KR20050008657A - 영장류 영양 배엽 생성 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 및 기타 영장류 줄기 세포의 수임 세포(committed cell) 계통으로의 직접적이며 균일한 분화를 유발시키는 방법에 관한 것이다. 단일 단백질 영양 배엽 유도 인자를 이용하는 영장류 줄기 세포의 치료는 상기 세포의 인간 영양 배엽 세포, 태반의 전구체 세포로의 형질전환을 유발시킨다. 뼈 형태형성 단백질 4(BMP4), BMP2, BMP7과 성장 및 분화 인자 5를 포함하는 몇몇 단백질 인자는 영양 배엽 유도 인자로서 작용할 수 있다.

Description

영장류 영양 배엽 생성 방법{METHOD FOR GENERATING PRIMATE TROPHOBLASTS}

현대 세포 생물학은 시험관 내에서 생 유기체의 여러가지 세포를 조작하기 위한 다양한 기법을 포함한다. 특히 관심을 끄는 공지된 세포 범위는 줄기 세포이다. 줄기 세포는 다수의 후대 및 성숙 세포 계통 및 유형으로 분화할 수 있는 능력을 보유하는 미분화되거나 또는 단지 부분적으로 분화된 세포이다. '줄기 세포(stem cell)'라는 용어는 조혈 줄기 세포와 같은 더 큰 유기체 내의 분화 세포 계통의 후대인 세포 유형을 의미하거나, 또는 적어도 이론적으로 신체의 임의 조직으로 분화할 수 있는 전체적으로 미분화된 줄기 세포를 의미할 수 있다. 최소한 줄기 세포는 만능세포(pluripotent)인데, 이는 그들이 다수의 상이한 세포 유형으로 분화할 수 있는 가능성을 보유한다는 의미이며, 또한 그들은 전능세포(totipotent)인데, 이는 그들이 성숙한 유기체 종의 임의의 세포 유형으로 분화할 수 있는 가능성을 보유한다는 의미이다. 줄기 세포 배양은 다양한 조직 유형 및 다수의 상이한 동물로부터 발전되어 왔다.

최근, 인간 및 붉은털 원숭이 배아 줄기 세포를 포함하는 영장류 배아 줄기 세포의 배양물을 생성하고, 배양하고 유지할 수 있게 되었다(참조: 예를 들어, 미국 특허 5,843,780 및 6,200,806, 톰슨). 영장류 배아 줄기 세포는 배양에서 무한 생존하는 배로부터 생성된 줄기 배양물이며, 영장류 신체의 주 조직 유형으로 분화할 수 있는 능력을 나타낸다. 영장류 배아 줄기 세포는 배양시 미분화 상태에서 무한 유지될 수 있거나, 다양한 세포가 하나 또는 다수의 발생 계통으로 발전하는 분화 과정을 개시할 수 있다. 전형적으로, 줄기 세포의 상이한 조직 유형으로의 분화는 배양체(embryoid body)의 생성으로 시작되는데, 이는 배아체 내의 줄기 세포의 여러가지 세포 유형으로의 분화를 유발한다.

과학적인 연구 대상인 더 분화된 유형의 인간 세포는 인간 영양 배엽(trophoblast)이다. 영양 배엽은 인간 태반의 형성에 참여하는 세포의 전구체이다. 포배 단계에서 배아가 분화를 시작하는 경우, 내부 세포 매스 내의 세포는 배아가 될 세포를 형성하는 한편, 포배의 외부 세포는 태반의 발생에 참여한다. 영양 배엽 세포는 이전에 분리되어 왔으나, 이들은 분리하기 어려워 연구를 위해 상당량 확보하는 것이 불가능하였다. 마우스 영양 배엽 세포주는 포배 및 이식후의 영양 배엽으로부터 생성되어 왔다. 인간 영양 배엽 세포주는 형질전환된 태반 세포로부터 생성되었으나, 배아 세포 또는 줄기 세포주로부터 영장류 영양 배엽의 배양물을 생성하는 기법은 아직 보고된 바 없다. 인간 배아 줄기 세포가 몇몇 영양 배엽 세포를 포함하는 다수의 분화된 세포 유형으로 동시에 분화되지만, 이러한 현상은 영양 배엽 세포의 유용한 배양물의 생성을 유도하지 못했다. 실제로, 마우스 배아 줄기 세포는 영양 배엽 세포로 분화될 수 있는 능력이 결여되어 있는 것으로 생각되며, 따라서 영양 배엽의 공급은 항상 극히 제한되어 왔다. 일관된 영양 배엽 세포의 보충가능한 공급은 다수의 약학적 연구에서 매우 유용하다. 구체적으로, 배아 이식을 목적으로 하는 피임약 및 태반 관련 출산 결함을 예방하는 치료제의 개발은 영장류 영양 배엽의 소스를 이용할 수 있다면 더 용이하게 수행할 수 있는 과학적인 연구 주제이다.

