CN101126080B

CN101126080B - 骨髓胚胎源性多能干细胞及其制备方法

Info

Publication number: CN101126080B
Application number: CN2007100438482A
Authority: CN
Inventors: 张传森; 温昱; 党瑞山; 李彬
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2007-07-17
Filing date: 2007-07-17
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2027-07-17
Also published as: CN101126080A

Abstract

本发明涉及细胞生物学技术领域。细胞移植和组织工程中寻找新的细胞来源成为当务之急。本发明提供了骨髓胚胎源性多能干细胞(EOPSC)的制备方法，包括骨髓胚胎源性多能干细胞的分离、纯化、扩增、建系，并从其形态结构、表面标志、生长特性、分化能力等方面深入研究，本发明还提供了依据该方法制得的EOPSC，它不属于任何已知的骨髓源干细胞群，而与ES非常相似，推测是遗留在成体骨髓中的ES，保持了未分化的状态。本发明通过多种方法诱导EOPSC成为三胚层细胞，提供一种取材方便、无免疫原性、不涉及伦理学问题的干细胞来源，其多向分化、持续增殖和自体来源的特性，对干细胞移植治疗和组织工程学的相关研究具有重大推动作用。

Description

骨髓胚胎源性多能干细胞及其制备方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，是从骨髓中制备一种骨髓胚胎源性多能干细胞的方法及其依据该方法制得的细胞。

背景技术

细胞移植和组织工程是近几年生物医学工程和医学领域研究的热点。胚胎干细胞由于全能分化性和持续增殖的能力成为该领域研究的重点，然而伦理学和免疫原性等问题制约了其在临床的应用，这是细胞移植和组织工程不能获得重大突破的关键，寻找新的细胞来源是当务之急。

Verfaillie研究组2001年通过优化体外培养条件，采用免疫磁珠分选技术由成年动物骨髓中分离得到了一种比骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells，MSC)更加原始的早期细胞群，命名为成体多能祖细胞。实验发现该细胞具有强大的增殖扩增能力，即使超过80倍的细胞倍增，也不出现增殖衰老现象，最长培养达到120代，而且在培养过程中，成体多能祖细胞仍保持长的端粒，不随着培养时间增加而缩短。40代时成体多能祖细胞的平均端粒长度为27kb，而102代时检测成体多能祖细胞的端粒长度没有任何改变。成体多能祖细胞另一个重要特征在于其多向分化能力，不仅可以诱导分化成为间充质来源细胞(骨、软骨、脂肪、肌组织)；也可以诱导分化为有神经外胚层表型和功能的细胞；而且在体外可以诱导成为具有功能特征的血管内皮细胞和肝细胞。目前成体多能祖细胞体外诱导分化的细胞类型已经包括了内、外、中胚三个胚层来源的细胞。尤其是将成体多能祖细胞导入早期的胚囊中，可以发育成绝大多数组织细胞类型，进一步证明了成体多能祖细胞具有比MSC更强的多向分化潜能，更强大的增殖扩增能力。这种具有高度多向分化性的亚全能干细胞为我们的研究提供了新的思路，也为组织工程寻找新的种子细胞带来了希望。该种细胞逐渐引起了人们的重视。但是很多学者对这种说法产生了质疑，认为成体多能祖细胞还是一群混合的细胞，没有完全纯化，或者是从不同的角度进行研究得到的已知骨髓源干细胞。

