CN114765957A - 从羊水中获得羊膜间充质干细胞的方法和设备及其来源的细胞 - Google Patents

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Abstract

用于生产先进治疗药品的具有新生儿质量和成体组织特异性的间充质干细胞(MSC)亚群的纯化、培养和选择方法。

Description

从羊水中获得羊膜间充质干细胞的方法和设备及其来源的 细胞
技术领域
本发明涉及用于纯化、培养和选择具有新生儿质量组织特异性的间充质干细胞(MSC)亚群以用于生产先进治疗性药品的方法。
背景技术
羊水是妊娠期间包围和保护胎儿的液体。在妊娠最后三个月期间，羊水部分由胎肺分泌，部分由胎儿尿液分泌。羊水经口摄入并被胎儿的肠道吸收，从而重新进入胎儿循环。足月羊水由含有电解质的水组成，但也含有蛋白质、碳水化合物、脂质、磷脂和尿素。除代谢废物外，羊水还含有胎儿细胞和其它从皮肤上脱落的物质，例如毛发和胎儿皮脂——一种婴儿出生时覆盖皮肤的油腻沉积物。与羊水接触的组织界面有助于包括细胞物质的羊水的含量。肺是这些组织界面中最大的组织界面，其也将肺表面活性物质分泌到TAF中。口腔和鼻粘膜、眼睛和泌尿道是其它具有与羊水拓扑接触的非角质化上皮界面的此类表面。
间充质干细胞(MSC)几乎存在于所有组织中，并且主要位于血管周围的微环境中。如本领域技术人员将理解的，间充质干细胞是多能基质细胞，这些多能基质细胞能够分化成多种细胞类型，并且还具有用于指导组织修复过程的抗炎、血管生成特性，由此使得间充质干细胞对于治疗性处置是有价值的。在剖宫产期间所收集的足月羊水(TAF)含有许多有价值的细胞，包括MSC。然而，由于与无菌收集、处理TAF以及鉴定和提取MSC关联的难题，以前没有大规模地提取和培养MSC。此外，特异性MSC亚群可能特别适合用于生产治疗性药物。以前，源自成体骨髓、成体脂肪组织或新生儿出生关联的组织(包括胎盘、脐带和脐带血)的MSC被广泛用于获得MSC。与源于这些成体源的MSC相比，来自这些新生儿组织的MSC可能具有额外的能力。实际上，几项研究已经报道了优于成体源性MSC的生物学特性，如来自出生关联组织的MSC的增殖能力、寿命和分化潜力的提高。然而，这些新生儿MSC源中没有一个在成人体内具有相应的组织或器官。因此，具有组织特异性的新生儿质量MSC将是极其有益的。此外，胎儿物质的获取可能与对婴儿的负面影响有关。例如，在脐带血采集中，已经表明应将尽可能多的脐带血返还给婴儿以改善生存、生长和精细运动技能的发展。另一方面，羊水当今被认为是废弃的医疗废物。因此，收集这种未开发资源的伦理和实际动机是显而易见的。
发明内容
某些公开的实例涉及用于从羊水获得羊膜间充质干细胞的装置、方法和系统及其来源的细胞。本领域技术人员将理解，本文所述的装置、方法和系统的应用不限于特定的细胞或组织类型。下面描述了进一步的实例。
一方面，本公开提供了一种从羊水中获得羊膜间充质干细胞的方法，其包含：提供足月羊水(TAF)；从TAF中去除颗粒物质以获得纯化的TAF细胞；对纯化的TAF细胞进行粘附选择以获得TAF粘附细胞；传代TAF粘附细胞以获得TAF间充质干细胞(TAF MSC)；以及选择表达标志物的TAF MSC，该标志物选自由以下组成的组：TBC1结构域家族成员3K(TBC1D3K)、同种异体移植炎症因子1样(AIF1L)、钙粘蛋白相关家族成员1(CDHR1)、钠/钾转运ATP酶相互作用蛋白4(NKAIN4)、ATP结合盒亚家族B成员1(ABCB1)、质膜囊泡关联蛋白(PLVAP)、间皮素(MSLN)、L1细胞粘附分子(L1CAM)、甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)、mal,T细胞分化蛋白2(基因/假基因)(MAL2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、双C2结构域β(DOC2B)、内皮细胞粘附分子(ESAM)、γ-氨基丁酸A型受体β1亚基(GABRB1)、钙粘蛋白16(CDH16)、免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3)、桥粒芯胶粘蛋白3(DSC3)、血红蛋白化和红系细胞扩增调节剂(RHEX)、钾电压门控通道相互作用蛋白1(KCNIP1)、CD70分子(CD70)、GDNF家族受体α1(GFRA1)、Crumbs细胞极性复合物组分3(CRB3)、紧密连接蛋白1(CLDN1)、新型转录本(AC118754.1)、钠电压门控通道α亚基5(SCN5A)、成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)、钾双孔结构域通道亚家族K成员3(KCNK3)、dysferlin(DYSF)、肝配蛋白A1(EFNA1)、钾内向整流通道亚家族J成员16(KCNJ16)、膜关联环-CH-型指1(MARCHF1)、突触结合蛋白样1(SYTL1)、钙同线蛋白2(CLSTN2)、整联蛋白亚基β4(ITGB4)、囊泡关联膜蛋白8(VAMP8)、G蛋白偶联受体C类5组成员C(GPRC5C)、CD24分子(CD24)、钙粘蛋白EGF LAG七次跨膜G型受体2(CELSR2)、钙粘蛋白8(CDH8)、谷氨酸受体相互作用蛋白1(GRIP1)、成束蛋白肌动蛋白结合蛋白(DMTN)、F11受体(F11R)、细胞粘附分子1(CADM1)、钙粘蛋白6(CDH6)、凝血因子II凝血酶受体样2(F2RL2)、含有LY6/PLAUR结构域的蛋白1(LYPD1)、溶质载体家族6成员6(SLC6A6)、桥粒芯糖蛋白2(DSG2)、粘附G蛋白偶联受体G1(ADGRG1)、缩胆囊素A受体(CCKAR)、催产素受体(OXTR)、整联蛋白亚基α3(ITGA3)、具有Ig样结构域2的粘附分子(AMIGO2)、钙粘蛋白EGF LAG七次跨膜G型受体1(CELSR1)、EPH受体B2(EPHB2)。
在另一方面，本公开提供可通过根据本公开所述的方法获得的分离的细胞，所述细胞表达表面标志物，该表面标志物选自由以下组成的组：TBC1结构域家族成员3K(TBC1D3K)、同种异体移植炎症因子1样(AIF1L)、钙粘蛋白相关家族成员1(CDHR1)、钠/钾转运ATP酶相互作用蛋白4(NKAIN4)、ATP结合盒亚家族B成员1(ABCB1)、质膜囊泡关联蛋白(PLVAP)、间皮素(MSLN)、L1细胞粘附分子(L1CAM)、甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)、mal,T细胞分化蛋白2(基因/假基因)(MAL2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、双C2结构域β(DOC2B)、内皮细胞粘附分子(ESAM)、γ-氨基丁酸A型受体β1亚基(GABRB1)、钙粘蛋白16(CDH16)、免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3)、桥粒芯胶粘蛋白3(DSC3)、血红蛋白化和红系细胞扩增调节剂(RHEX)、钾电压门控通道相互作用蛋白1(KCNIP1)、CD70分子(CD70)、GDNF家族受体α1(GFRA1)、Crumbs细胞极性复合物组分3(CRB3)、紧密连接蛋白1(CLDN1)、新型转录本(AC118754.1)、钠电压门控通道α亚基5(SCN5A)、成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)、钾双孔结构域通道亚家族K成员3(KCNK3)、dysferlin(DYSF)、肝配蛋白A1(EFNA1)、钾内向整流通道亚家族J成员16(KCNJ16)、膜关联环-CH-型指1(MARCHF1)、突触结合蛋白样1(SYTL1)、钙同线蛋白2(CLSTN2)、整联蛋白亚基β4(ITGB4)、囊泡关联膜蛋白8(VAMP8)、G蛋白偶联受体C类5组成员C(GPRC5C)、CD24分子(CD24)、钙粘蛋白EGF LAG七次跨膜G型受体2(CELSR2)、钙粘蛋白8(CDH8)、谷氨酸受体相互作用蛋白1(GRIP1)、成束蛋白肌动蛋白结合蛋白(DMTN)、F11受体(F11R)、细胞粘附分子1(CADM1)、钙粘蛋白6(CDH6)、凝血因子II凝血酶受体样2(F2RL2)、含有LY6/PLAUR结构域的蛋白1(LYPD1)、溶质载体家族6成员6(SLC6A6)、桥粒芯糖蛋白2(DSG2)、粘附G蛋白偶联受体G1(ADGRG1)、缩胆囊素A受体(CCKAR)、催产素受体(OXTR)、整联蛋白亚基α3(ITGA3)、具有Ig样结构域2的粘附分子(AMIGO2)、钙粘蛋白EGFLAG七次跨膜G型受体1(CELSR1)、EPH受体B2(EPHB2)。
在某些实例中，一种用于从足月羊水获得足月羊水间充质干细胞(TAF MSC)的方法可以包含：
提供足月羊水(TAF)；
从TAF中去除颗粒物质以获得纯化的TAF细胞；
对纯化的TAF细胞进行粘附选择以获得TAF粘附细胞；
传代TAF粘附细胞以获得包含TAF MSC的细胞群；以及
从群中选择TAF MSC作为表达至少一种A组表面标志物的细胞，该至少一种A组表面标志物选自由以下组成的组：TBC1结构域家族成员3K、同种异体移植炎症因子1样、钙粘蛋白相关家族成员1、钠/钾转运ATP酶相互作用蛋白4、ATP结合盒亚家族B成员1、质膜囊泡关联蛋白、间皮素、L1细胞粘附分子、甲型肝炎病毒细胞受体1、mal,T细胞分化蛋白2(基因/假基因)、SLAM家族成员7、双C2结构域β、内皮细胞粘附分子、γ-氨基丁酸A型受体β1亚基、钙粘蛋白16、免疫球蛋白超家族成员3、桥粒芯胶粘蛋白3、血红蛋白化和红系细胞扩增调节剂、钾电压门控通道相互作用蛋白1、CD70分子、GDNF家族受体α1、Crumbs细胞极性复合物组分3、紧密连接蛋白1、新型转录本、钠电压门控通道α亚基5、成纤维细胞生长因子受体4、钾双孔结构域通道亚家族K成员3、dysferlin、肝配蛋白A1、钾内向整流通道亚家族J成员16、膜关联环-CH-型指1、突触结合蛋白样1、钙同线蛋白2、整联蛋白亚基β4、囊泡关联膜蛋白8、G蛋白偶联受体C类5组成员C、CD24分子、钙粘蛋白EGF LAG七次跨膜G型受体2、钙粘蛋白8、谷氨酸受体相互作用蛋白1、成束蛋白肌动蛋白结合蛋白、F11受体、细胞粘附分子1、钙粘蛋白6、凝血因子II凝血酶受体样2、含有LY6/PLAUR结构域的蛋白1、溶质载体家族6成员6、桥粒芯糖蛋白2、粘附G蛋白偶联受体G1、缩胆囊素A受体、催产素受体、整联蛋白亚基α3、具有Ig样结构域2的粘附分子、钙粘蛋白EGF LAG七次跨膜G型受体1和EPH受体B2，由此获得TAFMSC。
