］～［６］のいずれかに記載の癌幹細胞阻害剤と、ホスホジエステラーゼ阻害剤とを備える、癌幹細胞阻害用キット。
［８］［１］～［６］のいずれかに記載の癌幹細胞阻害剤と薬学的に許容される担体とを含有する、癌幹細胞阻害用医薬組成物。
［９］ホスホジエステラーゼ阻害剤を更に含有する、［８］に記載の癌幹細胞阻害用医薬組成物。
［１０］ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路を阻害する６７ＬＲアゴニスト抗体の産生を誘導する、癌幹細胞阻害用ペプチド。
［１１］前記ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエピガロカテキンガレートに対する結合能を有するペプチドである、［１０］に記載の癌幹細胞阻害用ペプチド。
［１２］被験物質の存在下で、細胞中のＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β、ＰＤＨＡ１又はＭＡＲＣＨ８の発現量を測定する工程と、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β若しくはＰＤＨＡ１の発現量が前記被験物質の非存在下における発現量と比較して低下していた場合、又はＭＡＲＣＨ８の発現量が前記被験物質の非存在下における発現量と比較して上昇していた場合に、前記被験物質は癌幹細胞阻害剤であると判断する工程と、を備える、癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法。
［１３］被験物質の存在下で、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β、ＰＤＨＡ１又はＭＡＲＣＨ８の活性を測定する工程と、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β若しくはＰＤＨＡ１の活性が前記被験物質の非存在下における発現量と比較して低下していた場合、又はＭＡＲＣＨ８の活性が前記被験物質の非存在下における活性と比較して上昇していた場合に、前記被験物質は癌幹細胞阻害剤であると判断する工程と、を備える、癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法。
［１４］ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤を有効成分として含有する、癌転移抑制剤。
　本発明によれば、癌幹細胞阻害剤を提供することができる。
（ａ）～（ｃ）は、実験例１におけるスフェロイド形成能の測定結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例２における腫瘍体積の変化の測定結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例２において肝臓に転移した腫瘍の数を測定した結果を示すグラフである。（ｃ）は、実験例２におけるＢａｙ４１－２２７２投与群及び対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）のヌードマウスの肝臓の代表的な写真である。 （ａ）～（ｃ）は、実験例４におけるコロニーアッセイの結果を示すグラフである。（ｄ）～（ｆ）は実験例４におけるスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例５におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。（ｂ）～（ｆ）は、（ａ）の結果を数値化したグラフである。 （ａ）は、実験例６における腫瘍体積の測定結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例６において肝臓に転移した腫瘍の数を測定した結果を示すグラフである。（ｃ）は、実験例６の癌治療モデルの検討において、肝臓に転移した腫瘍の数を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例７におけるアクセッションＩＤ　ＧＳＥ２８７３５の解析結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例７におけるアクセッションＩＤ　ＧＳＥ２１５０１の解析結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｃ）は、実験例８における蛍光免疫染色の結果を示す写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例９における蛍光免疫染色の結果を示す写真である。 （ａ）～（ｄ）は、実験例１０におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。 （ａ）は、実験例１１におけるコロニーアッセイの結果を示すグラフである。（ｂ）～（ｄ）は、実験例１１におけるスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｄ）は、実験例１２におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。 （ａ）～（ｃ）は、実験例１３におけるコロニーアッセイの結果を示すグラフである。（ｄ）～（ｆ）は、実験例１３におけるスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例１４におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。（ｂ）は、実験例１４におけるミトコンドリア膜電位の測定結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｃ）は、実験例１５におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。 （ａ）～（ｃ）は、実験例１６におけるコロニーアッセイの結果を示すグラフである。（ｄ）～（ｆ）は、実験例１６におけるスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。 実験例１７における免疫沈降及びウエスタンブロットの結果を示す写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例１８におけるスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例１９におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。（ｂ）は、実験例１９における蛍光免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ｃ）～（ｅ）は、実験例１９におけるスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例２０におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。 実験例２１における腫瘍体積の変化を測定した結果を示すグラフである。 実験例２１において、肝臓に転移した腫瘍の数を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例２２における各群のヌードマウスの生存率を示すグラフである。（ｂ）は、実験例２２における細胞内ｃＧＭＰの測定結果を示すグラフである。 実験例２３におけるスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。 実験例２４におけるコロニーアッセイの結果を示す写真である。 発明者らが明らかにしたＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の模式図である。
［癌幹細胞阻害剤］
　１実施形態において、本発明は、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤を有効成分として含有する、癌幹細胞阻害剤を提供する。
　実施例において後述するように、発明者らは癌幹細胞の維持機構を明らかにした。図２５は、発明者らが明らかにした癌幹細胞維持経路である、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の模式図である。
　図２５に示すように、ＦＯＸＯ３の発現が上昇すると、ＬＫＢ１の発現が上昇する。また、ＬＫＢ１の発現が上昇すると、ＰＧＣ－１βの発現が上昇する。また、ＰＧＣ－１βの発現が上昇すると、ＰＤＨＡ１の発現が上昇する。また、ＰＤＨＡ１の発現が上昇すると、ＭＡＲＣＨ８によるＣＤ４４のユビキチン化が抑制され、ＣＤ４４の高発現が維持される。その結果、細胞の癌幹細胞性が維持される。
　ここで、ＦＯＸＯ３は、フォークヘッド型転写因子と呼ばれる転写因子の１種である。
ヒトＦＯＸＯ３のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ　ＩＤはＮＭ＿００１４５５等であり、マウスＦＯＸＯ３のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ　ＩＤはＮＭ＿０１９７４０等である。
　また、ＬＫＢ１は、Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　１１（ＳＴＫ１１）とも呼ばれるプロテインキナーゼの１種である。ヒトＬＫＢ１のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ　ＩＤはＮＭ＿０００４５５等であり、マウスＬＫＢ１のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ
　ＩＤはＮＭ＿００１３０１８５３、ＮＭ＿００１３０１８５４、ＮＭ＿０１１４９２等である。
　また、ＰＧＣ－１βは、核内受容体コファクターの１種である。ヒトＰＧＣ－１βのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ　ＩＤはＮＭ＿００１１７２６９８、ＮＭ＿００１１７２６９９、ＮＭ＿１３３２６３等であり、マウスＰＧＣ－１βのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ　ＩＤはＮＭ＿１３３２４９等である。
　また、ＰＤＨＡ１は、ミトコンドリアのマトリックスに存在する酵素である。ＰＤＨＡ１は、ピルビン酸の酸化的脱炭酸を触媒し、アセチルＣｏＡと二酸化炭素を精製する酵素である。ヒトＰＤＨＡ１のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ　ＩＤはＮＭ＿０００２８４、ＮＭ＿００１１７３４５４、ＮＭ＿００１１７３４５５、ＮＭ＿００１１７３４５６等であり、マウスＰＤＨＡ１のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ　ＩＤはＮＭ＿００８８１０等である。
　また、ＭＡＲＣＨ８は、膜結合型Ｅ３ユビキチンリガーゼの１種である。ヒトＰＧＣ－１βのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ　ＩＤはＮＭ＿００１００２２６５、ＮＭ＿００１００２２６６、ＮＭ＿００１２８２８６６等であり、マウスＰＧＣ－１βのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ　ＩＤはＮＰ＿００１２８９３１２、ＮＭ＿００１３０２３８３、ＮＰ＿００１２８９３１３、ＮＭ＿００１３０２３８４等である。
　実施例において後述するように、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路を阻害することにより、癌幹細胞の機能を阻害することができる。より詳細には、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β、ＰＤＨＡ１のいずれかの活性を阻害すると、ＭＡＲＣＨ８によるＣＤ４４のユビキチン化が促進され、ＣＤ４４の存在量が低下する。この結果、癌幹細胞の機能が阻害される。
　本明細書において、癌幹細胞阻害剤とは、癌幹細胞の機能を阻害する物質を意味する。
癌幹細胞の機能とは、少数存在するだけで元の腫瘍組織と同様の腫瘍を形成する機能であるということができる。癌幹細胞の機能は、実施例において後述する、スフェロイドアッセイ、コロニーアッセイ、癌の転移能の測定等により測定することができる。すなわち、癌幹細胞の機能とは、スフェロイドを形成する機能、コロニーを形成する機能、癌を転移させる機能等といいかえることができる。また、本明細書において、癌幹細胞の機能のことを癌細胞性という場合がある。また、細胞が癌幹細胞の機能を有することを、細胞が癌幹細胞性を有するという場合がある。
　実施例において後述するように、本実施形態の癌幹細胞阻害剤を投与することにより、細胞レベルにおいて、スフェロイド形成能、コロニー形成能等を抑制することができる。
また、生体レベルにおいて、腫瘍体積の増加、癌の転移等を抑制することができる。したがって、本実施形態の癌幹細胞阻害剤は、癌転移抑制剤、癌の治療剤等といいかえることができる。
　本明細書において、癌幹細胞とは、ＣＤ４４を高発現している癌細胞であるということもできる。ここで、ＣＤ４４を高発現しているとは、対照細胞と比較してよりＣＤ４４の発現量が高いことを意味する。対照細胞としては正常細胞等が挙げられる。あるいは、癌幹細胞とは、スフェロイド形成能有する細胞、コロニー形成能有する細胞、又はインビボにおいて転移して腫瘍を形成する能力を有する細胞であるということもできる。
　本実施形態の癌幹細胞阻害剤において、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤は、ＦＯＸＯ３阻害剤であってもよいし、ＬＫＢ１阻害剤であってもよいし、ＰＧＣ－１β阻害剤であってもよいし、ＰＤＨＡ１阻害剤であってもよい。