2004年Pochampally RR等在不含细胞因子的无血清培养基中培育早期人MSC 2-4周。发现一个细胞亚群能够在无血清环境中存活，而且具有更长的端粒；RT-PCR分析表明，该细胞亚群是一个早期祖细胞亚群，增强表达Oct-4和其它胚胎细胞特异表达的基因。2005年Yoon YS等在成人骨髓中发现一种干细胞亚群，具有自更新能力，扩增140代以后仍不损失多能性，能分化成所有三胚层细胞。根据表面标志表达，这些克隆扩增的细胞不属于任何先前所知的骨髓来源干细胞群，命名为人骨髓来源多能干细胞(humanbone marrow stem cells，hBMSCs)。心肌梗塞后于心肌内移植hBMSCs，结果移植的细胞大量嫁接，局部标志心肌细胞、上皮细胞、平滑肌细胞特征，与hBMSCs体内多线系分化相一致。心肌梗塞后移植hBMSCs的有益效果，可能缘自于宿主心肌组织增殖和保存增强、以及hBMSCs分化用于组织再生和修复。2006年Kucia M等在鼠骨髓中鉴别出少量均匀的Sca-1(+)lin(-)CD45(-)细胞群落，其带有多能干细胞标志，如SSEA-1、Oct-4、Nanog和Rex-1。电镜分析表明，这些细胞很小，细胞质围绕大的细胞核形成窄边，还包含开放型染色质，这是胚胎干细胞的典型特征。体外培养这些细胞可以分化成所有三胚层细胞系。猜测该群落为成体骨髓中遗留的少量胚胎干细胞样细胞，命名为胚胎源性多能干细胞(embryonic origin pluripotentstem cell，EOPSC)。

2007年Kucia M等提出骨髓中存在多能干细胞原始群(founderpopulation of pluripotent stem cells，PSC)的概念。认为胚胎发育时部分原始胚芽细胞(primordial germ cells，PGC)被存放到各种器官组织中，比如骨髓，随个体发育，这部分细胞没有分化为体细胞，而是保持了胚胎时的状态，持续存在。实验验证了这一观点，发现骨髓中确实存在一种小胚胎样(verysmall embryonic-like，VSEL)干细胞，表达Oct-4、SSEA-4等胚芽细胞特定的表面标志。因此认为原始胚芽细胞可能存在于成体骨髓中，由于不同的机制调节细胞增殖、影响细胞状态、选择表达不同的基因，导致了这些细胞不同的命运。我们假设这些细胞在组织/器官的再生中起重要作用，所以它们的存在可以解释干细胞的可塑性。但是病理条件下它们可能恶性转化，形成肿瘤。

2007年，Ratajczak等也发现成体组织中存在一群表达早期ES特定抗原和Oct-4、Nanog的干细胞。认为这些细胞是胚胎早期原肠胚形成时存放到组织中的一些EOPSC，并假设这些细胞是胚芽细胞的直接后代，是体细胞的母系细胞。2007年，Kucia等提出通过两步法可以纯化人脐带血中小胚胎样(VESL)干细胞，先采用低渗液溶解红细胞，然后分选出CXCR-4(+)、AC133(+)、CD34(+)，Lin(-)、CD45(-)，表达Oct-4、Nanog、SSEA-4的细胞，为该细胞的纯化提供了可行的方法。形态上很小，直径3-5μm，细胞质围绕大的细胞核形成窄边，还包含开放型染色质，这是ES的典型形态结构特征。体外培养这些细胞可以分化成所有三胚层细胞系。该细胞存在于多种成体组织中，以骨髓中含量最高，并随年龄增大量减少。体外最多倍增140代而未出现衰老现象。

综上所述，骨髓中确实存在与ES近似的干细胞群，表达ES特征性的表面标志，具有强大的增殖能力和多向分化潜能，学者们给这种细胞起了很多名字，我们认为胚胎源性多能干细胞(EOPSC)这个名称最合适，概括了其来源和功能。目前对该细胞还知之甚少，有必要进行深入研究，若能明确该细胞具有胚胎干细胞特性，其多向分化、持续增殖和可来源自体的能力，对干细胞移植和组织工程的研究具有重大推动作用。为了对EOPSC作进一步研究，必须获得纯的胚胎源性多能干细胞，但目前还未见分离、培养、鉴定成体骨髓中的EOPSC的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种细胞移植和组织工程中新的细胞来源，具体是指从骨髓中制备一种骨髓胚胎源性多能干细胞的方法及其依据该方法制得的细胞。

