CN112011614A

CN112011614A - Kmt5a在调控胶质瘤干细胞特性及胶质瘤诊治中的应用

Info

Publication number: CN112011614A
Application number: CN202010832156.1A
Authority: CN
Inventors: 韩明志; 王帅; 赵文博; 孔杨; 王东海; 王剑; 李新钢
Original assignee: Qilu Hospital of Shandong University
Current assignee: Qilu Hospital of Shandong University
Priority date: 2020-08-18
Filing date: 2020-08-18
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2040-08-18
Also published as: CN112011614B

Abstract

本发明提供KMT5A在调控胶质瘤干细胞特性及胶质瘤诊治中的应用，属于生药医药和分子生物学技术领域。本发明研究发现KMT5A(赖氨酸甲基转移酶5A)基因及其表达产物在胶质瘤干细胞中表达上调，且与胶质瘤分级的增加呈正相关；KMT5A的表达量与胶质瘤的预后相关。并且通过调控KMT5A的表达可控制胶质瘤干细胞成球能力(GSC stemness)及肿瘤干细胞标志物的表达水平。同时，研究进一步发现，在胶质瘤干细胞中KMT5A特异性抑制剂UNC0379可以通过抑制其催化的组蛋白4赖氨酸20位甲基化修饰(H4K20me1)进而抑制胶质瘤细胞的增殖，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

KMT5A在调控胶质瘤干细胞特性及胶质瘤诊治中的应用

技术领域

本发明属于生药医药和分子生物学技术领域，具体涉及KMT5A在调控胶质瘤干细胞特性及胶质瘤诊治中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是成人中枢神经系统中最常见的原发性肿瘤，恶性程度极高(世界卫生组织[WHO]IV级)。目前主要的治疗方案是在达到最大的安全切除范围后，与烷基化剂替莫唑胺进行联合放化疗，即使如此，患者的平均生存期也仅为14.6个月，两年生存率低至3.3％。因此，开发新的治疗策略以延长患者生存期是目前胶质瘤治疗面临的首要任务。胶质瘤干细胞(Glioblastoma stem cell,GSC)是神经胶质瘤中具有干细胞特性(GSC stemness)的一类重要的细胞亚群，其特点为具有自我更新能力及体外成球能力，并表达多种干细胞标志物(CD133、NESTIN、SOX2、CD44等)，在神经胶质瘤的发生，维持，复发和放疗抵抗中起着重要的作用。而研究胶质瘤干细胞发生和进展的分子机制，对参与肿瘤细胞发生发展过程中的细胞信号传导和其他生物学途径进行干预已被证实能够显著提高患者预后，并成为未来肿瘤生物治疗的主力军。

KMT5A是蛋白赖氨酸甲基化酶(protein lysine methyltransferases，KMT)的家族成员之一。具有SET结构域是多数KMT家族成员的特点，不同KMT可催化多种蛋白发生不同形式的赖氨酸甲基化，如单甲基化、双甲基化或三甲基化。它是已知哺乳动物体内唯一催化组蛋白4赖氨酸20位甲基化(H4K20me1)的单甲基化酶。组蛋白赖氨酸甲基化是一种常见的转录后修饰，同精氨酸甲基化修饰一样在染色质结构和基因转录等方面起着十分重要的作用。以往的文献已发现KMT5A及其催化的H4K20me1修饰在肿瘤的恶性增殖等功能方面发挥重要的作用，已有报道证明KMT5A在乳腺癌、胃癌、前列腺癌等癌症中表达水平异常上调，且与不良预后相关。然而，发明人发现，目前本领域内针对KMT5A与胶质瘤干细胞关系的研究还较少，关于KMT5A在人脑胶质瘤干细胞中的临床意义以及其功能的潜在机制仍缺乏深入研究。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供KMT5A在调控胶质瘤干细胞特性及胶质瘤诊治中的应用。本发明发现，KMT5A(赖氨酸甲基转移酶5A)基因及其表达产物在胶质瘤干细胞中表达上调，且与胶质瘤分级的增加呈正相关；KMT5A的表达量与胶质瘤的预后相关。并且通过调控KMT5A的表达可控制胶质瘤干细胞成球能力(GSC stemness)及肿瘤干细胞标志物的表达水平。同时，研究进一步发现，在胶质瘤干细胞中KMT5A特异性抑制剂UNC0379可以通过抑制其催化的组蛋白4赖氨酸20位甲基化修饰(H4K20me1)进而抑制胶质瘤细胞的增殖。基于上述研究结果，从而完成本发明。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供用于检测KMT5A和/或H4K20me1的物质在制备如下任意一种或多种产品中的应用：