在一些实例中，选择TAF MSC可以包含选择标志物表达减弱的TAF MSC，该标志物选自由以下组成的组：IL13RA2、CLU、TMEM119、CEMIP、LSP1、GPNMB、FAP、CRLF1、MME、CLMP、BGN、DDR2。去除颗粒物可以包含过滤和离心TAF。对纯化的TAF细胞进行粘附选择可以包含将纯化的TAF细胞粘附到涂覆有玻连蛋白基底物的表面上。选择步骤可以使用荧光激活细胞分选术(FACS)执行。选择步骤可以用针对任何标志物或表面标志物的抗体执行。选择步骤可以包含从A组表面标志物中选择表达至少两种标志物的TAF MSC。选择步骤可以包含从A组表面标志物中选择表达至少三种标志物的TAF MSC。选择步骤可以包含从A组表面标志物中选择表达至少四种标志物的TAF MSC。选择步骤可以包含多个分选步骤，每个分选步骤包含根据一组由各自TAF MSC表达或不表达的标志物将TAF MSC引导到第一输出组或第二输出组中。
在一些实例中，选择步骤可以包含将表达A组表面标志物的TAF MSC引导到第一输出组的第一分选步骤和将表达第二组标志物的来自第一输出组的TAF MSC引导到第二输出组的第二分选步骤。
在某些实例中，一种用于从足月羊水获得足月羊水肺间充质干细胞(TAF肺MSC)的方法可以包含：
提供足月羊水(TAF)；
从TAF中去除颗粒物质以获得纯化的TAF细胞；
对纯化的TAF细胞进行粘附选择以获得TAF粘附细胞；
传代TAF粘附细胞以获得包含TAF肺MSC的细胞群；以及
从群中选择TAF肺MSC作为表达至少一种B组表面标志物的细胞，该至少一种B组表面标志物选自由以下组成的组：PCDH19、DDR1、MME、IFITM10、BGN、NOTCH3、SULF1、TNFSF18、BDKRB1、FLT1、PDGFRA、TNFSF4、UNC5B、FAP、CASP1、CD248、DDR2、PCDH18、LRRC38和CRLF1，由此获得TAF肺间充质干细胞。
选择TAF肺MSC可以包含排除表达选自由CD24、ITGB4、TNFSF10、GFRA1、CD74、FGFR4、HAVCR1和OSCAR组成的组的标志物的MSC。选择步骤可以包含从B组表面标志物中选择表达至少两种表面标志物的TAF MSC。选择步骤可以包含从B组表面标志物中选择表达至少三种表面标志物的TAF MSC。选择步骤可以包含从B组表面标志物中选择表达至少四种表面标志物的TAF MSC。选择步骤可以包含选择表达选自由CD248、DDR1和LRRC38组成的组的表面标志物的TAF MSC。选择步骤可以包含选择表达CD248的TAF MSC。选择步骤可以包含选择表达CD248与选自由DDR1和LRRC38组成的组的标志物的组合的TAF MSC。选择步骤可以包含选择表达CD248、DDR1和LRRC38的TAF MSC。在一些实例中，分离的足月羊水(TAF)间充质干细胞可以通过上述方法获得，所述细胞表达至少一种A组表面标志物。
在一些实例中，一种分离的足月羊水(TAF)间充质干细胞群可表达至少一种A组表面标志物，该至少一种A组表面标志物选自由以下组成的组：TBC1结构域家族成员3K、同种异体移植炎症因子1样、钙粘蛋白相关家族成员1、钠/钾转运ATP酶相互作用蛋白4、ATP结合盒亚家族B成员1、质膜囊泡关联蛋白、间皮素、L1细胞粘附分子、甲型肝炎病毒细胞受体1、mal,T细胞分化蛋白2(基因/假基因)、SLAM家族成员7、双C2结构域β、内皮细胞粘附分子、γ-氨基丁酸A型受体β1亚基、钙粘蛋白16、免疫球蛋白超家族成员3、桥粒芯胶粘蛋白3、血红蛋白化和红系细胞扩增调节剂、钾电压门控通道相互作用蛋白1、CD70分子、GDNF家族受体α1、Crumbs细胞极性复合物组分3、紧密连接蛋白1、新型转录本、钠电压门控通道α亚基5、成纤维细胞生长因子受体4、钾双孔结构域通道亚家族K成员3、dysferlin、肝配蛋白A1、钾内向整流通道亚家族J成员16、膜关联环-CH-型指1、突触结合蛋白样1、钙同线蛋白2、整联蛋白亚基β4、囊泡关联膜蛋白8、G蛋白偶联受体C类5组成员C、CD24分子、钙粘蛋白EGF LAG七次跨膜G型受体2、钙粘蛋白8、谷氨酸受体相互作用蛋白1、成束蛋白肌动蛋白结合蛋白、F11受体、细胞粘附分子1、钙粘蛋白6、凝血因子II凝血酶受体样2、含有LY6/PLAUR结构域的蛋白1、溶质载体家族6成员6、桥粒芯糖蛋白2、粘附G蛋白偶联受体G1、缩胆囊素A受体、催产素受体、整联蛋白亚基α3、具有Ig样结构域2的粘附分子、钙粘蛋白EGF LAG七次跨膜G型受体1和EPH受体B2。
在一些实例中，一种组合物可以包含分离的上述足月羊水(TAF)间充质干细胞群和TAF MSC的药学上可接受的载体。可通过上述方法获得的分离的足月羊水(TAF)间充质肺干细胞可以表达至少一种B组表面标志物，该至少一种B组表面标志物选自由以下组成的组：PCDH19、DDR1、MME、IFITM10、BGN、NOTCH3、SULF1、TNFSF18、BDKRB1、FLT1、PDGFRA、TNFSF4、UNC5B、FAP、CASP1、CD248、DDR2、PCDH18和CRLF1。在某些实例中，一种分离的足月羊水(TAF)肺间充质干细胞群可以表达至少一种B组表面标志物。
在一些实例中，一种用于从足月羊水获得足月羊水肾间充质干细胞(TAF肾MSC)的方法可以包含：
提供足月羊水(TAF)；
从TAF中去除颗粒物质以获得纯化的TAF细胞；
对纯化的TAF细胞进行粘附选择以获得TAF粘附细胞；
传代TAF粘附细胞以获得包含TAF肾MSC的细胞群；以及
从群中选择TAF肾MSC作为表达至少一种C组表面标志物的细胞，该至少一种C组表面标志物选自由以下组成的组：HAVCR1、CD24、CLDN6、ABCB1、SHISA9、CRB3、AC118754.1、ITGB6、CDH1、LSR、EPCAM、AJAP1、ANO9、CLDN7、EFNA1、MAL2、F11R、L1CAM、GFRA1、IGSF3、TNF、MMP7、FOLR1、TGFA、C3、TNFSF10、PDGFB和WWC1，由此获得TAF肾MSC。
在某些实例中，一种分离的足月羊水(TAF)肾间充质干细胞(TAF肾MSC)群可以表达至少一种C组表面标志物，该至少一种C组表面标志物选自由以下组成的组：HAVCR1、CD24、CLDN6、ABCB1、SHISA9、CRB3、AC118754.1、ITGB6、CDH1、LSR、EPCAM、AJAP1、ANO9、CLDN7、EFNA1、MAL2、F11R、L1CAM、GFRA1、IGSF3、TNF、MMP7、FOLR1、TGFA、C3、TNFSF10、PDGFB和WWC1。
一种组合物可以包含如上所述分离的足月羊水(TAF)肾间充质干细胞群。
在一些实例中，一种用于从足月羊水获得足月羊水皮肤间充质干细胞(TAF皮肤MSC)的方法可以包含：
提供足月羊水(TAF)；
从TAF中去除颗粒物质以获得纯化的TAF细胞；
对纯化的TAF细胞进行粘附选择以获得TAF粘附细胞；
传代TAF粘附细胞以获得包含TAF皮肤MSC的细胞群；以及
从群中选择TAF皮肤MSC作为表达至少一种D组表面标志物的细胞，该至少一种D组表面标志物选自由以下组成的组：TNFSF18、PCDH19、NCAM2、TNFSF4、CD248、DDR2、HTR2B、PCDH18、SULF1、MME、ADGRA2、DCSTAMP、PDGFRA、UNC5B、SCUBE3、CEMIP、BDKRB1、FLT1、BDKRB2、FAP、CASP1和SRPX2；以及
获得TAF皮肤MSC。
在某些实例中，一种分离的足月羊水(TAF)皮肤间充质干细胞(皮肤MSC)群可以表达至少一种D组表面标志物，该至少一种D组表面标志物选自由以下组成的组：TNFSF18、PCDH19、NCAM2、TNFSF4、CD248、DDR2、HTR2B、PCDH18、SULF1、MME、ADGRA2、DCSTAMP、PDGFRA、UNC5B、SCUBE3、CEMIP、BDKRB1、FLT1、BDKRB2、FAP、CASP1和SRPX2。一种组合物可以包含上述分离的足月羊水(TAF)皮肤间充质干细胞群和TAF皮肤MSC的药学上可接受的载体。
在一些实例中，一种用于从足月羊水获得足月羊水神经间充质干细胞(TAF神经MSC)的方法可以包含：
提供足月羊水(TAF)；
从TAF中去除颗粒物质以获得纯化的TAF细胞；
对纯化的TAF细胞进行粘附选择以获得TAF粘附细胞；
传代TAF粘附细胞以获得包含TAF神经MSC的细胞群；以及
从群中选择TAF神经MSC作为表达至少一种E组表面标志物的细胞，该至少一种E组表面标志物选自由以下组成的组：HAVCR1、ACKR3、OSCAR、C3、SIRPB1、SLC6A6、CCKAR、TNFSF10、CLSTN2、TENM2、SFRP1、PIK3IP1、SCNN1D、CLDN11、ALDH3B1和ITGB4，由此获得TAF神经MSC。
在一些实例中，一种分离的足月羊水(TAF)神经间充质干细胞(TAF神经MSC)群可表达至少一种E组表面标志物，该至少一种E组表面标志物选自由以下组成的组：HAVCR1、ACKR3、OSCAR、C3、SIRPB1、SLC6A6、CCKAR、TNFSF10、CLSTN2、TENM2、SFRP1、PIK3IP1、SCNN1D、CLDN11、ALDH3B1和ITGB4。一种组合物可以包含上述分离的足月羊水(TAF)神经间充质干细胞群和TAF神经MSC的药学上可接受的载体。
在某些方面，本公开提供了用于分离足月羊水(TAF)间充质干细胞的方法和设备以及包括TAF间充质干细胞的组合物，这些TAF间充质干细胞包含前述说明书和/或附图的一个或多个特征。
附图说明
图1是示出MSC亚群的纯化、培养和选择步骤的流程图。
图2是绘示收集羊水的方法的图。
图3是根据实例的用于过滤羊水的设备的透视图的示意图。
图4是根据实例的用于过滤羊水的设备的截面侧视图的示意图。
图5是根据实例的用于过滤羊水的设备的截面侧视图的示意图。
图6是根据实例的用于过滤羊水的设备的截面侧视图的示意图。
图7是根据实例的用于过滤羊水的设备的截面侧视图的示意图。
图8是根据实例的用于过滤羊水的设备的截面侧视图的示意图。
图9是根据实例的用于过滤羊水的设备的截面侧视图的示意图。
图10是根据实例的用于过滤羊水的设备的截面侧视图的示意图。
图11是根据实例的用于过滤羊水的设备的截面侧视图的示意图。
图12a是根据实例的用于过滤羊水的设备的截面侧视图的示意图。
图12b是根据实例的用于过滤羊水的设备沿图10a中的截面A-A的示意图。
图13是根据实例的过滤羊水的方法的流程图。
图14是示出根据实例计算MSC组织特异性评分的步骤的流程图。
图15是示出代表5％和15％阈值的MSC组织特异性评分的实例图。
图16是示出组织优先化数据和组织远端数据，包括大于15％百分位的组织优先化数据的实例图。
图17A至图17D示出了证明使用TAF肺MSC治疗患有诱导性肺纤维化的大鼠的效果的实例研究的结果。
具体实施方式
纯化、培养和选择具有新生儿质量和成体组织特异性的MSC亚群的方法总结在图1中并在下面详细描述。本文公开的实例涉及用于收集、纯化、分离、扩增、分化和成熟羊水源性细胞的设备和方法。本文公开的实例不限于收集某种类型的羊膜源性细胞，并且本文公开的技术广泛适用于不同的细胞和组织。
羊水收集
