CN1615356A - 重建胚胎中核转移后融合和活化的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了数据证明不成功初次同时电融合和活化事件后,哺乳动物细胞核与去核的体内排出的卵母细胞的再次融合,提供了建立用于产生各种非人哺乳动物物种包括山羊、猪、啮齿动物、灵长目、兔和牛的活后代的活化和融合的能核转移的胚胎的另外的替代方法和改进。另外,多次电脉冲在动物核转移程序中产生有活力后代的同时融合活化方法学提供了替代的和更有效的活化方法。
Description
发明领域
本发明涉及用于非人哺乳动物中核转移程序的重建胚胎的融合和活化的改进方法。更特别地,本发明提供了通过使用至少两个电活化程序改进核转移程序中重建胚胎的活化的方法。
发明背景
本发明一般地涉及体细胞核转移(SCNT)领域和产生期望的转基因动物。更特别地,它涉及产生得自体细胞的细胞系的方法,转化这些细胞系的方法,和使用这些转化细胞和细胞系来产生转基因非人哺乳动物种的方法。
对具有某些期望性状或特征,如体重,奶含量,产奶量,泌乳间隔长度和抗病性增加的动物渴望已久。传统育种方法能够产生带有一些特定期望性状的动物,但是常常这些性状伴随很多不需要的特征,并且费时、昂贵和不可靠。而且,这些方法完全不能允许特定动物系产生基因产物,如所述物种的遗传互补物中本来完全没有的期望的蛋白治疗剂(即牛奶中的蛛丝蛋白)。
能够产生转基因动物的技术的发展提供了产生被改造携带特殊性状或被设计表达某些蛋白或其它分子化合物的动物的特别精确方法。那就是,转基因动物是携带在发育早期已被故意导入体细胞和/或生殖系细胞的基因的动物。当动物发育和生长时,改造给动物的蛋白产物或特殊发育改变变得明显。
目前,可利用的产生转基因家畜的技术效率低并且费时,典型地产生有活力胚胎的百分比很低。在转基因发展过程中,典型地随机插入DNA序列,可引起各种问题。这些问题的第一个是插入失活,它是由于编码或调节序列被新来DNA破坏造成的必需基因失活。另一个问题是该转基因可能根本不掺入,或掺入但不表达。更多问题是由于位置效应造成的调控不准确的可能性。这是指用相同转基因构建体产生的不同founder动物之间基因表达水平和基因调节准确度的变异性。因此,产生大量founder动物并且常常证实少于5%的动物以保证转基因系维持的方式表达该转基因并不罕见。
另外,产生转基因家畜的效率低,100个后代中产生1个转基因的效率并不罕见(Wall,1997)。结果,产生转基因动物相关的费用可以多至每个表达动物25-50万美元(Wall,1997)。
现有方法在克隆过程中典型地使用胚胎细胞类型。这包括Campbell等(Nature,1996)和Stice等(Biol.Reprod.,1996)的工作。在这两个研究中,胚胎细胞系得自妊娠小于10天的胚胎。在两个研究中,细胞维持在饲养层防止待用于克隆过程的供体细胞明显分化。本发明使用分化细胞。认为胚胎细胞类型也可以与从分化供体核开始的克隆胚胎一起用于本发明的方法。
因此,根据本发明,优良基因型的哺乳动物包括山羊的增殖是可能的。这将允许带有证明的遗传优越性或其它期望性状的成年动物增殖。例如很多重要哺乳动物种,包括山羊、啮齿动物、母牛和兔子的进展将加速。通过本发明,可能有数十亿个可收获并用于克隆程序的胎儿或成年细胞。这将可能短期产生很多相同后代。
因此,尽管各种方法已经产生了几个不同物种的转基因动物,但是仍缺乏以合理费用,容易和可重复产生能够表达高产量期望蛋白或表现插入转基因引起的遗传改变的转基因动物的方法。
因此,在转基因动物发展中存在允许生产效率增加的改进的核转移方法的需要,尤其是在努力更可靠和有效产生有活力转基因后代时在细胞偶联体的同时融合和活化过程中融合细胞活化的增加。
发明概述
简单说,本发明提供了通过核转移方法克隆非人哺乳动物的方法,包括:获得待用作供体核来源的期望的分化哺乳动物细胞;从与作为供体核来源的细胞相同的物种的哺乳动物获得至少一个卵母细胞;除去该至少一个卵母细胞的核;将期望的分化细胞或细胞核转移到去核卵母细胞中;同时融合和活化细胞偶联体,形成第一转基因胚胎;提供至少一个另外的活化方案,包括另外的电休克,来活化没有融合产生第一转基因胚胎,但在初次电休克后被活化的细胞-偶联体,形成第二转基因胚胎;培养活化的第一和/或第二转基因胚胎直到超过2细胞发育期;和最后将第一和/或第二转基因胚胎转移到合适的宿主哺乳动物中,使得该胚胎发育为胎儿。典型地,通过使用如下供体核完成上面的方法,在所述分化哺乳动物细胞或细胞核插入所述去核卵母细胞前,供体核已被插入、除去或修饰期望基因。也要注意的事实是使用的卵母细胞在去核前优选在体外成熟。
此外,本发明的方法也可用于通过使用被去核并与供体体细胞融合并同时活化的停滞在中期II期的山羊(caprine)卵母细胞优化转基因动物的产生。分析一个转基因克隆动物的奶表明人的期望靶转基因蛋白产物的产量水平高。
指出本发明也可以用于增加可用于例如细胞、组织和器官移植的CICM细胞、胎儿或后代的可利用性也很重要。通过从动物取出胎儿或成年细胞并在克隆程序中使用它,各种细胞、组织和可能器官当它们通过器官发生而发育时可从克隆的胎儿获得。细胞、组织和器官也可以从克隆的后代分离。这个方法可提供很多医学和兽医治疗,包括细胞和基因治疗的“材料”来源。如果细胞被转移回到该细胞所来源的动物,那么避免了免疫排斥。而且,因为可从这些克隆分离很多细胞类型,所以其它方法学如造血chimericism可用于避免相同物种动物以及种间动物的免疫排斥。
附图简述
图1显示了通过核转移产生克隆动物的方法的概括性图。
优选实施方案的描述
说明书中下列缩写具有指定的意思:
缩写解释:
体细胞核转移(SCNT)
培养的内细胞团细胞(CICM)
核转移(NT)
合成的输卵管液(SOF)
胎牛血清(FBS)
聚合酶链式反应(PCR)
牛血清白蛋白(BSA)
术语解释:
山羊/山羊的-山羊各个种所有的或与之相关的
重建胚胎-重建胚胎是通过去核程序其遗传物质已经被除去的卵母细胞。通过融合事件后将成年或胎儿体细胞的遗传物质放置于该卵母细胞中,它已被“重建”。
融合玻片-以固定距离分离放置的平行电极(parallelelectrodes)的玻片。细胞偶联体放置于电极之间接受融合和活化电流。
细胞偶联体(couplet)-融合和/或活化前的去核卵母细胞和体细胞或胎儿细胞核。
