KR20110024660A - 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포의 혈관내피세포로의 혈청 및 이종 비함유 분화방법 - Google Patents

인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포의 혈관내피세포로의 혈청 및 이종 비함유 분화방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포로부터 배상체를 형성시키는 단계; (b) 인간 재조합 BMP-4(human recombinant bone morphogenic protein-4), 인간 재조합 bFGF(human recombinant basic fibroblast growth factor), 인간 재조합 악티빈 A(human recombinant Activin A), 인간 재조합 VEGF-A(human recombinant vascular endothelial growth factor A), 및 혈청대체물(serum replacement)로 보충된 무-혈청(serum free) 및 무-이종(異種)물질(xeno-free) 배지 중에서, 단계(a)에서 얻어진 배상체를 배양하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 세포를 인간 재조합 VEGF-A로 보충된 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포의 혈관내피세포로의 분화방법을 제공한다.
인간 배아줄기세포, 인간 유도만능줄기세포, 혈관내피세포, 무-혈청, 무-이종물질

Description

인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포의 혈관내피세포로의 혈청 및 이종 비함유 분화방법{Serum-free, xeno-free method for differentiation of human embryonic stem cells or human induced pluripotent stem cells into endothelial cells}
본 발명은 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포의 혈관내피세포로의 분화방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 무-혈청(serum free) 및 무-이종(異種)물질(xeno-free) 배지를 사용하여 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포를 혈관내피세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
인간 배아줄기세포는 끊임없이 증식하여 일정한 수를 유지하려는 자가재생산능력(self-renewal)과 함께 거의 모든 체세포로 분화할 수 있는 전분화능 (pluripotency)을 가지고 있어, 인간 배아줄기세포 연구는 발생학, 재생의학, 및 신약개발 등 여러 학술분야에서 급진적인 진보를 가져올 것으로 예상하고 있으며, 인간 배아줄기세포를 원하는 세포로 분화하여 당뇨병, 신경계 질환, 심혈관계 질환 등의 여러 난치병 환자에 세포치료제로 사용될 수 있다는 면에서 매우 활용가치가 높다. 특히, 허혈성 심혈관계 질환을 가진 인구가 늘어나고, 기존의 수술이나 약물 치료에 부적응하는 환자를 위해 성체줄기세포를 이용한 세포치료법이 연구되고 있으나, 충분한 수의 성체줄기세포를 확보하는데 어려움을 겪고 있다. 이에 성체줄기세포보다 자가증식능력과 분화능력이 뛰어난 인간 배아줄기세포를 혈관내피세포로 분화하여 치료에 활용하고자 하는 노력이 활발하게 진행되고 있다.
인간 배아줄기세포를 심혈관계 질환 세포치료제로 실용화하기 위해서는 우선 이식시 면역거부반응을 최소화하기 위해서 환자 면역적합성 줄기세포를 확보하여야 하는데, 최근 환자의 체세포를 인간 배아줄기세포와 유사한 세포(유도만능줄기세포)로 역분화 하는 방법이 보고되어 환자 면역적합성 세포치료제 개발의 가능성이 높아지고 있다. 또한 인간 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포를 혈관내피세로로 분화 유도하는 기술이 필수적이며, 분화 과정 중 혈청 및 동물유래 물질 사용을 제한하여, 병원체 감염의 위험을 방지하여 임상 적용 시 안전성을 확보하는 것이 중요한 문제로 대두되고 있다.
현재 시행되고 있는 인간 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포의 혈관내피세포로의 분화법은 크게 소혈청(fetal bovine serum; FBS) 이용한 분화법 및 마우스 유래 골수 기질 세포(stromal cell) (OP9)과의 공배양을 이용한 분화법으로 대별된다. 소혈청(fetal bovine serum; FBS) 이용한 분화법으로서, 2007년 MIT의 Robert Langer 연구팀은 인간 배아줄기세포의 분화유도에 일반적으로 쓰이는 3차원적 배상체(embryonic body: EB)를 만든 후, 배상체를 20% FBS 가 첨가된 배양액에서 12일 간 배양하였다. 유세포 분석기를 이용하여 CD34 양성세포를 분리한 후 혈관내피세포로의 분화를 위해 5% FBS가 첨가된 EGM-2(endothelial growth medium-2)에서 10- 15일 더 배양하여 CD31 양성 혈관내피세포를 얻었다 (Vascular Progenitor cells isolated from human embryonic stem cells give rise to endothelial and smooth muscle-like cells and form vascular networks in vivo. Ferreira LS, Gerecht S, Shieh HF, Watson N, Rupnick MA, Dallabrida SM, Vunjak-Novakovic G, Langer R. Circulation Research 2007;101:286-94). 또한, 2007년 Chung 연구팀은 3차원적인 배상체를 10% FBS가 첨가된 배양액에서 9일간 배양하고 5% FBS이 첨가된 EGM-2에서 추가 배양한 후 본 빌란트 인자(von Willebrand factor)를 표지인자로 사용하여 유세포 분석기를 통해 혈관내피세로를 분리한 바 있다(Improvement of postnatal neovascularization by human embryonic stem cell derived endothelial-like cell transplantation in a mouse model of hindlimb ischemia. Cho SW, Moon SH, Lee SH, Kang SW, Kim J, Lim JM, Kim HS, Kim BS, Chung HM. Circulation 2007;116:2409-19). 또한, 2007년 Scadden 연구팀은 3차원적인 배상체 대신 인간 배아줄기세포를 2차원적 단일층(monolayer)으로 배양하여 혈관내피세포로 분화하는 방법을 보고하였다. 상기 분화방법에서 사용된 분화조건 역시 15% FBS를 이용하여 CD34 양성세포로 분화한 뒤 5% FBS가 첨가된 EGM-2에서 7-10일 배양하여 CD31 양성 혈관내피세포의 분화를 유도하고 있다(endothelial cells derived from human embryonic stem cells form durable blood vessels in vivo. Wang ZZ, Au P, Chen T, Shao Y, Daheron LM, Bai H, Arzigian M, Fukumura D, Jain RK, Scadden DT. Nature Biotechnology 2007;25:317-8).