本发明提供一种骨髓胚胎源性多能干细胞(EOPSC)的制备方法，包括下述步骤：

I)骨髓胚胎源性多能干细胞的分离：

取成年个体骨髓10ml，裂解红细胞，注入无血清培养基(Itskovitz-EldorJ，et al.Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodiescompromising thethree embryonic germ layers.Mol Med.2000.6：88-95)，24h后弃去不贴壁细胞；传代后采用有限稀释法(司徒镇强，吴军正，主编.细胞培养.西安：世界图书出版公司，第一版.2004.311-313)逐级稀释克隆培养EOPSC，3-5天传代；

II)骨髓胚胎源性多能干细胞的纯化、扩增、建系：

挑选单细胞克隆扩大培养，换用胚胎干细胞扩增培养基(Brivanlou AH，et al.Stem cells：setting standards for human embryonic stem cells.Science.2003.300：913-916)，3-5天传代，每代冻存部分细胞，建立EOPSC系；

III)骨髓胚胎源性多能干细胞的鉴定：

观察细胞形态，检测细胞无致瘤性，测定细胞表面标志；

IV)骨髓胚胎源性多能干细胞的诱导分化：

骨髓胚胎源性多能干细胞经诱导分化，形成心肌细胞、神经细胞及肝细胞样细胞。

本发明还提供了依据上述方法制得的骨髓胚胎源性多能干细胞(EOPSC)。

具体技术方案如下：

一、从骨髓中分离EOPSC

取新鲜骨髓，裂解红细胞后，贴壁培养，24h后去除悬浮未贴壁细胞，每3～4d换液1次，直到需要传代，第2代细胞克隆化培养。

二、EOPSC纯化、扩增、建系

第2代细胞达70％-80％融合时，用0.25％Typsin-EDTA消化成单细胞悬液，细胞计数后将单细胞悬液密度调成100/ml，取200μl滴于96孔板中每行的第1孔，以有限稀释法逐级稀释，接种于FN包被的96孔板中。种植后在显微镜下对单个细胞的孔进行标记，去除发现有多个细胞的孔。对单个细胞增殖来源的细胞克隆继续扩大培养至24孔板、小皿、大皿，接种密度为(0.5-1.5)×10³/cm²；3-5天进行传代。

三、EOPSC鉴定

(一)观察形态结构：倒置相差显微镜观察细胞形态，并行Gimsa染色；扫描电镜、透射电镜检测细胞超微结构和细胞间的生理连接；测定EOPSC染色体数目和核型。

(二)检测生长特性：测定EOPSC倍增时间、生长曲线、分裂指数、接种存活率、克隆形成率；支原体检测；端粒长度检测。

(三)免疫荧光检测表面标志CXCR-4、CD133、CD34、SSEA-4、SSEA-1、CD13、CD14、CD44、Lin、CD45、CD54、MHC II的表达；

(四)流式细胞技术检测EOPSC调亡

(五)流式细胞技术检测表面标志CD133、CD34、SSEA-4阳性细胞百分率、细胞周期时相、DNA合成；

(六)RT-PCR检测：Oct-4、Nanog、Rex-1等基因的表达；

(七)EOPSC冻存及冻存复苏后生物学性状检测

四、EOPSC诱导分化

(一)骨髓EOPSC诱导分化为心肌细胞(中胚层细胞)：2-3d EB种植到种植到已经铺有END-2细胞饲养层的24孔板中进行诱导，培养液中同时加入5ng/ml TGF-β，诱导培养5d后进行鉴定。

(二)骨髓EOPSC体外诱导分化为神经细胞(外胚层细胞)：采用模拟体内神经系统发育过程的序贯诱导方法。

(三)骨髓EOPSC体外诱导分化为肝细胞样细胞(内胚层细胞)。

具体实施方式

现结合实施例，对本发明作详细描述。

实施例1：成人骨髓胚胎源性多能干细胞的制备

实验动物、材料与试剂：

健康志愿者(男性，32岁龄，体质量73kg)。

M199、DMEM-LG、DMEM-HG、DMEM/F12、0.25％Typsin-EDTA、CD13、双抗(以上试剂均购自Gibco公司)