　ここで、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β又はＰＤＨＡ１の阻害剤とは、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β又はＰＤＨＡ１の発現阻害剤であってもよいし、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β又はＰＤＨＡ１の活性を抑制する物質であってもよい。
　ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β又はＰＤＨＡ１の発現阻害剤としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、低分子化合物等が挙げられる。また、実施例において後述するように、ｃＧＭＰ産生誘導剤の投与により、ＦＯＸＯ３の発現を抑制することができる。その結果、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路が阻害される。したがって、ｃＧＭＰ産生誘導剤も、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β又はＰＤＨＡ１の発現阻害剤であるということができる。ｃＧＭＰ産生誘導剤としては、例えばＢａｙ４１－２２７２（ＣＡＳ番号：２５６３７６－２４－６）等が挙げられる。
　ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられる２１～２３塩基対の低分子２本鎖ＲＮＡである。
細胞内に導入されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
　ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、９０～９５℃で約１分程度変性させた後、３０～７０℃で約１～８時間アニーリングさせることにより調製することができる。
　ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡは、ベクターによって細胞に導入し、Ｕ６プロモーター又はＨ１プロモーターで発現させてもよいし、ｓｈＲＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成し、ｓｉＲＮＡと同様の方法によりセルフアニーリングさせることによって調製してもよい。細胞内に導入されたｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、ｓｉＲＮＡへと切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
　ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）は、ゲノム上にコードされ、多段階的な生成過程を経て最終的に約２０塩基の微小ＲＮＡとなる機能性核酸である。ｍｉＲＮＡは、機能性のｎｃＲＮＡ（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　ＲＮＡ、非コードＲＮＡ：タンパク質に翻訳されないＲＮＡの総称）に分類されており、他の遺伝子の発現を調節するという、生命現象において重要な役割を担っている。特定の塩基配列を有するｍｉＲＮＡを生体に投与することにより、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β又はＰＤＨＡ１の発現を阻害することができる。
　リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡである。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、ＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となっている。リボザイムは、グループＩイントロン型、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡ等の４００ヌクレオチド以上の大きさのものであってもよく、ハンマーヘッド型、ヘアピン型等と呼ばれる４０ヌクレオチド程度のものであってもよい。
　アンチセンス核酸は、標的配列に相補的な核酸である。アンチセンス核酸は、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が形成された部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制等により、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
　ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部をペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成してもよい。
　実施例において後述するように、発明者らは、癌細胞におけるｃＧＭＰ産生を誘導することにより、癌細胞におけるＦＯＸＯ３の発現が抑制され、癌幹細胞の機能が阻害されることを明らかにした。
　したがって、本実施形態の癌幹細胞阻害剤は、癌細胞におけるｃＧＭＰ産生を誘導する物質であってもよい。
　また、上述したように、本実施形態の癌幹細胞阻害剤は、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β又はＰＤＨＡ１の活性を抑制する物質であってもよい。
　ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β又はＰＤＨＡ１の活性を抑制する物質としては、例えば、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β又はＰＤＨＡ１に対する特異的結合物質が挙げられる。
　ここで、特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー、低分子化合物等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β若しくはＰＤＨＡ１タンパク質又はそれらの断片を抗原として免疫することによって作製することができる。あるいは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、市販の抗体であってもよい。
　アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標的物質に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　
ｌｉｇａｎｄ　ｂｙ　ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標的物質に特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
　より具体的な、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤としては、例えば、６７ｋＤａラミニンレセプター（以下、「６７ＬＲ」という場合がある。）アゴニストが挙げられる。
　発明者らは以前に、癌細胞では６７ＬＲの発現が亢進している場合があり、６７ＬＲアゴニストが６７ＬＲに結合すると、Ａｋｔが活性化され、内皮性一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）を活性化され、一酸化窒素（ＮＯ）及びｃＧＭＰの産生が誘導され、タンパク質キナーゼＣδ（ＰＫＣδ）が活性化され、産生スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）が活性化され、その結果、細胞死が誘導されることを明らかにした。
　すなわち、６７ＬＲアゴニストは細胞内のｃＧＭＰの産生を誘導し、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路を阻害することができる。
　実施例において後述するように、発明者らは、インビトロ又はインビボにおいて、６７ＬＲアゴニストの投与により、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路を阻害できることを明らかにした。
　６７ＬＲアゴニストとしては、緑茶に含まれる主要なカテキンの一種であるエピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ－Ｏ－ｇａｌｌａｔｅ、以下、「ＥＧＣＧ」という場合がある。）、ＥＧＣＧ誘導体、ウーロン茶重合ポリフェノール、ウーロン茶重合ポリフェノール誘導体、抗６７ＬＲ抗体（６７ＬＲアゴニスト抗体）等が挙げられる。
　ＥＧＣＧ誘導体としては、例えばメチル化ＥＧＣＧが挙げられ、より具体的には下記式（１）で表される化合物等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　ウーロン茶重合ポリフェノールとは、半発酵というウーロン茶の独特の製造方法において、酵素反応や熱重合反応により形成される、カテキン類が複雑に結合した化合物の総称であり、例えばカテキン類の２量体、カテキン類の３量体等が挙げられる。カテキン類の２量体としては、例えば、ウーロンホモビスフラバンＡ、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ、ウーロンホモビスフラバンＢ、ウーロンホモビスフラバンＣ等のウーロンホモビスフラバン類等が挙げられる。
　ところで、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤は、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ等の環状リン酸ジエステルを加水分解する酵素を阻害する物質である。実施例において後述するように、６７ＬＲアゴニストと共にＰＤＥ阻害剤を併用することにより、ｃＧＭＰの分解が抑制され、６７ＬＲアゴニストの効果を相乗的に増強することができる。
　ＰＤＥ阻害剤としては、非選択的なＰＤＥ阻害剤及び選択的なＰＤＥ阻害剤が知られている。ＰＤＥ阻害剤は、非選択的なＰＤＥ阻害剤であってもよく、選択的なＰＤＥ阻害剤であってもよい。
　非選択的なＰＤＥ阻害剤としては、例えば、カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）及びペントキシフィリン（ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｌｉｎｅ）等が挙げられる。
　選択的なＰＤＥ阻害剤としては、例えば、８－メトキシ－３－イソブチル－１－メチルキサンチン等のＰＤＥ１阻害剤、エリスロ－９－（２－ヒドロキシ－３－ノニル）アデニン塩酸塩（ＥＨＮＡ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）等のＰＤＥ２阻害剤、シロスタミド（ｃｉｌｏｓｔａｍｉｄｅ）、ミルリノン（ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ）及びトレキシン（ｔｒｅｑｕｉｓｉｎ）等のＰＤＥ３阻害剤、エタゾラート塩酸塩（ｅｔａｚｏｌａｔｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）及びデンブフィリン（ｄｅｎｂｕｆｙｌｌｉｎｅ）等のＰＤＥ４阻害剤、及び、バルデナフィル（ｖａｒｄｅｎａｆｉｌ）、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）、ザプリナスト（ｚａｐｒｉｎａｓｔ）、タダラフィル（ｔａｄａｌａｆｉｌ）、ジピリダモール（ｄｉｐｙｒｉｄａｍｏｌｅ）、４－｛［３’，４’－（メチレンジオキシ）ベンジル］アミノ｝－６－メトキシキナゾリン、及び１－（３－クロロアニリノ）－４－フェニルフタラジン（ＭＹ－５４４５）等のＰＤＥ５阻害剤が挙げられる。
　本実施形態の癌幹細胞阻害剤が機能を阻害することができる癌幹細胞としては、癌幹細胞であれば特に限定されず、膵臓癌幹細胞、肺癌幹細胞等が挙げられる。
　本実施形態の癌幹細胞阻害剤を投与することにより、これらの癌幹細胞の機能を阻害することができる。このため、実施例において後述するように、癌を効果的に治療することができ、再発や転移のリスクを低減することができる。
［癌幹細胞阻害用キット］
　１実施形態において、本発明は、上述した癌幹細胞阻害剤とＰＤＥ阻害剤とを備える、癌幹細胞阻害用キットを提供する。
　本実施形態のキットにおいて、癌幹細胞阻害剤はｃＧＭＰの産生を促進させるものであることが好ましい。上述したように、ＰＤＥ阻害剤は、ｃＧＭＰの分解を抑制することにより、癌幹細胞阻害剤の効果を相乗的に増強することができる。ＰＤＥ阻害剤としては、上述したものと同様のものを使用することができる。
　本実施形態のキットにおいて、癌幹細胞阻害剤及びＰＤＥ阻害剤は、単一の容器内に混合して収容されていてもよいし、別々の容器内に収容されていてもよい。
　また、癌幹細胞阻害剤及びＰＤＥ阻害剤は、同時に投与されてもよいし、時間差を設けて投与されてもよい。時間差を設けて投与される場合、癌幹細胞阻害剤及びＰＤＥ阻害剤のいずれを先に投与してもよい。
［癌幹細胞阻害用医薬組成物］
　１実施形態において、本発明は、上述した癌幹細胞阻害剤と薬学的に許容される担体とを含有する、癌幹細胞阻害用医薬組成物を提供する。
　上記の医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の形態で非経口的に投与することができる。皮膚外用剤としては、より具体的には、軟膏剤、貼付剤等の剤型が挙げられる。
　薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。
　医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。
　医薬組成物は、上述した癌幹細胞阻害剤、薬学的に許容される担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
　医薬組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、例えば、投与単位形態あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分（癌幹細胞阻害剤）を投与すればよい。また、注射剤の場合には、例えば、投与単位形態あたり０．０１～５０ｍｇの有効成分を投与すればよい。