(a1)胶质瘤诊断或辅助诊断产品；

(a2)胶质瘤预后评估或辅助预后评估产品。

其中，所述诊断包括对胶质瘤分级的诊断；

所述预后评估包括对胶质瘤患者术后生存期评估。

本发明通过研究发现，KMT5A和H4K20me1的表达水平在胶质瘤表达异常上调，且与肿瘤分子分级相关，KMT5A表达与预后存在显著关联，其中在总体胶质瘤患者以及GBM患者中，KMT5A高表达均预示不良预后，与KMT5A的核表达现象相似，H4K20me1在正常脑组织中修饰水平较低，而在胶质瘤中修饰水平明显升高，其中GBM中最高。因此，KMT5A和H4K20me1可作为新的胶质瘤诊断或预后标志物，为胶质瘤患者诊断和术后生存期评估提供依据。

本发明的第二个方面，提供用于降低KMT5A表达水平的物质在制备产品中的应用。

本发明研究结果表明调控KMT5A的表达可控制胶质瘤干细胞成球能力(GSCstemness)及肿瘤干细胞标志物的表达水平。因此可通过抑制KMT5A的表达从而抑制胶质瘤细胞的增殖及恶性侵袭，实现对胶质瘤的抑制作用。同时，KMT5A特异性抑制剂UNC0379可以通过抑制其催化的组蛋白4赖氨酸20位甲基化修饰(H4K20me1)进而抑制胶质瘤细胞的增殖。所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(b1)抑制胶质瘤细胞增殖；

(b2)抑制胶质瘤细胞恶性侵袭；

(b3)抑制胶质瘤生长；

(b4)抑制胶质瘤转移；

(b5)治疗胶质瘤；

(b6)抑制胶质瘤干细胞成球能力；

(b7)抑制胶质瘤干细胞标志物的表达水平；

(b8)抑制H4K20me1的表达。

其中，降低KMT5A表达水平的物质可以是包括针对KMT5A的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，以及实施慢病毒感染或基因敲除的物质。

具体的，所述小分子抑制剂包括UNC0379；

所述实施慢病毒感染或基因敲除的物质包括敲除序列，所述敲除序列包括：5’-AGUCAAAGAUCUAUUCCUA-3’(SEQ ID NO.1)和5’-GCAACUAGAGAGACAAAUC-3’(SEQ ID NO.2)。

所述胶质瘤干细胞标志物包括CD133、OLIG2、CD44、SOX2和BMI-1。

本发明的第三个方面，提供用于提高KMT5A表达水平的物质在制备产品中的应用。

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(c1)促进胶质瘤细胞增殖；

(c2)促进胶质瘤细胞恶性侵袭；

(c3)促进胶质瘤生长；

(c4)促进胶质瘤转移；

(c5)制备胶质瘤动物模型；

(c6)促进胶质瘤干细胞成球；

(c7)促进胶质瘤干细胞标志物的表达水平；

(c8)促进H4K20me1的表达。

本发明的第四个方面，提供一种产品，其活性成分包括用于抑制KMT5A和/或H4K20me1表达水平的物质。

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(b1)抑制胶质瘤细胞增殖；

(b2)抑制胶质瘤细胞恶性侵袭；

(b3)抑制胶质瘤生长；

(b4)抑制胶质瘤转移；

(b5)治疗胶质瘤；

(b6)抑制胶质瘤干细胞成球能力；

(b7)抑制胶质瘤干细胞标志物的表达水平；

本发明的第五个方面，提供一种产品，其活性成分包括用于促进KMT5A和/或H4K20me1表达水平的物质。

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(c1)促进胶质瘤细胞增殖；

(c2)促进胶质瘤细胞恶性侵袭；

(c3)促进胶质瘤生长；

(c4)促进胶质瘤转移；

(c5)制备胶质瘤动物模型；

(c6)促进胶质瘤干细胞成球；

(c7)促进胶质瘤干细胞标志物的表达水平。

本发明的第六个方面，提供用于抑制KMT5A和/或H4K20me1表达水平的物质在如下任意一种或多种中的应用：

(b1)抑制胶质瘤细胞增殖；

(b2)抑制胶质瘤细胞恶性侵袭；

(b3)抑制胶质瘤生长；

(b4)抑制胶质瘤转移；

(b5)治疗胶质瘤；

(b6)抑制胶质瘤干细胞成球能力；

(b7)抑制胶质瘤干细胞标志物的表达水平。

本发明的第七个方面，提供用于促进KMT5A和/或H4K20me1表达水平的物质在如下任意一种或多种中的应用：

(c1)促进胶质瘤细胞增殖；

(c2)促进胶质瘤细胞恶性侵袭；

(c3)促进胶质瘤生长；

(c4)促进胶质瘤转移；

(c5)制备胶质瘤动物模型；

(c6)促进胶质瘤干细胞成球；

(c7)促进胶质瘤干细胞标志物的表达水平。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案首次证明了KMT5A高表达于胶质瘤干细胞，其表达水平随胶质瘤恶性程度的增加而增加，且与生存率呈负相关。上述技术方案所用sh-KMT5A慢病毒可显著降低胶质瘤KMT5A表达水平，特异性敲除KMT5A的表达抑制了胶质瘤干细胞特性，可作为一种有效的药物用于预防和/或治疗胶质瘤。