마우스 유래 골수 기질 (OP9)과의 공배양을 이용한 분화법으로서, 2007년 Itoh 연구팀에서는 마우스 골수 유래의 기질 세포를 지지 층(feeder layer)으로 사용하여 인간 배아줄기세포와 10% FBS 배양액 조건하에 공배양한 후, KDR 양성 세포를 분리하였다. 상기 KDR 양성세포를 10% FBS와 VEGF(vascular endothelial growth factor A)가 함유된 배양액에서 더 분화시켜 혈관내피세포를 얻었다(Pathway for differentiation of human embryonic stem cells to vascular cell components and their potential for vascular regeneration. Sone M, Itoh H, Yamahara K, Yamashita JK, Yurugi-Kobayashi T, Nonoguchi A, Suzuki Y, Chao TH, Sawada N, Fukunaga Y, Miyashita K, Park K, Oyamada N, Sawada N, Taura D, Tamura N, Kondo Y, Nito S, Suemori H, Nakatsuji N, Nishikawa S, Nakao K. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007 Oct;27(10):2127-34). 상기 마우스 세포와의 공배양을 통한 인간 배아줄기세포의 혈관내피세포로의 분화법은, 인간 유도만능줄기세포의 혈관내피세포로의 분화에도 적용되어, 2009년 Slukvin 연구팀 및 Sone 연구팀에서 그 결과를 보고한 바 있다(Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Choi KD, Yu J, Smuga-Otto K, Salvagiotto G, Rehrauer W, Vodyanik M, Thomson J, Slukvin I. Stem Cells 2009;27(3):559-67; 및 Induction and isolation of vascular cells from human-induced pluripotent stem cells. Taura D, Sone M, Homma K, Oyamada N, Takahashi K, Tamura N, Yamanaka S, Nakao K. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology 2009;29(7):1100-3).
그러나, 종래에 보고된 인간 배아줄기세포 혹은 인간 유도만능줄기세포를 혈 관내피세포로 분화시키는 방법은, 소혈청 혹은 동물유래 세포와의 공배양을 이용하고 있다. 따라서, 인간 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포에서 분화된 혈관내피세포를 임상 적용함에 있어 동물 유래 병원균체(pathogen)에 의한 오염(예를 들어, 세균 및 바이러스 감염 가능성) 및 그로 인한 환자의 면역반응 등을 초래할 수 있는 문제점이 존재한다. 특히, 인간 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 임상에 적용함에 있어서, 가장 중요한 문제로 거론되고 있는 안전성 확보를 위하여 혈청 및 동물유래원이 포함되지 않는 새로운 분화방법을 개발하는 것이 필수적으로 요구되고 있다.
본 발명자들은 혈청 및 동물 유래 물질 및/또는 동물유래 세포를 사용하지 않는 혈관내피세포 분화방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 분화에 영향을 미치는 인자를 다양하게 분석하였으며, 그 결과 특정 사이토카인들의 조합을 포함하는 배지 즉, 무-혈청(serum free) 및 무-이종(異種)물질(xeno-free) 배지를 확립하였으며, 상기 무-혈청 및 무-이종물질 배지를 사용하여 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포를 높은 효율로 혈관내피세포로 분화시킬 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 특정 사이토카인들을 포함하는 무-혈청 및 무-이종물질 배지를 사용하여, 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포를 혈관내피세로로 분화시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, (a) 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포로부터 배상체를 형성시키는 단계; (b) 인간 재조합 BMP-4(human recombinant bone morphogenic protein-4), 인간 재조합 bFGF(human recombinant basic fibroblast growth factor), 인간 재조합 악티빈 A(human recombinant Activin A), 인간 재조합 VEGF-A(human recombinant vascular endothelial growth factor A), 및 혈청대체물(serum replacement)로 보충된 무-혈청(serum free) 및 무-이종(異種)물질(xeno-free) 배지 중에서, 단계(a)에서 얻어진 배상체를 배양하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 세포를 인간 재조합 VEGF-A로 보충된 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포의 혈관내피세포로의 분화방법이 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따라, (a) 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포로부터 배상체를 형성시키는 단계; (b1) 인간 재조합 BMP-4, 인간 재조합 bFGF, 인간 재조합 악티빈 A, 및 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지 중에서, 단계(a)에서 얻어진 배상체를 배양하는 단계; (b2) 인간 재조합 BMP-4, 인간 재조합 bFGF, 인간 재조합 악티빈 A, 인간 재조합 VEGF-A, 및 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지 중에서, 단계(b1)에서 얻어진 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 단계(b2)에서 얻어진 세포를 인간 재조합 VEGF-A로 보충된 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포의 혈관내피세포로의 분화방법이 제공된다.
