KR20100053927A

KR20100053927A - 정자 미세 주입법에 의한 이종 교잡배 생산

Info

Publication number: KR20100053927A
Application number: KR1020080112813A
Authority: KR
Inventors: 김남형; 융난 쉬; 융쉰 진; 양병철; 성환후; 시앙 쑨 추이
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2008-11-13
Filing date: 2008-11-13
Publication date: 2010-05-24

Abstract

본 발명은 이종 교잡배 생산에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 마우스의 미수정란에 돼지 혹은 고양이 정자를 미세 주입하여 이종간 수정과정을 유도하여 교잡배아를 생산하는 방법이다. 수정란 내 정자 미세 주입법은 정자 희소증 환자의 남성불임 치료에 사용하거나 외래 유전자가 도입한 생쥐 정자를 이용하여 형질전환 동물에 사용하는 방법으로 활용되어 왔다. 본 연구에서는 정자 미세 주입 방법을 보완 개선하여 생쥐-고양이, 생쥐-돼지의 교잡 배를 세계 처음으로 생산하였다. 본 기술은 정자의 수정능력 검증, 체외수정기술 개선, 교잡배를 이용한 하이브리드 줄기세포 생산기반 기술로 활용될 수 있을 것이다.

마우스 수정란, 이종 수정 , 교잡배 생산

Description

정자 미세 주입법에 의한 이종 교잡배 생산 {Production of hybrid embryos using intracytoplasmic sperm injection}

본 발명은 이종 교잡배 생산에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 생쥐의 미수정란에 돼지 혹은 고양이 정자를 미세 주입하여 교잡배아를 생산하는 방법에 관한 것이다.

수정란 내 정자 미세 주입법은 정자 희소증 환자의 남성불임 치료에 사용하거나 외래 유전자가 도입한 생쥐 정자를 이용하여 형질전환 동물에 사용하는 방법으로 활용되어 왔다.

임상불임 치료 기술로서, 정자 직접 주입법의 경우 정자의 질적(예를 들면 운동성) 혹은 정자의 수가 양적으로 부족한 경우(수정에 이르기에는 턱없이 부족한 경우)에, 난자와 정자가 만나는 단계를 생략해 줌으로써 수정률을 높이는 것을 말한다. 이 방법에 의해 불임 치료 성공률은 26%정도로 추정되며, 국내외에서 널리 사용된다.

정자 직접 주입 기술에 의한 불임 치료 기술은 정자의 운동성이 없는 경우에도 가능하나, 정자 자체의 본질적인 문제에 의한 수정률 저하등과 같은 문제점은 해결되고 있지 않다. 예를 들면 정자 꼬리 부분에 있는 중심체의 손상, 정자 핵질의 메칠화 조절에서 발생하는 문제가 있는 경우가 있다. 이 경우 정자의 육안적 모양이나 운동성, 정자의 난자 투명대의 침투력에는 문제가 없으나, 수정 후 배 발생이 정확한 시기에 일어나지 않아 불임이 된다. 이러한 문제를 진단하기 위해서는 인간의 난자를 이용하여 정자를 미세 주입하여 수정 및 체외 발생을 조사하는 것이 확실한 방법이나, 이를 위해서는 윤리적 문제와 비용이 수반되는 다수의 인간 난자가 소요되어야 한다는 문제점이 있었다.

따라서, 동물의 난자를 이용하여 사람 정자의 수정 능력을 조사할 필요성이 있다. 즉 특별한 이유 없이 임신이 되지 않는 경우, 본 기술을 활용하여 남성불임의 원인을 규명하거나 진단에 사용할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있다.

동물의 난자를 이용하여 인간 정자의 남성 불임 여부를 조사하는 것은, 처음 임상에서 햄스터의 난자를 사용하여 일반적으로 행하여져 왔다. 즉 투명대(포유동물 난자의 바깥쪽에 위치한 두꺼운 당단백의 투명한 외막)를 제거한 햄스터 난자와 적절히 처리한 인간 정자를 넣어 정자의 운동성을 조사하는 예가 있었다. 하지만, 인간의 정자를 직접 생쥐의 난자에 주입하여 수정 초기과정을 조사한 바는 있지만(Fulka 등 2008), 수정의 완성 및 초기 배아 발생을 관찰 보고한 예는 없다.