上述技术方案首次证明在胶质瘤中小分子化合物UNC0379作为KMT5A抑制剂和组蛋白4赖氨酸20位甲基化(H4K20me1)抑制剂的应用。

上述技术方案为胶质瘤患者的诊断、预后评估分析提供了更为有利的手段，并对于胶质瘤干细胞的研究、靶向治疗具有重要的意义。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明实施例中KMT5A在胶质瘤中的表达水平和预后意义图，其中，A是TCGA数据库中(n＝669)，KMT5A在不同级别的瘤中的差异表达情况；B为KMT5A在胶质瘤干细胞(GSC)及非胶质瘤干细胞(non-GSC)中的表达差异情况图；C是在TCGA(n＝669)数据库中分析KMT5A在所有胶质瘤病人中的预后曲线图；D是在TCGA(n＝163)和Lee(n＝218)数据库中分析KMT5A在所有胶质母细胞瘤病人中的预后曲线图；E是利用免疫组化检测在5例正常脑组织和15例低级别胶质瘤(Low grade gliomas,LGG)及16例胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)中KMT5A的表达情况(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。

图2是本发明实施例中敲除KMT5A可降低胶质瘤干细胞特性系列图；其中，A为westernblot分析显示，使用慢病毒sh-KMT5A#1和sh-KMT5A#2转染细胞后KMT5A的相对蛋白水平显著降低，以GAPDH为对照；B、C为干细胞特性检测实验中，敲除KMT5A后GSC的体外成球能力及自我更新能力受抑制图；D为qRT-PCR显示敲除KMT5A后GSC的多项干细胞标志物的表达水平下降情况；E、F为在GBM#P3和LN229中，CCK-8检测基于OD450的生长曲线图；(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。

图3为本发明实施例中免疫荧光显示敲除KMT5A后胶质瘤干细胞中KMT5A、H4K20me1受抑制图和H4K20me1在正常脑组织及不同级别胶质瘤标本中的免疫组化染色强度图；其中A、B分别是本发明实施例中免疫荧光显示敲除KMT5A后胶质瘤干细胞中KMT5A和H4K20me1受抑制图；C为H4K20me1在正常脑组织及不同级别胶质瘤标本中的免疫组化染色强度。

图4为本发明实施例中小分子抑制剂UNC0379抑制KMT5A和H4K20me1表达系列图；其中，A是本发明实施例中免疫荧光实验显示小分子抑制剂UNC0379可以抑制KMT5A和H4K20me1；B为western blot实验显示小分子抑制剂UNC0379可以抑制KMT5A和增加细胞周期阻滞标志物p21的表达；C为干细胞特性检测实验中，显微镜下观察UNC0379处理后可抑制干细胞自我更新能力。

图5是本发明实施例中体内实验显示敲除KMT5A抑制肿瘤的生长。其中A和B分别是在LN229和GBM#P3中，采用生物荧光成像(biolescence imaging,BLI)系统评价各组BALB/c裸小鼠原位异种移植胶质瘤的肿瘤生长情况，第5，15和25天小鼠荧光强度统计图和生存期。对照组小鼠与KMT5A敲除的小鼠对比，荧光强度高，即肿瘤较大，对照组小鼠与KMT5A敲除的小鼠对比，生存时间更短。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

技术人员应理解，术语“表达水平”是指在特定的时间点体内或样品中存在的基因产物的量。表达水平可以例如通过由基因表达的蛋白质或mRNA来测量/量化/检测。可以例如如下量化表达水平：用相同样品或参考样品(例如，在相同时间从同一个体得到的样品或相同样品的相同尺寸(重量、体积)的部分)中相同类型基因产物的总量(总蛋白质或mRNA)归一化样品中存在的目的基因产物的量，或者确定目的基因产物的量/限定的样品尺寸(重量、体积等)。可以通过本领域已知的任何方法来测量或检测表达水平，所述方法例如用于目的基因产物的直接检测和量化的方法(例如质谱)，或者通常通过目的基因产物与对目的基因产物具有特异性的一种或更多种不同分子或检测装置(例如，引物、探针、抗体、蛋白质支架)结合而工作的用于间接检测和测量目的基因产物的方法。技术人员还已知的是确定基因拷贝的水平，其还包括确定一个或更多个片段的不存在或存在(例如，通过核酸探针或引物，例如定量PCR、多重连接依赖性探针扩增(Multiplex ligation-dependent probeamplification，MLPA)。