MCDB-201、Dexamethasone、2-磷酸抗坏血酸、ITS、FN、LAA、FITC-二抗、Cy3-二抗、CD34-FITC、SSEA-4-FITC、CD133-FITC(以上试剂均购自Sigma公司)

胎牛血清(FCS)(购自Hyclone公司)

rhEGF、rhPDGF-BB、FGF-4、HGF、IGF-1、VEGF(购自R&D System公司)

rhLIF、bFGF、TGF-β(购自Prospec公司)

CXCR-4、CD34、SSEA-4、SSEA-1、Lin、CD133、MHC-II、Troponin-T、Nestin、GFAP、GAL-C、MAP-II、TnT、Hoechst33342(以上抗体均购自Santa Cruz公司)

CD14、α-actin、CD54、CD44、CD45(以上抗体均购自博士德公司)

细胞/组织总RNA抽提试剂盒(购自上海华舜生物工程有限公司)

逆转录酶M-MLV(购自Promega公司)

TaqDNA聚合酶(购自TaKaRa公司)

引物序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成

一、从骨髓中分离EOPSC

采用骨髓单核细胞直接贴壁法：抽取成年健康男性志愿者髂骨骨髓10ml，900×g离心10min，弃上清与脂肪；加入红细胞裂解液TrisNH₄Cl 4℃5min去除红细胞，以1×10⁶/ml接种于FN包被的培养皿中，培养基为79％DMEM/F12、20％SR、2mmol/L Glutamine、1％MEM、1000U/ml LIF24h后去除悬浮未贴壁细胞，每3～4d换液1次，直到需要传代。

二、EOPSC纯化、扩增、建系

细胞克隆化培养：第2代细胞达70％-80％融合时，用0.25％Typsin-EDTA消化成单细胞悬液，换用扩增培养基：60％ DMEM-LG、40％ MCDB-201添加ITS、LA-BSA、10mmol/L Dexamethasone、10^-4mol/L LAA、2％FBS及10ng/ml PDGF-BB、10ng/ml EGF、1000U/ml LIF；细胞计数后将单细胞悬液密度调成100/ml，取200μl滴于96孔板中每行的第1孔，以有限稀释法逐级稀释，接种于FN包被的96孔板中。种植后在显微镜下对单个细胞的孔进行标记，去除发现有多个细胞的孔。对单个细胞增殖来源的细胞克隆继续扩大培养至24孔板、小皿、大皿，接种密度为(0.5-1.5)×10³/cm2；于接种5天后用0.25％Typsin-EDTA消化，进行传代，建立EOPSC系。

三、EOPSC鉴定

(一)EOPSC形态结构

1.倒置相差显微镜观察细胞形态：见细胞呈“巢状”克隆性增殖，集落边清晰、光滑，细胞排列紧密，细胞之间界限不清；消化后的单个ES细胞小、亮、圆形，边界清，胞浆少，核大，核质比大，核仁明显，2-3个；

2.扫描电镜、透射电镜可观察到细胞间的生理连接，细胞结构与其他细胞相似；

3.测定EOPSC染色体数目和核型：染色体众数分析结果表明46条染色体占全部统计细胞的78％(39/50)，＜46占10％(5/50)，＞46占12％(6/50)；染色体众数为46条。

(二)EOPSC生长特性

1.EOPSC生长曲线可见1～9天细胞数分别为2.00×10⁵/ml，3.01×10⁵/ml，4.75×10⁵/ml，6.37×10⁵/ml，8.05×10⁵/ml，9.45×10⁵/ml，10.80×10⁵/ml，11.21×10⁵/ml，11.02×10⁵/ml，细胞生长潜伏期短于24小时，对数生长期为3～7天，8天后进入平台期；

2.分裂指数：接种24小时后开始计数(每隔2h)，每1000个细胞中分裂细胞的数目，2.00％，3.01％，4.75％，6.37％，8.05％，9.45％，9.80％，9.85％。