또한 체외 수정란 생산은 인간의 불임 치료 기술 뿐만 아니라. 첨단 발생 기술 효율 향상에도 널리 이용되고 있다. 예를 들면 체세포 복제 동물생산 기술 및 줄기세포 이용 기술등에 활용되고 있는데, 이러한 첨단 기술의 효율성을 증대시키기 위해서는 동물 종간의 수정 과정에 대해 명확한 이해가 선행 되어야 한다.

본 발명은 교잡 동물 생산체계와 연관된 기술을 개발할 목적으로 기획된 연구이다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명에서는 마우스의 미수정란에 마우스 정자 주입 (대조군), 고양이, 및 돼지 정자를 주입하여 교잡배 생산에 그 목적을 두고 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 생쥐 난자에 생쥐, 고양이 및 돼지 정자를 미세 주입하여 교잡배아를 생산하는 것이다. 종래의 방법은 수정을 유도하기 위하여 동종의 정자를 난자에 미세 주입하여 수정과 배아 발생을 이루었지만, 본 발명에서는 이종정자, 즉 생쥐 난자에 고양이 정자와 돼지 정자를 주입하여 수정및 배 발생을 유도하였다. 그 결과, 고양이 와 돼지 정자 모두 정상정인 수정과정에서 관찰되어 자성및 웅성 전핵 발생이 관찰 되었지고, 특히 고양이 정자의 경우 정상적인 2-세포기, 및 상실배 배반포까지 발생됨을 확인할 수 있었다.

포유동물 배아의 배반포는 발생과정에서 중요한 의미를 지니고 있다. 배반포 단계는 분화 과정이 시작되는 단계로서, 배반포의 안쪽에 자리 잡고 있는, 내부 세포괴의 경우 체외에서 적절한 과정을 거치면 배아 줄기세포로 발생할수 있는 세포이다. 따라서 본 발명에의해 본 과정에서 생산된 배반포 단계의 교잡 배는 줄기세포의 생산이 가능한 단계라고 할 수 있는 것이다.

본 기술을 통해 동물 개체간, 수정 과정과 발생 과정을 보다 정확히 이해 할 수가 있도록 하는 효과가 있으며, 그에 따라 정자의 수정능력 검증, 체외수정기술 개선, 교잡배를 이용한 하이브리드 줄기세포 생산기반 기술에 이용될 수 있다.

이하, 이와 같은 본 발명을 다음 실시 예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠지만, 본 발명이 다음 실시 예에 한정된 것은 아니다.

실시 예 1 : 이종교잡배아의 생산

제 1 단계 : 성숙난자의 채취

암컷 마우스에 5IU의 PMSG(pregnant mare’s serum gonadotropin)를 복강 주사하고 48시간이 지나서 PMSG를 주사한 마우스들에 5IU의 hCG(human chorionic gonadotropin)를 복강 주사한 후, 12시간 뒤 이들 마우스를 경추탈골하고 등쪽을 절개하여 M2 배지 미소적을 준비해 둔 배양접시(petri dish)에 난관을 적출하여 세척을 하고 수집하였다. 현미경으로 보면서 핀셋(forceps)으로 난관의 끝을 잡고 주사기의 바늘을 그 구멍에 넣고, 천천히 주사기의 M2배지를 흘러넘치도록 주입(flushing)하여 난관 내의 수정란을 밀려나오게 하였다. 난구세포로 둘러싸여 있는 성숙 난자를 0.1% 하이알루로니데이즈가 포함된 M2 배지(Sigma)에 넣고, 피펫팅하여 난구세포를 제거한 후, 난자만을 골라서 M2 배지에 3회 세척 후, 수용난모세포로 제공하였다.

체외배양(In vitro culture)을 위한 배지는 다음과 같이 준비하였다.

세척용 M2 배지(Sigma사, Cat. No.: M7167);

배양용 M16 배지(Sigma사, Cat. No.: M7292);

상기 배양액을 냉장에 보관하였다.