术语“指标”和“标志”在本发明中可互换使用，并且是指病症的体征或信号或者用于监测病症。这样的“病症”是指细胞、组织或器官的生物状态，或者是指个体的健康和/或疾病状态。指标可以是包括但不限于肽、蛋白质和核酸的分子的存在或不存在，或者可以是细胞、或组织、器官或个体中这样的分子的表达水平或模式变化。指标可以是个体中疾病的发生、发展或存在或者这样的疾病的进一步进展的体征。指标也可以是在个体中发生疾病的风险的体征。

术语指标的水平“上调”、“升高”或“提高”是指与参考或参考样品相比，样品中这样的指标的水平降低。

术语指标的水平“下调”、“降低”或“下降”是指与参考或参考样品相比，样品中这样的指标的水平降低。

如前所述，目前本领域内针对KMT5A与胶质瘤干细胞关系的研究还较少，关于KMT5A在人脑胶质瘤干细胞中的临床意义以及其功能的潜在机制仍缺乏深入研究。

有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供用于检测KMT5A和/或H4K20me1的物质在制备如下任意一种或多种产品中的应用：

(a1)胶质瘤诊断或辅助诊断产品；

(a2)胶质瘤预后评估或辅助预后评估产品。

因此，所述应用(a1)中，胶质瘤诊断或辅助诊断包括对胶质瘤肿瘤分级进行诊断分析。

所述应用(a2)中，胶质瘤预后评估包括对患者胶质瘤术后总体生存期的预测。

本发明的一个具体实施方式中，所述产品包括检测试剂盒。

本发明的一个具体实施方式中，提供用于降低KMT5A表达水平的物质在制备产品中的应用。

(b1)抑制胶质瘤细胞增殖；

(b2)抑制胶质瘤细胞恶性侵袭；

(b3)抑制胶质瘤生长；

(b4)抑制胶质瘤转移；

(b5)治疗胶质瘤；

(b6)抑制胶质瘤干细胞成球能力；

(b7)抑制胶质瘤干细胞标志物的表达水平；

(b8)抑制H4K20me1的表达。

本发明的又一具体实施方式中，降低KMT5A表达水平的物质可以是包括针对KMT5A的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，以及实施慢病毒感染或基因敲除的物质。

本发明的又一具体实施方式中，所述小分子抑制剂包括UNC0379；

本发明的又一具体实施方式中，所述实施慢病毒感染或基因敲除的物质包括敲除序列，所述敲除序列包括：5’-AGUCAAAGAUCUAUUCCUA-3’(SEQ ID NO.1)和5’-GCAACUAGAGAGACAAAUC-3’(SEQ ID NO.2)。

本发明的又一具体实施方式中，所述胶质瘤干细胞标志物包括CD133、OLIG2、CD44、SOX2和BMI-1。

本发明的又一具体实施方式中，提供用于提高KMT5A表达水平的物质在制备产品中的应用。

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(c1)促进胶质瘤细胞增殖；

(c2)促进胶质瘤细胞恶性侵袭；

(c3)促进胶质瘤生长；

(c4)促进胶质瘤转移；

(c5)制备胶质瘤动物模型；

(c6)促进胶质瘤干细胞成球；

(c7)促进胶质瘤干细胞标志物的表达水平；

(c8)促进H4K20me1的表达。

本发明的一个具体实施方式中，提高KMT5A表达水平的物质包括采用基于基因特异性Mimics技术上调KMT5A表达和/或促进其活性的物质；如人工合成KMT5A的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)或上调KMT5A表达的启动子或者慢病毒；同时也包括化合物类促进剂。

所述产品可以为药物。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，其活性成分包括用于抑制KMT5A和/或H4K20me1表达水平的物质。

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(b1)抑制胶质瘤细胞增殖；

(b2)抑制胶质瘤细胞恶性侵袭；

(b3)抑制胶质瘤生长；

(b4)抑制胶质瘤转移；

(b5)治疗胶质瘤；

(b6)抑制胶质瘤干细胞成球能力；

(b7)抑制胶质瘤干细胞标志物的表达水平；

本发明的又一具体实施方式中，抑制KMT5A或H4K20me1表达水平的物质可以是包括针对KMT5A或H4K20me1的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，以及实施慢病毒感染或基因敲除的物质。

所述产品可以为药物。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，其活性成分包括用于促进KMT5A和/或H4K20me1表达水平的物质。

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(c1)促进胶质瘤细胞增殖；

(c2)促进胶质瘤细胞恶性侵袭；

(c3)促进胶质瘤生长；

(c4)促进胶质瘤转移；

(c5)制备胶质瘤动物模型；

(c6)促进胶质瘤干细胞成球；

(c7)促进胶质瘤干细胞标志物的表达水平。

本发明的一个具体实施方式中，促进KMT5A或H4K20me1表达水平的物质包括采用基于基因特异性Mimics技术上调KMT5A或H4K20me1表达和/或促进其活性的物质；如人工合成KMT5A或H4K20me1的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)，或上调KMT5A或H4K20me1表达的启动子或者慢病毒；同时也包括化合物类促进剂。