　また、医薬組成物の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、例えば、成人１日あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分を１日１回又は２～４回程度に分けて投与すればよい。
　本実施形態の癌幹細胞阻害用医薬組成物において、癌幹細胞阻害剤は６７ＬＲアゴニストであってもよい。６７ＬＲアゴニストとしては、上述したものと同様のものを使用することができる。
　また、本実施形態の癌幹細胞阻害用医薬組成物は、ＰＤＥ阻害剤を更に含有していてもよい。ＰＤＥ阻害剤としては、上述したものと同様のものを使用することができる。
［癌幹細胞阻害用ペプチド］
　１実施形態において、本発明は、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路を阻害する６７ＬＲアゴニスト抗体の産生を誘導する、癌幹細胞阻害用ペプチドを提供する。
　本実施形態のペプチドを生体に投与することにより、６７ＬＲアゴニスト抗体を誘導することができる。誘導された６７ＬＲ抗体は、癌幹細胞に発現した６７ＬＲに結合し、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路を阻害する。その結果、癌幹細胞の機能が阻害され、癌を効果的に治療することができる。本実施形態のペプチドは、癌の転移抑制用ペプチドであるということもできる。
　したがって、本実施形態のペプチドは、癌幹細胞阻害用ペプチドワクチンとして用いることができる。本実施形態のペプチドは、通常のペプチドワクチンと同様に、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアタンパク質と結合させて用いてもよい。
　上記のペプチドは、６７ＬＲのアミノ酸配列におけるＥＧＣＧとの結合領域に対応するものである。上記のペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであってもよく、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥＧＣＧに対する結合能を有するペプチドであってもよい。ここで、１又は複数個とは、例えば１～１０個であってもよく、例えば１～５個であってもよく、例えば１～３個であってもよく、例えば１～２個であってもよい。
　より具体的なペプチドとしては、配列番号１～１６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
　発明者らは以前に、上記のペプチドでマウスを免疫することにより、６７ＬＲアゴニスト抗体の産生が誘導されることを確認した（例えば、特開２０１６－１４５２００号を参照）。
［癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法］
　１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、細胞中のＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β、ＰＤＨＡ１又はＭＡＲＣＨ８の発現量を測定する工程と、前記工程において測定された、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β若しくはＰＤＨＡ１の発現量が前記被験物質の非存在下における発現量と比較して低下していた場合、又は、前記工程において測定されたＭＡＲＣＨ８の発現量が前記被験物質の非存在下における発現量と比較して上昇していた場合に、前記被験物質は癌幹細胞阻害剤であると判断する工程と、を備える、癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法を提供する。本実施形態のスクリーニング方法は、癌転移抑制剤のスクリーニング方法であるということもできる。
　本実施形態のスクリーニング方法において、細胞としては、例えば癌細胞株を用いることができる。細胞は癌幹細胞であるか、癌幹細胞を含んでいることがより好ましい。ここで、癌幹細胞は上述したものと同様であり、例えばＣＤ４４を高発現している癌細胞であってもよい。あるいは、スフェロイド形成能を有する細胞であってもよい。また、被験物質としては、特に制限されず、例えば化合物ライブラリー等を用いることができる。
　本実施形態のスクリーニング方法において、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β、ＰＤＨＡ１又はＭＡＲＣＨ８の発現量は、例えばマイクロアレイ、リアルタイムＰＣＲ等により遺伝子レベルで測定してもよく、ＥＬＩＳＡ、プロテインチップ、ウエスタンブロット等によりタンパク質レベルで測定してもよい。
　実施例において後述するように、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β又はＰＤＨＡ１の発現量を低下させる物質は、癌幹細胞の機能を阻害することができる。したがって、より効果的な癌の治療剤となる。また、ＭＡＲＣＨ８の発現量を上昇させる物質は、癌幹細胞の機能を阻害することができる。したがって、より効果的な癌の治療剤となる。
　現在、癌幹細胞維持機構としては、Ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎ経路、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ経路、Ｎｏｔｃｈ経路等が知られている。しかしながら、これらの因子をノックアウトしたマウスはいずれも胎生致死であることが知られている。したがって、これらの因子は正常幹細胞においても重要な機能を有していると考えられる。
　これに対し、特にＦＯＸＯ３ノックアウトマウスは、中年期に不妊が認められるものの、生存期間、発癌、体重において野生型マウスとの相違が認められない。このため、ＦＯＸＯ３は比較的安全な創薬ターゲットであるといえる。
　１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β、ＰＤＨＡ１又はＭＡＲＣＨ８の活性を測定する工程と、前記工程において測定された、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β若しくはＰＤＨＡ１の活性が、前記被験物質の非存在下における活性と比較して低下していた場合、又は、前記工程において測定されたＭＡＲＣＨ８の活性が前記被験物質の非存在下における活性と比較して上昇していた場合に、前記被験物質は癌幹細胞阻害剤であると判断する工程とを備える、癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法を提供する。本実施形態のスクリーニング方法は、癌転移抑制剤のスクリーニング方法であるということもできる。
　本実施形態のスクリーニング方法によれば、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β又はＰＤＨＡ１の活性を阻害する物質をスクリーニングすることができる。あるいは、本実施形態のスクリーニング方法によれば、ＭＡＲＣＨ８の活性を上昇させる物質をスクリーニングすることができる。ここで、ＦＯＸＯ３の活性としては、例えば標的遺伝子の転写活性等が挙げられる。また、ＬＫＢ１の活性としては、例えば標的基質をリン酸化する活性等が挙げられる。また、ＰＧＣ－１βの活性としては、例えば核内受容体であるＥＲＲ（ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、エストロゲン関連受容体）を活性化する活性等が挙げられる。また、ＰＤＨＡ１の活性としては、例えば基質であるピルビン酸を酸化的脱炭酸する活性等が挙げられる。また、ＭＡＲＣＨ８の活性としては、例えばＣＤ４４のユビキチン化を促進する活性等が挙げられる。
　本実施形態のスクリーニング方法は、細胞レベルで行ってもよく、非細胞レベル（試験管レベル）で行ってもよい。
　ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β又はＰＤＨＡ１の活性を低下させる物質は、癌幹細胞の機能を阻害することができる。したがって、より効果的な癌の治療剤となる。また、ＭＡＲＣＨ８の活性を上昇させる物質は、癌幹細胞の機能を阻害することができる。したがって、より効果的な癌の治療剤となる。
［癌転移抑制剤］
　１実施形態において、本発明は、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤を有効成分として含有する、癌転移抑制剤を提供する。実施例において後述するように、本実施形態の癌転移抑制剤を生体に投与することにより、癌の転移を抑制することができる。
　本実施形態の癌転移抑制剤において、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤としては、上述した癌幹細胞阻害剤におけるものと同様である。
　本実施形態の癌転移抑制剤は、膵臓癌、肺癌等の転移の抑制に有効である。
　本実施形態の癌転移抑制剤は、上述した癌幹細胞阻害剤と同様に、薬学的に許容される担体と混合して医薬組成物として製剤化されていてもよい。また、当該医薬組成物はホスホジエステラーゼ阻害剤を更に含有していてもよい。
［その他の実施形態］
　１実施形態において、本発明は、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、癌幹細胞の阻害方法を提供する。
　本実施形態の癌幹細胞の阻害方法は、癌幹細胞の癌幹細胞性の阻害方法、癌幹細胞のスフェロイド形成能を阻害する方法、癌幹細胞の癌幹細胞マーカーの発現を抑制する方法、癌の転移を抑制する方法、癌の治療方法等といいかえることもできる。
　本実施形態の方法において、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤としては、上述したものが挙げられる。また、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、既存の抗癌剤と併用して用いてもよい。
　１実施形態において、本発明は、癌幹細胞の阻害のためのＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤を提供する。ここで、「癌幹細胞の阻害」は、「癌幹細胞性の阻害」、「癌幹細胞の機能の阻害」、「スフェロイド形成能の阻害」、「癌幹細胞マーカーの発現の抑制」、「癌の転移の抑制」、「癌の治療」等といいかえることもできる。
　本実施形態の方法において、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤としては、上述したものが挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、癌幹細胞阻害剤の製造のためのＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤の使用を提供する。本実施形態の方法において、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤としては、上述したものが挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路を阻害する６７ＬＲアゴニスト抗体の産生を誘導する、癌幹細胞阻害用ペプチドの有効量を、治療又は予防を必要とする患者に投与することを含む、癌幹細胞の阻害方法を提供する。本実施形態の方法において、ペプチドとしては、上述したものを用いることができる。
　本実施形態の癌幹細胞の阻害方法は、癌幹細胞の癌幹細胞性の阻害方法、癌幹細胞のスフェロイド形成能を阻害する方法、癌幹細胞の癌幹細胞マーカーの発現を抑制する方法、癌の転移を抑制する方法、癌の治療方法、癌の予防方法等といいかえることもできる。
　１実施形態において、本発明は、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路を阻害する６７ＬＲアゴニスト抗体の産生の誘導のためのペプチドを提供し、当該ペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエピガロカテキンガレートに対する結合能を有するペプチドである。本実施形態のペプチドの具体例は、上述したものと同様である。
　ここで、「６７ＬＲアゴニスト抗体の産生の誘導」は、「癌幹細胞の阻害」、「癌幹細胞性の阻害」、「癌幹細胞の機能の阻害」、「スフェロイド形成能の阻害」、「癌幹細胞マーカーの発現の抑制」、「癌の転移の抑制」、「癌の治療」、「癌の予防」等といいかえることもできる。
　１実施形態において、本発明は、癌幹細胞阻害用ペプチドワクチンの製造のためのペプチドの使用を提供し、当該ペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエピガロカテキンガレートに対する結合能を有するペプチドである。本実施形態におけるペプチドの具体例は、上述したものと同様である。
　次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
［実験例１］
（ｃＧＭＰ産生誘導剤はヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した　１）
　ヒト膵臓癌細胞株（Ｐａｎｃ－１、ＢｘＰＣ－３、ＭＩＡ　Ｐａｃａ－２）の培地に、ｃＧＭＰ産生誘導剤である、Ｂａｙ４１－２２７２（Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を添加し、スフェロイド形成能を検討した。なお、スフェロイド形成能は癌幹細胞の機能の１つである。