본원은 2002년 3월 15일 출원된 미국 가출원 60/365,136호의 우선권 주장 출원이다. 본 발명은 인간 및 기타 영장류 줄기 세포의 수임 세포(committed cell) 계통으로의 직접적이며 균일한 분화를 유발시키는 방법에 관한 것이다.

도 1은 본 발명에 따라 배양된 영양 배엽 세포에 의한 호르몬 분비를 나타내는 그래프이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 특정 관찰에 기초한다. 본 발명자들에 의해 특정 단백질 인자가 영장류 배아 줄기 세포의 영양 배엽 세포로의 직접적인 분화를 유발하는 것이 확인되었다. 영양 배엽 세포는 안정하며 태반 전구체 세포의 모든 세포 특성을 나타낸다. 영장류 및 인간 배아 줄기 세포의 생성 및 배양은 표준화되어 왔고 용이하게 반복재현할 수 있기 때문에, 이 관찰은 배양체의 생성을 고려함이 없이 인간 또는 다른 영장류 줄기 세포 소스로부터 직접적으로 유래하는 단일 세포 유형(영양 배엽 세포)의 주부류의 생성을 최초로 가능하게 한다. 본 발명을 통해 영장류 배아 줄기 세포의 영양 배엽 세포로의 직접적인 분화를 유발하는 단백질 인자의 예로는 뼈 형태형성 단백질 4(BMP4) 뿐만 아니라 관련 단백질 인자, 예를 들어 BMP2, BMP7과 성장 및 분화 인자 5(GDF5)를 들 수 있다. 본 명세서에서 이러한 인자는 영양 배엽 유도 인자라 칭한다.

반복재현할 수 있는 양으로 인간 및 다른 영장류 영양 배엽 세포의 이용가능성은 태반 세포의 거동에 대한 많은 연구를 가능하게 한다. 현재 태반 전구체 세포의 반복재현할 수 있고 무제한적인 공급이 가능하게 되었다. 특히, 영양 배엽 세포배양물은 일반적인 독성학 뿐만 아니라 태반 세포에 대한 특정 효과에 대한 약물 테스트에서 사용하기 위해 태반 세포의 거동을 모델링하기 위한 화학 반응 연구를 위해 사용할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 자궁내에서 수정된 배아 이식을 억제하는 제제, 즉 임신조절제는 영양 배엽 세포 배양물에 대한 추정적인 제제의 효과를 관찰함으로써 조사할 수 있다.

이러한 개시는 인간 및 다른 영장류 줄기 세포가 단일 단백질 인자를 이용한 처리에 의해 영양 배엽 세포로 직접적으로 형질전환될 수 있음을 입증하는 데이타를 포함한다. 본원에 사용한 바와 같이, 영장류 줄기 세포는 적어도 만능세포인 인간 또는 다른 영장류 미분화 세포를 의미한다. 후술하는 실시예에 사용된 줄기 세포는 인간 및 붉은털원숭이 배아로부터 유래한 것이며, 따라서 영장류 배아 줄기 세포로 공지되어 있다. 배아 줄기 세포는 몇몇 발생 단계에서 인간으로부터 유도된 줄기 세포이다. 그러나, 본원에 기술한 방법은 다른 기원, 예를 들어 배아 배 계열 세포로부터 유래한 인간 줄기 세포 및 성숙한 영장류 신체로부터 분리된 줄기 세포에 동일하게 적용할 수 있다. 주목할 점은 인간 줄기 세포가 영양 배엽 세포로 분화할 것이라는 사실이 마우스 줄기 세포를 사용하여 얻은 경험에 기초하면 예상할 수 없는 것이라는 점이다. 외부 배양 환경의 조작을 통해 마우스 줄기 세포로부터 영양세포층 조직을 유도하기 위한 노력은 아직까지 성공하지 못했고, 손상되지 않은(intact) 전-이식 배아와 키메라를 형성하는 경우, 마우스 줄기 세포는 영양 배엽에 거의 기여하지 못한다. 영양 배엽 세포를 형성하기 위해 마우스 배아 줄기 세포를 이용하는 것에 따른 장애는 내부 세포 매스로부터 원시 내배엽의 탈적층후에형성되며 더이상 영양 배엽 계통에 기여하지 않는 원시 외배엽에 발생적으로 유사하다. 영양 배엽 세포를 형성할 수 있는 인간 배아 줄기 세포의 능력은 마우스 배아 줄기 세포와 인간 배아 줄기 세포의 발생 가능성 사이의 기본적인 차이를 의미한다.