可以根据美国专利申请号14/776,499(对应于US2016/0030489)中描述的方法收集羊水以产生足月羊水(TAF)，其全部内容通过引用并入本文。具体地，图2是根据本发明的示范性实例的羊水收集方法300的实例的框图。应当理解，方法300可以包括任何数量的附加或可替代的任务。图3中所示的任务不需要以所绘示的顺序执行，并且方法300可以合并到具有本文未详细描述的附加功能的更全面的工序或过程中。
如图2所示，方法300可以包括，例如在剖宫产期间在孕妇的子宫壁301上作一个切口。步骤301可以用标准医师的手术刀执行。又如图2所示，方法300可包括通过步骤301中所作的子宫壁上的切口插入羊水收集器302。方法300还包括使用步骤302的羊水收集器穿透羊膜303。步骤303还可以包括穿透绒毛膜。在一个方面，尖端插入到10cm的深度。在一些实例中，尖端插入到约3cm至约30cm的深度。在一些实例中，尖端插入到约4cm、约5cm、约6cm、约7cm、约8cm、约9cm、约10cm、约11cm、约12cm、约13cm、约14cm、约15cm、约16cm、约17cm、约18cm、约19cm、约20cm、约21cm、约22cm、约23cm、约24cm、约25cm、约26cm、约27cm、约28cm或约29cm的深度。
方法300还包括使用步骤302的羊水收集器从羊膜囊收集羊水304。步骤304可以包括启动虹吸管以如通过打开羊水收集器的入口阀将羊水转移到羊水收集器的收集室。步骤304还可以包括将羊水收集器的收集室放置在羊水收集器的入口下方。步骤304还可以包括将负压源联接到羊水收集器的出口以启动羊水的转移。步骤304可以包括重新安置羊水收集器的入口以基本上收回所有可用的羊水。
最后，方法300包括从羊膜囊中移除羊水收集器905。步骤905可以包括关闭羊水收集器的入口阀。在一个实例中，在所收集的物质中看不到血液。步骤905还可以包括清空收集系统供进一步使用/处理，并对整个装置的外部进行消毒。在一个实例中，使用70％乙醇对外部进行消毒，以便如在超净工作台机构中可以在例如根据本发明的细胞物质的分离和流体存储的任何后处理步骤中保持无菌性。
在一个实例中，羊水收集工序在不到一分钟内完成。在一个实例中，羊水收集工序在1至2分钟内完成。在一个实例中，羊水收集工序在不超过3分钟内完成。在一个实例中，相比于剖宫产手术的标准操作规程，该方法，例如通过防止羊水溢出到手术伤口中，从而改善可视性和物理接触而得到简化。在一个实例中，胎儿皮肤不受装置尖端的影响。
纯化
足月羊水(TAF)通过过滤足月羊水以去除胎儿皮脂而得到纯化。尽管在本文和本公开的其它地方采用了术语“足月羊水”，但是应当理解，本公开的方法、过程和装置可以应用于所有羊水，而不仅仅是足月羊水。足月羊水可以是使用例如基于闭合导管的系统在足月剖宫产分娩时所收集的羊水。出于本说明书的目的，“足月羊水”可以是在37个完整孕周或更晚期后的计划剖宫产所收集的羊水，或在接近足月，例如在36个完整孕周后的计划剖宫产所收集的羊水。优选地，在37个孕周或更晚的计划剖宫产时取足月羊水。
图3是根据一个实例的用于过滤羊水的设备100的示意图。羊水含有源自于胎儿或羊膜囊的羊膜细胞，如间充质干细胞。羊水还含有其它从皮肤上脱落的物质，如毛发和胎儿皮脂。羊膜细胞以外的物质在此被称为颗粒物，并且还可以包含胎粪、血块等。颗粒物可以被认为是任何大于20μm的物质。出于过滤的目的，将任何大于30μm或甚至50μm的物质作为颗粒物处理可能是特别有利的。任选地，任何大于靶羊膜细胞的物质都可以作为颗粒物处理。羊水因此通常含有羊膜细胞和颗粒物的混合物。设备100包含用于从羊水中过滤颗粒物的过滤器101和封闭过滤器101的腔室102。腔室102包含流体入口103和流体出口104。封闭过滤器101的腔室102应被解释为过滤器101通过腔室关于腔室102周围的环境隔离，使得腔室102中的羊水与所述环境之间没有流体连通。在图3的实例中，通过腔室102的流体连通因此经由流体入口103和流体出口104控制。过滤器101在流体入口103和流体出口104之间连接到腔室102的内部。图12示出了圆形腔室102和过滤器101的如图12所示的截面A-A的实例。然而，应当理解，腔室102和过滤器101可以具有不同的形状，以针对不同的应用进行优化。设备100包含入口连接器105，该入口连接器被布置以在流体入口103和羊水样品源201(如图4所示)之间形成密封连接。图4示出了这种源201的示意性实例。使入口连接器105连接到流体入口103并且被配置成在流体入口103和羊水源201之间直接提供密封连接，最大限度地减少对污染物的暴露，并有效地对羊水进行无菌处理。这有利于获得能够以改进的质量标准进行过滤后处理的羊膜细胞。因此，促进了无菌药物生产过程。可以促进例如表面活性剂分子的制备。设备100用于改善羊膜干细胞的功能，如移植后所改善的植入期。通过将过滤器101封闭在腔室102中，并布置入口连接器105以在腔室102的流体入口103和羊水样品源201之间形成密封连接来实现此类改进的过程。因此降低了羊膜干细胞暴露于如细菌和病毒等污染物的风险。暴露于氧也被最大限度地减少，这减少了可能对干细胞功能产生负面影响的氧自由基的形成。
图3示出了入口连接器105包含在第一密封连接件114处连接到流体入口103的管105的实例。入口连接器105可以通过力配合连接、粘合剂、夹具或其它固定元件与流体入口103形成密封连接。在另一实例中，如图4中示意性所示，入口连接器105是流体入口103的连续延伸部，无需单独的固定元件，而是例如通过模制或其它材料成型技术形成为单件。图3和图4示出了第二连接器115，其被配置成与样品源201，如容纳羊水的容器或袋201形成密封连接。第二连接器115可以包含可释放的力配合连接、夹具或其组合或其它可释放的固定元件。腔室102、过滤器101、流体入口103、流体出口104和入口连接器105可以在无菌包装中作为套件，例如一次性套件提供。这种套件，即设备100，因此提供了过滤和获得羊膜干细胞的便利和改进的过程。因此，在使用中，当羊水从流体入口103流到流体出口104时，羊水通过过滤器101。颗粒物因此沉积在过滤器101上并且含有羊膜细胞的羊水流经流体出口104。如图12中的实例所示，过滤器101可以围绕其边缘116连接到腔室102的内壁113。这避免了羊水未经过滤就从入口103流到出口104。过滤器101可以被张紧或以其它方式支撑，从而避免过滤器101在腔室102中的折叠或弯曲。这在过滤器101的整个区域上保持了限定的网目尺寸或孔径，并因此保持了限定的过滤特性。保持限定的网目尺寸或孔径也降低了堵塞过滤器101的风险。从而可以改善长期性能。
设备100可以包含出口连接器106，以在出口和羊膜细胞接收装置202，如设备100下游的离心机或其它羊膜细胞处理装备之间形成密封连接。图4示出了这种装置202的示意性实例。这最大限度地减少对污染物的暴露，并能够在过滤后的处理步骤中对羊水进行有效的无菌处理。图3示出了出口连接器106包含在第一密封连接117处连接到流体出口104的管106的实例。出口连接器106可以通过力配合连接、粘合剂、夹具或其它固定元件与流体出口104形成密封连接。在另一实例中，如图4中示意性所示，出口连接器106是流体出口104的连续延伸部，无需单独的固定元件，而是例如通过模制或其它材料成型技术形成为单件。图3和图4示出了第二连接器118，其被配置成与设备100下游的羊膜细胞处理装置，如离心机202形成密封连接。第二连接器118可以包含力配合连接、夹具、其组合或其它可释放的固定元件。因此，第二连接器118和例如离心机202之间的连接可以重复地连接和断开，并且也可以重新密封以在这种工序中保持密封连接。腔室102、过滤器101、流体入口103、流体出口104、入口连接器105和出口连接器106可以在无菌包装中作为套件，例如一次性套件提供。这种套件，即设备100，提供了过滤和处理羊膜干细胞的便利和改进的过程。设备100可以包含泵122、123，其被布置以对羊水加压使羊水从流体入口103流到流体出口104。这使得羊水的过滤更加有效。可以在较短的时间内过滤较大的体积的羊水。
图6示出了泵122连接到流体出口104以在所示箭头的方向上通过过滤器101抽吸羊水的实例。泵122可以布置在流体入口103处以推动羊水通过过滤器101。泵122可以是与流体入口103、流体出口104、入口连接器105或出口连接器106集成的小型手动操作泵。
图7示出了泵123被布置以对羊水加压使羊水从流体入口103流到流体出口104的另一实例，下面将更详细地进行描述。腔室102可以包含布置在流体入口103和流体出口104之间的导管119。腔室102中的压力可以响应于通过导管119的流体和/或气体连通而变化。通过过滤器101的羊水的流量因此可以根据应用进行优化，例如可以通过经由导管119改变腔室102中的压力来增加或减少通过过滤器101的流速。
图5示出了导管119与腔室102连通的实例。接入端口120，如连接器或阀元件，可以被致动以让流体或气体从腔室102排出，和/或注入到腔室102中，以影响其中的压力。在图5中，导管119布置在流体出口103和过滤器101之间，但在另一实例中，导管119可以布置在流体入口103和过滤器101之间。如下所述的图5示出了与腔室102连通的导管119的进一步的实例。泵123可以与导管119连通布置，如图7举例所示。这有利于优化腔室102中的流量和关联的过滤过程。在图7的实例中，导管119与腔室102的上游腔体108和腔室102的下游腔体109可变连通，即过滤器101可以被布置以将腔室102分成上游腔体108和下游腔体109。在图7中，导管119同时连接到上游腔体108和下游腔体109。泵123被布置以对羊水加压使羊水从上游腔体108流到下游腔体109，或从下游腔体109流到上游腔体108。后一种情况在期望瞬时反向流动例如以清除过滤器101的堵塞或阻塞的情况下可能是有利的。在这种情况下，如图7中示意性所示的阀120、120'、121、121'被操作以提供期望的流动方向。例如，对于反向流动，阀120和阀121'可以是打开的而阀120'和阀121可以是关闭的。在正常过滤模式下，阀121、121'可以是打开的而阀120、120'可以是关闭的。在这种过滤模式下，也可以通过打开阀120'对上游腔体108进行加压。
过滤器101可以包含第一过滤元件101a和布置在第一过滤元件101a和流体出口104之间的第二过滤元件101b，如图8示意性所示。第二过滤元件101b的网目尺寸或孔径可以小于第一过滤元件101a的网目尺寸或孔径。这能够有效地过滤尺寸逐渐变小的颗粒物。因此降低了过滤器阻塞的风险。这让羊水的过滤过程更加可靠和稳健。还提供了一种改进的过滤含有更大粒径范围的颗粒物的羊水的方法。进一步的，由于干细胞不会在堵塞的孔中丢失，因此可以获得羊水中更大比例的干细胞。虽然图8中示出了两个过滤元件101a、101b，但是应当理解，在从流体入口103到流体出口104的流体流动方向上，任意多个过滤元件可以以逐渐减小的网目尺寸或孔径顺序布置在腔室102中，以有效地过滤尺寸逐渐减小的颗粒物。第一过滤元件101a和第二过滤元件101b可以沿着从流体入口103到流体出口104的羊水流动方向隔开一定距离(d)，如在图8的实例中示意性所示。羊水在第一过滤元件101a和第二过滤元件101b之间的运动，其在一些情况下可能涉及浊流，可以进一步降低不希望发生的颗粒在第一和第二过滤元件101a、101b上堆积的风险。