　具体的には、Ｐａｎｃ－１、ＢｘＰＣ－３、ＭＩＡ　Ｐａｃａ－２の各細胞株を、Ｂ２７（５０倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を含有する無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１０００個／ｍＬの細胞密度に調製した。続いて、終濃度０、２．５又は５μＭのＢａｙ４１－２２７２を添加して、低接着プレートである、Ｕｌｔｒａ　Ｌｏｗ　Ｃｌｕｓｔｅｒ　Ｐｌａｔｅ（２４ウェル、Ｃｏｓｔａｒ社）に播種して２１日間培養した。その後、顕微鏡下でスフェロイド数を測定した。
　図１（ａ）～（ｃ）は、スフェロイド形成能を測定した結果を示すグラフである。図１（ａ）はＰａｎｃ－１細胞株の結果を示し、図１（ｂ）はＢｘＰＣ－３細胞株の結果を示し、図１（ｃ）はＭＩＡ　Ｐａｃａ－２細胞株の結果を示す。縦軸はスフェロイド形成能（測定されたスフェロイドの数）を示す。
　その結果、いずれの細胞株においても、Ｂａｙ４１－２２７２の濃度が高いほどスフェロイド形成能が有意に低下することが明らかとなった。この結果から、ｃＧＭＰ産生を誘導することにより、膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることが明らかとなった。
［実験例２］
（ｃＧＭＰ産生誘導剤はヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した　２）
　７週齢のヌードマウス（ｂａｌｂＣｎｕ／Ｃｒｌｊ、雌）にＣｏ６０線源を用いて１．８Ｇｙのγ線を照射し免疫抑制を誘導した。３日後、ＲＰＭＩ１６４０培地で１．０×１０７個／ｍＬの細胞密度に調整したＰａｎｃ－１細胞株を、ヌードマウスに５００μＬ（５×１０６個／匹）ずつ背面皮下注射し、Ｐａｎｃ－１細胞株移植モデルマウスを作製した。
　移植から４日後に腫瘍の生着が確認できたため、生着した腫瘍体積をもとに群分けを行い、Ｂａｙ４１－２２７２の腹腔内投与を開始した。投与量は２日に１回２．５ｍｇ／ｋｇとした。対照群には、Ｂａｙ４１－２２７２の代わりに溶媒のみ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）を投与した。腫瘍体積の測定を７日毎に行った。
　図２（ａ）は、腫瘍体積の変化を測定した結果を示すグラフである。その結果、Ｂａｙ４１－２２７２を投与したヌードマウスでは、対照（Ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較して、腫瘍体積が有意に縮小したことが明らかとなった。
　また、Ｂａｙ４１－２２７２の投与開始から３６日後に各ヌードマウスをと殺し、肝臓に転移した腫瘍の数を測定した。
　図２（ｂ）は、肝臓に転移した腫瘍の数を測定した結果を示すグラフである。その結果、Ｂａｙ４１－２２７２を投与したヌードマウスでは、対照（Ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較して、腫瘍の肝臓への転移が有意に減少したことが明らかとなった。
　図２（ｃ）は、Ｂａｙ４１－２２７２投与群及び対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）のヌードマウスの肝臓の代表的な写真である。各写真の右下に、各肝臓の拡大写真を示す。その結果、対照群のマウスの写真において、矢印の位置には肝臓に転移した腫瘍が認められた。また、肝臓の拡大写真において、丸で囲んだ領域には、肝臓に転移した腫瘍が認められた。これに対し、Ｂａｙ４１－２２７２投与群のヌードマウスの肝臓には、腫瘍は認められなかった。
　この結果から、ｃＧＭＰ産生を誘導することにより、インビボにおいても膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることが明らかとなった。この結果は、ｃＧＭＰ産生を誘導することにより、膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることを更に支持するものである。
［実験例３］
（ｃＧＭＰ産生誘導により発現量が変化する遺伝子の探索）
　実験例１及び２の結果を踏まえ、ｃＧＭＰ産生誘導により発現量が変化する遺伝子をマイクロアレイを用いて解析した。その結果、ｃＧＭＰ産生誘導剤Ｂａｙ４１－２２７２の投与により、細胞中のＦｏｒｋｈｅａｄ　ｂｏｘ　Ｏ３（ＦＯＸＯ３）の発現が抑制されることが示唆された。
［実験例４］
（ＦＯＸＯ３の発現抑制はヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した　１）
　ＲＮＡ干渉によりヒト膵臓癌細胞株におけるＦＯＸＯ３をノックダウンし、癌幹細胞の機能を検討した。
　具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ－１細胞及び膵臓癌患者由来初代膵臓癌細胞を、１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調製し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ　ｓｉ－ＦＯＸＯ３（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、４８時間培養後細胞を回収した。なお、ｓｉ－ＦＯＸＯ３は、ＦＯＸＯ３に対するｓｉＲＮＡであり、ＦＯＸＯ３－ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＦＯＸＯ３＿９１２７」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＦＯＸＯ３－ｓｉＲＮＡ（ｉｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＦＯＸＯ３＿９１２８」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）の配列の異なる２種類を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ－ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ＳＩＣ－００１」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
《コロニーアッセイ》
　回収した細胞を１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ培地で１０００個／ｍＬの細胞密度で５ｍＬディッシュに播種して２１日培養し、コロニー数を測定した。
《スフェロイドアッセイ》
　回収した細胞を、Ｂ２７（５０倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を含有する無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１０００個／ｍＬの細胞密度に調整し、低接着プレートである、Ｕｌｔｒａ　Ｌｏｗ　Ｃｌｕｓｔｅｒ　Ｐｌａｔｅ（２４ウェル、Ｃｏｓｔａｒ社）に播種して２１日間培養した。その後、顕微鏡下でスフェロイド数を測定した。
《結果》
　図３（ａ）～（ｃ）は、コロニーアッセイの結果を示すグラフである。図３（ａ）～（ｃ）の縦軸はコロニー形成能（測定されたコロニーの数）を示す。
　また、図３（ｄ）～（ｆ）はスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。図３（ｄ）～（ｆ）の縦軸はスフェロイド形成能（測定されたスフェロイドの数）を示す。
　図３（ａ）及び（ｄ）の「Ｐａｎｃ－１」は、Ｐａｎｃ－１細胞株の結果であることを示す。また、図３（ｂ）及び（ｅ）の「Ｐａｔｉｅｎｔ　Ｎｏ．１」は、膵臓癌患者Ｎｏ．１由来初代膵臓癌細胞の結果であることを示す。また、図３（ｃ）及び（ｆ）の「Ｐａｔｉｅｎｔ　Ｎｏ．２」は、膵臓癌患者Ｎｏ．２由来初代膵臓癌細胞の結果であることを示す。
　その結果、ＦＯＸＯ３の発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、癌細胞のコロニー形成能及びスフェロイド形成能が有意に低下することが明らかとなった。この結果から、ＦＯＸＯ３の発現を抑制することにより、膵臓癌幹細胞の機能が抑制される（癌幹細胞性が抑制される）ことが明らかとなった。
［実験例５］
（ＦＯＸＯ３の発現抑制はヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した　２）
　ＲＮＡ干渉によりヒト膵臓癌細胞株におけるＦＯＸＯ３をノックダウンし、癌幹細胞マーカーの発現を検討した。
　具体的には、まず、膵臓癌患者由来初代膵臓癌細胞を１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調整し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養後、１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ　ｓｉ－ＦＯＸＯ３（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、４８時間培養した。なお、ｓｉ－ＦＯＸＯ３は、ＦＯＸＯ３に対するｓｉＲＮＡであり、実験例３におけるＦＯＸＯ３－ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＦＯＸＯ３＿９１２７」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ－ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ＳＩＣ－００１」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
　その後、ウエスタンブロットにより癌幹細胞マーカーの発現を評価した。癌幹細胞マーカーとして、ＣＤ４４、β－ｃａｔｅｎｉｎ（ＣＴＮＮＢ）、ＰＯＵ　Ｃｌａｓｓ　５　
Ｈｏｍｅｏｂｏｘ　１（ＰＯＵ５Ｆ１）、ｃ－Ｍｙｃ（ＭＹＣ）の発現を検出した。なお、ＰＯＵ５Ｆ１はＯＣＴ－４とも呼ばれるものである。また、ローディングコントロールとしてβ－ａｃｔｉｎの発現を検出した。
　図４（ａ）は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。図４（ｂ）～（ｆ）は、図（ａ）の結果を数値化したグラフである。図４（ｂ）はＦＯＸＯ３の結果を示し、図４（ｃ）はＣＤ４４の結果を示し、図４（ｄ）はβ－ｃａｔｅｎｉｎの結果を示し、図４（ｅ）はＰＯＵ５Ｆ１の結果を示し、図４（ｆ）はｃ－Ｍｙｃの結果を示す。
　また、図４（ｂ）～（ｆ）中、「Ｐａｔｉｅｎｔ　Ｎｏ．１」は膵臓癌患者Ｎｏ．１由来の初代膵臓癌細胞の結果であることを示し、「Ｐａｔｉｅｎｔ　Ｎｏ．２」は膵臓癌患者Ｎｏ．２由来の初代膵臓癌細胞の結果であることを示し、「Ｓ」は対照のスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ－ｓｉＲＮＡ）の結果であることを示し、「（ｉ）」はＦＯＸＯ３－ｓｉＲＮＡ（ｉ）の結果であることを示す。
　その結果、ＦＯＸＯ３の発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、ＦＯＸＯ３だけでなく、ＣＤ４４、β－ｃａｔｅｎｉｎ、ＰＯＵ５Ｆ１、ｃ－Ｍｙｃの各癌幹細胞マーカーの発現も有意に低下することが明らかとなった。
　この結果は、ＦＯＸＯ３の発現を抑制することにより、膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることを更に支持するものである。
［実験例６］
（ＦＯＸＯ３の発現抑制はヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した　３）
　ＦＯＸＯ３に対するＳｈ－ＲＮＡレンチウイルス（カタログ番号「ＴＲＣＮ００００２３５４８９」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びスクランブルＳｈ－ＲＮＡレンチウイルス（カタログ番号「ＳＨＣ００２」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）をヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ－１細胞に感染させ、ＦＯＸＯ３をノックダウンしたヒト膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ－１細胞を作製した。
　７週齢のヌードマウス（ｂａｌｂＣｎｕ／Ｃｒｌｊ、雌）にＣｏ６０線源を用いて１．８Ｇｙのγ線を照射し免疫抑制を誘導した。続いて、上記の各細胞を５×１０６個／匹ずつヌードマウスの右背部に皮下注射し、Ｐａｎｃ－１細胞株移植モデルマウスを作製した。続いて、３６日後に腫瘍体積をノギスで測定した。腫瘍体積は下記式（Ｆ１）により算出した。
　腫瘍体積（ｍｍ３）＝（短径）２×長径×０．５　…（Ｆ１）
　また、肝臓への腫瘍の転移を評価した。
　図５（ａ）は、腫瘍体積の測定結果を示すグラフである。図５（ａ）中、「ＦＯＸＯ３－ｓｈ」は、ＦＯＸＯ３に対するＳｈ－ＲＮＡレンチウイルスを感染させたＰａｎｃ－１細胞株の結果であることを示し、「Ｓｃｒ－ｓｈ」は対照のスクランブルＳｈ－ＲＮＡレンチウイルスを感染させたＰａｎｃ－１細胞株の結果であることを示す。
　その結果、ＦＯＸＯ３に対するＳｈ－ＲＮＡレンチウイルスを感染させたＰａｎｃ－１細胞株を移植したヌードマウスでは、対照と比較して、腫瘍体積が有意に縮小したことが明らかとなった。
　また、図５（ｂ）は、肝臓に転移した腫瘍の数を測定した結果を示すグラフである。図５（ｂ）中、「ＦＯＸＯ３－ｓｈ」は、ＦＯＸＯ３に対するＳｈ－ＲＮＡレンチウイルスを感染させたＰａｎｃ－１細胞株の結果であることを示し、「Ｓｃｒ－ｓｈ」は対照のスクランブルＳｈ－ＲＮＡレンチウイルスを感染させたＰａｎｃ－１細胞株の結果であることを示す。
　その結果、ＦＯＸＯ３に対するＳｈ－ＲＮＡレンチウイルスを感染させたＰａｎｃ－１細胞株を移植したヌードマウスでは、対照と比較して、腫瘍の肝臓への転移が有意に減少したことが明らかとなった。
　以上の結果は、ＦＯＸＯ３の発現を抑制することにより、膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることを更に支持するものである。
《癌治療モデルの評価》
