CN113930386A - 引导多能干细胞成为发育停滞的细胞的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了引导多能干细胞成为发育停滞的细胞的方法及应用，涉及干细胞技术领域。引导多能干细胞成为发育停滞的细胞的方法包括：在培养多能干细胞的培养基中加入rapamycin持续培养。通过在多能干细胞(如人类胚胎干细胞)培养中加入rapamycin，可以引导多能干细胞成为类似自然状态下发育停滞的细胞，有利于防止特殊情况下多能干细胞过度增殖，为人类多能干细胞更多应用提供了新的思路，并且可以提高细胞生产的效率；有利于根据需要获得特定发育程度的多能干细胞，为人多能干细胞的应用提供了更多可能。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，具体而言，涉及引导多能干细胞成为发育停滞的细胞的方法及应用。
背景技术
人类多能干细胞(hPSC)可以分化为我们体内的所有细胞类型，并且是研究人类胚胎发育的重要模型系统。hPSC分化产生的特定细胞类型在细胞治疗，药物筛选和疾病模型研究中起着重要作用。可见，人多能干细胞为再生和修复多种组织和药物筛选提供了材料。
人多能干细胞不同发育程度的细胞均具有治疗应用价值，获取特定发育程度的人多能干细胞操作难度是非常大的。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种引导多能干细胞成为发育停滞的细胞的方法，旨在使多能干细胞成为类似自然状态下发育停滞的细胞，为多能干细胞的应用提供了更多可能。
本发明的另一目的在于提供一种获取多能干细胞的方法，其能够获取特定发育程度的多能干细胞。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种引导多能干细胞成为发育停滞的细胞的方法，包括：在培养多能干细胞的培养基中加入rapamycin。
在可选的实施方式中，rapamycin在培养基中的浓度为20-200nM；优选为50-100nM。
在可选的实施方式中，多能干细胞为人多能干细胞。
在可选的实施方式中，人多能干细胞选自人类胚胎干细胞或人类诱导多能干细胞。
在可选的实施方式中，人多能干细胞的培养是在添加有rapamycin的E8培养基中进行培养的。
在可选的实施方式中，E8培养基的成分包括DMEM/F12培养基、L-抗坏血酸-2-磷酸镁、硒酸钠、转铁蛋白、胰岛素、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β。
在可选的实施方式中，在E8培养基中，L-抗坏血酸-2-磷酸镁的浓度为60-70mg/L，硒酸钠的浓度为12-16μg/L，转铁蛋白的浓度为8-12mg/L，胰岛素的浓度为18-22mg/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为90-110μg/L，转化生长因子-β的浓度为1-3μg/L。
第二方面，本发明提供一种获取多能干细胞的方法，其采用前述实施方式中任一项的方法引导人类多能干细胞成为发育停滞的细胞。
在可选的实施方式中，停止培养之后，采用培养基将得到的细胞进行润洗。
在可选的实施方式中，采用E8培养基对得到的细胞润洗至少2次。
本发明具有以下有益效果：发明人通过在多能干细胞(如人多能干细胞)培养中加入rapamycin，可以引导多能干细胞成为类似自然状态下发育停滞的细胞，有利于防止特殊情况下多能干细胞过度增殖，为人类多能干细胞更多应用提供了新的思路，并且可以提高细胞生产的效率；有利于根据需要获得特定发育程度的多能干细胞，为人多能干细胞的应用提供了更多可能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为Rapamycin处理的人多能干细胞生长速度测试结果图；
图2为Rapamycin处理的人多能干细胞表达性测试结果图；
图3为Rapamycin处理的人多能干细胞细胞形态的测试图；
图4为Rapamycin连续处理的人多能干细胞培养组和对照组的生长情况测试结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
哺乳动物rapamycin靶蛋白(mTOR)是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸激酶，mTOR信号通路具有促进物质代谢、参与细胞凋亡、自噬的作用，在多种疾病中扮演着不可忽视的角色。rapamycin(rapamycin)是mTOR的特异性抑制剂，其也是最早被发现的mTOR抑制剂，是20世纪70年代从细菌中分离出来的一种大环内酯类抗生素。
本发明实施例提供一种引导多能干细胞成为发育停滞的细胞的方法，包括：在培养多能干细胞的培养基中加入rapamycin。发明人意外地发现，在多能干细胞培养中加入rapamycin可以使多能干细胞成为类似自然状态下发育停滞的细胞，有利于防止特殊情况下多能干细胞过度增殖，为人类多能干细胞更多应用提供了新的思路，并且可以提高细胞生产的效率。
具体地，多能干细胞可以为人多能干细胞，也可以为其他动物的多能干细胞。人多能干细胞可以为人胚胎干细胞或人类诱导多能干细胞等常见人多能干细胞。
为更好地控制人多能干细胞处于发育停滞状态，发明人优化了rapamycin的用量。在培养基中，rapamycin在培养基中的浓度为20-200nM；优选为50-100nM。
具体地，rapamycin的浓度可以为20nM、40nM、60nM、80nM、100nM、200nM等，也可以为以上浓度值之间的任意值。
在一些实施例中，人多能干细胞的培养是在添加有rapamycin的E8培养基中进行培养的。E8培养基适合于人多能干细胞的培养，适合于本发明实施例。
在其他实施例中，也可以不采用E8培养基，而采用其他适合于人多能干细胞培养的现有培养基。
进一步地，在E8培养基中，L-抗坏血酸-2-磷酸镁的浓度为60-70mg/L，硒酸钠的浓度为12-16μg/L，转铁蛋白的浓度为8-12mg/L，胰岛素的浓度为18-22mg/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为90-110μg/L，转化生长因子-β的浓度为1-3μg/L。