所述产品可以为药物。

本发明的又一具体实施方式中，提供用于抑制KMT5A和/或H4K20me1表达水平的物质在如下任意一种或多种中的应用：

(b1)抑制胶质瘤细胞增殖；

(b2)抑制胶质瘤细胞恶性侵袭；

(b3)抑制胶质瘤生长；

(b4)抑制胶质瘤转移；

(b5)治疗胶质瘤；

(b6)抑制胶质瘤干细胞成球能力；

(b7)抑制胶质瘤干细胞标志物的表达水平。

所述物质可以为药物。

本发明的又一具体实施方式中，提供用于促进KMT5A和/或H4K20me1表达水平的物质在如下任意一种或多种中的应用：

(c1)促进胶质瘤细胞增殖；

(c2)促进胶质瘤细胞恶性侵袭；

(c3)促进胶质瘤生长；

(c4)促进胶质瘤转移；

(c5)制备胶质瘤动物模型；

(c6)促进胶质瘤干细胞成球；

(c7)促进胶质瘤干细胞标志物的表达水平。

所述物质可以为药物。

根据本发明，“治疗”的概念表示任一适用于治疗胶质瘤相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。

根据本发明，上述药物还包括至少一种药物非活性成分。

所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。

所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。

本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。

本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

本发明的又一具体实施方式中，所述动物模型中的动物可以是非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩。

本发明的又一具体实施方式中，所述药物或物质施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

一、材料和方法

1.组织样本及资料库

本实施例包括来自山东大学齐鲁医院神经外科的神经胶质瘤样本和正常脑组织。本研究方案经医院制度审查委员会批准，并经每位受试者书面知情同意。胶质瘤标本由两名经验丰富的临床病理学家根据WHO肿瘤分类进行验证和分类。患者常规手术治疗获得5例正常脑组织、15例WHO II-III级、16例IV级(GBM)组织标本。公共数据库胶质瘤样本的临床信息及表达资料取自TCGA及Lee数据库。

2.胶质瘤干细胞培养和试剂

胶质母细胞瘤细胞GBM#P3取自临床GBM患者神经病理标本，LN229购自中国科学院细胞库。细胞均使用干细胞培养液(含B27和生长因子的Neurobasal培养基)培养并在37℃和含5％二氧化碳的细胞培养箱中孵育，以筛选并维持肿瘤干细胞状态。KMT5A特异性抑制剂UNC0379购自Selleck Chemicals公司。

3.KMT5A的敲除

采用慢病毒载体构建并合成的lenti-sh-KMT5A及lenti-Control慢病毒(Genepharma,Shanghai)按标准方案感染胶质瘤细胞,敲除序列1:5’-AGUCAAAGAUCUAUUCCUA-3’(SEQ ID NO.1)，敲除序列2:5’-GCAACUAGAGAGACAAAUC-3’(SEQID NO.2)。感染后经过嘌呤霉素筛选进行后续实验。

4.干细胞特性成球实验

将感染lenti-sh-KMT5A及lenti-Control后的GSC细胞以每孔3,000个细胞的密度接种于24孔板中，并加入GSC培养基。在细胞铺板后的第七天计算肿瘤悬浮球(直径大于100μm)数量。

5.免疫荧光实验

将转染的细胞接种在放置于12孔板中的圆形载玻片上24小时，并用4％多聚甲醛固定20分钟，用PBS洗涤两次，并用0.4％Triton X-100透化10分钟。用KTM5A和H4K20me1抗体孵育过夜，二抗孵育半小时，同时避光。将细胞核用DAPI染色5分钟。用莱卡激光共聚焦荧光显微镜拍摄载玻片。每个试验一式三份。

6.免疫组织化学染色

用4％甲醛固定取自小鼠的人脑胶质瘤组织样本或实体瘤。肿瘤石蜡包埋组织切片5μm厚度和固定在载玻片上，使用1mMol的EDTA来进行抗原修复。在含有3％过氧化氢的甲醇中孵育切片以灭活内源性过氧化物酶活性，然后切片放置在PBS中冲洗6分钟。接下来,切片使用山羊血清在室温下孵化2h，然后加一抗4℃孵育过夜。然后用PBS冲洗切片，用辣根过氧化物酶连接的山羊抗兔抗体或抗小鼠抗体孵育，然后用二氨基联苯胺反应，用Mayer的苏木精反染。

7.Westernblot

收获的细胞在RIPA细胞裂解缓冲液中用热变性进行裂解。蛋白溶解产物(20μg)进行分析，把蛋白质转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。孵化主要抗体KMT5A、p21、GAPDH(CST)。通过增强化学发光(ECL,Millipore,Bredford,USA)检测特异蛋白。