주목할 점은 본 발명의 방법은 줄기 세포의 분화와 정상적으로 관련된 임의의 과정을 개재시키지 않고 배양에서 줄기 세포에 직접적으로 영양 배엽 유도 인자를 적용하는 과정을 포함한다. 특히, 주목할 점은 본 발명의 방법과 관련하여 배양체의 전이 단계가 없다는 것이다. 다른 수단에 의해 배양된 줄기 세포에 대한 분화 과정은 일반적으로 균일하지 않은데, 이는 다수의 상이한 세포 계통 또는 세포 유형이 정상적으로 보이는 결과이다. 대조적으로, 본원에 기술된 방법은 줄기 세포의 통상의 분화된 세포 유형, 즉 영양 배엽으로의 매스 분화를 초래한다.

줄기 세포의 영양 배엽 세포로의 유도된 분화가 영양 배엽 유도 인자의 영향에 기인하는 것임을 입증하기 위해, 영양 배엽 유도 인자의 작용을 억제하고 그 결과를 관찰하였다. BMP4가 영양 배엽 유도 인자인 경우, 이 단백질은 가용성 BMP4 수용체 또는 길항작용성 단백질 노긴(noggin)에 의해 억제될 수 있다. 즉, BMP4 만과 함께 영장류 줄기 세포를 배양하는 경우, 줄기 세포 배양물은 영양 배엽 세포 유형으로의 대규모의 유도된 분화를 나타낼 것이다. 그러나, BMP4 및 임의의 억제제, 예를 들어 가용성 BMP4 수용체 또는 노긴(noggin)과 함꼐 유사한 영장류 줄기 세포를 배양하는 경우, 영양 배엽 세포의 분화는 일어나지 않을 것이다.

배양에서 인간 배아 줄기 세포는 매우 구별되는 형태를 보유한다. 그 세포들은 작고, 조밀하고, 균일하며, 군들에서 구별되는 세포 막 및 클러스터를 보유한다. 줄기 세포의 다른 세포 유형으로의 분화는 가시적인 과정인데, 그 이유는 줄기 세포가 더 커지고 더 확산성으로 되기 때문이다. 숙련된 당업자들은 다수의 세포 유형과 분화된 세포를 세포 외관에 의해 인식할 수 있다. 영양 배엽 세포의 경우, 세포들은 더 커지고 편평해지며, 세포 막은 확산성으로되어 볼 수 없다. 그러나, 영양 배엽 세포의 상태를 보충하기 위해, 여러가지 특징적인 세포 연구를 수행하였다. DNA 마이크로어레이를 이용하는 유전자 발현 연구를 수행하여 세포의 유전자 발현 패턴을 연구하였다. 또한, 세포에 의한 태반 호르몬의 분비도 연구하였다. 연구 결과는 영양 배엽 세포로서 이들 분화된 세포의 확인과 일치하였다. 이는 이들 세포의 형태학적 확인이 올바른 것임을 확인시켜 준다.

발명의 개요

본 발명은 영장류 줄기 세포의 주로 인간 영양 배엽으로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것인데, 이는 단백질 영양 배엽 유도 인자의 존재 하에서 영장류 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생성된 영장류 영양 배엽 세포의 균일한 배양물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기한 바와 같은 영양 배엽 배양물에 제제를 노출시켜 태반 세포에 대한 제제의 효과를 테스트하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 목적은 균일하고 일관되며 재현할 수 있는 방식으로 거의 순수한 영양 배엽의 배양물을 생성하는 것이다.

본 발명의 특징은 배양시 영장류 줄기 세포의 반복적이고, 직접적이며, 개별적이고 또한 동시에 주로 수임 세포 계통으로의 분화를 유도하는 것으로 공지된 방법을 교시하는 것이다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 후술하는 발명의 상세한 설명에 의해 명백하게 될 것이다.