过滤器101可以包含网目尺寸在20至2000μm范围内的网。在另一实例中，过滤器101包含网目尺寸在100至500μm范围内的网。这能够特别有效地从羊水中过滤颗粒物。再次转向图8，第一过滤元件101a可以包含网目尺寸在500至1000μm范围内的网，并且第二过滤元件101b可以包含网目尺寸在30至150μm范围内的网。第一过滤元件101a因此可以去除较大的碎片，接着用第二过滤元件101b去除较小的颗粒。由于堵塞的风险被进一步降低，因此这能够对不同尺寸的颗粒物进行特别有效的过滤，并在更长的时间周期内对体积增加的颗粒物进行可靠的过滤。如前所述，任何多个过滤元件可以连续地布置在腔室102中。
图9示出了布置在腔室102中的三个过滤元件101a、101b、101c。在一些实例中，布置在腔室102中最下游的网目尺寸或孔径最小的过滤元件，如图6中的过滤元件101b和图9中的过滤元件101c，可以具有特定的网目尺寸或孔径，以便只有单个羊膜细胞或小于10个细胞的羊膜细胞团块通过过滤器101。在这样的实例中，最小的网目尺寸或孔径可以是大约30μm。过滤器101可以包含网，如尼龙网。过滤器101可以包含多孔材料，该多孔材料在羊水从流体入口103到流体出口104的流动方向上通过过滤器101的孔径可变。即较大的碎片在最接近入口103的过滤器101的表面处被去除，而较小尺寸的颗粒被去除到过滤器的较深处，因为羊水沿着朝向出口104的方向流过过滤器101并且孔径变小。如前所述，腔室102可以包含上游腔体108和下游腔体109。上游腔体108和下游腔体109可以形成为一体件以例如通过模制工艺中或其它材料成型技术形成腔室102。上游腔体108和下游腔体109可以形成为单独的单元，然后这些单元例如通过粘合剂或焊接彼此连接以形成密封连接。过滤器101可以用这种焊接工艺或通过上述粘合剂同时或相继连接。
上游腔体108和下游腔体109可以在连接元件110处可释放地彼此连接，以形成密封连接，如图9中示意性所示。这能够打开腔室102，例如以更换过滤器101。过滤器101因此可以可释放地连接到腔室102，例如，在图7中，过滤元件101a、101b、101c可以可释放地连接到腔室102。这能够针对不同的应用进行便利的定制，因为孔径或网目尺寸不同的过滤元件101a、101b、101c或不同数量的这种过滤元件可以安装在腔室102中。
连接元件110被配置成形成上游腔体108和下游腔体109的密封连接，并且可以包含围绕上游腔体108和下游腔体109的边缘延伸的环形垫圈。过滤器101可以包含由不同数量的过滤元件101a、101b、101c构成的滤筒，这些过滤元件具有可以针对特定羊水样品定制的不同孔径。例如，羊水浊度和乳浊程度(在颗粒大小和不透明性两方面的胎儿皮脂水平)的评价可以作为使用适当过滤器滤筒的指标。羊水样品与哪个样品进行比较的附随图表可以指示使用哪个过滤器滤筒。上游腔体108和/或下游腔体109可以是漏斗形的。图3至图9示出了上游腔体108和下游腔体109都是漏斗形的实例。图11示出了仅下游腔体109为漏斗形的实例。具有漏斗形状对于引导羊水沿期望的对称矢量流过过滤器101和设备100可能是有利的。上游腔体108和/或下游腔体109可以包含腔室壁111a、111b，这些腔室壁基本上与过滤器101平行布置，即垂直于羊水从流体入口103到流体出口104的流动方向。图10示出了上游腔体108和下游腔体109的腔室壁111a、111b基本上与过滤器101平行布置的实例。这最大限度地减小腔室102内的空间，同时保持足够的过滤面积，以最大限度地降低引入例如可能干扰表面活性剂分子的空气的风险，降低感染风险并减少羊膜细胞中活性氧的有害形成。腔室102和/或入口连接器105和/或出口连接器106可以由无邻苯二甲酸酯PVC材料形成。这提供了一种适于与如羊膜细胞等药物起始材料接触的设备。
设备100可以包含从腔室102的内壁113延伸布置的突起112。图11和图12分别以截面侧视图和通过截面A-A的方式示出了此类突起112的实例。突起112为过滤器101提供支撑，以防过滤器101开始向内壁113弯曲和折叠。因此，在这种情况下，通过过滤器101的网或孔的流动仍然是可能的，因为过滤器101可以由与内壁113相距一定距离的突起112支撑，即突起112能够进一步限制节流的风险并且提供高效、稳健并可靠的过滤。
图13是过滤含有颗粒物和羊膜细胞的羊水的方法300的流程图。方法300包含在腔室102的流体入口103和羊水样品源201之间形成密封连接301。方法300包含通过提供羊水从流体入口103到腔室102的流体出口104的流动，使羊水通过302封闭在腔室102中的过滤器101。颗粒物由此沉积在过滤器101上，并且含有羊膜细胞的羊水流经出口104。方法300因此提供了如以上关于设备100和图3至图12所述的有利益处。方法300提供了羊水的有效和无菌过滤，以获得高质量的羊膜细胞样品。
在一个实施例中，从TAF中去除颗粒物质以获得纯化的TAF细胞可以通过应用本领域任何已知的方法如过滤、离心等来完成。TAF可以通过孔径等于或大于20μm的过滤器进行过滤。过滤器可以由任何合成材料制成，包括但不限于醋酸纤维素、硝酸纤维素(火棉胶)、聚酰胺(尼龙)、聚碳酸酯、聚丙烯和聚四氟乙烯(特氟隆)。在一个实施例中，去除颗粒物质通过应用设备100来完成。
粘附选择
本领域技术人员已知的各种术语已经并将在整个说明书中使用，例如，在细胞表面标志物的上下文中的术语“表达(express、expression和/或expressing)”是指细胞表面上特定标志物的存在，所述表面标志物已经由细胞产生。表面标志物表达可以用于在不同细胞群之间进行选择，例如，表面标志物表达的正向选择指示选择相比于另一细胞群更强表达特定表面标志物的细胞群。相反地，细胞表面标志物表达的反向选择指示选择相比于另一细胞群更弱表达特定表面标志物的细胞群。
如上文和说明书中其它地方所述，TAF含有各种祖细胞类型。在某些实例中，特定的祖细胞类型可以经由粘附选择进行分离和繁殖。例如，玻连蛋白底物，Synthemax(默克公司(Merck)，
Figure BDA0003671438180000151
II-SC底物，CLS3535-1EA)可用作涂层为干细胞培养创造更类似于体内的环境，由此限制TAF源性祖细胞的成熟并保持可塑性。Synthemax是无动物成分的、合成的柔性玻连蛋白基肽底物，用于人祖细胞/干细胞和其它成体干细胞类型的血清或无血清扩增。本领域技术人员将理解，玻连蛋白基肽底物可以包括玻连蛋白的一部分，如玻连蛋白的特定肽序列。可替换地，可以使用完整的玻连蛋白。Synthemax玻连蛋白底物为细胞培养中常用的和本领域已知的生物涂层和/或饲养细胞层提供了一种合成的、无异源替代品。简而言之，标准组织培养处理的烧瓶可以以10μg/mL涂覆有约0.2mLSynthemax/cm2，产生2μg/cm2的表面密度，并且在37℃下孵育约1小时、1.5小时、2小时、4小时、8小时或超过8小时，或在室温下孵育约2小时、1小时、4小时、8小时或超过8小时，其中剩余的溶液任选地被去除和替换。在某些实例中，Synthemax可以以约以下的表面密度涂覆：1至5μg/cm2，如2μg/cm2、0.1至10μg/cm2、0.5至4μg/cm2、1至3μg/cm2或约1.5至2.5μg/cm2。
在其它实施例中，可以使用涂覆有例如胶原、纤连蛋白的表面进行粘附选择。可替换地，可使用包含组织培养处理的塑料的未涂覆表面进行粘附选择。
从TAF中纯化的细胞可以温和地重悬于预温热的无异源细胞培养基中，然后将细胞悬液添加到Synthemax涂覆的烧瓶中。培养基可以在添加到烧瓶中后的不同时间更换一次，例如在约2小时至168小时、12小时至96小时、24小时至72小时、36小时至60小时、42小时至56小时或48小时后，随后改为约：每天、每隔一天、每三天、每五天、每周一次、每两周一次或约每两周不到一次。通过重复去除用过的培养基，可以去除未附着的细胞，由此通过其附着于经Synthemax处理的表面的亲和力来选择MSC。可以将细胞培养一段时间，如约4天、7天、10天、11天、12天、13天、14天、18天、21天、28天或超过21天。任选地，在一些实例中，细胞可在缺氧条件下培养，缺氧启动可在扩增期间改变细胞代谢，增加对氧化应激的抗性，由此改善所移植的MSC的植入、缺血微环境中的存活和血管生成潜力。培养后，可以将已经形成的P0菌落(菌落形成单位-CFU)分离并汇集。汇集后，剩余的细胞可能主要是非组织特异性MSC。在某些实例中，可将汇集的P0细胞温和地重悬于预温热的无异源细胞培养基中，并再涂布于未经Synthemax处理的组织培养瓶中进行传代。汇集的细胞可以以介于约以下密度之间的接种密度进行接种：100至10000个细胞/cm2、500至8000个细胞/cm2、1000至5000个细胞/cm2或约2000至4000个细胞/cm2。培养基可以大约每1天、2天、4天或超过4天更换一次。一段时间后，如约2天、4天、7天或超过7天，细胞可以被解离并收获。如下所述，可以实现进一步的选择性MSC分离。
标志物的鉴定
当通过RNAseq比较源自脂肪组织或骨髓的TAF-MSC和成体型MSC的基因表达谱时，TAF-MSC倾向于表达较多成体型MSC中存在的一些基因中，而较少表达其它基因。阳性和阴性TAF-MSC特异性新生儿细胞表面标志物的鉴定能够使用例如抗体和适体等配体或其它选择技术从那些已进一步分化且作为祖细胞不太重要的MSC中分选具有新生儿质量的MSC。
可以经由一种利用组织特异性评分算法的生物信息学方法来阐明区分组织相关细胞与其它MSC的细胞表面标志物。MSC组织特异性评分算法的实例示于图14中。组织特异性可以测定为两种组分的组合：“组织转录相似性”也称为相似性评分和“组织特异性基因表达程序”也称为基因集评分。在某些实例中，相似性评分可以是与每个MSC组织参考样品(例如胎肺MSC样品)的平均斯皮尔曼(Average Spearman)相关性。在实例中，基因集评分可以是组织特异性基因集中基因的平均表达水平。如图14所示，在某些实例中，在使用Z变换将相似性和基因集评分归一化以将为实数或复数序列的输入值转换为复数频域表示，然后将其组合，为每个评分分配相等的权重并使用Z变换变换组合值后，所得的输出是MSC组织特异性评分。MSC组织特异性评分通过测定有多少一种样品相比于平均输入样品或多或少对给定的组织具有特异性的标准偏差来测定输入样品之间的相对组织特异性。例如，MSC组织特异性评分可以指示还有多少克隆样品似乎具有组织特异性表型，如肺表型。这种方法能够使用正态分布函数识别最高X％百分位评分，从而有效地鉴定对相关组织最具组织特异性的最高X％的克隆。