본 발명의 분화방법에 있어서, 단계(a)는 상기 배상체를 인간 재조합 BMP-4, 인간 재조합 bFGF, 인간 재조합 악티빈 A, 및 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지 중에서 1∼14 일 동안 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로는, 단계(a)는 상기 배상체를 1∼30 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 및 5∼20 중량%의 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지 중에서 2∼10 일 동안, 더욱 바람직하게는 10∼20 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 5∼10 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 3∼10 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 및 10 중량%의 혈청 대체물로 보충된 DMEM/F12 배지 중에서 2∼6 일 동안 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
상기 단계(b) 혹은 단계(b1) 및 (b2)는 저산소 조건(hypoxia condition)에서 바람직하게 수행될 수 있다.
단계(b)는, 1∼30 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 1∼100 ng/ml의 인간 재조합 VEGF-A, 및 5∼20 중량%의 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지, 더욱 바람직하게는 10∼20 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 5∼10 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 3∼10 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 10∼50 ng/ml의 인간 재조합 VEGF-A, 및 10 중량%의 혈청대체물로 보충된 DMEM/F12 배지 중에서 단계(a)에서 얻어진 배상체를 4∼14 일 동안 배양함으로써 수행될 수 있다.
또한, 단계(b1)은 1∼30 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 및 5∼20 중량%의 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지, 더욱 바람직하게는 10∼20 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 5∼10 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 3∼10 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 및 10 중량%의 혈청대체물로 보충된 DMEM/F12 배지 중에서, 단계(a)에서 얻어진 배상체를 2∼6 일 동안 배양함으로써 수행될 수 있다.
또한, 단계(b2)는 1∼30 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 1∼100 ng/ml의 인간 재조합 VEGF-A, 및 5∼20 중량%의 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지, 더욱 바람직하게는 10∼20 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 5∼10 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 3∼10 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 10∼50 ng/ml의 인간 재조합 VEGF-A, 및 10 중량%의 혈청대체물로 보충된 DMEM/F12 배지 중에서, 단계(b1)에서 얻어진 세포를 2∼12 일 동안 배양함으로써 수행될 수 있다.
단계(c)는 단계(b) 또는 단계(b2)에서 얻어진 세포를 인간 재조합 VEGF-A로 보충된 배지, 바람직하게는 10∼100 ng/ml의 인간 재조합 VEGF-A로 보충된 배지, 더욱 바람직하게는 10∼50 ng/ml의 인간 재조합 VEGF-A로 보충된 EBM-2(endothelial basal medium-2) 배지 중에서 배양함으로써 수행될 수 있다.
본 발명에 의해, 특정 사이토카인들의 조합을 포함하는 배지, 즉 인간 재조합 BMP-4, 인간 재조합 bFGF, 인간 재조합 악티빈 A, 인간 재조합 VEGF-A, 및 혈청대체물로 보충된 배지를 사용할 경우, 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포를 높은 효율로 혈관내피세포로 분화시킬 수 있음이 밝혀졌다. 상기 배지는 무-혈청(serum free) 및 무-이종(異種)물질(xeno-free) 배지로서, 혈청 및 동물유래 세포를 사용할 필요가 없으므로, 각종 허혈성 심혈관질환 환자에 임상적용함에 있어 동물세포 및 혈청 사용에 의한 바이러스 및 세균 감염등을 최소화할 수 있어 줄기세포 치료제의 안전성을 확보할 수 있다.
본 명세서에서, "인간 배아줄기세포(human embryonic stem cells)"라 함은 인간 상실배의 내부 세포 괴로부터 유래된 전능 세포를 말한다. 상기 인간 배아줄기세포는 예를 들면, CHA-hES3 (Ahn SE, Kim S, Park KH, Moon SH, Lee HJ, Kim GJ, Lee YJ, Park KH, Cha KY, Chung HM. Primary bone-derived cells induce osteogenic differentiation without exogenous factors in human embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2006 10;340(2):403-408) 등을 사용하거나, 상업적으로 구입할 수 있는 H9 세포 (WiCell 사, USA)를 사용할 수도 있다. 또한, 인간 배아 줄기세포는 상기와 같이 공지의 방법에 의해 당업자에 의하여 용이하게 구축될 수 있다.
"인간 유도만능줄기세포(human induced pluripotent stem cells, iPS 세포)"라 함은 "reprogrammed pluripotent stem cells"로도 지칭되며, 분화된 세포(예를 들어, 체세포)를 재프로그램하여(즉, 역분화시켜) 만능분화능(pluripotency)을 갖도록 유도된 세포를 말한다. 상기 역분화 만능 줄기세포는 뇌, 심장, 혈관 등의 장기 세포로 다양하게 분화될 수 있다. iPS 세포는 역분화 유도인자들에 의해 분화된 세포를 재프로그램화(reprogramming)하여 얻어질 수 있으므로, 체세포 핵치환(somatic cell transfer) 없이 환자 면역 적합성 만능 세포주의 생성이 가능하다. 따라서 iPS 세포는 환자의 세포에서 유래될 수 있어 임상에 적용 시 면역 거부반응을 피할 수 있다. 또한, iPS 세포는 난자나 배아를 사용하지 않기 때문에 생명윤리적 논란이나 종교적 비난이 없는 장점이 있다. iPS 세포는 공지의 방법, 예를 들어 Yu J et al. (2007) Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 혹은 Takahashi K et al. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872 등에 개시된 방법에 따라 얻을 수 있다.