8.实时定量PCR

采用Trizol试剂(Invitrogen,Life Technologies)从胶质瘤细胞中提取RNA。并进行逆转录。ALDH1A3的引物为正向引物：5’-AAATCCAGGGCAAGACCATC-3’(SEQ ID NO.3)；反向引物：5’-TTCCACACCAGCATCAGCAG-3’(SEQ ID NO.4)，CD44的引物为正向引物：5’-TGAATATAACCTGCCGCTTTG-3’(SEQ ID NO.5)；反向引物：5’-TCCGTCCGAGAGATGCTGTAG-3’(SEQ ID NO.6)，NESTIN的引物为正向引物：5’-GGCGCACCTCAAGATGTCC-3’(SEQ ID NO.7)；反向引物：5’-CTTGGGGTCCTGAAAGCTG-3’(SEQ ID NO.8)，OCT4的引物为正向引物：5’-GACCATCTGCCGCTTTGAGGCTCTG-3’(SEQ ID NO.9)；反向引物：5’-GCGCCGGTTACAGAACCACACTCGG-3’(SEQ ID NO.10)，SOX2的引物为正向引物：5’-GCTGGGCGCCGAGTGGA-3’(SEQ ID NO.11)；反向引物：5’-GGCGAGCGTTCATGTAGGTCTG-3’(SEQID NO.12)，BMI-1的引物为正向引物：5’-AGATCGGGGCGAGACAATG-3’(SEQ ID NO.13)；反向引物：5’-TTTTATTCTGCGGGGCTGGGA-3’(SEQ ID NO.14)，OLIG2的引物为正向引物：5’-TCGCATCCAGATTTTCGGGT-3’(SEQ ID NO.15)；反向引物：5’-AAAAGGTCATCGGGCTCTGG-3’(SEQID NO.16)。

9.细胞增殖能力分析

取胶质瘤细胞在96孔细胞培养皿中，密度为3000细胞/孔。转染24、48、72、96h后用细胞计数Kit-8(CCK-8)分析细胞增殖情况。每孔添加10μL CCK-8溶剂，然后在细胞培养箱中孵育1h。然后利用Ensight(PerkinElmer)在450nm处测量光密度，并用相对吸光度值分析绘制细胞增殖曲线。

10.小鼠体内实验

建立颅内神经胶质瘤，LN229和GBM#P3荧光素酶细胞(1×10⁶)转染了Lenti-sh-KMT5A或Lenti-Control病毒，然后立体定向植入小鼠脑内。应用生物发光成像技术检测颅内肿瘤在第5、15和25天的生长情况。Kaplan-Meier生存曲线用于描述生存时间。

11.统计分析

使用GraphPad Prism 7软件，应用ANOVA或t检验。所有实验重复3次，取平均值±标准误差。使用log-rank检验分析Kaplan-Meier生存曲线。P<0.05为差异有统计学意义。

二、实验结果

1.KMT5A的表达水平在胶质瘤干细胞中上调，且与肿瘤分级和患者预后相关

首先利用TCGA数据库中分析了KMT5A在不同级别的肿瘤中的基因表达水平差异。结果显示，KMT5A的表达量随着胶质瘤级别的升高而增加(图1A所示)。进一步利用数据库检测KMT5A在胶质瘤干细胞中的表达特征，发现KMT5A显著高表达于胶质瘤干细胞(GSC)亚群，而在分化的胶质瘤细胞等其他非干细胞亚群(non-GSC)中表达水平较低(图1B)。利用Kaplan-Meier生存曲线中检验KMT5A表达在胶质瘤患者总体生存(OS)中的预后价值。在TCGA及Lee数据库中，KMT5A表达与预后存在显著关联，其中在总体胶质瘤患者以及GBM患者中，KMT5A高表达均预示不良预后(图1C、D所示)。进一步在临床标本中利用免疫组织化学染色检测KMT5A表达量，观察到相似的结果，KMT5A主要为核染色阳性，在正常脑组织低表达，而在胶质瘤中表达明显升高，其中GBM中的表达量最高(图1E所示)。以上结果表明KMT5A在胶质瘤干细胞亚群中的重要作用，其可能是GSC的重要调控分子。KMT5A可作为一种新的胶质瘤预后标志物，为患者术后生存期评估提供依据。