需要说明的是，通过对E8培养基中的成分进行控制，能够更好地促进人多能干细胞的生长。L-抗坏血酸-2-磷酸镁、硒酸钠、转铁蛋白、胰岛素、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β的浓度可以控制在上述所规定的区间内即可。
本发明实施例提供一种获取多能干细胞的方法，其采用前述实施方式中的方法引导多能干细胞成为发育停滞的细胞，进而可以获得特定发育程度的多能干细胞，具有非常好的应用前景。
在一些实施例中，停止培养之后，采用培养基将得到的细胞进行润洗，通过润洗可以去除细胞表面粘附的杂质。润洗用的培养基不限，可以采用E8培养基对得到的细胞润洗，润洗次数以至少2次为宜。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
需要说明的是，以下实施例所使用的E8培养基中除抑制剂之外的其他成分包括：L-抗坏血酸-2-磷酸镁的浓度为64mg/L，硒酸钠的浓度为14μg/L，转铁蛋白的浓度为10mg/L，胰岛素的浓度为20mg/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为100μg/L，转化生长因子-β的浓度为2μg/L。
实施例1
本实施例提供一种引导多能干细胞成为发育停滞的细胞的方法，具体实现如下：
在E8培养基中培养人多能干细胞H1(即H1人类胚胎干细胞)，每天更换新鲜培养基，当细胞密度达到70％-80％时进行传代。首先用DPBS-EDTA洗涤两次，然后在室温下孵育5分钟，第三次抽吸DPBS-EDTA，并添加含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基。重悬细胞后，以1:6至1:12的密度传代，加入预先包被基质胶的12孔板。细胞粘附在平板上的一天后，加rapamycin的E8培养基。
细胞传代三次以后收取细胞做定量PCR和免疫荧光实验检测多能基因表达，并且将细胞注射到裸鼠皮下，6-8周后将畸胎瘤(Teratoma)组织分离，固定后做石蜡包埋和切片染色，观察三胚层分化形态，测试结果见图1-图3。图中，control是指不加入rapamycin的空白试验。
从图1可以看出，rapamycin连续处理的人多能干细胞生长速度明显减慢。
图2为H1用rapamycin处理3代后做的多能基因检测，结果显示依然可以高表达，具有干细胞特性。从图2可以看出，rapamycin连续处理的人多能干细胞高表达OCT4和NANOG。
从图3可以看出，rapamycin连续处理的人多能干细胞可以获得具有三胚层形态的畸胎瘤Teratoma。
实施例2
将人类人多能干细胞H1培养在E8培养基中，每天更换新鲜培养基，细胞密度达到70％-80％。首先用DPBS-EDTA洗涤两次，然后在室温下孵育5分钟，第三次除去DPBS-EDTA，并用含有5μMRockinhibitor的E8培养基重悬细胞后，以1:6至1:12的密度传代，加入预先包被基质胶的12孔板，加入含有rapamycin抑制剂的E8培养基。
当细胞连续在同一个孔生长8天左右时，即使不更换E8培养基，rapamycin处理的细胞依然可以存活的很好，如图4中A所示。rapamycin连续处理的人多能干细胞培养过程中不更新E8培养基，和对照组比较在生长后期逐渐超越对照组。
当每天更换E8培养基时，rapamycin可以防止干细胞过度生长，如图4中B所示。rapamycin连续处理的人多能干细胞培养过程中每天更新E8培养基，在生长后期逐渐达到并超过对照组。
从图4可以看出，采用含有rapamycin的培养基对人多能干细胞进行培养，可以有效防止人多能干细胞克隆过度生长。
综上所述，本发明提供引导多能干细胞成为发育停滞的细胞的方法及应用，通过在多能干细胞(如人多能干细胞)培养中加入rapamycin，可以引导多能干细胞成为类似自然状态下发育停滞的细胞，有利于防止特殊情况下多能干细胞过度增殖，为人类多能干细胞更多应用提供了新的思路，并且可以提高细胞生产的效率。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种引导多能干细胞成为发育停滞的细胞的方法，其特征在于，包括：在培养多能干细胞的培养基中加入rapamycin。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述rapamycin在培养基中的浓度为20-200nM；优选为50-100nM。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多能干细胞为人多能干细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述人多能干细胞选自人类胚胎干细胞或人类诱导多能干细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述人多能干细胞的培养是在添加有rapamycin的E8培养基中进行培养的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述E8培养基的成分包括DMEM/F12培养基、L-抗坏血酸-2-磷酸镁、硒酸钠、转铁蛋白、胰岛素、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述E8培养基中，L-抗坏血酸-2-磷酸镁的浓度为60-70mg/L，硒酸钠的浓度为12-16μg/L，转铁蛋白的浓度为8-12mg/L，胰岛素的浓度为18-22mg/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为90-110μg/L，转化生长因子-β的浓度为1-3μg/L。
8.一种获取多能干细胞的方法，其特征在于，其采用权利要求1-7中任一项所述的方法引导多能干细胞成为发育停滞的细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，停止培养之后，采用培养基将得到的细胞进行润洗。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，采用E8培养基对得到的细胞润洗至少2次。
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