3.安全性检测

1)支原体检测EOPSC核Hoechst33342染色后发蓝色荧光，未检测到支原体DNA；

2)检测细胞培养上清液及EOPSC HBVDNA、细菌和HIVDNA及真菌均为阴性；

3)成瘤性实验表明EOPSC在裸鼠体内无致瘤性；说明得到的EOPSC没有污染，无成瘤性，可以安全的应用于基础研究和临床研究。

(三)EOPSC表面标志检测

免疫荧光检测表面标志的表达：CXCR-4(+)、CD133(+)、CD34(+)、SSEA-4(+)、SSEA-1(+)、CD13(+)、CD14(+)、CD44(+)、Lin(-)、CD45(-)、CD54(-)、MHC II(-)。

(四)流式细胞技术检测EOPSC调亡

分析各代细胞的凋亡情况，凋亡细胞所占的百分比均在1％以下。10代为0.07％，30代为0.08％，40代为0.06％。

(五)流式细胞技术检测

细胞克隆化培养传至第10代和20代时，0.25％Typsin-EDTA消化，取约5×10⁶个细胞，均分为5管，分别按抗体说明书加人荧光标记抗体：CD34-FITC，SSEA-4-FITC，CD133-FITC和PI，FITC荧光二抗作为对照，混匀，室温避光放置30min。PBS洗涤后，重悬细胞。流式细胞仪检测，以Cellquest软件获取细胞，10代阳性细胞率分别为CD3478％，SSEA-457％，CD133 69％；S期细胞占7.46％；20代性细胞率分别为CD34 85％，SSEA-477％，CD133 91％；S期细胞占9.32％。

(六)RT-PCR检测发现Oct-4、Nanog、Rex-1基因强表达。

(七)EOPSC冻存及冻存复苏后生物学性状检测

6个月后，复苏冻存的细胞，发现，细胞的形态，表面抗原，增殖速度等

和冻存前及在体外持续培养细胞无差别。

四、EOPSC诱导分化

(一)骨髓EOPSC诱导分化为心肌细胞(中胚层细胞)

1.10代的EOPSC种植到铺有END-2细胞饲养层的24孔板中进行诱导，培养液为DMEM-HG+10％胎牛血清及5ng/ml TGF-β；诱导培养5d后进行鉴定。

2.分化的心肌细胞鉴定：

1)大体观察：每天用相差显微镜观察拟胚体，至第5天出现自发性收缩，即出现了白发搏动的心肌细胞；

2)透射电镜可见细胞内横纹和细胞间的闰盘连接；

3)免疫细胞荧光技术：α-actin、Troponin-T抗体，于4℃孵育过夜。再用罗丹明标记的山羊抗小鼠IgG孵育1h，缓冲甘油封片，荧光镜下观察为阳性；

4)流式细胞技术：将EB分化集落消化成单细胞悬液，以心肌细胞特异性肌钙蛋白T(TnT)抗体和TRITC标记的免抗鼠IgG作用后，以流式细胞仪进行心肌细胞分化率，结果为TnT阳性细胞为18.36％。

(二)骨髓EOPSC体外诱导分化为神经细胞(外胚层细胞)

采用模拟体内神经系统发育过程的序贯诱导方法，共分4步：

1.当EOPSC进入对数生长期，将细胞在明胶包被的24孔板中传2代，然后以(4-5)×10⁸/L接种在10g/L明胶包被的24孔板上，培养2d，细胞再次聚集成团；更换为DMEM/F12+10％胎牛血清培养基，培养3d细胞团飘浮起来，即拟胚体；

2.诱导分化：将拟胚体吹打为单细胞悬液，接种在10g/L明胶包被的24孔板上，更换培养基为分化培养基DMEM/F12，胰岛素10mg/L，腐胺200mmol/L，肾上腺素40mg/L，黄体酮40mmol/L，转铁蛋白200mg/L，硒化钠50mmol/L，甲状腺素200mg/L，bFGF20mg/L，EGF20mg/L，培养3d。此时撤除培养基中的bFGF和EGF，培养4d；