　７週齢のヌードマウス（ｂａｌｂＣｎｕ／Ｃｒｌｊ、雌）にＣｏ６０線源を用いて１．８Ｇｙのγ線を照射し免疫抑制を誘導した。３日後、ヒト膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ－１細胞株を５×１０６個／匹ずつヌードマウスの右背部に皮下注射し、Ｐａｎｃ－１細胞株移植モデルマウスを作製した。
　続いて、腫瘍生着後（１４日後）から、４日おきにＦＯＸＯ３に対するＳｈ－ＲＮＡレンチウイルス（カタログ番号「ＴＲＣＮ００００２３５４８９」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）又はスクランブルＳｈ－ＲＮＡレンチウイルス（カタログ番号「ＳＨＣ００２」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を腫瘍内投与した。続いて、レンチウイルスの投与開始から３６日後に各ヌードマウスをと殺し、肝臓への腫瘍の転移を評価した。
　図５（ｃ）は、肝臓に転移した腫瘍の数を測定した結果を示すグラフである。図５（ｃ）中、「ＦＯＸＯ３－ｓｈ」は、ＦＯＸＯ３に対するＳｈ－ＲＮＡレンチウイルスを腫瘍内投与した結果であることを示し、「Ｓｃｒ－ｓｈ」は対照のスクランブルＳｈ－ＲＮＡレンチウイルスを腫瘍内投与した結果であることを示す。
　その結果、ＦＯＸＯ３に対するＳｈ－ＲＮＡレンチウイルスを継続的に腫瘍内投与したヌードマウスでは、対照と比較して、腫瘍の肝臓への転移が有意に減少したことが明らかとなった。この結果は、ＦＯＸＯ３の発現を抑制することにより、インビボにおいて膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることを更に支持するものである。
［実験例７］
（ＦＯＸＯ３活性が膵臓癌患者の予後に与える影響の検討）
　ＦＯＸＯ３活性化と膵臓癌患者の予後の関係を検討した。具体的には、マイクロアレイデータベースであるＧｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）のデータを用いてＦＯＸＯ３の活性と予後の関係をカプラン・マイヤー法に基づく生存曲線を基に解析した。
　マイクロアレイデータとしては、膵臓癌の中でも最も一般的かつ予後不良である浸潤性膵管癌（ＰＤＡＣ）の患者のマイクロアレイデータである、アクセッションＩＤ　ＧＳＥ２８７３５及びＧＳＥ２１５０１のデータを使用した。
　データの抽出は（Huang S., et al., MED12 Controls the Response to Multiple Cancer Drugs through Regulation of TGF-beta Receptor Signaling, Cell, 151, 937-950,2012）に基づいて、ａｆｆｙ　ｐａｃｋａｇｅ（Gautier L., et al., affy--analysis of Affymetrix GeneChip data at the probe level, Bioinformatics, 20 (3), 307-315,2004.）にしたがってＲ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（Gentleman R. C., et al., Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics,Genome Biol., 5 (10), R80, 2004.）を用いて行った。
　ＦＯＸＯ３の活性は、ＦＯＸＯ３によって転写制御される９つの遺伝子の発現に基づいて決定した。ＦＯＸＯ３の活性と予後の関係をカプラン・マイヤー法に基づく生存曲線を基に解析した。図６（ａ）は、アクセッションＩＤ　ＧＳＥ２８７３５の解析結果を示すグラフである。図６（ｂ）は、アクセッションＩＤ　ＧＳＥ２１５０１の解析結果を示すグラフである。
　その結果、ＦＯＸＯ３活性が高い患者において有意に予後不良であることが明らかとなった。このことから、ＦＯＸＯ３はヒトにおいても膵臓癌の進行に寄与することが明らかとなった。
［実験例８］
（ＣＤ４４陽性膵臓癌幹細胞におけるＦＯＸＯ３の発現の検討）
　癌幹細胞マーカーであるＣＤ４４陽性の膵臓癌幹細胞におけるＦＯＸＯ３の発現を蛍光免疫染色により検討した。
　膵臓癌の組織標本としては、ヒト膵臓癌腫瘍アレイ（ＵＳ　ｂｉｏｍａｘ社）を使用した。また、抗体としては、抗ＣＤ４４抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社）及び抗ＦＯＸＯ３抗体（ＣＳＴ社）を使用した。
　図７（ａ）は、蛍光免疫染色によりＣＤ４４の発現を検出した結果を示す写真である。
また、図７（ｂ）は、図７（ａ）と同一視野においてＦＯＸＯ３の発現を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。また、図７（ｃ）は、図７（ａ）と同一視野においてＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の蛍光により核を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
　その結果、ＣＤ４４陽性細胞がＦＯＸＯ３を発現していることが明らかとなった。すなわち、膵臓癌幹細胞においてＦＯＸＯ３が高発現していることが明らかとなった。
［実験例９］
（ｃＧＭＰ産生誘導剤Ｂａｙ４１－２２７２は、膵臓癌細胞におけるＦＯＸＯ３及びＣＤ４４の発現量を低下させた）
　ｃＧＭＰ産生誘導剤が膵臓癌細胞におけるＦＯＸＯ３及びＣＤ４４の発現量に及ぼす影響を検討した。
　具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ－１細胞を、１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で２．５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調整し、２ｍＬディッシュ（マツナミ社）に播種した。続いて、２４時間前培養した後、培地をＢａｙ４１－２２７２（５μＭ）を添加した１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、４８時間後（ＦＯＸＯ３）及び７２時間後（ＣＤ４４）に細胞を固定した。
　続いて、固定した細胞を用いて、ＦＯＸＯ３及びＣＤ４４の免疫染色を行った。ＦＯＸＯ３の染色には抗ＦＯＸＯ３抗体（ＣＳＴ社）を用いた。また、ＣＤ４４の染色には、抗ＣＤ４４抗体（ａｂｃａｍ社）を用いた。
　図８（ａ）は、ＦＯＸＯ３の発現を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。また、図８（ｂ）は、ＣＤ４４の発現を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、ｃＧＭＰ産生誘導剤を添加することにより、膵臓癌細胞におけるＦＯＸＯ３及びＣＤ４４の発現量が低下することが明らかとなった。
［実験例１０］
（膵臓癌細胞におけるＦＯＸＯ３の発現抑制はＬＫＢ１の発現量を低下させた）
　ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉により膵臓癌細胞株におけるＦＯＸＯ３をノックダウンし、ＬＫＢ１の発現に与える影響を検討した。
　具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ－１、ＢｘＰＣ－３、ＭＩＡ　Ｐａｃａ－２を１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調整し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ　ｓｉ－ＦＯＸＯ３（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、更に４８時間培養した。ｓｉ－ＦＯＸＯ３としては、実験例４におけるＦＯＸＯ３－ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＦＯＸＯ３＿９１２７」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＦＯＸＯ３－ｓｉＲＮＡ（ｉｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＦＯＸＯ３＿９１２８」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ－ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ＳＩＣ－００１」、Ｓｉｇｍａ
　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
　続いて、ウエスタンブロットによりＦＯＸＯ３及びＬｉｖｅｒ　ｋｉｎａｓｅ　Ｂ１（ＬＫＢ１）の発現量を検討した。また、ローディングコントロールとしてβ－ａｃｔｉｎの発現を検出した。なお、ＬＫＢ１はＳｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　１１（ＳＴＫ１１）とも呼ばれるものである。
　図９（ａ）～（ｄ）は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。図９（ａ）及び（ｂ）は、Ｐａｎｃ－１細胞の結果を示し、図９（ｃ）はＢｘＰＣ－３細胞の結果を示し、図９（ｄ）はＭＩＡ　Ｐａｃａ－２細胞の結果を示す。
　その結果、ＦＯＸＯ３の発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、ＬＫＢ１の発現が顕著に低下することが明らかとなった。
［実験例１１］
（ＬＫＢ１の発現抑制はヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した）
　ＲＮＡ干渉によりヒト膵臓癌細胞株におけるＬＫＢ１をノックダウンし、癌幹細胞の機能を検討した。
《コロニーアッセイ》
　ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ－１細胞を、１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調製し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ　ｓｉ－ＬＫＢ１（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、４８時間培養後細胞を回収した。なお、ｓｉ－ＬＫＢ１は、ＬＫＢ１に対するｓｉＲＮＡであり、ＬＫＢ１－ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＳＴＫ１１＿２６８７」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＬＫＢ１－ｓｉＲＮＡ（ｉｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＳＴＫ１１＿２６８９」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）の配列の異なる２種類を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ－ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ＳＩＣ－００１」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
　回収した細胞を１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ培地で１０００個／ｍＬの細胞密度で５ｍＬディッシュに播種して２１日培養し、コロニー数を測定した。
《スフェロイドアッセイ》
　ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ－１、ＢｘＰＣ－３、ＭＩＡ　Ｐａｃａ－２細胞を、１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調製し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ　ｓｉ－ＬＫＢ１（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、４８時間培養後細胞を回収した。なお、ｓｉ－ＬＫＢ１としては、ＬＫＢ１－ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＳＴＫ１１＿２６８７」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＬＫＢ１－ｓｉＲＮＡ（ｉｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＳＴＫ１１＿２６８９」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）の配列の異なる２種類を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ－ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ＳＩＣ－００１」、Ｓｉｇｍａ　
Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
　回収した細胞を、Ｂ２７（５０倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を含有する無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１０００個／ｍＬの細胞密度に調整し、低接着プレートである、Ｕｌｔｒａ　Ｌｏｗ　Ｃｌｕｓｔｅｒ　Ｐｌａｔｅ（２４ウェル、Ｃｏｓｔａｒ社）に播種して２１日間培養した。その後、顕微鏡下でスフェロイド数を測定した。
《結果》
　図１０（ａ）は、Ｐａｎｃ－１細胞株を用いたコロニーアッセイの結果を示すグラフである。図１０（ａ）の縦軸はコロニー形成能（測定されたコロニーの数）を示す。