본 발명자들은 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포의 혈관내피세포로의 무-혈청(serum free) 및 무-이종(異種)물질(xeno-free) 분화방법을 확립하기 위하여, 인간 재조합 성장인자 및 사이토카인 만을 이용하여 최적의 분화조건을 탐색하였다. 그 결과, FBS 혹은 마우스 골수세포와의 공배양 대신 특정 단백질 즉, 인간 재조합 BMP-4, 인간 재조합 bFGF, 인간 재조합 악티빈 A, 인간 재조합 VEGF-A, 및 혈청대체물을 이용하여 인간배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포를 CD31 양성의 혈관내피세포로 높은 효율로(약 13%) 분화시킬 수 있음을 확인하였다. CD31을 표지인자로 MACS를 통해 혈관내피세포를 순수 분리하였으며, 이렇게 분리된 세포는 다양한 시험을 통하여 혈관내피세포의 특징과 기능을 가지고 있음을 검증하였다. 즉, 혈관내피세포의 특징적인 세포 형태인 코블스톤(cobblestone) 형태가 관찰되었고, 혈관내피세포의 특징인 UEA-1 렉틴에 의해 염색되는 것을 확인하였다. 또한 혈관내피세포의 기능 검증법으로 Matrigel 위에서 맥관이 형성되는 것을 확인하였고, 또 다른 혈관내피세포 특징적 기능인 아세틸화된 LDL(acetylated LDL)의 섭취능도 관찰되었다.
본 발명은 (a) 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포로부터 배상체를 형성시키는 단계; (b) 인간 재조합 BMP-4, 인간 재조합 bFGF, 인간 재조합 악티빈 A, 인간 재조합 VEGF-A, 및 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지 중에서, 단계(a)에서 얻어진 배상체를 배양하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 세포를 인간 재조합 VEGF-A로 보충된 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포의 혈관내피세포로의 분화방법을 제공한 다.
상기 단계(b)는 필요에 따라 2단계 이상의 다단계 배양 시스템을 적용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 인간 재조합 VEGF-A를 별도로 분리하여, 인간 재조합 BMP-4, 인간 재조합 bFGF, 인간 재조합 악티빈 A, 및 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지 중에서 배양을 수행한 다음, 상기 배양액 조성에 인간 재조합 VEGF-A로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지 중에서 배양을 수행할 경우, VEGF-A의 수용체가 인간 배아줄기세포에 과발현되는 시점에서 VEGF-A를 배지에 첨가함으로써, 인간 재조합 VEGF-A의 사용을 최소화하는 장점이 있다.
따라서, 본 발명의 일 구현예에 따라, (a) 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포로부터 배상체를 형성시키는 단계; (b1) 인간 재조합 BMP-4, 인간 재조합 bFGF, 인간 재조합 악티빈 A, 및 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지 중에서, 단계(a)에서 얻어진 배상체를 배양하는 단계; (b2) 인간 재조합 BMP-4, 인간 재조합 bFGF, 인간 재조합 악티빈 A, 인간 재조합 VEGF-A, 및 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지 중에서, 단계(b1)에서 얻어진 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 단계(b2)에서 얻어진 세포를 인간 재조합 VEGF-A로 보충된 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포의 혈관내피세포로의 분화방법이 제공된다.
본 발명의 분화방법은 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포로부터 배상체를 형성시키는 단계[즉, 단계(a)]를 포함한다.
상기 배상체를 형성하는 방법은 공지의 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어, Takahashi K et al. Cell (2007) 131, 861-872에 개시된 방법에 따라 혈청(또는 혈청 대체물), L-글루타민, 비필수 아미노산, 및 β-머캅토에탄올을 포함하는 DMEM/F12 배지 중에서 배양된 인간 배아 줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포를 콜라게네이즈 IV, 디스페이즈 효소, 혹은 물리적 분리방법으로 지지세포와 분리시킨 후 세포덩어리를 새로운 배양 접시에 옮겨서 형성할 수 있다
단계(a)는, 필요에 따라, 상기 배상체를 인간 재조합 BMP-4, 인간 재조합 bFGF, 인간 재조합 악티빈 A, 및 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지 중에서 1∼14 일 동안 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기와 같이 배상체를 추가로 배양할 경우, 이어지는 분화 유도 단계에서 분화 배양액에 대한 세포 적응기간을 부여하므로 바람직하다.
상기 배상체의 추가 배양은, 얻어진 배상체를 1∼30 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 및 5∼20 중량%의 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지 중에서 2∼10 일 동안, 더욱 바람직하게는 10∼20 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 5∼10 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 3∼10 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 및 10 중량%의 혈청 대체물로 보충된 DMEM/F12 배지 중에서 2∼6 일 동안 배양함으로써 수행될 수 있다. 상기 인간 재조합 BMP-4, 인간 재조합 bFGF, 인간 재조합 악티빈 A, 및 혈청대체물은 모두 상업적으로 구입할 수 있으며, 예를 들어, 인간 재조합 BMP-4 및 인간 재조합 bFGF는 각각 Prospec사로부터 얻을 수 있고, 인간 재조합 악티빈 A는 R&D사로부터 얻을 수 있으며, 혈청대체물은 Invitrogen사의 Knockout™ Serum Replacement 를 사용할 수 있다. 또한, 상기 DMEM/F12은 http://www.atcc.org/Portals/1/Pdf/30-2006.pdf 등에 공지된 것을 사용할 수 있다.