2.验证KMT5A在胶质瘤细胞中的敲除效率以及下调KMT5A对胶质瘤干细胞特性(GSC stemness)的抑制作用

基于KMT5A在胶质瘤干细胞中表达异常上调，提示其可能在肿瘤干细胞特性的维持中发挥重要作用，为了评估KMT5A在GSC中的功能，提取原代胶质瘤细胞并培养于干细胞培养液环境，进一步构建了慢病毒lenti-sh-KMT5A来下调GBM#P3和LN229中KMT5A的表达。Westernblot分析证实感染两条独立序列sh-KMT5A后KMT5A的表达水平较NC组明显降低(图2A)。这些结果进一步证实了sh-KMT5A在胶质瘤细胞体外功能实验中对下调KMT5A的有效性。胶质瘤干细胞(GSC)是神经胶质瘤中具有干细胞特性(GSC stemness)的一类重要的细胞亚群，其特点为具有自我更新能力及体外成球能力，并表达多种干细胞标志物(CD133、NESTIN、SOX2、CD44等)，GSC在神经胶质瘤的发生，维持，复发和放疗抵抗中起着重要的作用。进一步，检测KMT5A在GSC中的作用，体外成球能力实验是目前公认的干细胞特性检测实验，发现敲除KMT5A后GSC的体外成球能力受到显著抑制(图2B、2C)，提示GSC的干细胞特性(自我更新能力)在KMT5A敲除后降低。进一步，利用qRT-PCR检测了多项经典的肿瘤干细胞标志物的表达水平，显示敲除KMT5A后GSC的多项干细胞标志物(CD133、OLIG2、CD44、SOX2和BMI-1)的表达水平均显著下降(图2D)。同时，KMT5A对细胞增殖的影响采用CCK-8实验测定。CCK-8结果显示，KMT5A敲除组的胶质瘤细胞在5天后的增殖情况显著低于对照组(图2E、2F)。以上结果表明KMT5A基因是调控胶质瘤干细胞特性的重要分子。

3.KMT5A敲除对胶质瘤干细胞中组蛋白4赖氨酸20位甲基化修饰的影响

组蛋白赖氨酸甲基化是一种常见的转录后修饰，其中，组蛋白4赖氨酸20位甲基化(H4K20me1)在调控染色质结构和下游靶向基因转录等方面起着十分重要的作用。已有报道显示KMT5A催化的H4K20me1修饰在包括髓母细胞瘤等多种肿瘤中发挥功能，H4K20me1修饰可通过介导下游多个经典癌基因/抑癌基因的转录调控而发挥促癌作用。申请人利用免疫荧光检测了KMT5A敲除后胶质瘤干细胞中的组蛋白4赖氨酸20位甲基化(H4K20me1)显著降低(图3A和B)。这些数据表明KMT5A过表达可抑制胶质瘤干细胞H4K20me1修饰水平。进一步，利用免疫组化评估了H4K20me1修饰水平在不同胶质瘤病理组织中的差异情况，图3C显示，与KMT5A的核表达现象相似，H4K20me1在正常脑组织中修饰水平较低，而在胶质瘤中修饰水平明显升高，其中GBM中最高。以上结果表明了KMT5A在GSC中对H4K20me1修饰的重要调控作用。

4.KMT5A特异性抑制剂UNC0379对胶质瘤干细胞的影响

KMT5A是蛋白赖氨酸甲基化酶(protein lysine methyltransferases，KMT)的家族成员之一。具有SET结构域是多数KMT家族成员的特点，不同KMT可催化多种蛋白发生不同形式的赖氨酸甲基化，如单甲基化、双甲基化或三甲基化。它是哺乳动物体内目前报道的唯一催化组蛋白4赖氨酸20位甲基化(H4K20me1)的单甲基化酶。近期已有研究开发了特异性靶向KMT5A的小分子抑制剂UNC0379。申请人利用免疫荧光检测了小分子抑制剂UNC0379对胶质瘤细胞中KMT5A表达和H4K20me1的影响。结果显示小分子抑制剂UNC0379显著降低KMT5A表达和组蛋白4赖氨酸20位甲基化水平(图4A)。随后，申请人利用Western检测了小分子抑制剂UNC0379对胶质瘤干细胞中KMT5A表达量的影响，结果显示UNC0379过表达显著抑制了KMT5A的表达，同时上调了细胞周期阻滞标志物p21(图4B)。进一步利用UNC0379处理GSC，干细胞特性检测实验中，显微镜下观察UNC0379处理后可抑制干细胞成球能力，干细胞特性显著降低(图4C)。这些数据表明特异性抑制KMT5A可下调胶质瘤干细胞中H4K20me1修饰水平并抑制GSC特性，进一步验证了KMT5A在胶质瘤干细胞中的重要作用。

5.KMT5A对颅内肿瘤生长情况的影响

利用生物发光成像(BLI)系统检测裸鼠颅内种瘤后胶质瘤的生长进展情况。结果显示sh-KMT5A组与对照组相比，在种瘤后25天荧光强度显著降低。对照组总生存时间短于sh-KMT5A组(图5A、5B)。这些结果表明，KMT5A敲除导致胶质瘤细胞在体内生长速度降低。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学齐鲁医院

<120> KMT5A在调控胶质瘤干细胞特性及胶质瘤诊治中的应用

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

agucaaagau cuauuccua 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcaacuagag agacaaauc 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaatccaggg caagaccatc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttccacacca gcatcagcag 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgaatataac ctgccgcttt g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tccgtccgag agatgctgta g 21

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggcgcacctc aagatgtcc 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cttggggtcc tgaaagctg 19