细胞松弛素(Cytocholasin)-B-某些真菌的代谢产物,它选择性和可逆地阻断胞质分裂,而不影响核分裂。
胞质体-真核细胞的细胞质物质。
细胞核-细胞核,通过去核得自细胞,被狭窄的细胞质边缘和质膜环绕。
体细胞-生物体除了生殖细胞以外的任何细胞。
单性生殖的(parthenogenic)-来自无精子穿透的卵母细胞的胚胎的发育。
转基因生物-一种生物,其中被实验转移了来自另一个生物的遗传物质,使得该宿主获得了其染色体组成中被转移基因的遗传性状。
体细胞核转移-也称作治疗性克隆,是体细胞与去核卵母细胞融合的方法。体细胞的核提供遗传信息,而卵母细胞提供营养和胚胎发育所需的其它产能物质。一旦发生融合,细胞就是全能的,并最终发育为胚泡,在此点分离内细胞团。
本发明涉及为核转移程序开发的增加转基因胚胎数量的系统。本发明提供了不成功的初次同时电融合和活化事件后,产生融合和活化胚胎的改进方法。这个能力给活化和融合的能够核转移产生各种非人种哺乳动物活后代的胚胎的产生效率提供了改进,所述哺乳动物包括山羊、猪、啮齿动物、灵长目、兔子和牛。
此外,本发明涉及克隆程序,其中得自分化胎儿或成年哺乳动物细胞的细胞核,包括无血清饥饿的分化胎儿或成年山羊细胞,移植到与供体核相同物种的去核卵母细胞。该核被重新编程以指导克隆胚胎的发育,该胚胎接着可转移给受体雌性动物而产生胎儿和后代,或用于产生培养的内细胞团(CICM)。克隆胚胎也可以与受精胚胎组合产生嵌合胚胎、胎儿和/或后代。
供体细胞核与去核胞质体的融合,和所得偶联体的随后活化是用体细胞核转移成功产生活后代所需的重要步骤。供体细胞核与胞质体的电融合是使用的最普通方法。然而更重要的是,已经发表了核转移方法学中使用来启动很多家畜物种中胚胎发育过程的几种活化方法,和活化步骤的时间选择。在哺乳动物中,尽管物种间有差异,最初信号转导事件和受精时精子诱导的随后Ca+2振荡是导致卵母细胞活化和胚胎发育的正常过程(Fissore等,1992和Alberio等,2001)。目前利用Ca+2动员的化学和电方法活化体细胞核转移产生的偶联体。然而,这些方法不产生与典型的体内受精模式中精子类似的Ca+2振荡模式。
自从利用体细胞的绵羊的成功首次报道,核转移上已经发生了显著的进步(Wilmut等,1997)。自那时以后已经从体细胞不同程度成功地克隆了很多其它物种(Baguisi等,1999和Cibelli等,1998)。也已经报道了很多其它胎儿和成年体细胞组织类型(Zou等,2001和Wells等,1999),以及胚胎(Yang等,1992;Bondioli等,1990;和Meng等,1997)。细胞核处于重建时期的细胞周期阶段也已经被引证为不同实验室方法中的关键(Kasinathan等,Biol.Reprod.2001;Lai等,2001;Yong等,1998;和Kasinathan等,Nature Biotech.2001)。然而,在融合和活化使用的顺序、时间选择和方法上有相当大程度的变异性。
现有技术依靠使用早期胚胎的卵裂球进行核转移程序。这个方法受可利用胚胎卵裂球数量少和不能将外源遗传物质导入这种细胞的限制。相比之下,分化胚胎、胎儿或成年体细胞可起细胞核供体的作用进行核转移的发现提供了生殖系修饰的广泛可能性。根据本发明,使用重组体细胞系进行核转移,和通过使用“重建”胚胎增加可利用细胞数量而提高这个程序的效率,不仅允许用常规转染方法将转基因导入更多转基因动物,而且在克服founder镶嵌性问题的同时实质性地增加了转基因动物产生的效率。
我们以前表明同时电融合和活化可成功产生山羊物种和其它动物的活后代。在我们当前的实验中,我们研究了初次成功同时电融合和活化之后,使用另外的电活化事件来更接近地模拟精子诱导的Ca+2振荡并通过体细胞核转移产生胚胎和活后代。最后,我们确定了初次同时电融合和活化事件中没有成功融合的供体细胞核与去核胞质体再次融合,通过体细胞核转移产生山羊胚胎和活后代的能力。
本发明所基于的数据证明在产生活后代能力上,初次成功同时电融合和活化后单一的另外电活化事件与仅仅同时电融合和活化相比更有效。在随后实验中,我们扩展了实验方案以包括初次成功同时电融合处理后单次或定时的多次另外电活化事件。随后实验结果证明,尽管不同数量的另外电活化步骤产生能够在受孕55天建立妊娠的核转移胚胎的能力相当,但是两种方法都比所述实验更有效。Bondolli等以前报道了另外电活化事件可成功通过核转移产生猪物种的活后代。其它报道(Collas等,1993)证明另外的电活化事件可成功产生牛物种的单性生殖胚胎。这里我们的结果提示在分开的方案方法学中,山羊细胞核和去核体内排卵卵母细胞初次成功同时电融合和活化后另外的电活化可提供各种动物尤其是山羊物种中使用核转移的可供选择和更有效的活化方法。
细胞核和去核胞质体电融合的效率基于使用的物种和细胞类型而变化。然而,根据我们对山羊的经验,以及如其他人所报道(Baguisi等,1999;和Stice等,1992),在初次融合尝试过程中存在不成功融合的偶联体亚群。在这些实验中,我们确定了不成功初次同时电融合和活化事件后的另外再次融合尝试通过体细胞核转移产生山羊胚胎和活后代的能力。在实验中,数据证明与单单同时电融合和活化(Baguisi等,1999)或初次成功同时电融合和活化后单一另外电活化事件相比,在产生活后代的能力上,再次融合是可能的并且更有效。在随后实验中,我们证实了我们的观察,即未融合偶联体的再次融合能够产生能在受孕55天建立妊娠的核转移胚胎。
供体细胞核是从得自40天转基因雌性胎儿的原代胎儿体细胞系得到的,该转基因雌性胎儿是由阴性成年雌性动物与转基因雄性动物的精子人工受精产生的。用两种核转移程序产生活后代。在一个方案中,除去停滞在中期-II期的山羊卵母细胞的核,与供体体细胞电融合和同时活化。在第二个方案中,除去在体内活化的有丝分裂末期-II期的山羊卵母细胞的核,与供体细胞核电融合和同时活化第二次以诱导基因组再活化。三个健康的相同雌性后代出生。基因型分析证实所有克隆后代得自供体细胞系。一个转基因克隆动物的奶分析表明人抗凝血酶III的产量水平高,类似于亲本转基因系。因此,通过本发明采用的方法和系统,通过体细胞核转移产生了转基因动物,山羊,并且表明能够在克隆动物的奶中产生靶治疗蛋白。
尽管为理解的目的以例证和实例方式有些详细地描述了前面的发明,但是可实施某些改变和修改对本领域技术人员很明显。因此,说明书和实施例不应该被解释为限制本发明的范围,本发明范围由所附权利要求描述。