상기 단계(b) 혹은 단계(b1) 및 (b2)는 저산소 조건(hypoxia condition)에서 바람직하게 수행될 수 있다. 상기 저산소 조건은 예를 들어, 산소 분압이 15% 이하, 바람직하게는 1 내지 10%, 더욱 바람직하게는 약 3%로 유지되는 배양기 조건일 수 있으며, 저산소 조건하에서 단계(b) 혹은 단계(b1) 및 (b2)의 배양을 수행할 경우, 보다 효율적으로 혈관내피세포로의 분화를 유도할 수 있다.
단계(b)는, 1∼30 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 1∼100 ng/ml의 인간 재조합 VEGF-A, 및 5∼20 중량%의 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지, 더욱 바람직하게는 10∼20 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 5∼10 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 3∼10 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 10∼50 ng/ml의 인간 재조합 VEGF-A, 및 10 중량%의 혈청대체물로 보충된 DMEM/F12 배지 중에서 단계(a)에서 얻어진 배상체를 4∼14 일 동안 배양함으로써 수행될 수 있다.
또한, 단계(b1)은 1∼30 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 및 5∼20 중량%의 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지, 더욱 바람직하게는 10∼20 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 5∼10 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 3∼10 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 및 10 중량%의 혈청대체물로 보충된 DMEM/F12 배지 중에서, 단계(a)에서 얻어진 배상체를 2∼6 일 동안 배양함으로써 수행될 수 있다.
또한, 단계(b2)는 1∼30 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 1∼100 ng/ml의 인간 재조합 VEGF-A, 및 5∼20 중량%의 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지, 더욱 바람직하게는 10∼20 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 5∼10 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 3∼10 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 10∼50 ng/ml의 인간 재조합 VEGF-A, 및 10 중량%의 혈청대체물로 보충된 DMEM/F12 배지 중에서, 단계(b1)에서 얻어진 세포를 2∼12 일 동안 배양함으로써 수행될 수 있다.
상기 단계(b) 혹은 단계(b1) 및 (b2)에서 사용되는, 인간 재조합 BMP-4, 인간 재조합 bFGF, 인간 재조합 악티빈 A, 및 혈청대체물은 모두 상기한 바와 같이 상업적으로 구입할 수 있으며, 또한, DMEM/F12도 상기한 바와 같이 공지된 것을 사용할 수 있다. 인간 재조합 VEGF-A는 R&D사로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 분화방법은 단계(b) 또는 단계(b2)에서 얻어진 세포를 인간 재조합 VEGF-A로 보충된 배지 중에서 배양하는 단계를 포함한다.
상기 단계(c)의 배양은 단계(b) 또는 단계(b2)에서 얻어진 세포를 인간 재조합 VEGF-A로 보충된 배지, 바람직하게는 10∼100 ng/ml의 인간 재조합 VEGF-A로 보충된 배지, 더욱 바람직하게는 10∼50 ng/ml의 인간 재조합 VEGF-A로 보충된 EBM-2(endothelial basal medium-2) 배지 중에서 배양함으로써 수행될 수 있다. 상기 EBM-2 배지는 Lonza사로부터 구입할 수 있다. 단계(c)의 배양에 의해, 단계 (b)에서 분화된 혈관내피세포를 선택적으로 증식시켜 분화 효율을 높일 수 있다.
상기와 같이 분화 유도된 세포 즉 혈관내피세포는 통상의 방법에 따라 분리 할 수 있다. 예를 들어, 상기 분리는 물리적 분리방법, 효소 처리방법 등을 사용하여 분리할 수 있다. 또한, 항체를 사용한 유세포 분석법, 자성입자 분석법등으로 분리할 수 있다. 상기와 같이 얻어진 혈관내피세포는 통상의 배양액, 예를 들어 EGM-2/MV(Cambrex) 배양액 혹은 50 ng/ml의 VEGF-A가 포함된 EBM 배양액 및 트립신-EDTA 등을 사용하여 계대 배양하여 더 증식시킬 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 시험방법
(1-1) 무-혈청 및 무-이종물질 배지에서 인간 배아줄기세포의 분화
<단계 I>
미분화 상태의 인간 배아줄기세포(H9, WiCell, USA)를 디스페이즈를 이용하여, 공지의 방법(Takahashi K et al. Cell (2007) 131, 861-872)에 따라 배상체를 형성시켰다.
얻어진 배상체를 인간 재조합 BMP-4(10ng/ml, Prospec), 인간 재조합 bFGF(5ng/ml, Prospec), 인간 재조합 악티빈 A (3ng/ml, R&D), 및 혈청대체물(Knockout™ Serum Replacement xenofree, 10 중량%, invitrogen)로 보충된 DMEM/F12 (invitrogen, 조성: http://www.atcc.org/Portals/1/Pdf/30-2006.pdf)에 48시간 동안, 정상산소분압 (20% 산소농도) 조건에서 부유배양하였다.