在一个实例中，对于特定的组织，组织优先化克隆可以被定义为任何属于最高X％百分位评分的克隆，其中X是在一定范围内的任何百分比，该范围的下限从约0.1至25，如约1、5、10、15和20，以及上限从约30至75，如约：35、40、45、50、55、60、65或70。TAF-MSC组织特异性优先化结果的实例示于图15中，其中15％和5％的阈值可见。使组织特异性克隆优先化，然后可以鉴定候选表面标志物基因。对于每个组织，可定义两个组：组织优先化组和组织远端组。可以使用合适的分析程序进行该测定，例如来自Bioconductor.org的DEseq2。组织优先化组可以包括评分在最高15％百分位的克隆。组织远端组可以包括评分在最低Y％百分位的克隆，其中Y是在一定范围内的任何百分比，该范围的下限从约25至70，如约：30、35、40、45、50、55、60或65以及上限从75至99.9，如约：80、85、90、95或99。图16示出了对肾组织进行此类分析的实例。接下来，可以鉴定组织优先化组和组织远端组之间差异表达的基因。最后，差异表达结果可以用表面标志物基因信息进行注释。
在某些实例中，为了鉴定组织特异性细胞表面标志物，表面标志物基因具有多于Z倍的增加，其中Z倍的增加至少约为：相比于普通克隆，优先化克隆表达的1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍、8倍、10倍、12倍、15倍甚至更多倍(log2FoldChange)的增加并且可以选择大于约500，如大于约：1000、1500、2000、2500、3000、5000或甚至更大的每千碱基百万转录本(Transcripts Per Kilobase Million，TPM)，以给出排名在前的组织特异性标志物候选物，如大约前：5、10、20、30、40、50、60、70、100或更高，例如那些如下表3至表6中所示并且在下面更详细描述的标志物。合适的log2FoldChange和TPM值甚至可能会进一步变化，这取决于组织类型特异性并取决于良好标志物的丰度/缺乏。
应用上述组织特异性算法鉴定表面标志物，在粘附选择和传代后，TAF-MSC可表达各种如下表1所示的所鉴定的表面标志物，指示非组织特异性TAF-MSC。本领域技术人员将理解，此类表面标志物可以以各种表面密度存在，并且与其它细胞类型相比可以上调或下调。因此，此类表面标志物可用于鉴定和分离特定的细胞类型。在一些情况下，相比于其它MSC细胞类型，特别是相比于源自骨髓或脂肪组织的成体MSC，下表1中所列的表面标志物对于TAF MSC的平均高表达水平可能至少高8倍。用于生成表1的阈值如下所示：X选择为15％，Y选择为50％，Z选择为8倍并且TPM选择为大于3000。本领域技术人员将理解，表1和本文所有表中使用的编号仅用于表示所鉴定的标志物的总数，而不是指示一种特定标志物相比于另一标志物表达更强和/或更优选。
1.TBC1D3K TBC1结构域家族成员3K
2.AIF1L 同种异体移植炎症因子1样
3.CDHR1 钙粘蛋白相关家族成员1
4.NKAIN4 钠/钾转运ATP酶相互作用蛋白4
5.ABCB1 ATP结合盒亚家族B成员1
6.PLVAP 质膜囊泡关联蛋白
7.MSLN 间皮素
8.L1CAM L1细胞粘附分子
9.HAVCR1 甲型肝炎病毒细胞受体1
10.MAL2 mal,T细胞分化蛋白2(基因/假基因)
11.SLAMF7 SLAM家族成员7
12.DOC2B 双C2结构域β
13.ESAM 内皮细胞粘附分子
14.GABRB1 γ-氨基丁酸A型受体β1亚基
15.CDH16 钙粘蛋白16
16.IGSF3 免疫球蛋白超家族成员3
17.DSC3 桥粒芯胶粘蛋白3
18.RHEX 血红蛋白化和红系细胞扩增调节剂
19.KCNIP1 钾电压门控通道相互作用蛋白1
20.CD70 CD70分子
21.GFRA1 GDNF家族受体α1
22.CRB3 Crumbs细胞极性复合物组分3
23.CLDN1 紧密连接蛋白1
24.AC118754.1 新型转录本
25.SCN5A 钠电压门控通道α亚基5
26.FGFR4 成纤维细胞生长因子受体4
27.KCNK3 钾双孔结构域通道亚家族K成员3
28.DYSF dysferlin
29.EFNA1 肝配蛋白A1
30.KCNJ16 钾向内整流通道亚家族J成员16
31.MARCHF1 膜关联环-CH-型手指1
32.SYTL1 突触结合蛋白样1
33.CLSTN2 钙同线蛋白2
34.ITGB4 整联蛋白亚基β4
35.VAMP8 囊泡关联膜蛋白8
36.GPRC5C G蛋白偶联受体C类5组成员C
37.CD24 CD24分子
38.CELSR2 钙粘蛋白EGF LAG七次跨膜G型受体2
39.CDH8 钙粘蛋白8
40.GRIP1 谷氨酸受体相互作用蛋白1
41.DMTN 成束蛋白肌动蛋白结合蛋白
42.F11R F11受体
43.CADM1 细胞粘附分子1
44.CDH6 钙粘蛋白6
45.F2RL2 凝血因子II凝血酶受体样2
46.LYPD1 含有LY6/PLAUR结构域的蛋白1
47.SLC6A6 溶质载体家族6成员6
48.DSG2 桥粒芯糖蛋白2
49.ADGRG1 粘附G蛋白偶联受体G1
50.CCKAR 缩胆囊素A受体
51.OXTR 催产素受体
52.ITGA3 整联蛋白亚基α3
53.AMIGO2 具有Ig样结构域2的粘附分子
54.CELSR1 钙粘蛋白EGF LAG七次跨膜G型受体1
55.EPHB2 EPH受体B2
表1
如本领域技术人员所理解的，表1中列出的标志物的合适组合可用于通过从表1中选择特异性标志物或从表1中选择两种、三种、四种、五种、六种或更多种标志物的组合从成体MSC分离TAF MSC。在某些实例中，相比于成体MSC，TAF MSC可以通过鉴定更强表达，例如TBC1D3K和/或AIF1L和/或CDHR1和/或NKAIN4和/或ABCB1和/或PLVAP等前述标志物的任何组合的8倍或更多倍更强表达的组合来更特异性地进行鉴定。当使用标志物的组合时，可用较强表达，如标志物中的每一种标志物的2倍或更多倍、4倍或更多倍或6倍或更多倍表达的较低阈值来实现鉴定。
与相比于成体MSC可以在TAF-MSC的表面上表达更强的以上表面标志物(阳性标志物)相反，在某些实例中，表2中的以下表面标志物：IL13RA2、CLU、TMEM119、CEMIP和LSP1可能在TAF-MSC上相比于在其它细胞类型(阴性标志物)上表达更弱，如前述标志物的任何组合相对于成体MSC的1/8倍或更少倍表达(任选地，TPM阈值>500)。当使用阴性标志物的组合时，可以用较弱表达，如标志物中的每一种标志物的1/2倍或更少倍、1/4倍或更少倍或1/6倍或更少倍表达的较低阈值来实现鉴定。
两种或多种这些阴性标志物的组合也可以用于更特异性地分离TAF MSC。此外，本领域技术人员还将认识到，同时包括阴性和阳性标志物的组合，如在上述任何阈值时，也可以有效更特异性地分离TAF MSC。
1.IL13RA2 白介素13受体亚基α2
2.CLU 聚集素
3.TMEM119 跨膜蛋白119
4.CEMIP 细胞迁移诱导透明质酸酶1
5.LSP1 淋巴细胞特异性蛋白1
6.GPNMB 糖蛋白Nmb
7.FAP 成纤维细胞活化蛋白α
8.CRLF1 细胞因子受体样因子1
9.MME 膜金属肽链内切酶
10.CLMP CXADR样膜蛋白
11.BGN 双糖链蛋白聚糖
12.DDR2 盘状结构域受体酪氨酸激酶2
表2
基于标志物的选择
羊水含有含异源细胞的均匀流体。因此，可能需要基于标志物的选择。基于标志物的选择的一个实例借助于荧光激活细胞分选术(FACS)。可使用荧光激活细胞分选术(FACS)纯化TAF-MSC的细胞群，即使当靶细胞类型表达非常低水平的鉴定标志物和/或需要基于标志物密度的差异进行分离时，FACS也能够得到纯度非常高的期望的细胞群。FACS能够基于大小、粒度和荧光对单个细胞进行纯化。如本领域技术人员将理解的，FACS可以用于选择某些比另一细胞群多表达一种细胞表面标志物的细胞群，反之亦然。在纯化方法的一些实例中，大量纯化方法如淘选、补体消耗和磁珠分离可与FACS组合使用或作为FACS的替代物。简而言之，为了借助于FACS纯化目标细胞，首先将其用荧光标记的单克隆抗体(mAB)进行染色，这些单克隆抗体识别期望的细胞群上的特异性表面标志物。未染色细胞的反向选择也能够实现分离。对于根据一些实例的细胞的GMP生产，FACS可以使用封闭体系分选技术如
Figure BDA0003671438180000201
运行。样品可在一次性、完全封闭的MACSQuant Tyto舱(MACSQuantTyto Cartridge)内保持无污染。此外，过滤的空气可以在非常低的压力(<3PSI)下驱动细胞通过微通道进入微芯片。然而，在进入微通道前，潜在的细胞团块可被过滤器系统截留，从而保证顺利的分选过程。荧光检测系统可以基于细胞的预定荧光参数检测目标细胞。基于其荧光和散射光特征，靶细胞可以通过位于微通道内的分选阀重定向。对于纯化方法的某些实例，染色的成功和由此带来的分选的成功在很大程度上取决于鉴定标志物的选择和mAb的选择。分选参数可以根据纯度和收率的要求进行调整。与常规液滴分选仪不同，由MACSQuant Tyto分选的细胞可能不会承受高压或电荷，也可能不会减压。因此，这种温和的分选方法可能导致细胞的高活性和功能性。可替代地，其它基于标志物的选择技术对于本领域技术人员而言是已知的并在此使用。这些选择技术包括但不限于磁激活细胞分选、基于微流体的分选、浮力激活细胞分选、质谱流式细胞术等。
组织特异性细胞和用途
TAF肺细胞标志物
如上所述，来自TAF-MSC克隆、成体和新生儿MSC参考物质以及胎儿成纤维细胞的RNAseq数据和公开可用的表达数据集的分析可用于鉴定和表征TAF-MSC细胞。例如，TAF-MSC亚群可以通过将其表达数据(RNAseq)与新生儿参考样品进行聚类来建立。此类亚群包括但不限于肺MSC、泌尿道MSC(在本公开中也描述为肾MSC)和皮肤MSC。表达数据的每个簇的高表达和低表达基因的基因列表能够实现每个簇的表面标志物基因的鉴定。使用此类数据比较，基于其基因表达(RNAseq)将TAF细胞亚群与成体MSC细胞进行比较，得出每个簇的新生儿特异性表面标志物基因的列表。鉴定了许多与肺TAF细胞关联的目标表面标志物。例如，下面提供了用于鉴定和分离TAF肺细胞的优选表面标志物的非排他性列表。此外，由于TAF中不同MSC亚型的数量有限，组织特异性MSC的选择可以首先通过表征，之后通过考虑不同组织特异性MSC的组合(多变量)表面标志物谱对物质进行逐步反向选择/分选来完成。本领域技术人员将理解，这些表面标志物的任何此类组合可以用于从一般TAF源性细胞和/或TAF-MSC细胞群中鉴定并分离肺TAF细胞。在一些实例中，与其它细胞类型，如其它TAF源性细胞和/或TAF-MSC细胞相比，以下非排他性的表面标志物列表可以在TAF肺细胞的表面上表达更高。
如上所述，生物信息学技术可用于鉴定组织特异性表面标志物，因此，表3中所鉴定的表面标志物在优先化克隆上的表达相比于普通TAF-MSC克隆可能至少增加10倍(任选地，TPM阈值>2000)。
1.PCDH19-原钙粘附蛋白19；
2.DDR1-盘状结构域受体酪氨酸激酶1；
3.MME-膜金属肽链内切酶；