Wilmut等和Campbell等报道了使用单一电脉冲进行重建胚胎的融合,随后在胚胎化学活化前延迟几个小时。其它报道已经示范了可用于各种物种活化的不同的电和化学刺激(Koo等,2000;和Fissore A.等)。本发明通过同时融合和活化,两个事件之间不包含延迟,给活化和融合胚胎使用随后的另外电脉冲,提供了体细胞核转移的用途。随后对融合和活化技术的研究产生了本发明提供的可供选择的方法,它提供了提高的效率和使得制备转基因动物或细胞系的过程更可靠和有效。
在开发增加现有技术中可利用的融合和活化胚胎的低效率的本方法的过程中,进行调查以估计如何利用初次未融合但是已经被活化的重建胚胎。实施其后实验观察测试物种(如山羊)的多次电脉冲。也在核转移后卵母细胞活化和产生活小猪方面在猪模型中测试相同方法。这是为了更好模拟当精子正常穿透和使卵母细胞受精和诱导钙振荡时体内所观察到的情况(Alberio等,2001;和Ducibella等,1998)。
材料和方法
用作卵母细胞供体的雌性动物的动情期同步化和超排卵及显微操作如Gavin W.G.1996所述实施,该文献特别引入这里作为参考。原代体细胞的分离和建立,用作细胞核供体的体细胞的转染和制备也如前述实施。原代体细胞是使用标准的基于脂质的转染方案,用感兴趣基因转染的动物组织得到的分化的非生殖细胞。测试转染细胞,如Baguisi等1999所述培养和制备转基因阳性细胞用作核转移的供体细胞。也应该记住可以用DNA染料Hoechst 33342或使核酸可见的其它荧光敏感成分对卵母细胞染色或不染色来实施去核和重建步骤。然而优选使用大约0.1-5.0μg/ml Hoechst 33342来着色中期板上的遗传物质。
山羊
用于本研究的一群纯育的和混合繁殖的无瘙痒病的Alpine、Saanen和Toggenburg奶山羊按Good Agricultural Practice(GAP)指南维持。
山羊胎儿体细胞系的分离
待用作细胞核供体的原代山羊胎儿成纤维细胞细胞系得自用转基因雄性动物的新鲜收集精子人工受精2只非转基因雌性动物产生的35和40天胎儿。手术取出胎儿并放置于平衡磷酸缓冲盐水(PBS,无ca++/Mg++)中。切碎在0.025%胰蛋白酶,0.5mM EDTA,38℃中的胎儿组织10分钟制备单一细胞悬液。用胎儿细胞培养基[补充核苷、0.1mM2-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素(10,000I.U.每种/毫升)的含10%胎牛血清(FBS)的平衡培养基-199(M199,Gibco)]洗涤细胞,并培养在25cm2的瓶中。培养4天后通过胰蛋白酶作用收集原代胎儿细胞的汇合单层,接着维持在培养中或冷冻保存。
供体细胞系的性别区分和基因分型
从胎儿组织分离基因组DNA,并用聚合酶链式反应(PCR)分析靶信号序列,以及区分性别有用的序列的存在。通过扩增367bp的序列检测靶转基因序列。使用zfX/zfY引物对和Sac I限制性酶消化扩增片段来实施性别区分。
用于胚胎重建的供体细胞的制备
转基因雌性动物系(CFF6)用于所有核转移程序。胎儿体细胞接种在含胎儿细胞培养基的4孔板上并维持在培养中(5%CO2,39℃)。48小时后,培养基用新鲜的低血清(0.5%FBS)胎儿细胞培养基替换。接下来的7天,每48至72小时用低血清胎儿细胞培养基替换培养基。第一次添加低血清培养基后第7天,胰蛋白酶作用收集体细胞(待用作细胞核供体)。与去核卵母细胞融合前1-3小时,细胞重新悬于补充2mM L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素(10,000I.U.每种/毫升)的含10%FBS的平衡M199中。
卵母细胞收集
如前所述(Gavin W.G.,1996)进行卵母细胞供体雌性动物的同步和超排卵,并以48小时间隔与切除输精管的雄性动物交配。收集后,卵母细胞培养在补充2mM L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素(10,000I.U.每种/毫升)的含10%FBS的平衡M199中。
胞质体制备和去核
丢弃含附加丘细胞的卵母细胞。无丘细胞的卵母细胞分为两组:停滞的中期-II(一个极体)和分裂末期-II方案(无清晰可见的极体或存在部分挤压的第二极体)。首先对停滞的中期-II方案中的卵母细胞去核。通过在M199/10%FBS中培养2至4小时制备分配到活化的分裂末期-II方案中的卵母细胞。这个时期后,所有活化卵母细胞(存在部分挤压第二极体)分组为培养诱导的、钙活化的分裂末期-II的卵母细胞(分裂末期-II-Ca)并去核。培养期间没有活化的卵母细胞随后在含7%乙醇,10%FBS的M199中培养5分钟诱导活化和接着在含10%FBS的M199中培养另外3小时到达分裂末期-II(分裂末期-II-EtOH方案)。
去核前15至30分钟,所有卵母细胞用细胞松弛素-B(Sigma,在含10%FBS的M199中5μg/ml)处理。用25至30μm玻璃吸管通过抽吸第一极体和极体周围环绕的相邻细胞质(~30%细胞质)以除去中期板,除去中期-II期卵母细胞的核。通过除去第一极体和含有部分挤压第二极体的环绕细胞质(10-30%细胞质)来除去分裂末期-II-Ca和分裂末期-II-EtOH卵母细胞的核。去核后,立即重建所有卵母细胞。
核转移和重建
在与卵母细胞去核中使用的相同培养基中进行供体细胞注射。使用玻璃吸管将一个供体细胞放置于透明带和卵质膜之间。电融合和活化程序前,细胞-卵母细胞偶联体在M199中培养30至60分钟。重建的卵母细胞在融合缓冲液(300mM甘露醇,0.05mM CaCl2,0.1mM MgSO4,1mM K2HPO4,0.1mM谷胱苷肽,0.1mg/ml BSA)中平衡2分钟。室温,在含2个制成“融合玻片”(500μm间隙;BTX-Genetronics,San Diego,CA)的不锈钢钢电极,充满融合介质的融合室中进行电融合和活化。