<단계 II>
단계 I에서 얻어진 배상체를 파이펫을 사용하여 분리하여, 새롭게 준비한 혈관내피세포 분화 배양액 즉, 혈청대체물(Knockout™ Serum Replacement xenofree, 10 중량%, invitrogen), 10ng/ml의 재조합 인간 BMP-4, 5ng/ml의 재조합 인간 bFGF, 및 3ng/ml의 재조합 인간 악티빈 A로 보충된 DMEM/F12로 배지 중에서, 저산소 분압상태(3% 산소농도)에서 48시간 동안 부유배양하였다.
<단계 III>
단계 II에서 얻어진 배상체를 파이펫을 사용하여 분리하여, 혈청대체물(Knockout™ Serum Replacement xenofree, 10 중량%, invitrogen), 10ng/ml의 재조합 인간 BMP-4, 5ng/ml의 재조합 인간 bFGF, 3ng/ml의 재조합 인간 악티빈 A, 및 10 ng/ml의 재조합 VEGF-A(R&D사)로 보충된 DMEM/F12로 배지 중에서, 저산소 분압상태(3% 산소농도)에서 6일 동안 부유배양하였다.
<단계 IV>
단계 III에서 얻어진 배상체를 파이펫을 사용하여 분리하여, 배양접시로 옮긴 후, 인간 재조합 VEGF-A (50ng/ml)로 보충된 EBM-2(endothelial basal medium-2, Lonza) 중에서 정상 산소 분압 상태(즉, 20% 산소농도)에서 8일 동안 배양하였다.
(1-2) 무-혈청 및 무-이종물질 배지에서 인간 유도만능줄기세포의 분화
미분화 상태의 인간 유도만능줄기세포 콜로니(SES-3, SES-8)를 디스페이즈를 이용하여, 공지의 방법(Takahashi K et al. Cell (2007) 131, 861-872)에 따라 배상체를 형성시키고, 얻어진 배상체를 사용한 것을 제외하고는, (1-1)과 동일한 방법으로 분화를 유도시켰다.
(2) MACS (Magnetic activated cell sorting) 분석
분화된 세포들은 CD31 MicroBead Kit (MACS)를 이용하여 선별하였다. 트립신/EDTA (Gibco)를 이용하여 세포들을 분리하고, Kit에 첨부된 FcR 시약과 CD31 MicroBeads를 넣고 4 ℃에서 약 30분간 보관하였다. MACS 컬럼을 이용하여 CD31이 표지된 세포만을 분리하였다.
(3) 유세포 분석 (Fluorescence activated cell sorting: FACS)
세포를 trypsin/EDTA로 20분간 처리하여 분리한 후 형광물질이 복합화되어 있는 항체 (anti-human Tie2, CD31, KDR, CD34 항체)와 4 ℃에서 20분간 반응시킨 후 PBS로 세척하였다. 분석은 FACS (caliber flow cytometry, BD Bioscience)를 사용하였다.
(4) 실시간(Real-time) 역전사 중합효소 반응 (RT-PCR)
Trizol (Invitrogen)을 이용하여 세포의 RNA를 추출하고, 유전자들의 발현을 실시간(Real-time) PCR 법을 이용하여 관찰하였다. 먼저 1 ㎍의 RNA를 Superscript first-strand synthesis system (Invitrogen)를 통해 cDNA로 합성하고, 각 유전자 의 프라이머 및 Real time PCR SYBR-Green PCR master mix (Qiagen)를 이용하여 증폭하여 유전자 발현을 Bioneer Exicycler_96 (Bioneer corporation)로 측정하였다.
사용된 프라이머는 다음 표 1과 같다.
표지인자 서열
CD34 정방향 5'-ctccagctgtgcggagttta-3'
역방향 5'-ttggccaagaccagcagtag-3'
CD31 정방향 5'-gctctcttgatcattgcg-3
역방향 5'-gaggacacttgaacttcc-3'
KDR 정방향 5'-gtgaccaacatggagtcgtg-3'
역방향 5'-tgcttcacagaagaccatgc-3'
c-kit 정방향 5'-agcaaatccatccccacacc-3'
역방향 5'-caaccttccccaaagctcca-3'
Tie2 정방향 5'-ctgcctaaaagtcagaccac-3'
역방향 5'- gtgttgactctagctcggac-3'
GAPDH 정방향 5'-aagggtcatcatctctgccc-3'
역방향 5'-gtgatggcatggactgtggt-3'
(5) 형광면역염색
분화된 세포를 4% 파라포름알데히드에 10분간 고정하고, 0.5% Triton X-100에 20분간 반응시켰다. 10% 고우트 혈청(goat serum)이 들어있는 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline, PBS)에 1시간 동안 블록킹(blocking)하고, CD31 (Dako) 1차 항체를 4 ℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 PBS로 세척하고 형광이 표지된 2차 항체와 상온에서 반응시키고 약 2시간 후 PBS로 세척하였다. 마지막으로 4,6-디아미노-2-페닐인돌 (DAPI)로 핵을 염색한 후 LSM 510 META confocal miscroscope (Carl Zeiss Inc.)을 이용하여 관찰하였다.
(6) 혈관내피세포 맥관 형성(Tube formation) 분석
혈관내피세포의 중요 기능인 맥관 형성능은 Matrigel assay를 통해 확인하였다. 분화된 세포(3 X 104)를 Matrigel (BD)에 파종하고 약 18시간이 지난 후 맥관 형성 여부를 확인하였다.
