CN100523213C - 产生灵长类动物滋养层的方法 - Google Patents

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Abstract

揭示了第一种引起人和其它灵长类动物干细胞培养物直接和统一分化成定向细胞系的方法。用单蛋白滋养层诱导因子处理灵长类动物干细胞导致细胞转换成人滋养层细胞即胎盘前体细胞。一些蛋白因子包括骨形成蛋白4(BMP4)、BMP2、BMP7及生长-分化因子5，能作为滋养层诱导因子。

Description

产生灵长类动物滋养层的方法
相关申请的参照
此专利申请要求提交于2002年3月15日的美国临时专利申请号60/365,136的权利。
关于联邦政府赞助研究或发展的声明
无。
发明背景
现代细胞生物包括多种体外操作不同活生物体细胞的技术。特别感兴趣的是一类称为干细胞的细胞。干细胞是未分化或仅部分分化的细胞，能分化成一些祖细胞和成熟细胞系和类型。术语“干细胞”可用于指一种细胞类型，它是较大生物体中分化细胞系的祖细胞如造血干细胞，或可指完全未分化干细胞，它们至少在理论上能分化成任何身体组织。干细胞最少是多能性的，意味着它们有分化成许多不同组织细胞的潜能，且可以是全能性的，意味着有分化成任何成熟生物种类的细胞类型的潜能。干细胞培养物发展自多种组织类型和一些不同动物。
近来，能产生、培养和维持灵长类动物胚胎干细胞的培养物，包括人和恒河猴胚胎干细胞。参见例如Thomson的美国专利号5,843,780、6,200,806。灵长类动物胚胎干细胞是产生自胚胎的干培养物，在培养中存活不确定且证明能分化成灵长类动物身体的主要组织类型。灵长类动物胚胎干细胞可在培养中以未分化状态不确定维持，或可开始分化过程，通过此过程不同细胞定向成为一种或多种发育谱系(developmental lineage)。通常，干细胞分化成不同组织类型是以胚状体产生为开始，这使胚胎体中的干细胞开始分化成不同细胞类型。
具有科学和研究兴趣的更加分化的人细胞类型是人滋养层。滋养层是一种细胞，它是参与人胎盘形成的细胞前体。当胚胎开始分化时，在胚泡阶段，内细胞群中的细胞定向形成变为胚胎的细胞，而胚泡的外部细胞定向参与胎盘发育。以前分离过滋养层细胞，但它们难以分离且不能大量用于研究。小鼠滋养层细胞系产生自胚泡和移植后滋养层。人滋养层细胞系产生自转化的胎盘细胞，但还未报导从胚细胞或干细胞系生成灵长类动物滋养层培养物的技术。人胚胎干细胞会同时分化成一些分化细胞类型，包括一些滋养层细胞，此现象不导致有用的滋养层细胞培养物产生。事实上，小鼠胚胎干细胞似乎缺乏分化成滋养层的能力，因此，滋养层供应总是很有限。恒定滋养层细胞的可补充供应对许多药物研究很有用。针对胚胎移植的避孕药物研究和防止胎盘相关出生缺陷的治疗仍是科学研究的主题，如果有灵长类动物滋养层来源，能更容易研究。
发明概述
本发明概括了诱导灵长类动物干细胞主要分化成人滋养层的方法，包括在蛋白滋养层诱导因子存在时培养灵长类动物干细胞的步骤。
本发明也涉及由本文所教授方法产生的灵长类动物滋养层细胞统一培养物。
本发明同样涉及在胎盘细胞上测试试剂的方法，其中试剂暴露于本文所述滋养层培养物。
本发明的一个目标是以一致和可重复方式产生几乎纯的滋养层培养物。
本发明的一个特征是教授了第一种已知引起培养的灵长类动物干细胞重复、直接、单独和同步分化成定向细胞系的方法。
本发明的其它目标、特征和优势从下列说明中显然。
附图简述
图1阐述了按照本发明培养的滋养层细胞的激素分泌。
发明详述
本发明以观察为前提。发明者发现一些蛋白因子会引起灵长类动物胚胎干细胞分化成滋养层细胞。滋养层细胞稳定并表现出胎盘前体细胞的所有细胞特征。由于产生和培养灵长类动物和人胚胎干细胞被标准化且易重复，此观察可第一次直接从人或其它灵长类动物干细胞来源生成单细胞类型的主要种类(滋养层细胞)，而不干扰胚状体产生。这里发现引起灵长类动物胚胎干细胞直接分化成滋养层细胞的蛋白因子包括骨形成蛋白4(BMP4)以及相关蛋白因子如BMP2、BMP7及生长-分化因子5(GDF5)。这种因子在本文称为滋养层诱导因子。
存在可再生量的人和其它灵长类动物滋养层细胞能对胎盘细胞性质进行许多调查研究。现在能具有可再生和无穷尽的胎盘前体细胞供应。特定认为滋养层细胞培养物可用于化学反应研究以模拟药物测试中使用的胎盘细胞性质，用于一般毒物学以及对胎盘细胞的特定作用。例如，研究抑制子宫中受精胚胎移植的试剂即节育剂可通过观察推定试剂对滋养层细胞培养物的作用。
此描述包括证明人和其它灵长类动物干细胞能通过单蛋白因子处理直接转入滋养层细胞的数据。如本文所用，灵长类动物干细胞指人或其它灵长类动物未分化的细胞，它们至少是多能的。下面例子中所用干细胞来源自人和恒河猴胚胎，从而称为灵长类动物胚胎干细胞。胚胎干细胞来自处于一定发育阶段人的干细胞。然而，本文所述方法同样可应用于获自其它来源的人干细胞，包括胚生殖系细胞和分离自成熟灵长类动物体的干细胞。注意到在小鼠干细胞经验基础上不预期人干细胞会分化成滋养层细胞。通过控制外部培养环境从小鼠干细胞获得滋养外胚层组织的努力迄今还未成功，当与完整预移植胚形成嵌合体时，小鼠干细胞很少对滋养层有贡献。小鼠胚胎干细胞不能形成滋养层细胞与小鼠胚胎干细胞发育类似原始外胚层的理论一致，小鼠胚胎干细胞在原始外胚层与内细胞群分离后形成且不再对滋养层谱系有贡献。人胚胎干细胞形成滋养层细胞的能力暗示小鼠和人胚胎干细胞间发育潜能的基本差异。