使用融合玻片实施融合。融合玻片置于融合皿里面,皿中充满足够量的融合缓冲液覆盖融合玻片的电极。从培养温箱这取出偶联体并通过融合缓冲液洗涤。使用立体显微镜,电极间等距放置偶联体,细胞核/胞质体连接处与电极平行。应该注意应用给偶联体促进活化和融合的电压范围可以从1.0kV/cm至10.0kV/cm。然而优选初次单一同时融合和活化电脉冲具有2.0至3.0kV/cm的电压范围,最优选在2.5kV/cm,优选至少20μ秒的持续时间。使用BTX ECM 2001电子细胞操作仪(Electrocell Manipulator)将此脉冲应用给细胞偶联体。微脉冲的持续时间可以从10至80μ秒变化。此过程之后,处理的偶联体典型地转移到一滴新鲜融合缓冲液中。通过平衡SOF/FBS洗涤融合处理的偶联体,接着转移到含或不含细胞松弛素-B的平衡SOF/FBS中。如果使用细胞松弛素-B,其浓度可以从1至15μg/ml变化,最优选5μg/ml。偶联体在含大约5%CO2的空气的潮湿气室37-39℃中培养。应该注意本文公开内容中提供的任何方案中,细胞松弛素-B可以使用甘露醇替代(基于HEPES缓冲的甘露醇(0.3mm)的含Ca+2和BSA的培养基)。
融合后10至90分钟开始,最优选在融合后30分钟开始,确定真实细胞核/胞质体融合的存在。为了本发明的目的,融合的偶联体可以接受另外活化处理(双脉冲)。这个另外脉冲在电压强度方面可以从0.1至5.0kV/cm变化,时间范围10至80μ秒。然而优选地,融合偶联体将接受0.4或2.0kV/cm的另外单一电脉冲(双脉冲)20μ秒。另外脉冲的给予可以在首次脉冲后至少15分钟小时开始,然而最优选,在初次融合和活化处理后30分钟至2小时开始这次另外脉冲以促进额外活化。在其它实施方案中,用单一电脉冲再次融合未融合的偶联体。这次另外脉冲的电压范围和时间可从1.0kV/cm至5.0kV/cm至少10μ秒变化,发生在初次融合脉冲后至少15分钟。然而更优选地,这次另外脉冲是2.2kV/cm至3.2kV/cm,至少20μ秒,在初次融合和活化处理后30分钟至1小时开始以促进融合。所有融合的和融合处理的偶联体返回SOF/FBS加5μg/ml细胞松弛素-B。偶联体在含大约5%CO2的空气的潮湿气室中37-39℃培养至少20分钟,优选30分钟。
本发明方法的另一版本对于细胞偶联体提供了另外的单一电脉冲(双脉冲),优选2.0kV/cm,至少20μ秒,在初次融合和活化处理后至少15分钟,优选30分钟至1小时开始,以促进额外的活化。这次另外活化脉冲的电压范围可以从1.0至6.0kV/cm变化。
可供选择地,在后面的工作中,剩余融合的偶联体随后接受至少三次另外单一电脉冲(四脉冲),最优选2.0kV/cm,至少20μ秒,间隔15至30分钟,在初次融合和活化处理后至少30分钟开始,以促进另外的活化。然而,应该注意在这个另外方案中,该另外活化脉冲的电压范围可以从1.0至6.0kV/cm变化,持续时间可以从10μ秒至60μ秒变化,在初次融合处理后可以短至15分钟,或长至4小时开始。在随后实验中,用2.6至3.2kV/cm,至少20μ秒,在初次融合和活化处理后1小时开始的单一电脉冲再次融合未融合的偶联体以促进融合。所有融合的和融合处理的偶联体返回含或不含细胞松弛素-B的平衡SOF/FBS。如果使用细胞松弛素-B,其浓度可以从1至15μg/ml变化,最优选5μg/ml。偶联体在包含含大约5%CO2的空气的潮湿气室37-39℃中培养至少30分钟。可以使用甘露醇替换细胞松弛素-B。
再次融合后30分钟开始,确定细胞核/胞质体再次融合的成功。用平衡SOF/FBS洗涤融合处理的偶联体,接着转移到加5μg/ml放线菌酮的平衡SOF/FBS中。偶联体在含大约5%CO2的空气的潮湿气室37-39℃中培养最多4小时。
放线菌酮处理后,用补充至少0.1%牛血清白蛋白,优选至少0.7%,优选0.8%,加100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的平衡SOF培养基(SOF/BSA)充分洗涤偶联体。偶联体转移到平衡SOF/BSA中,在含大约6%O2,5%CO2,余量为氮的潮湿组合孵育室中37-39℃静置培养24-48小时。适当发育(在24至48小时,1细胞到8细胞)年龄的核转移胚胎转移给同步化代理受体。
核转移胚胎培养和转移给受体
所有核转移胚胎在原代山羊输卵管上皮细胞的单层上,在覆盖矿物油的含10%FBS的50μl小滴M199中共培养。转移给受体雌性动物之前,胚胎培养物在含5%CO2潮湿39℃温箱中维持48小时。如前所述实施受体的胚胎转移22。
妊娠和围产期护理
对于山羊,持续动情期第一天后的第25天开始,超声波检查法确定妊娠。每周估计雌性动物直到受孕75天,和其后每月一次估计胎儿活力。对于持续超过152天的妊娠,用5mg PGF2α(Lutalyse,Upjohn)促进分娩。处理后24小时内发生分娩。出生后立即从母畜移开小山羊,并在分娩后1小时内接受热处理的初乳。
克隆动物的基因分型
出生后不久,从克隆的雌性动物(如山羊)和代孕雌亲获得血液样品和耳朵皮肤活检组织进行基因组DNA分离。使用特定转基因靶蛋白的引物,通过PCR首先分析每个样品,接着用那个特定靶蛋白的cDNA,进行Southern印迹分析。对于每个样品,用EcoRI(New England Biolabs,Beverly,MA)消化5μg基因组DNA,在0.7%琼脂糖凝胶(SeaKem,ME)中电泳并在本领域已知标准步骤后用毛细管转移固定到尼龙膜(MagnaGraph,MSI,Westboro,MA)上。用α-32P dCTP标记的1.5kb XhoI至Sal I hAT cDNA片段,使用Prime-It试剂盒(Stratagene,LaJolla,CA)探测膜。在65℃杂交过夜。用0.2 X SSC,0.1%SDS洗涤印迹和用X-OMATTM AR胶片曝光48小时。
奶蛋白分析
对于幼年雌性转基因动物,在两月龄时实施泌乳的激素诱导。对动物手工挤奶,每天一次,收集奶样品进行hAT表达分析。如所述(Edmunds,T.等,1998)实施Western印迹和rhAT活性分析。
在本发明的开发过程中实施的实验中,在去核和重建之后,细胞核/胞质体偶联体在补充了1%至15%胎牛血清,优选10%FBS,加100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的平衡合成输卵管液培养基(SOF/FBS)中培养。融合前至少30分钟,偶联体在具有含大约5%CO2的空气的潮湿气室中37-39℃培养。
结果