인간 배아 줄기 세포주 H1은 마우스 배아 섬유아세포(MEF)에 대해 조정되고 4 mg/ml의 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)로 보충된 배지 내에서 마트리겔(상표명) 코팅된 플라스틱 플레이트 상에서 배양하였다. 인간 뼈 형태형성 단백질 4(BMP4)(미국 미네소타 미니아폴리스의 R&D 시스템즈, 본원에 기술한 다른 재조합 단백질의 소스)는 배양 배지 1 ml 당 1, 10 및 100 ng의 농도로 줄기 세포에 적용하였다. 줄기 세포는 단층으로 존재하며, 배양체 내에서 응집되지 않았다. 이어서, H1 세포는 투여량 및 시간 의존성 형태학적 변화를 수행하며, 퍼지고, 편평해지며, 얇아지며, 그들의 핵은 더 작아지면서 확대되거나 신장된다. 이들 변화는 영양 배엽 세포의 형태와 일치한다. 형태학적 변화는 각 콜로니의 에지에서 세포와 함께시작되며, 그곳으로부터 내부로 퍼진다. 형태 변화는 100 ng/ml BMP4로 처리한 배양 2일째, 10 ng/ml로 처리한 배양 3일 또는 4일째 및 1 ng/ml BMP로 처리한 배양 4 내지 5일째에 명백하였다.

BMP4 단백질 시그날 훼밀리의 다른 멤버를 이용하여 유사한 실험을 수행하였다. 유사한 효과를 활성화시키고, 줄기 세포의 영양 배엽 세포로의 변화를 유발시키는 것을 입증하는 단백질의 예로는 BMP2, BMP7과 성장 및 분화 인자 5(GDF5)를 들 수 있다. TGF 베타 1 및 액티빈과 같은 TGF 슈퍼훼밀리의 멤버를 포함하는 다른 단백질은 줄기 세포 내에서 이와 동일한 형태학적 변화를 활성화시키지 않는 것으로 확인되었다. 유사한 형태학적 변화는 BMP4, BMP2, BMP7 및 GDF5로 처리한 붉은털 원숭이 배아 줄기 세포주에서 관찰되었다.

영양 배엽 유도 인자로 처리한 줄기 세포의 형태학적 변화는 몇몇 세포가 태반을 형성하는 계통이 되는 배아의 발생에서 일어나는 형태학적 변화와 일치한다. 형태학적 변화 이외에, 상기 세포들은 전사 인자 GATA2 및 GATA3과 장막 고나도트로핀 알파 및 베타 유전자의 발현을 시작하는데, 이들 모두는 다른 수단에 의해 형성된 영양 배엽에서 발현된다. 상기 세포들은 장막 고나도트로핀, 에스트라디올 및 프로게스테론을 포함하는 높은 양의 태반 호르몬을 포함한다. 상기 세포들은 이들 호르몬의 무기한 분비를 계속한다. 상기 세포들의 유동 세포분석법을 통해 확인된 바와 같이, 상기 세포들은 적어도 우세한 CG 베타 양성이었다.

또한, BMP 훼밀리 인자의 길항물질이 상기 단백질 인자로서 동시에 배양물에 첨가하는 실험을 수행하였다. 가용성 BMP 수용체(100 ng/ml) 또는 BMP 길항작용성단백질 노긴(300 ng/ml)을 BMP4에 관해서 동시에 배양물에 첨가하는 경우, 줄기 세포에서 형태학적 변화는 전체적으로 예방되는 것을 확인하였다. 이는 활성 단백질 인자의 효과의 특이성을 입증한다.

유사한 실험을 다른 줄기 세포주, 즉 H9에 수행하였으며, 영양 배엽 세포 생성이라는 유사한 결과를 얻었다. 또한, 유사한 실험을 bFGF의 부재 하에서 배양된 H1 세포에 대해 수행하였으며, 상기 효과는 여러가지 공여체로부터 유래한 인간 줄기 세포에는 일반적인 것이며, bFGF의 존재와는 무관하다.