注意到本文的方法包括直接应用滋养层诱导因子于培养的干细胞，而没有通常与干细胞分化相关的任何干扰过程。特别注意到没有转变成胚状体的阶段与此方法相关。由其它方法培养的干细胞分化过程一般不均一，这通常是许多不同细胞谱系或细胞类型导致的。相反，本文所述方法使干细胞大量分化成定向分化的细胞类型即滋养层。
为证明干细胞定向分化成滋养层细胞是由于滋养层诱导因子的影响，可能抑制滋养层诱导因子的作用并观察结果。如果BMP4是滋养层诱导因子，此蛋白能被可溶性BMP4受体或拮抗蛋白头蛋白抑制。如果仅用BMP4培养灵长类动物干细胞，干细胞培养物会大规模定向分化成滋养层细胞类型。然而，如果用BMP4和抑制剂如可溶性BMP4受体或头蛋白培养类似的灵长类动物干细胞培养物，不发生成为滋养层细胞的分化。
培养的人胚胎干细胞有很独特的形态。细胞小、紧密且均一，有独特的细胞膜和成组的簇。干细胞分化成其它细胞类型是明显的过程，因为干细胞变得更大和更扩散。有经验的技术人员能通过分化细胞的细胞外形识别许多细胞类型。在滋养层细胞的情况中，细胞确实变得更大和扁平，细胞膜从扩散变为不可见。然而，为补充滋养层细胞状况，采用不同细胞特征研究。进行使用DNA微阵列的基因表达研究以检测细胞的基因表达模式。也检测细胞的胎盘激素分泌。结果与这些分化细胞被鉴定为滋养层细胞一致。这确认了形态鉴定这些细胞是正确的。
实施例
人胚胎干细胞系H1在MatrigelTM-包被塑料平板的培养基中培养，以小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为条件且添加4mg/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。人骨形成蛋白4(BMP4)(R&D Systems，Minneapolis，MN，也是本文所列其它重组蛋白来源)以1、10和100ng/ml培养基浓度应用于干细胞。干细胞是单层细胞且不在胚状体中聚集。随后H1细胞经历了剂量和时间依赖的形态变化，变得展开、扁平、薄和扩大或延长，它们的核变得更小。这些变化与滋养层细胞形态一致。形态变化开始于各菌落边缘并由此向内展开。形态变化在用100ng/ml BMP4处理培养的第2天、10ng/ml BMP4处理培养的第3或4天和1ng/ml BMP4处理培养的第4到5天明显。
用BMP4蛋白信号家族其它成员进行类似实验。证明引起相似作用、导致干细胞变为滋养层细胞的蛋白包括BMP2、BMP7及生长-分化因子5(GDF5)。没有发现其它蛋白在干细胞中引起这种相同的形态变化，包括TGF超家族成员如TGFβ1和活化素。类似形态变化在用BMP4、BMP2、BMP7和GDF5处理的恒河猴胚胎干细胞系中观察到。
用滋养层诱导因子处理干细胞的形态变化与胚胎发育中发生的形态变化一致，其中一些细胞定向变为产生胎盘的谱系。除了形态变化，细胞开始表达转录因子GATA2和GATA3和慢性促性腺激素α和β基因，它们都在由其它方法生成的滋养层中表达。细胞产生大量胎盘激素，包括慢性促性腺激素、雌二醇和孕酮。细胞继续不确定分泌这些激素。细胞的流式细胞仪证明细胞至少主要是CGβ阳性。
也进行实验，其中BMP家族因子的拮抗物与蛋白因子同时加入培养物。发现如果可溶性BMP受体(100ng/ml)或BMP拮抗蛋白头蛋白(300ng/ml)与BMP4同时加入培养物，完全防止了干细胞中的形态变化。这证明活化蛋白因子的作用特异性。
对名为H9的另外细胞系进行类似实验，产生滋养层细胞生成的相似结果。此外，对缺乏bFGF时培养的H1细胞进行类似实验，暗示此作用对来自不同供体的人干细胞是普遍的且不取决于bFGF的存在。
为进一步研究滋养层特征，cDNA微阵列用于分析BMP4处理细胞和未处理未分化H1细胞中差异表达的基因。在阵列上检测的43,000个cDNA基因中，仅代表14个基因的19个克隆簇在所有检测时间点强烈上调。14个基因中的11在前面确定特征为与滋养层或胎盘发育相关。许多这些基因编码转录因子，如转录因子AP-2(TFAP-2)、mah同源盒同系物2(MSX2)、细胞因子信号3的抑制物(SSI3)、GATA结合蛋白2和3(GATA2和GATA3)及与YPRW基序1相关的多毛/spli增强子(HEY1)。用BMP4处理的第7天也观察到许多已知在滋养层或胎盘表达的基因mRNA表达显著增加，如编码CG-α和CG-β亚基、促黄体素-α和胎盘生长因子的基因。我们也使用RT-PCR以观察滋养层标记表达增高，所述标记包括CG-β、神经胶质细胞缺失-1(GCM1)、非典型HLA I类分子HLA-G1和CD9。微阵列分析中，代表8个基因的所有10个上调最高克隆除了一个以外，都编码前面与滋养层细胞表达基因相关的蛋白或肽。相反，用BMP4处理7天后，多能细胞中一些高度表达基因的转录本降低，如编码POU结构域、5类、转录因子1(POU5F1，也称为OCT4)以及端粒酶反转录因子(TERT)的基因。
为进一步确定细胞特征，检测细胞分泌到培养基的胎盘激素CG、雌二醇和孕酮量。用BMP4处理的H1细胞相较未分化细胞或无条件培养基中分化的细胞，表现出显著更高的各激素浓度。图1阐述与无BMP4的细胞(CM)和可在无条件培养基中分化的细胞(UM)相比，暴露于BMP4的细胞(CM+BMP4)中这些激素增加的时程。