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaccatctgc cgctttgagg ctctg 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcgccggtta cagaaccaca ctcgg 25

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gctgggcgcc gagtgga 17

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggcgagcgtt catgtaggtc tg 22

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

agatcggggc gagacaatg 19

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttttattctg cggggctggg a 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tcgcatccag attttcgggt 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aaaaggtcat cgggctctgg 20

Claims

1.用于检测KMT5A和/或H4K20me1的物质在制备如下任意一种或多种产品中的应用：

(a1)胶质瘤诊断或辅助诊断产品；

(a2)胶质瘤预后评估或辅助预后评估产品。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，

所述应用(a1)中，胶质瘤诊断或辅助诊断包括对胶质瘤肿瘤分级进行诊断分析；或，

所述应用(a2)中，胶质瘤预后评估包括对患者胶质瘤术后总体生存期的预测；

优选的，所述产品包括检测试剂盒。

3.用于降低KMT5A表达水平的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(b1)抑制胶质瘤细胞增殖；

(b2)抑制胶质瘤细胞恶性侵袭；

(b3)抑制胶质瘤生长；

(b4)抑制胶质瘤转移；

(b5)治疗胶质瘤；

(b6)抑制胶质瘤干细胞成球能力；

(b7)抑制胶质瘤干细胞标志物的表达水平；

(b8)抑制H4K20me1的表达。

4.如权利要求3所述应用，其特征在于，降低KMT5A表达水平的物质包括针对KMT5A的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，以及实施慢病毒感染或基因敲除的物质；

优选的，所述小分子抑制剂包括UNC0379；

优选的，所述实施慢病毒感染或基因敲除的物质包括敲除序列，所述敲除序列包括：5’-AGUCAAAGAUCUAUUCCUA-3’(SEQ ID NO.1)和5’-GCAACUAGAGAGACAAAUC-3’(SEQ IDNO.2)。

优选的，所述胶质瘤干细胞标志物包括CD133、OLIG2、CD44、SOX2和BMI-1。

5.用于提高KMT5A表达水平的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(c1)促进胶质瘤细胞增殖；

(c2)促进胶质瘤细胞恶性侵袭；

(c3)促进胶质瘤生长；

(c4)促进胶质瘤转移；

(c5)制备胶质瘤动物模型；

(c6)促进胶质瘤干细胞成球；

(c7)促进胶质瘤干细胞标志物的表达水平；

(c8)促进H4K20me1的表达；

优选的，提高KMT5A表达水平的物质包括采用基于基因特异性Mimics技术上调KMT5A表达和/或促进其活性的物质；包括人工合成KMT5A的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)或上调KMT5A表达的启动子或者慢病毒；也包括化合物类促进剂；

所述胶质瘤干细胞标志物包括CD133、OLIG2、CD44、SOX2和BMI-1。

6.一种产品，其特征在于，其活性成分包括用于抑制KMT5A和/或H4K20me1表达水平的物质；

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(b1)抑制胶质瘤细胞增殖；

(b2)抑制胶质瘤细胞恶性侵袭；

(b3)抑制胶质瘤生长；

(b4)抑制胶质瘤转移；

(b5)治疗胶质瘤；

(b6)抑制胶质瘤干细胞成球能力；

(b7)抑制胶质瘤干细胞标志物的表达水平。

7.一种产品，其特征在于，其活性成分包括用于促进KMT5A和/或H4K20me1表达水平的物质；

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(c1)促进胶质瘤细胞增殖；

(c2)促进胶质瘤细胞恶性侵袭；

(c3)促进胶质瘤生长；

(c4)促进胶质瘤转移；

(c5)制备胶质瘤动物模型；

(c6)促进胶质瘤干细胞成球；

(c7)促进胶质瘤干细胞标志物的表达水平。

8.用于抑制KMT5A和/或H4K20me1表达水平的物质在如下任意一种或多种中的应用：

(b1)抑制胶质瘤细胞增殖；

(b2)抑制胶质瘤细胞恶性侵袭；

(b3)抑制胶质瘤生长；

(b4)抑制胶质瘤转移；

(b5)治疗胶质瘤；

(b6)抑制胶质瘤干细胞成球能力；

(b7)抑制胶质瘤干细胞标志物的表达水平。

9.用于促进KMT5A和/或H4K20me1表达水平的物质在如下任意一种或多种中的应用：

(c1)促进胶质瘤细胞增殖；

(c2)促进胶质瘤细胞恶性侵袭；

(c3)促进胶质瘤生长；

(c4)促进胶质瘤转移；

(c5)制备胶质瘤动物模型；

(c6)促进胶质瘤干细胞成球；

(c7)促进胶质瘤干细胞标志物的表达水平。

10.权利要求3-5所述应用、权利要求6或7所述产品和/或权利要求8或9所述应用，其特征在于，所处产品或物质为药物。