(7) 아세틸화 저밀도 지방단백질 (acetylated low density lipoprotein) 분석법
혈관내피세포의 특징인 아세틸화 LDL 흡수(acetylated LDL uptake)를 확인하기 위하여 10mg/ml의 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트((DiI)-표시된 아세틸화 LDL(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate(DiI)-labeled acetylated LDL)(Molecular Probes, Eugene, OR)로 37 ℃에서 3시간 동안 배양하고 고정한 후, 다시 형광-이소티오시아네이트(fluorescein-isothiocyanate, FITC)-컨쥬게이티드 Ulex europaeus agglutinin(UEA)-1 렉틴(10 μg/mL, Sigma)에서 4시간 동안 배양 후 형광 현미경(Zeiss)으로 관찰하여 이중형광을 나타내는 혈관내피세포를 관찰하였다.
2. 시험결과
(1) 줄기세포 분화과정 중의 혈관내피세포 관련 유전자 발현
미분화된 인간 배아줄기세포를 상기 분화 조건에서 분화시킨 후, 각각 분화 10일(즉, 단계 III), 18일(즉, 단계 IV) 경과 후 세포를 회수하여, 실시간 RT-PCR 을 통하여 분화과정 중의 혈관내피세포 관련 유전자의 발현 양상을 조사하였다. 그 결과는 도 1과 같다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 미분화 인간배아줄기세포(D0)와 비교시 VEGF의 수용체인 KDR, 줄기세포인자(stem cell factor)의 수용체인 c-kit, 조혈모세포 특이 마커인 CD34와 조혈모세포 및 혈관내피세포 공동 발현 유전자인 Tie2의 발현이 18일 경과 후 크게 증가되는 것을 확인하였다.
(2) 형광면역염색 분석 - 혈관내피세포 검증
인간 배아줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포를 검증하기 위하여, 분화 18일 째 세포에 CD31 항체를 이용한 형광면역 염색을 실시하였다. 그 결과는 도 2와 같다. 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, CD31 양성세포가 세포 콜로니의 주변보다는 중심부분에서 주로 관찰되었다. 동일한 조건에서 인간 유도만능줄기세포를 혈관내피세포로 분화시킨 경우에도 동일한 실험 결과가 관찰되었다.
(2) 유세포 분석 - 정량 분석
면역형광염색 결과를 정량적으로 확인하기 위하여, 인간 배아줄기세포에서 분화 18일째 세포를 회수하여 유세포 분석을 실시하였다. 그 결과는 도 3과 같다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 분화 18일째 세포 중 혈관내피세포 특이 마커인 CD31양성 세포가 전체의 13.68%를 차지함으로써, 높은 효율로 분화가 유도되었다.
(3) MACS 분석
MACS를 이용하여 CD31 양성 세포만을 순수 분리한 후, 분리한 세포가 혈관내피세포인지 검증하였다. 분리한 세포를 세포 배양용기에 파종하여 세포의 형태(morphology)를 관찰하였다. 그 결과는 도 4와 같다. 도 4로부터, 분리한 세포들은 혈관내피세포의 전형적인 모양인 코블스톤(cobblestone) 형태를 지니고 있으며, 이 세포들을 혈관내피세포 배양액에서 더 배양하면 콜로니를 구성하며 증식하는 것이 확인되었다.
(4) 맥관 형성 확인
분리한 세포가 혈관내피세포의 특징적인 기능을 가지고 있는지 확인하기 위하여, 분리한 세포에 의해 혈관생성의 초기 단계에서 일어나는 맥관 형성이 일어나는지 여부를 Matrigel 맥관 형성 분석법을 이용하여 조사하였다. 그 결과는 도 5와 같다. 도 5로부터, 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포 유래 CD31 양성세포 모두 Matrigel 위에서 맥관을 형성하는 것이 확인되었다.
(5) 아세틸화 LDL 섭취 능력 평가
또 다른 혈관내피세포의 기능검증법으로서 아세틸화 LDL 섭취 능력을 확인하기 위하여, 붉은 형광으로 표지된 아세틸화 LDL을 세포와 함께 배양하여 세포가 아세틸화 LDL을 섭취하는지 여부를 형광현미경으로 관찰하였다. 동시에 녹색 형광으로 표지된 UEA-1 렉틴을 이용하여 분리한 세포가 혈관내피세포에 특이적으로 발현되는 당단백질을 세포막 표면에 발현하고 있는지 여부를 확인하였다. 그 결과는 도 6과 같다. 도 6으로부터, 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포 유래 CD31 양성세포는 아세틸화 LDL을 섭취하고 UEA-1 렉틴에 의해 염색되는 것으로 관찰되었다.
도 1은 인간 배아줄기세포의 분화과정 중 세포의 유전자 발현 양상을 분석한 결과로서, 분화전 (D0), 분화 후 각각 10일, 18일 경과한 세포의 유전자 발현을 실시간 RT-PCR로 확인한 결과이다. HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell)는 혈관내피세포 특이 유전자 발현 확인을 위한 양성 대조군으로 사용하였다.
도 2는 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포에서 분화된 혈관내피세포의 형광면역염색 사진을 나타낸다(CD31: 적색, DAPI: 청색).
도 3은 인간 배아줄기세포에서 분화 18일 경과 후 회수한 세포의 유세포 분석 결과를 나타낸다 (Control: 2차 항체와만 반응한 세포).
도 4는 MACS로 분리한 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포 유래 CD31 양성세포의 형태(morphology)를 나타낸다. CD31양성세포를 세포배양용기에 파종 시 혈관내피세포의 전형적인 코블스톤(cobblestone) 형태 및 콜로니 형성이 관찰되었다.