3.神经细胞的维持培养：以DMEM/F12+20％胎牛血清维持培养得到的神经细胞；

4.免疫化学鉴定：诱导分化形成拟胚体后用Nestin多克隆抗体进行免疫细胞荧光染色为阳性。细胞固定后，分别行GFAP(1∶200)，GAL-C(1∶100)，MAP-II(1∶1000)细胞免疫细胞荧光染色，均为阳性。

(三)骨髓EOPSC体外诱导分化为肝细胞样细胞(内胚层细胞)

1.将1×10⁵/ml EOPSC接种到培养液为无饲养层的DMEM-HG培养基，内含rhLIF、10％胎牛血清、3-巯基乙醇、L-谷氨酰胺和非必需氨基酸以及双抗，3d传代1次；

2.悬滴培养法制备拟胚体：将消化后的细胞离心、去上清液，用去除rmLIF的上述培养液重悬细胞制成单细胞悬液，以30μl/滴的密度接种在100mm3培养皿的上盖，然后倒置悬浮培养(培养皿内装少许PBS液)2d后，小心翻转培养皿的上盖，收集液滴，种人培养液中继续悬浮培养。每日取出换液，并用吸管轻轻吹打以防形成的拟胚体过早贴壁3d后形成拟胚体；

3.诱导向肝细胞分化：将5d的拟胚体吸至6孔板培养皿中贴壁培养2d，培养液为加人10MM Dexamethasone的去除rmLIF的上述培养液。从第3d始于去除rmLIF的培养液中加人FGF-4，第5d再加入HGF等诱导因子，继续培养2周；

4.取出6孔板内置的盖玻片行免疫组化检测，发现白蛋白、CK18阳性；

5.细胞功能检测：1.糖原染色：加入诱导分化培养液2周后，进行糖原染色，显微镜下见胞浆内存在红色颗粒，为阳性。2.尿素合成功能检测：加人Dex、FGF4和HGF等诱导因子进行分化培养2周后，行比色法检测尿素氮含量，结果1d为124μg/10⁶cells、2d为131μg/10⁶cells、3d为148μg/10⁶cells、4d为162μg/10⁶cells，逐天增高。

Claims

1.一种骨髓胚胎源性多能干细胞的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

I)骨髓胚胎源性多能干细胞的分离：

骨髓单核细胞贴壁培养法培养成年骨髓中胚胎源性多能干细胞，取成年个体骨髓10ml，裂解红细胞，注入无血清培养基，弃去不贴壁细胞；

II)骨髓胚胎源性多能干细胞的纯化、扩增、建系：

第2代细胞达70％-80％融合时，用0.25％Typsin-EDTA消化成单细胞悬液，细胞计数后将单细胞悬液密度调成100/ml，取200μl滴于96孔板中每行的第1孔，以有限稀释法逐级稀释，接种于FN包被的96孔板中；种植后在显微镜下对单个细胞的孔进行标记，去除发现有多个细胞的孔；对单个细胞增殖来源的细胞克隆继续扩大培养至24孔板、小皿、大皿，接种密度为(0.5-1.5)×10³/cm²；3-5天进行传代；

III)骨髓胚胎源性多能干细胞的鉴定：

观察细胞形态，检测细胞无致瘤性，用免疫荧光法测定表面标志CXCR-4(+)、CD133(+)、CD34(+)、SSEA-4(+)、SSEA-1(+)、CD13(+)、CD14(+)、CD44(+)、Lin(-)、CD45(-)、CD54(-)、MHC II(-)的表达；

IV)骨髓胚胎源性多能干细胞的诱导分化：

采用添加了5ng/ml TGF-β及10％胎牛血清的DMEM-HG培养液进行心肌细胞诱导培养并进行鉴定；采用添加胰岛素、腐胺、肾上腺素、黄体酮、转铁蛋白、硒化钠、甲状腺素、bFGF、EGF的DMEM/F12培养液进行神经细胞诱导培养并进行鉴定；采用添加了rhLIF、胎牛血清、3-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸及双抗的DMEM-HG培养基进行肝细胞样细胞诱导培养并进行鉴定。

2.一种按照权利要求1所述的制备方法制得的骨髓胚胎源性多能干细胞。