如表1总结的,在实验中,尝试了初次单一同时融合和活化脉冲的1646个偶联体中,114个偶联体裂解,720个偶联体(43.7%)融合。在该720个融合偶联体中,364个融合的偶联体接受双脉冲,13个偶联体裂解和培养351个双脉冲的偶联体。初次融合尝试得到的没有融合的共812个偶联体被再次融合。由这些再次融合尝试,54个偶联体裂解,346个偶联体(42.6%)融合。初次融合和再次融合的总体融合率是尝试融合的1646个偶联体中1066个偶联体(64.8%)融合。
表1.核转移融合分析
融合类型 | #融合的偶联体/#处理的偶联体(%) |
单一脉冲 | 720/1646(43.7) |
再次融合 | 346/812(42.6) |
表2总结了接受基于融合和活化类型的核转移胚胎的代孕受体雌性动物足月妊娠的结果。在这些实验中,4个接受了再次融合的偶联体产生的胚胎的受体雌性动物(6.1%)发生足月妊娠,而1个接受双脉冲偶联体产生的胚胎的受体雌性动物(2.7%)发生足月妊娠。可供选择地,在实验动物中没有一只接受单一脉冲偶联体产生的胚胎的雌性动物发生足月妊娠。
表2.核转移妊娠分析
融合类型 | #足月受体/#受体(%) |
单一脉冲 | 0/35 |
双脉冲 | 1/37(2.7) |
再次融合 | 4/66(6.1) |
表3总结了基于融合和活化类型产生的后代的结果。在实验中,再次融合产生的346个融合阳性偶联体产生了4个后代(1.2%),而双脉冲活化方法产生的351个融合阳性偶联体产生了1个后代(0.3%)。可供选择地,同时融合和活化产生的353个融合阳性偶联体没有产生后代。
表3.核转移融合和活化后代分析
融合类型 | #融合偶联体 | #后代(%) |
单一脉冲 | 353 | 0 |
双脉冲 | 351 | 1(0.3) |
再次融合 | 346 | 4(1.2) |
表4总结了转基因founder动物发育的产出成果的结果,在这组实验中,产生的动物是山羊。然而,这里提供的技术在其它哺乳动物物种中也有效。这个数据表示了2001年5月至6月的时期。尽管这个表详述了产出成果,但是最相关的方面是成功融合的重建偶联体的数量和转移给受体雌性动物的发育胚胎的所得数量。体细胞核转移产生的共902个胚胎移植给138个代孕受体雌性动物,五个受体雌性动物(3.6%)发生足月妊娠产生了5个健康后代。
表4.核转移数据2000/2001季(4月30日-6月22日,2001年)
#供体 178
#排卵/供体 18.1(共3213排卵)
#卵/供体 11.2(共1998卵)
#去核 1951(97.6%回收卵母细胞)
#重建 1784(91.4%去核卵母细胞)
#尝试融合的偶联体 1646(92.3%重建卵母细胞)
#融合的偶联体 1066(64.8%尝试融合)
#卵裂 536(50.3%融合的偶联体)
#受体 138(共转移902)
#胚胎/受体 6.5(范围1-24)
#妊娠 5/138(3.6%)
#后代 5
基于这些实验的结果,在随后实验中,未将融合的单一脉冲偶联体转移给受体雌性动物。换句话说,所有融合的偶联体都进行双和四脉冲处理。此外,在所有随后实验中,实施未融合偶联体的再次融合。如表5总结的,在随后实验中,在尝试初次单一同时融合和活化脉冲的2599个偶联体中,85个偶联体裂解,1404个偶联体融合(54.0%)。在1404个融合偶联体中,825个融合偶联体接受了双脉冲,22个偶联体裂解,培养803个双脉冲偶联体。剩余的融合偶联体中,579个融合偶联体接受四脉冲,57个偶联体裂解和培养522个四脉冲偶联体。初次融合尝试没有融合的共1110个偶联体再次融合。由这些再次融合尝试,33个偶联体裂解和672个偶联体融合(60.5%)。初次融合和再次融合的整体融合比率是尝试融合的2599个偶联体中2076个偶联体融合(79.9%)。
表5.核转移融合分析
融合类型 | #融合的偶联体/#处理的偶联体(%) |
单一脉冲 | 1404/2599(54.0) |
再次融合 | 672/1110(60.5) |
表6总结了接受基于融合和活化类型的核转移胚胎的代孕受体雌性动物在第55天的超声结果。在这些实验中,7个接受双脉冲偶联体产生的胚胎的受体雌性动物(13.2%)在受孕55天妊娠。可供选择地,4个接受四脉冲偶联体产生的胚胎的受体雌性动物(8.5%)和4个接受再次融合偶联体产生的胚胎的受体雌性动物(4.6%)在受孕第55天妊娠。
表6.核转移妊娠分析
融合类型 | 受孕第55天#妊娠的受体/#受体(%) |
双脉冲 | 7/53(13.2) |
四脉冲 | 4/47(8.5) |
再次融合 | 4/87(4.6) |
在当前实施例中,山羊用作转基因动物。因此在它们受孕第55天进行超声检查妊娠雌性动物。表7总结了基于融合和活化类型的第55天超声结果。在随后实验中,从双脉冲活化方法产生的803个融合阳性偶联体发育了9个胎儿(1.1%),而从四脉冲活化方法产生的522个融合阳性偶联体发育了6个胎儿(1.1%)。可供选择地,从672个再次融合产生的融合阳性偶联体发育了5个胎儿(0.7%)。
表7.核转移融合和活化后代分析
融合类型 | #融合偶联体 | #受孕第55天胎儿(融合%) |
双脉冲 | 803 | 9(1.1) |
四脉冲 | 522 | 6(1.1) |
再次融合 | 672 | 5(0.7) |
表8总结了转基因founder动物发育的产出成果的结果。这个随后的数据表示了2001年9月至2001年12月的时期。尽管这个表详述了产出成果,但是最相关的方面是成功融合的重建偶联体的数量和转移给受体雌性动物的发育胚胎的所得数量。体细胞核转移产生的共1562个胚胎移植给262个代孕受体雌性动物。对188个受体实施第55天超声,15个证实的妊娠(8.0%)显示胎儿发育。
表8.核转移数据2001/2002季(8月27日-12月21日,2001年)
总排卵 5266
#供体 381
排卵/供体 13.8
#取出的卵 2965(56%排卵)
#卵/供体 7.8
#排出和吸出的卵 3188
#去核 3001(94%回收卵母细胞)
#重建 2798(93%去核卵母细胞)
#尝试融合的偶联体 2599(93%重建卵母细胞)
#融合的偶联体 2076(80%尝试融合)
#卵裂 765(40%融合的偶联体)(在大约48小时是57%)
#转移的核转移胚胎 1562
#受体 262
#胚胎/受体 6.0(范围1-1 4)
#妊娠 15/188(8.0%)
#后代 NA