도 5는 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포 유래 CD31 양성세포의 맥관 형성능을 분석한 결과를 나타낸다. CD31 양성세포를 Matrigel 코팅된 세포배양용기에서 18시간 배양 후 맥관 형성 여부를 관찰하였다.
도 6은 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포 유래 CD31 양성세포가 아세틸화 LDL (붉은 형광)을 섭취하며, UEA-1 렉틴(녹색 형광)에 염색되는 것을 나타낸다.

Claims (15)

  1. (a) 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포로부터 배상체를 형성시키는 단계;
    (b) 인간 재조합 BMP-4(human recombinant bone morphogenic protein-4), 인간 재조합 bFGF(human recombinant basic fibroblast growth factor), 인간 재조합 악티빈 A(human recombinant Activin A), 인간 재조합 VEGF-A(human recombinant vascular endothelial growth factor A), 및 혈청대체물(serum replacement)로 보충된 무-혈청(serum free) 및 무-이종(異種)물질(xeno-free) 배지 중에서, 단계(a)에서 얻어진 배상체를 배양하는 단계; 및
    (c) 단계(b)에서 얻어진 세포를 인간 재조합 VEGF-A로 보충된 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는,
    인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포의 혈관내피세포로의 분화방법.
  2. (a) 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포로부터 배상체를 형성시키는 단계;
    (b1) 인간 재조합 BMP-4, 인간 재조합 bFGF, 인간 재조합 악티빈 A, 및 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지 중에서, 단계(a)에서 얻어진 배상체를 배양하는 단계;
    (b2) 인간 재조합 BMP-4, 인간 재조합 bFGF, 인간 재조합 악티빈 A, 인간 재조합 VEGF-A, 및 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지 중에서, 단계(b1)에서 얻어진 세포를 배양하는 단계; 및
    (c) 단계(b2)에서 얻어진 세포를 인간 재조합 VEGF-A로 보충된 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는,
    인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포의 혈관내피세포로의 분화방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계(a)가 상기 배상체를 인간 재조합 BMP-4, 인간 재조합 bFGF, 인간 재조합 악티빈 A, 및 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지 중에서 1∼14 일 동안 배양하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분화방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계(a)가 상기 배상체를 1∼30 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 및 5∼20 중량%의 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지 중에서 2∼10 일 동안 배양하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분화방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계(a)가 상기 배상체를 10∼20 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 5∼10 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 3∼10 ng/ml의 인간 재조합 악티 빈 A, 및 10 중량%의 혈청 대체물로 보충된 DMEM/F12 배지 중에서 2∼6 일 동안 배양하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분화방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계(b) 혹은 단계(b1) 및 (b2)가 저산소 조건(hypoxia condition)에서 수행되는 것을 특징으로 하는 분화방법.
  7. 제1항에 있어서, 단계(b)가, 1∼30 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 1∼100 ng/ml의 인간 재조합 VEGF-A, 및 5∼20 중량%의 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지 중에서, 단계(a)에서 얻어진 배상체를 4∼14 일 동안 배양함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 분화방법.
  8. 제1항에 있어서, 단계(b)가 10∼20 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 5∼10 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 3∼10 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 10∼50 ng/ml의 인간 재조합 VEGF-A, 및 10 중량%의 혈청대체물로 보충된 DMEM/F12 배지 중에서 단계(a)에서 얻어진 배상체를 4∼14 일 동안 배양함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 분화방법.
  9. 제2항에 있어서, 단계(b1)이 1∼30 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 및 5∼20 중량%의 혈 청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지 중에서, 단계(a)에서 얻어진 배상체를 2∼6 일 동안 배양함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 분화방법.
  10. 제2항에 있어서, 단계(b1)이 10∼20 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 5∼10 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 3∼10 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 및 10 중량%의 혈청대체물로 보충된 DMEM/F12 배지 중에서, 단계(a)에서 얻어진 배상체를 2∼6 일 동안 배양함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 분화방법.
  11. 제2항에 있어서, 단계(b2)가 1∼30 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 1∼20 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 1∼100 ng/ml의 인간 재조합 VEGF-A, 및 5∼20 중량%의 혈청대체물로 보충된 무-혈청 및 무-이종물질 배지 중에서, 단계(b1)에서 얻어진 세포를 2∼12 일 동안 배양함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 분화방법.
  12. 제2항에 있어서, 단계(b2)가 10∼20 ng/ml의 인간 재조합 BMP-4, 5∼10 ng/ml의 인간 재조합 bFGF, 3∼10 ng/ml의 인간 재조합 악티빈 A, 10∼50 ng/ml의 인간 재조합 VEGF-A, 및 10 중량%의 혈청대체물로 보충된 DMEM/F12 배지 중에서, 단계(b1)에서 얻어진 세포를 2∼12 일 동안 배양함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 분화방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계(c)가 단계(b) 또는 단계(b2)에서 얻어진 세포를 인간 재조합 VEGF-A로 보충된 배지 중에서 배양함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 분화방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 배지가 10∼100 ng/ml의 인간 재조합 VEGF-A로 보충된 배지임을 특징으로 하는 분화방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 배지가 10∼50 ng/ml의 인간 재조합 VEGF-A로 보충된 EBM-2(endothelial basal medium-2) 배지임을 특징으로 하는 분화방법.
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