영양 배엽의 특성을 추가로 조사하기 위해, cDNA 마이크로어레이를 사용하여 BMP4-처리 세포 및 미처리 미분화 H1 세포에서 차등 발현된 유전자를 분석하였다. 상기 어레이에서 조사된 43,000 cDNA 유전자 중에서, 단지 19개 클론의 클러스터(14개의 유전자를 의미함)는 모든 조사 시점에서 강하게 상향조절되었다. 이들 14개의 유전자 중에서, 11개의 유전자는 영양 배엽 또는 태반의 발생에 관해 이미 그 특성이 규명되어 왔다. 이들 유전자중 다수는 전사 인자, 예를 들어 전사 인자 AP-2(TFAP2), msh 호메오박스 상동체 2(MSX2), 시토킨 신호전달 3의 억제제(SSI3), GATA 결합 단백질 2 및 3(GATA2 및 GATA3) 및 YPRW 모티프 1과 관련된 모상(hairy)/인핸서-오브-스플리(enhancer-of-spli)(HEY1)를 암호화한다. BMP4로 처리하고 7일째에, 영양 배엽 또는 태반에서 발현되는 것으로 알려진 다수의 유전자, 예를 들어 CG-α및 CG-β서브유닛, 황체 형성 호르몬-알파 및 태반 성장 인자를 암호화하는 유전자의 mRNA 발현이 급격하게 증가되는 것을 관찰하였다. 또한, 본 발명자들은 RT-PCR을 사용하여 영양 배엽 마커, 예를 들어 CG-β, 신경교 세포 미싱-1(GCM1), 비고전 HLA 부류 I 분자 HLA-G1 및 CD9의 증강된 발현을 관찰하였다. 마이크로어레이 분석에서 8개의 유전자를 나타내는 상위 10개의 상향조절된 클론 모두는 하나의 예외를 제외하곤 영양 배엽 세포 내에서 발현된 유전자와 이미 관련된 단백질 또는 펩티드를 암호화한다. 대조적으로, BMP4 처리하고 7일후, 만능세포에서 고도로 발현된 몇몇 유전자의 전사체, 예를 들어 POU 도메인, 부류 5, 전사 인자 1(POU5F1, OCT4로도 알려짐) 및 텔로머라제 역 전사 인자(TERT)를 암호화하는 전사체는 감소하였다.

상기 세포들의 특성을 추가로 확인하기 위해, 세포의 배지내로 분비된 태반 호르몬 CG, 에스트라디올 및 프로게스테론의 양을 조사하였다. BMP4로 처리한 H1 세포는 미분화 세포 또는 조정하지 않은 배지에서 분화된 세포와 비교하여 더 높은 농도의 각각의 호르몬을 나타냈다. 도 1은 BMP4(CM)로 처리하지 않은 세포 및 조정하지 않은 배지(UM)에서 분화할 수 있는 세포와 비교하여 BMP4(CM+BMP4)에 노출된 세포에서 이들 호르몬의 시간에 따른 증가를 나타낸다.

Claims (14)

1. 단백질 영양 배엽 유도 인자의 존재 하에서 영장류 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 영장류 줄기 세포의 인간 영양 배엽 세포로의 분화를 유도하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 단백질 영양 배엽 유도 인자는 뼈 형태형성 단백질 4(BMP4), 뼈 형태형성 단백질 2(BMP2), 뼈 형태형성 단백질 7(BMP7)과 성장 및 분화 인자 5(GDF5)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 단백질 영양 배엽 유도 인자는 배양 배지 1 ml 당 1∼100 ng의 농도로 줄기 세포에 적용하는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 비인간 영장류 배아 줄기 세포인 방법.
6. 시험관내 배양에서 영장류 영양 배엽 세포의 배양물로서, 상기 영양 배엽 세포는 영양 배엽 유도 인자에 노출된 영장류 줄기 세포로부터 유래한 것인 배양물.
7. 제6항에 있어서, 상기 영양 배엽 유도 인자는 뼈 형태형성 단백질 4(BMP4), 뼈 형태형성 단백질 2(BMP2), 뼈 형태형성 단백질 7(BMP7)과 성장 및 분화 인자 5(GDF5)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 배양물.
8. 제6항에 있어서, 상기 영양 배엽 세포는 인간 세포인 배양물.
9. 제6항에 있어서, 상기 영양 배엽 세포는 비인간 영장류 세포인 배양물.
10. 태반 세포에 대한 효과에 대해 제제를 테스트하는 방법으로서,

    - 영양 배엽 유도 인자의 존재 하에서 영장류 줄기 세포를 배양하여 영양 배엽 세포를 생성하는 단계;

    - 영양 배엽 세포를 상기 제제에 노출시키는 단계; 및

    - 상기 제제가 영양 배엽 세포에 대해 어떤 영향을 미치는지 관찰하는 단계

    를 포함하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 영양 배엽 유도 인자는 뼈 형태형성 단백질 4(BMP4), 뼈 형태형성 단백질 2(BMP2), 뼈 형태형성 단백질 7(BMP7)과 성장 및 분화 인자 5(GDF5)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
12. 제10항에 있어서, 상기 영양 배엽 유도 인자는 배양 배지 1 ml 당 1∼100 ng의 농도로 줄기 세포에 적용하는 것인 방법.
13. 제10항에 있어서, 상기 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포인 방법.
14. 제10항에 있어서, 상기 줄기 세포는 비인간 영장류 배아 줄기 세포인 방법.