4.IFITM10-干扰素诱导的跨膜蛋白10；
5.BGN-二聚糖；
6.NOTCH3-刻痕受体3；
7.SULF1-硫酸酯酶1；
8.TNFSF18-TNF超家族成员18；
9.BDKRB1-缓激肽受体B1；
10.FLT1-fms相关酪氨酸激酶1；
11.PDGFRA-血小板源性生长因子受体α；
12.TNFSF4-TNF超家族成员4；
13.UNC5B-unc-5纺锤蛋白受体B；
14.FAP-成纤维细胞活化蛋白α；
15.CASP1-半胱天冬酶1；
16.CD248-内皮唾酸蛋白；
17.DDR2-盘状结构域受体酪氨酸激酶2；
18.PCDH18-原钙粘附蛋白18；和/或
19.CRLF1-细胞因子受体样因子1；
表3
与可以在TAF肺MSC的表面上表达更强的以上表面标志物相反，在某些实例中，以下表面标志物：CD24、ITGB4、TNFSF10、GFRA1、CD74、FGFR4、HAVCR1和OSCAR相比于其它细胞类型，如其它TAF源性细胞和/或TAF-MSC可能在TAF肺MSC上表达更弱。如本领域技术人员将理解的，一种、两种、三种、四种或更多种上述表达更弱的表面标志物可用于从其它细胞类型，如其它TAF源性细胞和/或TAF-MSC分离TAF肺细胞。
在某些实例中，细胞表面标志物CD248(内皮唾酸蛋白)可用于从TAF MSC群分选TAF肺MSC。可用于分选TAF肺MSC的进一步表面标志物包括DDR-1(盘状结构域受体酪氨酸激酶1)和LRRC38(含有富含亮氨酸重复的蛋白质38)，所有这三种标志物已经经由抗体鉴定为用于分离的有用标志物。在一些实例中，单独的内皮唾酸蛋白、DDR-1和/或LRRC38或与其它标志物的组合可用于分选。内皮唾酸蛋白可以与DDR-1或LRRC38组合进行分选，或DDR-1和LRRC38可以不与内皮唾酸蛋白组合。
如本领域技术人员将理解的，表3中所列的标志物与CD248、DDR-1和LRR38的合适组合可用于通过从表3选择特异性标志物或从表3选择两种、三种、四种、五种、六种或更多种标志物和/或CD248和/或DDR-1和/或LRR38的组合从TAF MSC分离TAF肺MSC。在某些实例中，相比于TAF MSC，TAF肺MSC可以通过鉴定更强表达，例如PCDH19和/或DDR1和/或MME和/或IFITM10和/或BGN和/或NOTCH3和/或CD248和/或DDR-1和/或LRR38等前述标志物的任何组合的10倍或更多倍更强表达(任选地，TPM阈值>2000)的组合来更特异性地进行鉴定。当使用标志物的组合时，可以用较强表达，如标志物中每种标志物的4倍或更多倍、6倍或更多倍或8倍或更多倍表达的较低阈值来实现鉴定。
与相比于TAF MSC可以在TAF肺MSC的表面上表达更强的以上表面标志物(阳性标志物)相反，在某些实例中，以下表面标志物：CD24、ITGB4、TNFSF10、GFRA1、CD74、FGFR4、HAVCR1和OSCAR相比于其它细胞类型(阴性标志物)可在TAF肺MSC上表达更弱，如上述标志物的任何组合相对于TAF MSC的1/8倍或更少倍表达(任选地，TPM>500)。当使用阴性标志物的组合时，可以用较弱表达，如标志物中的每一种标志物的1/2倍或更少倍、1/4倍或更少倍或1/6倍或更少倍表达的较低阈值来实现鉴定。
两种或多种这些阴性标志物的组合也可以用于更特异性地分离TAF肺MSC。此外，本领域技术人员还将认识到，同时包括阴性和阳性标志物的组合，如在上述任何阈值时，也可以有效更特异性地分离TAF肺MSC。
图17A至图17D示出了关于TAF肺MSC用于治疗的潜在用途的原理循证研究的结果的实例，该原理循证研究使用表达MSC肺细胞表面标志物，包括CD248、DDR1和LRRC38(称为“LBX-THX-001细胞”)的新生分选的TAF MSC来执行。本研究的目的是研究LBX-THX-001细胞在博来霉素诱导的雄性大鼠肺纤维化模型中的作用。检测了两种细胞浓度(2M细胞/kg和5M细胞/kg)和用于细胞的两种类型的媒介物(PBS和CryoStor CS-10)。
文献中充分记录了暴露于博来霉素后大鼠肺纤维化的发展，以及用于研究肺纤维化病理学和不同治疗效果的常用模型。所注射的LBX-THX-001细胞的数量被选为与可能的人类疗法相关。因此选择细胞的数量以反映以前对大鼠(8至20M细胞/kg)和人类(0.5至2M细胞/kg)的研究中使用的细胞数量。
向34只雄性SD大鼠气管内滴注博来霉素(每1000U/大鼠)用于诱导大鼠肺纤维化。在第一周期间，每天监测大鼠并称重，此后每周两次直至研究终止。在博来霉素攻击后第4天，通过静脉内(i.v.)注射施用LBX-THX-001细胞。注射量为194至535μL(最大耐受注射量1mL/kg)。基于先前对模型的经验，对博来霉素气管内滴注的反应是正如预期的，该模型在滴注后的第一天和其后的恢复期间体重减轻。博来霉素组和治疗组之间的体重减轻没有显著差异。
如图17A至图17D所示，博来霉素滴注诱导肺中的纤维化变化。组织病理学评价推断出博来霉素组关于受影响的实质百分比和使用改良雅斯科(Ashcroft)量表评分后两者的病理学改变。如图17A至图17D所示，相比于博来霉素组，博来霉素后4天用LBX-THX-001细胞(2百万个细胞/kg)治疗的组在其肺中的纤维化显著较少。这在使用读出的“受影响的实质百分比”(图17A至图17B)和纤维化评分雅斯科改良量表(图17A至图17D)的组织病理学评价中均可见。终止时(28天后)大鼠肺中未检测到人MSC。
TAF肾细胞标志物
与以上所鉴定的TAF肺MSC细胞标志物相似，鉴定了许多与肾TAF细胞关联的目标表面标志物。例如，用于鉴定和分离TAF肾MSC的表面标志物的非排他性列表提供于下表4中。与TAF肺MSC标志物相似，表4中所鉴定的表面标志物在优先化肾TAF克隆上的表达相比于普通TAF-MSC克隆可增加至少12倍(任选地，TPM阈值>2000)。此外，由于TAF中不同MSC亚型的数量有限，组织特异性MSC的选择可以首先通过表征，之后通过考虑不同组织特异性MSC的组合(多变量)表面标志物谱对物质进行逐步反向选择/分选来完成。本领域技术人员将理解，这些表面标志物的任何此类组合可以用于从一般TAF源性细胞和/或TAF-MSC细胞群中鉴定并分离TAF肾细胞。在一些实例中，相比于与其它细胞类型，如其它TAF源性细胞和/或TAF-MSC细胞，以下表面标志物的非排他性列表可以在TAF肾细胞的表面上表达更高：
1.HAVCR1-甲型肝炎病毒细胞受体1；
2.CD24-CD24分子；
3.CLDN6-紧密连接蛋白6；
4.ABCB1-ATP结合盒亚家族B成员1；
5.SHISA9-shisa家族成员9；
6.CRB3-Crumbs细胞极性复合物组分3；
7.AC118754.1-花生四烯酸15-脂氧合酶、ALOX15、Smoothelin样蛋白2、SMTNL2、谷胱甘肽水解酶6、GGT6、Myb结合蛋白1A、MYBBP1A、蛋白同源物2、SPNS2
8.ITGB6-整联蛋白亚基β6；
9.CDH1-钙粘蛋白1；
10.LSR-脂肪分解刺激脂蛋白受体；
11.EPCAM-上皮细胞粘附分子；
12.AJAP1-黏附连接关联蛋白1；
13.ANO9-anoctamin 9；
14.CLDN7-紧密连接蛋白7；
15.EFNA1-肝配蛋白A1；
16.MAL2-mal,T细胞分化蛋白2(基因/假基因)；
17.F11R-F11受体；
18.L1CAM-L1细胞粘附分子；
19.GFRA1-GDNF家族受体α1；
20.IGSF3-免疫球蛋白超家族成员3；
21.TNF-肿瘤坏死因子；
22.MMP7-基质金属蛋白酶7；
23.FOLR1-叶酸受体α；
24.TGFA-转化生长因子α；
25.C3-补体C3；
26.TNFSF10-TNF超家族成员10；
27.PDGFB-血小板源性生长因子亚基B；和/或
28.WWC1-包含WW和C2结构域的蛋白1。
表4
如本领域技术人员所理解的，通过从表4中选择特异性标志物或从表4中选择两种、三种、四种、五种、六种或更多种标志物的组合，表4中所列标志物的合适组合可用于从TAF-MSC分离TAF肾细胞。在某些实例中，相比于TAF-MSC，TAF肾MSC可以通过鉴定更强表达，例如HAVCR1和/或CD24和/或CLDN6和/或ABCB1和/或SHISA9和/或CRB3等前述标志物的任何组合的12倍或更多倍更强表达(任选地，TPM阈值>2000)的组合来更特异性地鉴定。当使用标志物的组合时，可以用较强表达，如标志物中每种标志物的4倍或更多倍、6倍或更多倍或8倍或更多倍表达的较低阈值来实现鉴定。
与可以在TAF肾MSC的表面上表达更强的以上表面标志物(阳性标志物)相反，在某些实例中，以下表面标志物：GREM1、PDGFRB、BGN、FAP、CXCL12、CCKAR、CD248相比于其它细胞类型(阴性标志物)可以在TAF肾细胞上表达更弱，如前述标志物的任何组合和其它TAF源性细胞和/或TAF-MSC细胞的1/8倍或更少倍表达(任选地，TPM阈值>500)。当使用阴性标志物的组合时，可以用较弱表达，如标志物中的每一种标志物的1/2倍或更少倍、1/4倍或更少倍或1/6倍或更少倍表达的较低阈值来实现鉴定。
两种或多种这些阴性标志物的组合也可以用于更特异性地分离TAF肾MSC。此外，本领域技术人员还将认识到，同时包括阴性和阳性标志物的组合，如在上述任何阈值时，也可以有效更特异性地分离TAF肾MSC。
TAF皮肤细胞标志物
与以上所鉴定的TAF肺和肾MSC标志物相似，鉴定了许多与皮肤TAF细胞关联的目标表面标志物。例如，用于鉴定和分离TAF皮肤细胞的表面标志物的非排他性列表提供于下表5中。表5中所鉴定的TAF皮肤MSC标志物在优先化克隆上的表达相比于普通TAF-MSC克隆可能至少增加12倍(任选地，TPM阈值>2000)。此外，由于TAF中不同MSC亚型的数量有限，组织特异性MSC的选择可以首先通过表征，之后通过考虑不同组织特异性MSC的组合(多变量)表面标志物谱对物质进行逐步反向选择/分选来完成。本领域技术人员将理解，这些表面标志物的任何此类组合可以用于从一般TAF源性细胞和/或TAF-MSC细胞群中鉴定并分离TAF皮肤细胞。在一些实例中，相比于与其它细胞类型，如其它TAF源性细胞和/或TAF-MSC细胞，以下非排他性的表面标志物列表可以在TAF皮肤细胞的表面上表达更高：
1.TNFSF18-TNF超家族成员18；
2.PCDH19-原钙粘附蛋白19；
3.NCAM2-神经细胞粘附分子2；
4.TNFSF4-TNF超家族成员4；
5.CD248-内皮唾酸蛋白；
6.DDR2-盘状结构域受体酪氨酸激酶2；
7.HTR2B-5-羟色胺受体2B；
8.PCDH18-原钙粘附蛋白18；
9.SULF1-硫酸酯酶1；
10.MME-膜金属肽链内切酶；
11.ADGRA2-粘附G蛋白偶联受体A2；
12.DCSTAMP-树突细胞表达的七次跨膜蛋白；
13.PDGFRA-血小板源性生长因子受体α；
14.UNC5B-unc-5纺锤蛋白受体B；
15.SCUBE3-含有信号肽、CUB结构域和EGF样结构域的蛋白3；