Claims (14)

1.一种诱导灵长类动物干细胞分化成滋养层细胞的方法，其特征在于，所述方法包括在蛋白滋养层诱导因子存在时培养灵长类动物干细胞的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，蛋白滋养层诱导因子选自骨形成蛋白4、骨形成蛋白2、骨形成蛋白7及生长-分化因子5。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蛋白滋养层诱导因子以每毫升培养基1-100纳克的浓度应用于干细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞是人胚胎干细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞是恒河猴胚胎干细胞。
6.一种体外培养的灵长类动物滋养层细胞培养物，其特征在于，所述滋养层细胞来自暴露于滋养层诱导因子的灵长类动物干细胞。
7.如权利要求6所述的培养物，其特征在于，所述滋养层诱导因子选自骨形成蛋白4、骨形成蛋白2、骨形成蛋白7及生长-分化因子5。
8.如权利要求6所述的培养物，其特征在于，所述滋养层细胞是人细胞。
9.如权利要求6所述的培养物，其特征在于，所述滋养层细胞是恒河猴细胞。
10.一种测试试剂对胎盘细胞的作用的方法，其特征在于，所述方法包括
通过在滋养层诱导因子存在时培养灵长类动物干细胞来产生滋养层细胞；
使滋养层细胞暴露于试剂；以及
观察试剂对滋养层细胞的作用。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述滋养层诱导因子选自骨形成蛋白4、骨形成蛋白2、骨形成蛋白7及生长-分化因子5。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述滋养层诱导因子以每毫升培养基1-100纳克的浓度应用于干细胞。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述干细胞是人胚胎干细胞。
14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述干细胞是恒河猴胚胎干细胞。
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