　また、図１０（ｂ）～（ｄ）はスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。図１０（ｂ）～（ｄ）の縦軸はスフェロイド形成能（測定されたスフェロイドの数）を示す。図１０（ｂ）はＰａｎｃ－１細胞株の結果を示し、図１０（ｃ）はＢｘＰＣ－３細胞株の結果を示し、図１０（ｄ）はＭＩＡ　Ｐａｃａ－２細胞株の結果を示す。
　その結果、ＬＫＢ１の発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、癌細胞のコロニー形成能及びスフェロイド形成能が有意に低下することが明らかとなった。この結果から、ＬＫＢ１の発現を抑制することにより、膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることが明らかとなった。
［実験例１２］
（膵臓癌細胞におけるＬＫＢ１の発現抑制はＰＧＣ－１βの発現量を低下させた）
　ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉により膵臓癌細胞株におけるＬＫＢ１をノックダウンし、ＰＧＣ－１βの発現に与える影響を検討した。
　具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ－１、ＢｘＰＣ－３、ＭＩＡ　Ｐａｃａ－２を１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調整し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ　ｓｉ－ＬＫＢ１（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、更に４８時間培養した。ｓｉ－ＬＫＢ１としては、実験例１１におけるＬＫＢ１－ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＳＴＫ１１＿２６８７」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＬＫＢ１－ｓｉＲＮＡ（ｉｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＳＴＫ１１＿２６８９」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ－ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ＳＩＣ－００１」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
　続いて、ウエスタンブロットによりＬＫＢ１及びＰＰＡＲγ　ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ　１β（ＰＧＣ－１β）の発現量を検討した。また、ローディングコントロールとしてβ－ａｃｔｉｎの発現を検出した。
　図１１（ａ）～（ｄ）は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。図１１（ａ）及び（ｂ）は、Ｐａｎｃ－１細胞の結果を示し、図１１（ｃ）はＢｘＰＣ－３細胞の結果を示し、図１１（ｄ）はＭＩＡ　Ｐａｃａ－２細胞の結果を示す。
　その結果、ＬＫＢ１の発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、ＰＧＣ－１βの発現が顕著に低下することが明らかとなった。
［実験例１３］
（ＰＧＣ－１βの発現抑制はヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した）
　ＲＮＡ干渉によりヒト膵臓癌細胞株におけるＰＧＣ－１βをノックダウンし、癌幹細胞の機能を検討した。
　具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ－１、ＢｘＰＣ－３、ＭＩＡ　Ｐａｃａ－２を、１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調製し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ　ｓｉ－ＰＧＣ－１β（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、４８時間培養後細胞を回収した。なお、ｓｉ－ＰＧＣ－１β（カタログ番号「Ｈｓ＿ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ＿２９２３」、Ｓｉｇｍａ社）は、ＰＧＣ－１βに対するｓｉＲＮＡである。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ－ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ＳＩＣ－００１」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
《コロニーアッセイ》
　回収した各細胞を１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ培地で１０００個／ｍＬの細胞密度で５ｍＬディッシュに播種して２１日培養し、コロニー数を測定した。
《スフェロイドアッセイ》
　回収した各細胞を、Ｂ２７（５０倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を含有する無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１０００個／ｍＬの細胞密度に調整し、低接着プレートである、Ｕｌｔｒａ　Ｌｏｗ　Ｃｌｕｓｔｅｒ　Ｐｌａｔｅ（２４ウェル、Ｃｏｓｔａｒ社）に播種して２１日間培養した。その後、顕微鏡下でスフェロイド数を測定した。
《結果》
　図１２（ａ）～（ｃ）は、コロニーアッセイの結果を示すグラフである。図１２（ａ）～（ｃ）の縦軸はコロニー形成能（測定されたコロニーの数）を示す。
　また、図１２（ｄ）～（ｆ）はスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。図１２（ｄ）～（ｆ）の縦軸はスフェロイド形成能（測定されたスフェロイドの数）を示す。
　図１２（ａ）及び（ｄ）はＰａｎｃ－１細胞株の結果を示し、図１２（ｂ）及び（ｅ）はＢｘＰＣ－３細胞株の結果を示し、図１２（ｃ）及び（ｆ）はＭＩＡ　Ｐａｃａ－２細胞株の結果を示す。
　その結果、ＰＧＣ－１βの発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、癌細胞のコロニー形成能及びスフェロイド形成能が有意に低下することが明らかとなった。この結果から、ＰＧＣ－１βの発現を抑制することにより、膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることが明らかとなった。
［実験例１４］
（膵臓癌細胞におけるＦＯＸＯ３の発現抑制はミトコンドリア機能を阻害した）
　ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉により膵臓癌細胞株におけるＦＯＸＯ３をノックダウンし、ＰＧＣ－１βの発現及びミトコンドリア機能に与える影響を検討した。
　具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株であるＢｘＰＣ－３を１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調整し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ　ｓｉ－ＦＯＸＯ３（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、更に４８時間培養した。ｓｉ－ＦＯＸＯ３としては、実験例４におけるＦＯＸＯ３－ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＦＯＸＯ３＿９１２７」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ－ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ＳＩＣ－００１」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
　続いて、ウエスタンブロットによりＦＯＸＯ３及びＰＧＣ－１βの発現量を検討した。また、ローディングコントロールとしてβ－ａｃｔｉｎの発現を検出した。
　また、各細胞のミトコンドリア膜電位を、フローサイトメーターを用いて測定した。
　図１３（ａ）はウエスタンブロットの結果を示す写真である。また、図１３（ｂ）はミトコンドリア膜電位の測定結果を示すグラフである。
　その結果、ＦＯＸＯ３のノックダウンによってＰＧＣ－１βの発現が抑制され、ミトコンドリアの機能が阻害されることが明らかになった。
［実験例１５］
（膵臓癌細胞におけるＰＧＣ－１βの発現抑制はＰＤＨＡ１の発現量を低下させた）
　ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉により膵臓癌細胞株におけるＰＧＣ－１βをノックダウンし、ＰＤＨＡ１の発現に与える影響を検討した。
　具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株であるＢｘＰＣ－３、ＭＩＡ　Ｐａｃａ－２、Ｐａｎｃ－１を１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調整し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ　ｓｉ－ＰＧＣ－１β（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、更に４８時間培養した。ｓｉ－ＰＧＣ－１βとしては、ＰＧＣ－１β－ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ＿２９２３」、Ｓｉｇｍａ社）及びＰＧＣ－１β－ｓｉＲＮＡ（ｉｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ＿２９２４」、Ｓｉｇｍａ社）の配列の異なる２種類を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ－ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ＳＩＣ－００１」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
　続いて、ウエスタンブロットによりＰＧＣ－１β及びＰｙｒｕｖａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　α１（ＰＤＨＡ１）の発現量を検討した。また、ローディングコントロールとしてβ－ａｃｔｉｎの発現を検出した。
　図１４（ａ）～（ｃ）は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。図１４（ａ）はＢｘＰＣ－３細胞の結果を示し、図１４（ｂ）はＭＩＡ　Ｐａｃａ－２細胞の結果を示し、図１４（ｃ）はＰａｎｃ－１細胞の結果を示す。
　その結果、ＰＧＣ－１βの発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、ＰＤＨＡ１の発現が顕著に低下することが明らかとなった。
［実験例１６］
（ＰＤＨＡ１の発現抑制はヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した）
　ＲＮＡ干渉によりヒト膵臓癌細胞株におけるＰＤＨＡ１をノックダウンし、癌幹細胞の機能を検討した。
　具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ－１、ＢｘＰＣ－３、ＭＩＡ　Ｐａｃａ－２を、１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調製し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ　ｓｉ－ＰＤＨＡ１（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、４８時間培養後細胞を回収した。なお、ｓｉ－ＰＤＨＡ１は、ＰＤＨＡ１に対するｓｉＲＮＡである。ｓｉ－ＰＤＨＡ１としては、ＰＤＨＡ１－ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＰＤＨＡ１＿２４５８」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＰＤＨＡ１－ｓｉＲＮＡ（ｉｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＰＤＨＡ１＿２２４２」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）の配列の異なる２種類を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ－ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ＳＩＣ－００１」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
《コロニーアッセイ》
　回収した各細胞を１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ培地で１０００個／ｍＬの細胞密度で５ｍＬディッシュに播種して２１日培養し、コロニー数を測定した。
《スフェロイドアッセイ》
　回収した各細胞を、Ｂ２７（５０倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を含有する無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１０００個／ｍＬの細胞密度に調整し、低接着プレートである、Ｕｌｔｒａ　Ｌｏｗ　Ｃｌｕｓｔｅｒ　Ｐｌａｔｅ（２４ウェル、Ｃｏｓｔａｒ社）に播種して２１日間培養した。その後、顕微鏡下でスフェロイド数を測定した。