16.CEMIP-细胞迁移诱导透明质酸酶1；
17.BDKRB1-缓激肽受体B1；
18.FLT1-fms相关酪氨酸激酶1；
19.BDKRB2-缓激肽受体B2；
20.FAP-成纤维细胞活化蛋白α；
21.CASP1-半胱天冬酶1；和/或
22.SRPX2-含有sushi重复蛋白X连锁2。
表5
如本领域技术人员将理解的，表5中列出的标志物的合适组合可用于通过从表5中选择特异性标志物或从表5中选择两种、三种、四种、五种、六种或更多种标志物的组合从TAF-MSC分离TAF皮肤MSC。在某些实例中，相比于TAF-MSC，TAF皮肤MSC可以通过鉴定更强表达，例如TNFSF18和/或PCDH19和/或NCAM2和/或TNFSF4和/或CD248和/或DDR2等前述标志物的任何组合的12倍或更多倍更强表达(任选地，TPM>2000)的组合来更特异性地进行鉴定。当使用标志物的组合时，可以用较强表达，如标志物中每种标志物的4倍或更多倍、6倍或更多倍或8倍或更多倍表达的较低阈值来实现鉴定。
与可以在TAF皮肤细胞表面上表达更强的以上表面标志物(阳性标志物)相反，在某些实例中，以下表面标志物：CD24、TNFSF10、ITGB4、ABCB1可在TAF皮肤细胞上相比于其它细胞类型(阴性标志物)表达更弱，如前述标志物的任何组合和其它TAF源性细胞和/或TAF-MSC细胞的1/8倍或更少倍表达(任选地，TPM阈值>500)。当使用阴性标志物的组合时，可以用较弱表达，如标志物中的每一种标志物的1/2倍或更少倍、1/4倍或更少倍或1/6倍或更少倍表达的较低阈值来实现鉴定。
两种或多种这些阴性标志物的组合也可以用于更特异性地分离TAF皮肤MSC。此外，本领域技术人员还将认识到，同时包括阴性和阳性标志物的组合，如在上述任何阈值时，也可以有效更具体地分离TAF皮肤MSC。
TAF神经细胞标志物
与以上所鉴定的TAF肺、肾和皮肤MSC标志物相似，鉴定了许多与TAF神经细胞关联的目标表面标志物。例如，下面提供了用于鉴定和分离TAF神经细胞的表面标志物的非排他性列表。表6中所鉴定的TAF神经MSC表面标志物在优先化克隆上的表达相比于普通TAF-MSC克隆至少增加3倍(任选地，TPM阈值>500)。此外，由于TAF中不同MSC亚型的数量有限，组织特异性MSC的选择可以首先通过表征，之后通过考虑不同组织特异性MSC的组合(多变量)表面标志物谱对物质进行逐步反向选择/分选来完成。本领域技术人员将理解，这些表面标志物的任何此类组合可以用于从一般TAF源性细胞和/或TAF-MSC细胞群中鉴定并分离TAF神经细胞。在一些实例中，相比于与其它细胞类型，如其它TAF源性细胞和/或TAF-MSC细胞，以下非排他性的表面标志物列表可以在TAF神经细胞的表面上表达更高：
1.HAVCR1-甲型肝炎病毒细胞受体1；
2.ACKR3-非典型趋化因子受体3；
3.OSCAR-破骨细胞关联Ig样受体；
4.C3-补体C3；
5.SIRPB1-信号调节蛋白β1；
6.SLC6A6-溶质载体家族6成员6；
7.CCKAR-缩胆囊素A受体；
8.TNFSF10-TNF超家族成员10；
9.CLSTN2-钙同线蛋白2；
10.TENM2-teneurin跨膜蛋白2；
11.SFRP1-分泌型卷曲相关蛋白1；
12.PIK3IP1-磷脂酰肌醇-3-激酶相互作用蛋白1；
13.SCNN1D-钠通道上皮1δ亚基；
14.CLDN11-紧密连接蛋白11；
15.ALDH3B1-醛脱氢酶3家族成员B1；和/或
16.ITGB4-整联蛋白亚基β4。
表6
如本领域技术人员将理解的，表6中列出的标志物的合适组合可以用于通过从表6中选择特异性标志物或从表6中选择两种、三种、四种、五种、六种或更多种标志物的组合从TAF-MSC分离TAF神经MSC。在某些实例中，相比于TAF-MSC，TAF神经MSC可以通过鉴定更强表达，例如HAVCR1和/或ACKR3和/或OSCAR和/或C3和/或SIRPB1和/或SLC6A6等前述标志物的任何组合的3倍或更多倍更强表达(任选地，TPM阈值>500)的组合来更特异性地进行鉴定。当使用标志物的组合时，可以用更强表达，如标志物中的每一种标志物的2倍或更多倍、6倍或更多倍、8倍或更多倍或12倍或更多倍表达的较低阈值或较高阈值来实现鉴定。此外，本领域技术人员还将认识到，同时包括阴性和阳性标志物的组合，如在上述任何阈值时，也可以有效更具体地分离TAF神经MSC。
在本说明书(包括任何附随的展示，权利要求，摘要和附图)中公开的所有特征，和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤，可以以任何组合进行组合，除了其中至少一些这样的特征和/或步骤相互排斥的组合。本公开不限于任何前述实例的细节。本公开扩展到本说明书(包括任何所附权利要求，摘要和附图)中公开的特征的任何新颖特征或任何新颖组合，或者扩展到如此公开的任何方法或过程的步骤的任何新颖步骤或任何新颖组合。
本领域技术人员将理解，在一些实例中，在所示出或公开的过程中采取的实际步骤可以与附图中所示的那些步骤不同。根据该实例，可以删除上述的某些步骤，也可以添加其它步骤。例如，在所公开的过程中采取的实际步骤或步骤顺序可以与图中所示的那些不同。根据该实例，可以删除上述的某些步骤，也可以添加其它步骤。此外，以上公开的具体实例的特征和属性可以以不同方式组合以形成附加实例，所有这些附加实例都属于本公开的范围。
除非另外特别说明，或在所使用的上下文中以其它方式理解，条件性语言，诸如“可以(can)”，“可以/可能(could)”，“可以/可能(might)”或“可以/可能(may)”，通常旨在表达某些实例包括某些特征、元件或步骤，而其它实例不包括某些特征、元件或步骤。因此，此类条件性语言通常不旨在暗示一个或多个实例以任何方式需要特征、元件或步骤，或者一个或多个实例必须包括用于在有或没有用户输入或提示的情况下决定这些特征、元件或步骤是否被包括在任何特定实例中或要在任何特定实例中执行的逻辑。术语“包含(comprising)”，“包括(including)”，“具有(having)”等是同义的，并且以开放式的方式包含性地使用，并且不排除附加的元件、特征、动作、操作等。此外，术语“或”以其包含性意义上(而不是以其排他性意义上)使用，以便当例如用于连接元件列表时，术语“或”意指列表中的一个、一些或所有元件。类似地，关于两个或更多个项目的列表的术语“和/或”涵盖该词的所有以下解释：列表中的任何一个项目、列表中的所有项目以及列表中的项目的任何组合。此外，这里使用的术语“每个/每种”除了具有其普通含义之外，还可以指应用术语“每个/每种”的一组元素的任何子集。另外，当在本申请中使用时，词语“本文”，“以上”，“以下/下面”和具有类似含义的词语是指本申请整体而不是本申请的任何特定部分。
除非另外明确说明，否则诸如短语“X、Y和Z中的至少一个”的连接语言在上下文中应理解为通常用于表达项目、术语等可以是X、Y或Z。因此，此类连接语言一般不旨在暗示某些实例需要存在X中的至少一个、Y中的至少一个和Z中的至少一个。
本文中使用的程度的语言，如本文中使用的术语“大约”、“约”、“大体上”和“基本上”表示接近规定值、量或特性的值、量或特性，其仍然执行期望的功能或实现期望的结果。例如，术语“大约”、“约”、“大体上”和“基本上”可指在规定量的小于10％内、小于5％内、小于1％内、小于0.1％内和小于0.01％内的量。作为另一实例，在某些实例中，术语“大体上平行”和“基本上平行”是指偏离完全平行小于或等于15度、10度、5度、3度、1度或0.1度的值、量或特性。
对本公开中描述的实施方案的各种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的，并且在不脱离本公开的精神或范围的情况下，本文定义的一般原理可以应用于其它实施方案。因此，本公开不旨在限于本文所示的实施方案，而是要被赋予与本文公开的原理和特征一致的最宽范围。本公开的某些实例包含在下面列出或将来呈现的权利要求集中。

Claims (36)

1.一种从足月羊水中获得足月羊水间充质干细胞(TAF MSC)的方法，其包含：
提供足月羊水(TAF)；
从所述TAF中去除颗粒物质以获得纯化的TAF细胞；
对所述纯化的TAF细胞进行粘附选择以获得TAF粘附细胞；
传代所述TAF粘附细胞以获得包含所述TAF MSC的细胞群；以及
从所述群中选择所述TAF MSC作为表达至少一种A组表面标志物的细胞，所述至少一种A组表面标志物选自由以下组成的组：TBC1结构域家族成员3K、同种异体移植炎症因子1样、钙粘蛋白相关家族成员1、钠/钾转运ATP酶相互作用蛋白4、ATP结合盒亚家族B成员1、质膜囊泡关联蛋白、间皮素、L1细胞粘附分子、甲型肝炎病毒细胞受体1、mal,T细胞分化蛋白2(基因/假基因)、SLAM家族成员7、双C2结构域β、内皮细胞粘附分子、γ-氨基丁酸A型受体β1亚基、钙粘蛋白16、免疫球蛋白超家族成员3、桥粒芯胶粘蛋白3、血红蛋白化和红系细胞扩增调节剂、钾电压门控通道相互作用蛋白1、CD70分子、GDNF家族受体α1、Crumbs细胞极性复合物组分3、紧密连接蛋白1、新型转录本、钠电压门控通道α亚基5、成纤维细胞生长因子受体4、钾双孔结构域通道亚家族K成员3、dysferlin、肝配蛋白A1、钾内向整流通道亚家族J成员16、膜关联环-CH-型指1、突触结合蛋白样1、钙同线蛋白2、整联蛋白亚基β4、囊泡关联膜蛋白8、G蛋白偶联受体C类5组成员C、CD24分子、钙粘蛋白EGF LAG七次跨膜G型受体2、钙粘蛋白8、谷氨酸受体相互作用蛋白1、成束蛋白肌动蛋白结合蛋白、F11受体、细胞粘附分子1、钙粘蛋白6、凝血因子II凝血酶受体样2、含有LY6/PLAUR结构域的蛋白1、溶质载体家族6成员6、桥粒芯糖蛋白2、粘附G蛋白偶联受体G1、缩胆囊素A受体、催产素受体、整联蛋白亚基α3、具有Ig样结构域2的粘附分子、钙粘蛋白EGF LAG七次跨膜G型受体1和EPH受体B2，由此获得TAF MSC。
2.根据权利要求1所述的方法，其中选择TAF MSC包含选择表达减弱的标志物的TAFMSC，所述标志物选自由以下组成的组：IL13RA2、CLU、TMEM119、CEMIP、LSP1、GPNMB、FAP、CRLF1、MME、CLMP、BGN、DDR2。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中去除颗粒物包含过滤和离心所述TAF。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对所述纯化的TAF细胞进行粘附选择包含将所述纯化的TAF细胞粘附到涂覆有玻连蛋白基底物的表面。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中选择步骤使用荧光激活细胞分选术(FACS)执行。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述选择步骤用针对所述标志物或表面标志物中的任何一种标志物的抗体执行。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述选择步骤包含选择表达来自所述A组表面标志物的至少两种标志物的TAF MSC。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述选择步骤包含选择表达来自所述A组表面标志物的至少三种标志物的TAF MSC。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述选择步骤包含选择表达来自所述A组表面标志物的至少四种标志物的TAF MSC。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述选择步骤包含多个分选步骤，每个分选步骤包含根据一组由各自的TAF MSC表达或不表达的标志物将TAF MSC引导到第一输出组或第二输出组中。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述选择步骤包含：