通过提供活化和融合转基因胚胎的额外产生,本发明允许增加转基因程序的效率。这些胚胎可以植入代孕动物或可以克隆繁殖和保存或利用。通过核转移与体外修饰或选择这些细胞的能力组合,这个程序比以前的转基因胚胎技术更有效。根据本发明,这些转基因克隆胚胎可以用于产生CICM细胞系或其它胚胎细胞系。因此,本发明消除了得到和体外维持有助于基因工程技术的未分化细胞系的需要。
因此,在一个方面,本发明提供了克隆哺乳动物的方法。通常,哺乳动物可以用核转移方法制备,所述方法包括下列步骤:
(i)获得待用作供体核来源的期望的分化哺乳动物细胞;
(ii)从与供体核来源细胞相同的物种的哺乳动物获得卵母细胞;
(iii)将所述卵母细胞去核;
(iv)将期望的分化细胞或细胞核转移给去核的卵母细胞;
(v)同时融合和活化该细胞偶联体,形成第一转基因胚胎;
(vi)通过提供至少一个另外的活化方案包括另外的电休克来活化没有融合产生第一转基因胚胎,但在初次电休克后被活化的细胞-偶联体,形成第二转基因胚胎;
(vii)培养所述的活化的第一和/或第二转基因胚胎直到超过2细胞发育期;和
(viii)将所述第一和/或第二转基因胚胎转移给宿主哺乳动物,使得该胚胎发育为胎儿。
本发明也包括克隆基因工程或转基因哺乳动物的方法,其中分化的哺乳动物细胞或细胞核插入去核卵母细胞之前,分化的哺乳动物细胞或细胞核中被插入、除去或修饰期望的基因。
本发明也提供了根据上面的方法获得的哺乳动物,和那些哺乳动物的后代。本发明优选用于克隆山羊。本发明进一步提供了核转移胎儿和核转移和嵌合后代在细胞、组织和器官移植领域中的用途。
在另一个方面,本发明提供了制备CICM细胞的方法。该方法包括:
(i)获得待用作供体核来源的期望的分化哺乳动物细胞;
(ii)从与供体核来源细胞相同的物种的哺乳动物获得卵母细胞;
(iii)将所述卵母细胞去核;
(iv)将期望的分化细胞或细胞核转移给去核的卵母细胞;
(v)同时融合和活化细胞偶联体,形成第一转基因胚胎;
(vi)通过提供至少一个另外的活化方案包括另外的电休克来活化没有融合产生第一转基因胚胎,但在初次电休克后被活化的细胞-偶联体,形成第二转基因胚胎;
(vii)培养所述的活化的第一和/或第二转基因胚胎直到超过2细胞发育期;和
(viii)培养从所述培养的活化胚胎获得的细胞,得到CICM细胞。
这里所述方法得到的CICM细胞也有利地用于细胞、组织和器官移植领域,或制备胎儿或后代,包括转基因胎儿或后代。分化的哺乳动物细胞是经过了早期胚胎阶段的那些细胞。分化的细胞可以得自外胚层、中胚层或内胚层组织或细胞层。
也可以使用可供选择的方法,其中细胞偶联体可接受多次电休克来增强融合和活化。通常,通过核转移方法产生哺乳动物,所述方法包括下列步骤:
(i)获得待用作供体核来源的期望的分化哺乳动物细胞;
(ii)从与供体核来源细胞相同的物种的哺乳动物获得卵母细胞;
(iii)将所述卵母细胞去核;
(iv)将期望的分化细胞或细胞核转移至去核的卵母细胞中;
(v)对细胞-偶联体采用至少两次电休克,启动所述细胞-偶联体的融合和活化成为活化和融合的胚胎。
(vii)培养所述的活化和融合的胚胎直到超过2细胞发育期;和
(viii)将所述的第一和/或第二转基因胚胎转移至宿主哺乳动物,使得该胚胎发育为胎儿;
其中,所述至少两次电休克的第二次在初次电休克之后至少15分钟给予。
哺乳动物细胞,包括人细胞,可以用熟知方法获得。例如,本发明中有用的哺乳动物细胞包括上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T淋巴细胞)、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、单个核细胞、成纤维细胞、心肌细胞和其它肌细胞等。此外,用于核转移的哺乳动物细胞可以从不同器官获得,如皮肤、肺脏、胰腺、肝脏、胃、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾脏、尿道和其它泌尿器官等。这些仅仅是合适供体细胞的实例。合适的供体细胞,即本主题发明中有用的细胞可以从肌体的任何细胞或器官获得。这包括所有体细胞或生殖细胞。
成纤维细胞是理想的细胞类型,因为它们可从发育的胎儿和成年动物大量获得。成纤维细胞是多少分化的,因此,以前认为是用于克隆程序的不良细胞类型。重要的是,这些细胞容易在体外繁殖,倍增时间快,并可以克隆繁殖用于基因打靶步骤。再者本发明是新的,因为使用分化的细胞类型。本发明是有利的,因为这些细胞容易繁殖,遗传修饰和体外选择。
合适的卵母细胞来源的哺乳动物包括山羊、绵羊、母牛、猪、兔子、豚鼠、小鼠、仓鼠、大鼠、灵长目等。优选,该卵母细胞从山羊和有蹄类动物获得,最优选山羊。分离卵母细胞的方法是本领域熟知的。基本上,这将包括从哺乳动物如山羊的卵巢或生殖道分离卵母细胞。山羊卵母细胞容易获得的来源是来自激素诱导的雌性动物。
为了技术如基因工程、核转移和克隆的成功使用,在这些细胞可以用作受体细胞进行核转移之前,和它们可以被精子受精发育为胚胎之前,优选卵母细胞可在体内成熟。已经在体内成熟的中期II期卵母细胞已经成功用于核转移技术。基本上,动情发作过去或注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)或类似激素过去几个小时,通过手术从非超排卵或超排卵的动物收集成熟的中期II卵母细胞。
此外,应该注意通过转基因技术修饰动物基因组的能力提供了制备重组蛋白的新的可供选择技术。转基因畜牧动物的奶中人重组药物的产生解决了与微生物生物反应器(如缺乏翻译后修饰、不正确的蛋白折叠、高纯化费用)或动物细胞生物反应器(如资本费用高、昂贵培养基、产量低)相关的很多问题。
已报道了去核和核转移时卵母细胞的成熟阶段对核转移方法的成功很重要(First和Prather 1991)。通常,成功的哺乳动物胚胎克隆实践使用中期II期卵母细胞作为受体卵母细胞,因为在这个时期据信该卵母细胞可以被或足以被“活化”从而如同它对受精精子一样处理导入的核。对于家畜,特别是山羊,卵母细胞活化期通常发生在精子接触和穿透进入卵母细胞质膜的时间。
固定时间的成熟期(范围从大约10至40小时,优选大约16-18小时)之后,将卵母细胞去核。去核前,优选取出卵母细胞并在除去丘细胞前,放置于含1毫克每毫升透明质酸酶的RMCARE培养基中。这可通过很细小孔的吸移管重复吸吹或通过简单涡旋实行。剥脱的卵母细胞接着筛选极体,并选择中期II卵母细胞,如极体的存在所确定的,然后用于核转移。去核如下。