《結果》
　図１５（ａ）～（ｃ）は、コロニーアッセイの結果を示すグラフである。図１５（ａ）～（ｃ）の縦軸はコロニー形成能（測定されたコロニーの数）を示す。
　また、図１５（ｄ）～（ｆ）はスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。図１５（ｄ）～（ｆ）の縦軸はスフェロイド形成能（測定されたスフェロイドの数）を示す。
　図１５（ａ）及び（ｄ）はＰａｎｃ－１細胞株の結果を示し、図１５（ｂ）及び（ｅ）はＢｘＰＣ－３細胞株の結果を示し、図１５（ｃ）及び（ｆ）はＭＩＡ　Ｐａｃａ－２細胞株の結果を示す。
　その結果、ＰＤＨＡ１の発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、癌細胞のコロニー形成能及びスフェロイド形成能が有意に低下することが明らかとなった。この結果から、ＰＤＨＡ１の発現を抑制することにより、膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることが明らかとなった。
［実験例１７］
（ＦＯＸＯ３又はＰＤＨＡ１の発現抑制はＭＡＲＣＨ８依存的にＣＤ４４のユビキチン化を促進した）
　ＲＮＡ干渉によりヒト膵臓癌細胞株におけるＦＯＸＯ３又はＰＤＨＡ１をノックダウンし、ＣＤ４４のユビキチン化を検討した。
　具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ－１を、１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調整して１０ｍＬディッシュに播種し、２４時間前培養した。前培養後、１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地に培地交換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ、それぞれ１０ｎＭのｓｉ－ＦＯＸＯ３、ｓｉ－ＰＤＨＡ１又はｓｉ－ＭＡＲＣＨ８（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ、及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、２４時間培養した。
　ｓｉ－ＦＯＸＯ３としては、上述したＦＯＸＯ３－ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＦＯＸＯ３＿９１２７」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。また、ｓｉ－ＰＤＨＡ１としては、上述したＰＤＨＡ１－ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＰＤＨＡ１＿２４５８」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。また、ｓｉ－ＭＡＲＣＨ８としては、ＭＡＲＣＨ８－ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「ｓｃ－９０４３２」、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ－ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ＳＩＣ－００１」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
　続いて、２４時間後に、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２　０．１μＭを添加し、更に２４時間培養した。培養後、各細胞を回収し、抗ＣＤ４４抗体で免疫沈降し、抗ユビキチン抗体（Ｕｂ）、抗ＭＡＲＣＨ８抗体（ＭＡＲＣＨ８）又は抗ＣＤ４４抗体（ＣＤ４４）を用いたウエスタンブロットを行った。
　図１６は免疫沈降及びウエスタンブロットの結果を示す写真である。その結果、対照と比較して、ＦＯＸＯ３又はＰＤＨＡ１をノックダウンした場合には、ＭＡＲＣＨ８とＣＤ４４との相互作用が増加し、ＣＤ４４のユビキチン化が促進されることが明らかとなった。
　また、ＦＯＸＯ３及びＭＡＲＣＨ８をノックダウンした場合、又は、ＰＤＨＡ１及びＭＡＲＣＨ８をノックダウンした場合には、上記の効果は認められなかった。
　以上の結果は、ＦＯＸＯ３又はＰＤＨＡ１のノックダウンにより、ＭＡＲＣＨ８依存的にＣＤ４４のユビキチン化が促進されることが明らかとなった。
［実験例１８］
（ＦＯＸＯ３の発現抑制によるヒト膵臓癌幹細胞の機能阻害は、ＭＡＲＣＨ８の発現抑制によって解消された）
　ＲＮＡ干渉によりヒト膵臓癌細胞株におけるＦＯＸＯ３又はＭＡＲＣＨ８をノックダウンし、癌幹細胞の機能を検討した。
　ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ－１を、１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調製し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ、１０ｎＭのｓｉ－ＦＯＸＯ３（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）又はｓｉ－ＭＡＲＣＨ８（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、４８時間培養後細胞を回収した。なお、ｓｉ－ＦＯＸＯ３としては、上述したＦＯＸＯ３－ｓｉＲＮＡ（ｉ）を使用した。また、ｓｉ－ＭＡＲＣＨ８としては、ＭＡＲＣＨ８－ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「ｓｃ－９０４３２」、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）及びＭＡＲＣＨ８－ｓｉＲＮＡ（ｉｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＭＡＲＣＨ８＿４９５２」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）の配列の異なる２種類を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ－ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ＳＩＣ－００１」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
　回収した細胞を、Ｂ２７（５０倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を含有する無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１０００個／ｍＬの細胞密度に調整し、低接着プレートである、Ｕｌｔｒａ　Ｌｏｗ　Ｃｌｕｓｔｅｒ　Ｐｌａｔｅ（２４ウェル、Ｃｏｓｔａｒ社）に播種して２１日間培養した。その後、顕微鏡下でスフェロイド数を測定した。
　図１７（ａ）及び（ｂ）は、スフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。図１０（ａ）及び（ｂ）の縦軸はスフェロイド形成能（測定されたスフェロイドの数）を示す。
　その結果、対照と比較して、ＦＯＸＯ３の発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、癌細胞のスフェロイド形成能が有意に低下することが明らかとなった。また、ＦＯＸＯ３及びＭＡＲＣＨ８をノックダウンした場合には、ＦＯＸＯ３のノックダウンによるスフェロイド形成能の低下の効果は解消された。
　以上の結果から、ＦＯＸＯ３のノックダウンによる癌幹細胞の機能の抑制が、ＭＡＲＣＨ８依存的であることが明らかとなった。
［実験例１９］
（ＥＧＣＧとＰＤＥ阻害剤の併用は、ヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した　１）
　発明者らは、以前に、緑茶に含まれる主要なカテキンの一種であるエピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ－Ｏ－ｇａｌｌａｔｅ、以下、「ＥＧＣＧ」という場合がある。）が、６７ｋＤａラミニンレセプター（以下、「６７ＬＲ」という場合がある。）に結合すると、Ａｋｔが活性化され、内皮性一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）を活性化され、一酸化窒素（ＮＯ）及びｃＧＭＰの産生が誘導され、タンパク質キナーゼＣδ（ＰＫＣδ）が活性化され、産生スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）が活性化され、その結果、細胞死が誘導されることを明らかにした。すなわち、ＥＧＣＧは、６７ＬＲを介してｅＮＯＳ／ＰＫＣδ／ＡＳＭ経路を活性化し、細胞致死活性を示すことを明らかにした。
　発明者らはまた、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤は、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ等の環状リン酸ジエステルを加水分解する酵素を阻害する物質であることから、ＥＧＣＧと共にＰＤＥ阻害剤を併用することにより、ｃＧＭＰの分解が抑制され、ＥＧＣＧの活性を相乗的に増強することができることを明らかにした。
　そこで、ＥＧＣＧとＰＤＥ阻害剤の併用がヒト膵臓癌幹細胞の機能に与える影響を検討した。
　具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ－１における６７ＬＲの発現量をウエスタンブロットにより検討した。対照として、正常ヒト線維芽細胞を用いた。また、ローディングコントロールとしてβ－ａｃｔｉｎの発現を検出した。
　図１８（ａ）は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。その結果、正常ヒト線維芽細胞と比較して、膵臓癌細胞では６７ＬＲの発現が亢進していることが明らかとなった。
　続いて、膵臓癌組織におけるＰＤＥ３の発現を蛍光免疫染色により検討した。膵臓癌の組織標本としては、ヒト膵臓癌腫瘍アレイ（ＵＳ　ｂｉｏｍａｘ社）を使用した。また、抗体としては、抗ＣＤ４４抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社）及び抗ＰＤＥ３抗体（ＣＳＴ社）を使用した。
　図１８（ｂ）は、蛍光免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、膵臓癌組織においてＰＤＥ３が高発現していることが明らかとなった。
《スフェロイドアッセイ》
　ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ－１、ＢｘＰＣ－３、ＭＩＡ　Ｐａｃａ－２を、Ｂ２７（５０倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、Ｃａｔａｌａｓｅ（２００　Ｕ／ｍＬ）を含有する無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１０００個／ｍＬの細胞密度に調整し、ＥＧＣＧ（１０μＭ）及びＰＤＥ３阻害剤であるＴｒｅｑｕｉｎｓｉｎ（２．５μＭ）を添加し、低接着プレートである、Ｕｌｔｒａ　Ｌｏｗ　Ｃｌｕｓｔｅｒ　Ｐｌａｔｅ　（２４ウェル、Ｃｏｓｔａｒ社）に播種して２１日間培養した。その後、顕微鏡下でスフェロイド数を測定した。
　図１８（ｃ）～（ｅ）は、スフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。図１８（ｃ）～（ｅ）の縦軸はスフェロイド形成能（測定されたスフェロイドの数）を示す。図１８（ｃ）はＰａｎｃ－１細胞株の結果であり、図１８（ｄ）はＢｘＰＣ－３細胞株の結果であり、図１８（ｅ）はＭＩＡ　Ｐａｃａ－２細胞株の結果である。
　その結果、ＥＧＣＧ及びＰＤＥ３を併用した場合に、膵臓癌幹細胞の指標であるスフェロイド形成能が有意に阻害されることが明らかとなった。この結果から、ＥＧＣＧとＰＤＥ３阻害剤の併用が、ヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害することが明らかとなった。
［実験例２０］
（ＥＧＣＧとＰＤＥ阻害剤の併用は、ヒト膵臓癌細胞におけるＦＯＸＯ３及びＣＤ４４の発現を低下させた）
　ヒト膵臓癌細胞の培地にＥＧＣＧ及びＰＤＥ阻害剤を添加し、ウエスタンブロットによりＦＯＸＯ３及びＣＤ４４の発現を検討した。
　具体的には、ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ－１を１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で２．５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調整し、１０ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養を行った後、培地をＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）及びＣａｔａｌａｓｅ（２００　Ｕ／ｍＬ）を含有する１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＥＧＣＧ（１０μＭ）又はＰＤＥ３阻害剤であるＴｒｅｑｕｉｎｓｉｎ（２．５μＭ）を添加した。続いて、ＦＯＸＯ３（４８時間後）及びＣＤ４４（７２時間後）の発現量をウエスタンブロットにより検討した。また、ローディングコントロールとしてβ－ａｃｔｉｎの発現を検出した。