제 2 단계 : 정자의 준비

실험에 사용될 생쥐, 돼지 및 고양이 정자는 액체질소에 미리 보관되었던 정자를 녹여서 dPBS 매질에 3차 세척한 후, 소니케이트(sonicated for 5min) 처리하여 정자머리부분을 분리시켜 사용하였다. 돼지의 경우, 도축장에서 얻은 정소의 정소상체 미부로부터 회수하였고, 고양이의 경우, 수음법에 의해 채취하였다.

제 3 단계 : 정자의 미세 주입

정자의 미세주입을 위해 M2 배지로 작업용 디쉬에 미소적을 만들었다. 작업용 디쉬를 미세주입기의 조작판 위에 위치하도록 놓은 다음, 고정용 피펫은 9시 방향에 위치시키고, 정자 미세주입 피펫은 3시 방향에 위치시켰다. 고정용 피펫을 흡입하여 난자의 핵이 12시 방향에 위치하도록 고정시킨 후, 조동나사와 미동나사를 이용하여 난자의 초점을 맞추었다. 정자 미세주입용 피펫을 상하로 움직여 난자와 초점이 같도록 맞추었다. 미세주입용 피펫은 피에조(Prime Tech, Japan)를 이용하여 적당한 속도와 힘으로 투명대와 세포질막을 뚫고 정자를 유압을 걸어 수용난모세포의 세포질내에 주입시켰다. 이식이 끝난 난자들은 외배양 배지에 넣어 정치시켰다.

제 4 단계 : 재구성란의 활성화 단계

정자를 주입한 난자들은 활성화시킬 때까지 체외배양 배지에서 15분 이상 정 치시켰다. 활성화는 칼슘이 제거된 씨지비(CZB) 배양액(표1)에 10mM의 스트론튬클로라이드(SrCl_2,Sigma)를 첨가하여 1시간동안 배양하였다.

제 5 단계: 재구성란의 배양

재구성 및 활성화가 완료된 배아는 M16 배지에서 3회 세척 후, 같은 배지로 5%의 이산화탄소가 있는 37℃의 배양기에서 배양하였다.

제 6 단계 : 형광 편광 면역 측정법 (FISH)

교잡배의 확인을 위해 형광편광 변역법을 사용하였다. 생쥐 Cot-1 DNA(미국 이비트로젠 회사. 켈리포니아)로 생쥐 유래 디엔에이(DNA) 측정을 시도하였다. 간략히 설명하면, 교잡배아를 유리 슬라이드에 올려놓고, 메탄올과 아세트산(3:1)으로 고정한 후, 공기 건조법에 의해 고정한 후, 50% 포르말린과 10% 덱스트란 설페이트의 존재 하에서 Cot1 탐침(probe)과 하루 종일 공배양하여 편광이 결합되도록 유도 하였다. 이어 슬라이드를 DAPI(2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidineIdentifiers ; CAS number[28718-90-3]) 염색을 하였고, 이것을 공촛점 현미경 하에서 관찰 하였다.

제 7단계 : 전핵 형성 및 방추사 형성 과정 조사

정자를 미세 주입 한 후, 6 시간에서 3.7% 포르말린(formalin) 용액에서 10분간 고정한 후, 2.5㎎/㎖의 소디움아지드(sodium azide)와 2.5㎍/㎖의 호이스트(Hoechst 33342, Sigma사, Cat. No.: B2261)가 함유된 글리세롤(3): PBS(1)의 용액으로 염색하였다. 전핵 형성을 위하여 H3 Ace K9 과 H3 met K9을 사용하였으며, 방추사 검사를 위해 알파 튜블린 항체를 사용하였다.

이후 난자의 염색과정은 다음과 같다.

슬라이드글라스의 1/3 부위에 4군데에 파라핀 점적을 형성시킨 다음, 난자를 4군데의 점 가운데에 생쥐피펫 (?) 으로 4-10개 정도 올려놓고 커버글라스를 덮었다. 다음, 볼펜이나 피펫팁 등의 가는 물건을 이용하여 난자를 눌러주었다. 그리고, 호이스트(Hoechst 33342, Sigma사, Cat. No.: B2261)가 포함된 용액을 흘려보내고 거름종이를 반대편에 대어 용액을 통과시켰다.

하기 표 1에는 생쥐 체세포 핵이식 수정란의 활성화 배지(Ca²⁺-제거 CZB)의 조성을 나타내었다.