可以用已知方法实行去核,如美国专利4,994,384所述,它引入这里作为参考。例如,中期II期卵母细胞放置于EMCARE培养基中,优选含7.5微克每毫升细胞松弛素B,用于立即去核,或可放置于合适的培养基中,例如胚胎培养基如CR1aa,加10%FBS,接着之后去核,优选不超过24小时后,和更优选16-18小时后去核。
可以用显微手术使用微量吸管除去极体和相邻细胞质完成去核。接着可筛选该卵母细胞鉴定其中已成功去核的那些。这个筛选可以通过用1微克每毫升33342 Hoechst染料在EMCARE或SOF中对卵母细胞染色,接着在紫外线照射下观察卵母细胞少于10秒来实行。已成功去核的卵母细胞接着可放置于合适的培养基中。
在本发明中,受体卵母细胞将优选是在体外或体内成熟开始后大约10小时至大约40小时去核,更优选在体外或体内成熟开始后大约16小时至大约24小时,最优选在体外或体内成熟开始后大约16-18小时时去核。
接着,与去核卵母细胞相同物种的单一哺乳动物细胞转移至用于产生活化胚胎的去核卵母细胞的卵周隙中。哺乳动物细胞和去核卵母细胞将用于根据本领域已知方法产生活化胚胎。例如,可以通过电融合来融合细胞。通过提供足以引起质膜瞬间打破的电脉冲来完成电融合。这种质膜的打破非常短,因为膜迅速重新形成。因此,如果诱导两相邻膜打破和重新形成时脂双层混合,在这两个细胞之间将开放小的通道。由于这种小开口的热力学不稳定性,它扩大直到两个细胞变成一个。Prather等的美国专利4,997,384提供了这个方法更多讨论(其全部内容引入这里作为参考)。可以使用各种电融合介质包括如蔗糖、甘露醇、山梨醇和磷酸盐缓冲溶液。也可以使用仙台病毒作为融合剂来完成融合(Ponimaskin等,2000)。
而且,在有些情况下(如小供体核),优选将核直接注射给卵母细胞而不是使用电穿孔融合。Collas和Barnes,Mol.Reprod.Dev.,38:264-267(1994)中公开了这种技术,其全部内容引入这里作为参考。
可以用已知技术活化活化胚胎。这种方法包括如在亚生理温度下培养活化胚胎,基本上是通过给活化胚胎应用寒冷,或实际上凉的温度休克来进行。这可以通过在室温培养活化胚胎来最方便地进行,该室温相对于胚胎正常暴露的生理温度条件是寒冷的。
可供选择地,可以应用已知活化剂完成活化。例如,已经表明受精过程中精子穿透卵母细胞活化灌注卵母细胞而产生更多数量的成活妊娠和核转移后的多个遗传学相同的小牛。而且,可以使用如电和化学休克等处理在融合后活化NT胚胎。合适的卵母细胞活化方法是Susko-Parrish等的美国专利5,496,720的主题,其全部内容引入这里作为参考。
另外,最好同时实行活化,尽管确实存在随后活化的方案。在活化方面,发生下列细胞事件:
(i)增加卵母细胞中二价阳离子的水平,和
(ii)降低卵母细胞中细胞蛋白的磷酸化。
上面的事件可以通过将二价阳离子如镁、锶、钡或钙,如以离子载体的形式导入卵母细胞的细胞质而外源性地刺激发生。增加二价阳离子水平的其它方法包括使用电休克,用乙醇处理和用笼形螯合剂(cagedchelators)处理。可以用已知方法降低磷酸化,如添加激酶抑制剂,如丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂,如6-二甲基-氨基嘌呤,星形孢菌素,2-氨基嘌呤和鞘氨醇。可供选择地,通过将磷酸酶,如磷酸酶2A和磷酸酶2B导入卵母细胞可以抑制细胞蛋白的磷酸化。
因此,应该理解本发明这里提供的增加活化和融合的“重建胚胎”的可利用性的实施方案仅仅是举例说明本发明原理的应用。由前述说明书明显可知这里公开的重建胚胎用于SCNT的改善用途的方法的各种形式、使用方法和各种成分的应用方面的变化是新的,并且可以被修改和/或采用而不背离本发明的精神,或所附权利要求的范围。
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Claims (50)
1.一种通过核转移方法克隆非人哺乳动物的方法,包括
(i)获得待用作供体核来源的目的分化哺乳动物细胞;
(ii)从与供体核来源细胞相同的物种的哺乳动物获得至少一个卵母细胞;
(iii)将所述至少一个卵母细胞去核;
(iv)将目的分化细胞或细胞核转移至去核的卵母细胞中;
(v)同时融合和活化细胞偶联体,形成第一转基因胚胎;
(vi)通过提供至少一个另外的活化方案,包括另外的电休克,来活化没有融合产生第一转基因胚胎,但在初次电休克后被活化的细胞-偶联体,形成第二转基因胚胎;
(vii)培养所述的活化的第一和/或第二转基因胚胎直到超过2细胞发育阶段;和
(viii)将所述第一和/或第二转基因胚胎转移至宿主哺乳动物中,使得该胚胎发育为胎儿。
2.权利要求1的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自中胚层。
3.权利要求1的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自内胚层。
4.权利要求1的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自外胚层。
5.权利要求1的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自胎儿体细胞组织。
6.权利要求1的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自胎儿体细胞。
7.权利要求1的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自成纤维细胞。
8.权利要求1的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自有蹄类动物。
9.权利要求1或8的方法,其中所述供体细胞或供体细胞核来自选自牛、羊、猪、马、山羊和水牛的有蹄类动物。
10.权利要求1的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自成年非人哺乳动物体细胞。
11.权利要求1的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞选自组上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和肌细胞。