　図１９（ａ）及び（ｂ）はウエスタンブロットの結果を示す写真である。図１９（ａ）及び（ｂ）において、「対照」はＥＧＣＧもＴｒｅｑｕｉｎｓｉｎも添加しなかった群の結果を示し、「ＥＧＣＧ」はＥＧＣＧのみを添加した群の結果を示し、「Ｔｒｅｑｕｉｎｓｉｎ」はＴｒｅｑｕｉｎｓｉｎのみを添加した群の結果を示し、「ＥＧＣＧ＋Ｔｒｅｑｕｉｎｓｉｎ」はＥＧＣＧ及びＴｒｅｑｕｉｎｓｉｎを添加した群の結果を示す。
　また、図１９（ａ）はＦＯＸＯ３の発現を検討した結果を示し、図１９（ｂ）はＣＤ４４の発現を検討した結果を示す。
　その結果、ＥＧＣＧ及びＰＤＥ阻害剤を併用することにより、ヒト膵臓癌細胞におけるＦＯＸＯ３及びＣＤ４４の発現が顕著に低下することが明らかとなった。
［実験例２１］
（ＥＧＣＧとＰＤＥ阻害剤の併用は、ヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した　２）
　７週齢のヌードマウス（ｂａｌｂＣｎｕ／Ｃｒｌｊ、雌）にＣｏ６０線源を用いて１．８Ｇｙのγ線を照射し免疫抑制を誘導した。３日後、ＲＰＭＩ１６４０培地で１．０×１０７個／ｍＬの細胞密度に調整したＰａｎｃ－１細胞株を、ヌードマウスに５００μＬ（５×１０６個／匹）ずつ背面皮下注射し、Ｐａｎｃ－１細胞株移植モデルマウスを作製した。
　移植から４日後に腫瘍の生着が確認できたため、生着した腫瘍体積をもとに群分けを行い、ＥＧＣＧ、ＰＤＥ３阻害剤であるＴｒｅｑｕｉｎｓｉｎ、又は抗癌剤であるＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅを投与した。ＥＧＣＧの投与量は２日に１回１０ｍｇ／ｋｇとした。Ｔｒｅｑｕｉｎｓｉｎの投与量は２日に１回５ｍｇ／ｋｇとした。Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅの投与量は６日に１回１００ｍｇ／ｋｇとした。
　続いて、経時的に腫瘍体積をノギスで測定した。腫瘍体積は下記式（Ｆ１）により算出した。
　腫瘍体積（ｍｍ３）＝（短径）２×長径×０．５　…（Ｆ１）
　図２０は、腫瘍体積の変化を測定した結果を示すグラフである。その結果、ＥＧＣＧとＰＤＥ阻害剤を併用して投与することにより、腫瘍体積の増加が顕著に阻害されることが明らかとなった。
　また、ＥＧＣＧ、Ｔｒｅｑｕｉｎｓｉｎ、又はＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅの投与開始から３６日後に各ヌードマウスをと殺し、肝臓に転移した腫瘍の数を測定した。
　図２１は、肝臓に転移した腫瘍の数を測定した結果を示すグラフである。その結果、ＥＧＣＧとＰＤＥ阻害剤を併用して投与したヌードマウスでは、腫瘍の肝臓への転移が顕著に減少したことが明らかとなった。
　この結果から、ＥＧＣＧとＰＤＥ阻害剤を併用して投与することにより、インビボにおいても膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることが明らかとなった。この結果は、ＥＧＣＧとＰＤＥ阻害剤との併用が、膵臓癌幹細胞の機能を抑制することを更に支持するものである。
［実験例２２］
（ＥＧＣＧ誘導体は膵臓癌モデルマウスの生存期間を有意に延長した）
　７週齢のヌードマウス（ｂａｌｂＣｎｕ／Ｃｒｌｊ、雌）にＣｏ６０線源を用いて１．８Ｇｙのγ線を照射し免疫抑制を誘導した。３日後、ＲＰＭＩ１６４０培地で１．０×１０７個／ｍＬの細胞密度に調整したＢｘＰｃ－３細胞株を、ヌードマウスに５００μＬ（５×１０６個／匹）ずつ腹腔内投与し、ＢｘＰｃ－３細胞株移植モデルマウス（腹膜播種モデル）を作製した。
　続いて、ヌードマウスをランダムに群分けし、ＥＧＣＧ又はＥＧＣＧ誘導体（化合物Ｎｏ．１９）を２日に１回５ｍｇ／ｋｇの投与量で腹腔内投与した。下記式（１）に使用したＥＧＣＧ誘導体（化合物Ｎｏ．１９）の化学式を示す。対照には、等容量の溶媒のみを腹腔内投与した。続いて、ヌードマウスの生存率を検討した。ヌードマウスの死亡をエンドポイントとした。実験結果の統計処理にはＴｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔを用い、危険率５％未満を有意とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　図２２（ａ）は各群のヌードマウスの生存率を示すグラフである。その結果、ＥＧＣＧ誘導体は生存期間の顕著な延長効果を有することが明らかになった。
　また、ヒト膵臓癌細胞株であるＢｘＰｃ－３を１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で２．５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調整し、１０ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養を行った後、培地をＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）及びＣａｔａｌａｓｅ（２００　Ｕ／ｍＬ）を含有する１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＥＧＣＧ（１０μＭ）又はＥＧＣＧ誘導体（化合物Ｎｏ．１９）（２．５μＭ）を添加して、９６ウェルプレートに播種して３時間インキュベートした。対照には、等容量の溶媒のみを添加した。その後、市販のキット（商品名「ｃＧＭＰ　ＥＩＡ　ｋｉｔ」、ケイマンケミカル社製）を用いて細胞内のｃＧＭＰ量を測定した。
　図２２（ｂ）は、細胞内ｃＧＭＰの測定結果を示すグラフである。その結果、ＥＧＣＧ誘導体（化合物Ｎｏ．１９）の添加により、細胞内のｃＧＭＰの産生が有意に上昇することが明らかとなった。
［実験例２３］
（ｃＧＭＰ産生誘導剤はヒト肺癌幹細胞の機能を阻害した　１）
　ヒト肺癌細胞株Ａ５４９の培地に、ｃＧＭＰ産生誘導剤である、Ｂａｙ４１－２２７２（Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を添加し、スフェロイド形成能を検討した。
　具体的には、Ａ５４９細胞株を、Ｂ２７（５０倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を含有する無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１０００個／ｍＬの細胞密度に調製した。続いて、終濃度０、０．５、１又は２．５μＭのＢａｙ４１－２２７２を添加して、低接着プレートである、Ｕｌｔｒａ　Ｌｏｗ　Ｃｌｕｓｔｅｒ　Ｐｌａｔｅ（２４ウェル、Ｃｏｓｔａｒ社）に播種して２１日間培養した。その後、顕微鏡下でスフェロイド数を測定した。
　図２３は、スフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。縦軸はスフェロイド形成能（測定されたスフェロイドの数）を示す。図中、「＊＊」は危険率５％未満で有意差があることを示し、「＊＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。
　その結果、Ｂａｙ４１－２２７２の濃度が高いほどスフェロイド形成能が有意に低下することが明らかとなった。この結果から、ｃＧＭＰ産生を誘導することにより、肺癌幹細胞の機能が抑制されることが明らかとなった。
［実験例２４］
（ＦＯＸＯ３の発現抑制はヒト肺癌幹細胞の機能を阻害した　２）
　ＲＮＡ干渉によりヒト肺癌細胞株におけるＦＯＸＯ３をノックダウンし、癌幹細胞の機能を検討した。
　具体的には、まず、ヒト肺癌細胞株であるＡ５４９を、１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調製し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ　ｓｉ－ＦＯＸＯ３（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、４８時間培養後細胞を回収した。ｓｉ－ＦＯＸＯ３としては、実験例４におけるＦＯＸＯ３－ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＦＯＸＯ３＿９１２７」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。また、比較のためにスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ－ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ＳＩＣ－００１」、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加した群を用意した。また、対照としてｓｉＲＮＡを添加しなかった群を用意した。
　続いて、回収した各細胞を１％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ培地で１０００個／ｍＬの細胞密度で５ｍＬディッシュに播種して２１日培養し、コロニー数を測定した。
　図２４は、コロニーアッセイの結果を示す写真である。その結果、ＦＯＸＯ３の発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、癌細胞のコロニー形成能が顕著に低下することが明らかとなった。この結果から、ＦＯＸＯ３の発現を抑制することにより、肺癌幹細胞の機能が抑制されることが明らかとなった。
　本発明によれば、癌幹細胞阻害剤を提供することができる。

Claims (14)

  1. 　Ｆｏｒｋｈｅａｄ　ｂｏｘ　Ｏ３（ＦＯＸＯ３）／Ｌｉｖｅｒ　ｋｉｎａｓｅ　Ｂ１（ＬＫＢ１）／ＰＰＡＲγ　ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ　１β（ＰＧＣ－１β）／Ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　α１（ＰＤＨＡ１）／Ｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｒｉｎｇ－ＣＨ－ｔｙｐｅ　ｆｉｎｇｅｒ　８（ＭＡＲＣＨ８）経路の阻害剤を有効成分として含有する、癌幹細胞阻害剤。
  2. 　ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤が、ＦＯＸＯ３阻害剤、ＬＫＢ１阻害剤、ＰＧＣ－１β阻害剤又はＰＤＨＡ１阻害剤である、請求項１に記載の癌幹細胞阻害剤。
  3. 　ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤が、環状グアノシン一リン酸産生誘導剤である、請求項１又は２に記載の癌幹細胞阻害剤。
  4. 　ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤が、６７ｋＤａラミニンレセプター（６７ＬＲ）アゴニストである、請求項１～３のいずれか一項に記載の癌幹細胞阻害剤。
  5. 　前記６７ＬＲアゴニストが下記式（１）で表される化合物である、請求項４に記載の癌幹細胞阻害剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  6. 　前記癌幹細胞が、膵臓癌幹細胞又は肺癌幹細胞である、請求項１～５のいずれか一項に記載の癌幹細胞阻害剤。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の癌幹細胞阻害剤と、ホスホジエステラーゼ阻害剤とを備える、癌幹細胞阻害用キット。
  8. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の癌幹細胞阻害剤と薬学的に許容される担体とを含有する、癌幹細胞阻害用医薬組成物。
  9. 　ホスホジエステラーゼ阻害剤を更に含有する、請求項８に記載の癌幹細胞阻害用医薬組成物。
  10. 　ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路を阻害する６７ＬＲアゴニスト抗体の産生を誘導する、癌幹細胞阻害用ペプチド。
  11. 　前記ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエピガロカテキンガレートに対する結合能を有するペプチドである、請求項１０に記載の癌幹細胞阻害用ペプチド。
  12. 　被験物質の存在下で、細胞中のＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β、ＰＤＨＡ１又はＭＡＲＣＨ８の発現量を測定する工程と、
    　ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β若しくはＰＤＨＡ１の発現量が前記被験物質の非存在下における発現量と比較して低下していた場合、又はＭＡＲＣＨ８の発現量が前記被験物質の非存在下における発現量と比較して上昇していた場合に、前記被験物質は癌幹細胞阻害剤であると判断する工程と、を備える、
    　癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法。
  13. 　被験物質の存在下で、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β、ＰＤＨＡ１又はＭＡＲＣＨ８の活性を測定する工程と、
    　ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ－１β若しくはＰＤＨＡ１の活性が前記被験物質の非存在下における発現量と比較して低下していた場合、又はＭＡＲＣＨ８の活性が前記被験物質の非存在下における活性と比較して上昇していた場合に、前記被験物質は癌幹細胞阻害剤であると判断する工程と、を備える、
    　癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法。
  14. 　ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ－１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤を有効成分として含有する、癌転移抑制剤。
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