第一分选步骤，将表达A组表面标志物的TAF MSC引导到第一输出组中，和
第二分选步骤，将表达第二组标志物的来自第一输出组的TAF MSC引导到第二输出组中。
12.一种从足月羊水中获得足月羊水肺间充质干细胞(TAF肺MSC)的方法，其包含：
提供足月羊水(TAF)；
从所述TAF中去除颗粒物质以获得纯化的TAF细胞；
对所述纯化的TAF细胞进行粘附选择以获得TAF粘附细胞；
传代所述TAF粘附细胞以获得包含所述TAF肺MSC的细胞群；以及
从所述群中选择所述TAF肺MSC作为表达至少一种B组表面标志物的细胞，所述至少一种B组表面标志物选自由以下组成的组：PCDH19、DDR1、MME、IFITM10、BGN、NOTCH3、SULF1、TNFSF18、BDKRB1、FLT1、PDGFRA、TNFSF4、UNC5B、FAP、CASP1、CD248、DDR2、PCDH18、LRRC38和CRLF1，由此获得TAF肺间充质干细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中选择TAF肺MSC包含排除表达选自由CD24、ITGB4、TNFSF10、GFRA1、CD74、FGFR4、HAVCR1和OSCAR组成的组的标志物的MSC。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中选择步骤包含从所述B组表面标志物中选择表达至少两种表面标志物的TAF MSC。
15.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述选择步骤包含从所述B组表面标志物中选择表达至少三种表面标志物的TAF MSC。
16.根据权利要求12、13、14或15所述的方法，其中所述选择步骤包含从所述B组表面标志物中选择表达至少四种表面标志物的TAF MSC。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述选择步骤包含选择表达选自由CD248、DDR1和LRRC38组成的组的表面标志物的TAF MSC。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述选择步骤包含选择表达CD248的TAF MSC。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述选择步骤包含选择表达CD248与选自由DDR1和LRRC38组成的组的标志物的组合的TAF MSC。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述选择步骤包含选择表达CD248、DDR1和LRRC38的TAF MSC。
21.可通过根据权利要求1至10所述的方法获得的分离的足月羊水(TAF)间充质干细胞，所述细胞表达至少一种A组表面标志物。
22.一种分离的足月羊水(TAF)间充质干细胞群，所述细胞表达至少一种A组表面标志物，所述至少一种A组表面标志物选自由以下组成的组：TBC1结构域家族成员3K、同种异体移植炎症因子1样、钙粘蛋白相关家族成员1、钠/钾转运ATP酶相互作用蛋白4、ATP结合盒亚家族B成员1、质膜囊泡关联蛋白、间皮素、L1细胞粘附分子、甲型肝炎病毒细胞受体1、mal,T细胞分化蛋白2(基因/假基因)、SLAM家族成员7、双C2结构域β、内皮细胞粘附分子、γ-氨基丁酸A型受体β1亚基、钙粘蛋白16、免疫球蛋白超家族成员3、桥粒芯胶粘蛋白3、血红蛋白化和红系细胞扩增调节剂、钾电压门控通道相互作用蛋白1、CD70分子、GDNF家族受体α1、Crumbs细胞极性复合物组分3、紧密连接蛋白1、新型转录本、钠电压门控通道α亚基5、成纤维细胞生长因子受体4、钾双孔结构域通道亚家族K成员3、dysferlin、肝配蛋白A1、钾内向整流通道亚家族J成员16、膜关联环-CH-型指1、突触结合蛋白样1、钙同线蛋白2、整联蛋白亚基β4、囊泡关联膜蛋白8、G蛋白偶联受体C类5组成员C、CD24分子、钙粘蛋白EGF LAG七次跨膜G型受体2、钙粘蛋白8、谷氨酸受体相互作用蛋白1、成束蛋白肌动蛋白结合蛋白、F11受体、细胞粘附分子1、钙粘蛋白6、凝血因子II凝血酶受体样2、含有LY6/PLAUR结构域的蛋白1、溶质载体家族6成员6、桥粒芯糖蛋白2、粘附G蛋白偶联受体G1、缩胆囊素A受体、催产素受体、整联蛋白亚基α3、具有Ig样结构域2的粘附分子、钙粘蛋白EGF LAG七次跨膜G型受体1和EPH受体B2。
23.一种组合物，其包含根据权利要求18所述的分离的足月羊水(TAF)间充质干细胞群和用于所述TAF MSC的药学上可接受的载体。
24.可通过根据权利要求12至16所述的方法获得的分离的足月羊水(TAF)间充质肺干细胞，所述细胞表达至少一种B组表面标志物，所述至少一种B组表面标志物选自由以下组成的组：PCDH19、DDR1、MME、IFITM10、BGN、NOTCH3、SULF1、TNFSF18、BDKRB1、FLT1、PDGFRA、TNFSF4、UNC5B、FAP、CASP1、CD248、DDR2、PCDH18和CRLF1。
25.一种分离的足月羊水(TAF)肺间充质干细胞群，所述细胞表达至少一种B组表面标志物。
26.分离的足月羊水(TAF)间充质干细胞，其包含前述说明书和/或附图的一个或多个特征。
27.一种从足月羊水中获得足月羊水肾间充质干细胞(TAF肾MSC)的方法，其包含：
提供足月羊水(TAF)；
从所述TAF中去除颗粒物质以获得纯化的TAF细胞；
对所述纯化的TAF细胞进行粘附选择以获得TAF粘附细胞；
传代所述TAF粘附细胞以获得包含所述TAF肾MSC的细胞群；以及
从所述群中选择所述TAF肾MSC作为表达至少一种C组表面标志物的细胞，所述至少一种C组表面标志物选自由以下组成的组：HAVCR1、CD24、CLDN6、ABCB1、SHISA9、CRB3、AC118754.1、ITGB6、CDH1、LSR、EPCAM、AJAP1、ANO9、CLDN7、EFNA1、MAL2、F11R、L1CAM、GFRA1、IGSF3、TNF、MMP7、FOLR1、TGFA、C3、TNFSF10、PDGFB和WWC1，由此获得TAF肾MSC。
28.一种分离的足月羊水(TAF)肾间充质干细胞(TAF肾MSC)群，所述TAF肾MSC表达至少一种C组表面标志物，所述至少一种C组表面标志物选自由以下组成的组：HAVCR1、CD24、CLDN6、ABCB1、SHISA9、CRB3、AC118754.1、ITGB6、CDH1、LSR、EPCAM、AJAP1、ANO9、CLDN7、EFNA1、MAL2、F11R、L1CAM、GFRA1、IGSF3、TNF、MMP7、FOLR1、TGFA、C3、TNFSF10、PDGFB和WWC1。
29.一种组合物，其包含根据权利要求28所述的分离的足月羊水(TAF)肾间充质干细胞群。
30.一种从足月羊水中获得足月羊水皮肤间充质干细胞(TAF皮肤MSC)的方法，包含：
提供足月羊水(TAF)；
从所述TAF中去除颗粒物质以获得纯化的TAF细胞；
对所述纯化的TAF细胞进行粘附选择以获得TAF粘附细胞；
传代所述TAF粘附细胞以获得包含所述TAF皮肤MSC的细胞群；以及
从所述群中选择所述TAF皮肤MSC作为表达至少一种D组表面标志物的细胞，所述至少一种D组表面标志物选自由以下组成的组：TNFSF18、PCDH19、NCAM2、TNFSF4、CD248、DDR2、HTR2B、PCDH18、SULF1、MME、ADGRA2、DCSTAMP、PDGFRA、UNC5B、SCUBE3、CEMIP、BDKRB1、FLT1、BDKRB2、FAP、CASP1和SRPX2；以及
获得TAF皮肤MSC。
31.一种分离的足月羊水(TAF)皮肤间充质干细胞(皮肤MSC)群，所述TAF皮肤MSC表达至少一种D组表面标志物，所述至少一种D组表面标志物选自由以下组成的组：TNFSF18、PCDH19、NCAM2、TNFSF4、CD248、DDR2、HTR2B、PCDH18、SULF1、MME、ADGRA2、DCSTAMP、PDGFRA、UNC5B、SCUBE3、CEMIP、BDKRB1、FLT1、BDKRB2、FAP、CASP1和SRPX2。
32.一种组合物，其包含根据权利要求27所述的分离的足月羊水(TAF)皮肤间充质干细胞群和用于所述TAF皮肤MSC的药学上可接受的载体。
33.一种从足月羊水中获得足月羊水神经间充质干细胞(TAF神经MSC)的方法，其包含：
提供足月羊水(TAF)；
从所述TAF中去除颗粒物质以获得纯化的TAF细胞；
对所述纯化的TAF细胞进行粘附选择以获得TAF粘附细胞；
传代所述TAF粘附细胞以获得包含所述TAF神经MSC的细胞群；以及
从所述群中选择所述TAF神经MSC作为表达至少一种E组表面标志物的细胞，所述至少一种E组表面标志物选自由以下组成的组：HAVCR1、ACKR3、OSCAR、C3、SIRPB1、SLC6A6、CCKAR、TNFSF10、CLSTN2、TENM2、SFRP1、PIK3IP1、SCNN1D、CLDN11、ALDH3B1和ITGB4，由此获得TAF神经MSC。
34.一种分离的足月羊水(TAF)神经间充质干细胞(TAF神经MSC)群，所述TAF神经MSC表达至少一种E组表面标志物，所述至少一种E组表面标志物选自由以下组成的组：HAVCR1、ACKR3、OSCAR、C3、SIRPB1、SLC6A6、CCKAR、TNFSF10、CLSTN2、TENM2、SFRP1、PIK3IP1、SCNN1D、CLDN11、ALDH3B1和ITGB4。
35.一种组合物，其包含根据权利要求30所述的分离的足月羊水(TAF)神经间充质干细胞群和用于所述TAF神经MSC的药学上可接受的载体。
36.一种分离足月羊水(TAF)间充质干细胞的方法，所述TAF间充质干细胞包含前述说明书和/或附图的一个或多个特征。
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