12.权利要求1的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自选自皮肤、肺脏、胰腺、肝脏、胃、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾脏和尿道的器官。
13.权利要求1的方法,其中在去核前,所述的至少一个卵母细胞在体内成熟。
14.权利要求1的方法,其中在去核前,所述的至少一个卵母细胞在体外成熟。
15.权利要求1的方法,其中所述的非人哺乳动物是啮齿类动物。
16.权利要求1的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞是非静止体细胞或分离自所述非静止体细胞的核。
17.权利要求1或8的方法,其中胎儿发育为后代。
18.权利要求1的方法,其中所述的至少一个卵母细胞在体外成熟开始后大约10至60小时被去核。
19.权利要求1的方法,其中在所述分化哺乳动物细胞或细胞核插入所述去核卵母细胞前,在所述分化哺乳动物细胞或细胞核中插入、除去或修饰目的基因。
20.权利要求1或19的方法产生的后代。
21.权利要求19的产生后代,进一步包括其中由所述核转移程序产生的后代是嵌合的。
22.权利要求1的方法,其中在克隆方案中使用细胞松弛素-B。
23.权利要求1的方法,其中在克隆方案中不使用细胞松弛素-B。
24.一种制备培养的内细胞团细胞的方法,包括:
(i)获得待用作供体核来源的目的分化哺乳动物细胞;
(ii)从与供体核来源细胞相同的物种的哺乳动物获得至少一个卵母细胞;
(iii)将所述至少一个卵母细胞去核;
(iv)将目的分化细胞或细胞核转移至去核的卵母细胞中;
(v)同时融合和活化细胞偶联体,形成第一转基因胚胎;
(vi)通过提供至少一个另外的活化方案,包括另外的电休克,来活化没有融合产生第一转基因胚胎、但在初次电休克后被活化的细胞-偶联体,形成第二转基因胚胎;和
(vii)培养从所述培养的活化胚胎获得的细胞以得到培养的内细胞团细胞。
25.权利要求24的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自中胚层。
26.权利要求24的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自内胚层。
27.权利要求24的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自外胚层。
28.权利要求24的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自胎儿体细胞组织。
29.权利要求24的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自胎儿体细胞。
30.权利要求24的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自成纤维细胞。
31.权利要求24的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自有蹄类动物。
32.权利要求24或31的方法,其中所述供体细胞或供体细胞核来自选自牛、羊、猪、马、山羊和水牛的有蹄类动物。
33.权利要求24的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自成年哺乳动物体细胞。
34.权利要求24的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞选自上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和肌细胞。
35.权利要求24的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自选自皮肤、肺脏、胰腺、肝脏、胃、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾脏和尿道的器官。
36.权利要求24的方法,其中在去核前,所述的至少一个卵母细胞在体内成熟。
37.权利要求24的方法,其中在去核前,所述的至少一个卵母细胞在体外成熟。
38.权利要求24的方法,其中所述哺乳动物细胞来自啮齿类动物。
39.权利要求24的方法,其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞是非静止体细胞或分离自所述非静止体细胞的核。
40.权利要求24或31的方法,其中任何所述培养的内细胞团细胞胎儿发育为非人后代。
41.权利要求24的方法,其中所述的至少一个卵母细胞在体外成熟开始后大约10至60小时被去核。
42.权利要求24的方法,其中在所述分化哺乳动物细胞或细胞核插入所述去核卵母细胞前,在所述分化哺乳动物细胞或细胞核中插入、除去或修饰目的基因。
43.权利要求24或42的方法产生的后代。
44.权利要求42的产生后代,进一步包括其中由所述核转移程序产生的任何非人后代是嵌合的。
45.权利要求24的方法,其中在该方案中使用细胞松弛素-B。
46.权利要求24的方法,其中在该方案中不使用细胞松弛素-B。
47.权利要求24的方法,其中在该方案中使用细胞松弛素-B。
48.权利要求24的方法,其中所述培养的内细胞团细胞用于发育移植用的功能器官。
49.权利要求24的方法,其中所述培养的内细胞团细胞用于器官发生。
50.一种通过核转移方法克隆非人哺乳动物的方法,包括:
(i)获得待用作供体核来源的目的分化哺乳动物细胞;
(ii)从与供体核来源细胞相同的物种的哺乳动物获得至少一个卵母细胞;
(iii)将所述卵母细胞去核;
(iv)将目的分化细胞或细胞核转移至去核的卵母细胞中;
(v)对细胞-偶联体采用至少两次电休克以启动所述细胞-偶联体的融合和活化成为活化和融合的胚胎。
(vii)培养所述的活化和融合的胚胎直到超过2细胞发育阶段;
(viii)将所述的第一和/或第二转基因胚胎转移至宿主哺乳动物中,使得该胚胎发育为胎儿;
其中所述至少两次电休克的第二次在初次电休克之后至少1 5分钟给予;和
其中在所述分化哺乳动物细胞或细胞核插入所述去核卵母细胞前,在所述分化哺乳动物细胞或细胞核中插入、除去或修饰目的基因。
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