성분	농도
황산마그네슘 무수물(magnesium sulfate anhydrous)	1.18mM
염화칼륨(potassium chloride)	4.83mM
인산이수소칼륨(potassium phosphate monobasic)	1.18mM
에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA)	0.11mM
중탄산나트륨(sodium bicarbonate)	25.12mM
염화나트륨(sodium chloride)	81.62mM
소의 알부민(분획 V)(Albumin, Bovine Fraction V)	0.04%
피루빈산나트륨(pyrubic acidㆍNa)	0.27mM
DL-젖산나트륨(DL-lactic acidㆍNa)	31.30mM

상기 실시 예1에서 생산된 이종교잡배아를 M16배지에서 배양한 결과, 하기 표 2에 나타난 바와 같이 생쥐-돼지는 웅, 자성전핵의 형성과 함께 2세포기까지는 발달하였으나, 2세포기에서 발달이 정지되었다. 하지만 생쥐-고양이의 교잡배는 4세포기 이후로 생쥐-생쥐보다는 발달율이 현저하게 낮았으나, 여전히 상실배 및 배반포까지 발달할 수 있음을 확인할 수 있었다.

난자+정자	2PN	2C	4C	Mo	BL
생쥐+생쥐	98.23±2.34	96.23±3.12	88.57±3.86	73.23±5.32	60.11±3.50
생쥐+고양이	95.31±4.23	93.67±5.67	50.14±4.91*	20.47±4.33*	4.45±4.12*
생쥐+돼지	40.54±5.36*	25.83±3.12*	0	0	0
* ; P<0.05

본 발명은 정자 미세 주입 방법을 보완 개선하여 생쥐-고양이, 생쥐-돼지의 교잡배를 최초로 생산하였으며, 이를 바탕으로 정자의 수정능력 검증, 체외수정기술 개선, 교잡배를 이용한 하이브리드 줄기세포 생산기반 기술에 이용될 수 있을 것이다. 또한, 본 발명을 활용하여, 이종 교잡 줄기세포를 확보 할 수 있는 일련의 방법들을 개발하여 인수 공통 질환 치료 기술(예, 인수 공통 질병, 알러지) 개발 등에 활용될 수 있다.

도 1은 생쥐-돼지의 교잡배아를 2세포기까지 배양하였을 때의 형태학적 모양과 혹스트로 염색하여 공초점형광현미경으로 촬영한 2세포기 핵 사진이다.

도 2는 생쥐-생쥐, 생쥐-고양이 교잡배아의 배반포 단계의 형태학적 모양과 피쉬(FISH)염색법을 이용하여 염색된 염색질사진이다.

도 3은 생쥐-생쥐, 생쥐-고양이, 생쥐-돼지의 교잡배아의 전핵형성시기에 히스톤 단백질의 아세칠화와 메칠화의 양상을 관찰한 사진이다.

도 4는 생쥐-생쥐, 생쥐-고양이, 생쥐-돼지의 교잡배아의 유사분열중기의 미세소관과 DNA의 사진이다.

Claims

교잡배아 생산에 있어서,

생쥐로부터 성숙난자를 채취하여 수용난모세포로 제공하는 수용난모세포준비단계;

포유동물의 정자를 채취하고, 초음파처리하여 정자머리부분만 분리시키는 정자준비단계;

상기 정자준비단계에서 수득된 정자를 상기 수용난모세포준비단계에서 수득된 수용난모세포의 세포질 내로 미세주입하여 수정시키는 수정단계;

상기 수정단계에서 수정된 수정란을 재구성하는 재구성 및 활성화시키는 처리단계;

상기 처리단계에서 재구성 및 활성화된 수정란을 체외배양시키는 배양단계;

를 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 포유동물의 교잡배아의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 포유동물이 돼지 또는 고양이임을 특징으로 하는 포유동물의 교잡배아의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 배양단계에서 수정란을 체외배양시켜 배반포를 수득하는 것을 특징으로 하는 포유동물의 교잡배아의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 배양단계에서 수정란을 체외배양시켜 줄기세포를 수득하는 것을 특징으로 하는 포유동물의 교잡배의 제조방법.