CN114200139A - 一种癌胚抗原参考物质准确赋值的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于量值溯源的CEA候选标准物质准确赋值的方法。本发明所提供的方法，包括如下步骤：采用CEA国际标准物质进行量值溯源的方式对CEA候选标准物质进行定值，具体是采用PBS缓冲液稀释WHO CEA73/601制作校准曲线，采用3个检测系统为候选参考物质定值。实验证明，定值结果准确一致，推进CEA检测的标准化和一致化。
Description
技术领域
本发明属于标准物质定值技术领域，具体涉及一种癌胚抗原参考物质准确赋值的方法。
背景技术
癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen CEA)是存在于细胞表面的富含多糖的蛋白复合物，分子量约为150，000～200，000道尔顿。1965年首先由Gold和Freedman 从结肠腺癌的肝转移后和正常胎儿消化道分离提取物中得到CEA[1]。CEA可广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌，也存在于正常胚胎的消化管组织中，在正常人血清中也可有微量存在。
目前，临床实验室常规使用多种检测系统和方法测定CEA项目，不同实验室或不同检测系统检测同一患者样本时可能得到不同的结果。检验结果缺乏标准化或一致化将影响患者疾病的诊疗以及临床实践指南的正确应用[2]。国际标准物质在标准化或一致化过程中发挥重要作用，但此类物质的应用并不适用于所有的检测项目[3]，主要原因在于其本身缺乏互通性[4]。由于CEA尚无参考测量程序，其准确性只能依赖溯源至国际标准物质，所以CEA标准物质互通性尤为重要。目前绝大多数检测系统均宣称溯源至WHO 73/601，但缺乏对73/601互通性的系统研究。因此，开发一种癌胚抗原参考物质准确赋值的方法，推进CEA检测的标准化和一致化，具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于量值溯源的癌胚抗原候选标准物质多系统定值方法。
本发明所提供的基于量值溯源的癌胚抗原候选标准物质多系统定值方法，包括如下步骤：采用CEA国际标准物质进行量值溯源的方式，对CEA候选标准物质进行定值。
所述方法具体可包括如下步骤：
1)将所述CEA国际标准物质采用PBS缓冲液进行稀释，得到系列不同浓度的所述CEA国际标准物质的稀释溶液，并计算获得各稀释溶液中CEA国际标准物质的理论浓度；
2)采用N个CEA定量检测系统分别测定步骤1)中获得的各稀释溶液中CEA 国际标准物质的浓度；
3)针对所述N个CEA定量检测系统中的每个CEA定量检测系统，均采用步骤1)获得的各稀释溶液中CEA国际标准物质的理论浓度和步骤2)中获得的各稀释溶液中CEA国际标准物质的测定浓度进行线性拟合，得到CEA国际标准物质定值标准曲线；即N个CEA定量检测系统得到N个相对应的CEA定值标准曲线。
4)将所述癌胚抗原(CEA)候选标准物质用步骤1)中所述的PBS缓冲液进行稀释，得到CEA候选标准物质稀释溶液；再采用所述N个CEA定量检测系统分别测定所述CEA候选标准物质稀释溶液中CEA的浓度；
5)针对所述N个CEA定量检测系统中的每个CEA定量检测系统，均将步骤4) 获得的所述CEA候选标准物质稀释溶液中CEA的测定浓度代入到步骤3)获得的相应的CEA定量检测系统的CEA定值标准曲线的方程，从而获得所述CEA候选标准物质稀释溶液中CEA的浓度；
6)将步骤5)获得的针对所述N个CEA定量检测系统测定的所述CEA候选标准物质稀释溶液中CEA的浓度求平均值，所得均值即为所述CEA候选标准物质中 CEA浓度的最终定值。
本发明中所述N可为2以上的自然数，具体如N为3-10的自然数，更加具体的， N为6，进一步可为3。
本发明中所述的“系统”包括用于定量检测CEA的仪器和所使用的试剂。如临床实验室CEA检测系统。
上述方法中，所述步骤1)中所述CEA国际标准物质具体为WHO CEA73/601。
所述步骤1)中，所述CEA国际标准物质的稀释溶液中CEA国际标准物质的最低浓度大于1.18ng/ml，优选的最低浓度不小于3.70ng/ml。
更进一步的，所述CEA国际标准物质的稀释溶液中CEA国际标准物质的浓度范围可为3.70ng/ml-473.37ng/ml。
所述步骤1)中，所述PBS缓冲液的pH值为7.2-7.4。
上述方法中，所述步骤2)中所述CEA定量检测系统包括Abbott Architect i2000免疫分析仪、CEA测定试剂盒(美国雅培诊断产品有限公司)；Beckman DXI800免疫分析仪、CEA测定试剂盒(美国贝克曼库尔特有限公司)；Roche Cobas e601免疫分析仪、CEA测定试剂盒(罗氏诊断产品有限公司)；Diasorin Liaison XL免疫分析仪、CEA 测定试剂盒(索灵诊断医疗设备有限公司)；Maccura i3000免疫分析仪、CEA测定试剂盒(迈克生物有限公司)；Autobio 2000免疫分析仪、CEA测定试剂盒(安图生物有限公司)。
优选的，所述CEA定量检测系统包括Beckman DXI800免疫分析仪、CEA测定试剂盒(美国贝克曼库尔特有限公司)；Roche Cobas e601免疫分析仪、CEA测定试剂盒 (罗氏诊断产品有限公司)；Diasorin Liaison XL免疫分析仪、CEA测定试剂盒(索灵诊断医疗设备有限公司)。
上述方法中，所述步骤5)具体可按照包括如下步骤的方法实现：
将步骤4)中某一CEA定量检测系统测得的所述CEA候选标准物质稀释溶液中 CEA的浓度值代入到步骤3)中获得的该CEA定量检测系统对应的CEA定值标准曲线的方程，从而获得所述CEA候选标准物质稀释溶液中CEA的浓度值，该浓度值即为该CEA定量检测系统对所述CEA候选标准物质稀释溶液中CEA浓度的定值结果。针对N个CEA定量检测系统会得到N个CEA浓度的定值结果。
其中，所述CEA定值标准曲线的横坐标(Y)为认定值(理论浓度)，纵坐标(X) 为测定值(测定浓度)。步骤5)中是将所述CEA候选标准物质稀释溶液中CEA的测定浓度代入所述CEA定值标准曲线的方程的X值，计算得到的Y值即为所述CEA候选标准物质稀释溶液中CEA的浓度。
本发明还保护一种癌胚抗原(CEA)候选标准物质。
本发明所提供的癌胚抗原(CEA)候选标准物质为含CEA的混合人血清基质。
具体的，所述癌胚抗原(CEA)候选标准物质是按照包括如下步骤的方法制备得到的：收集不同个体的CEA高值血清和体检健康人群血清，将所述CEA高值血清和健康人群血清分别混合均匀，使用所述体检健康人群血清将CEA高值血清稀释为6 个不同浓度水平的CEA血清溶液；再分别对6种不同CEA浓度的血清溶液中的CEA 进行定值，得到如下6种浓度的CEA候选标准物质：3.65±0.36ng/ml，16.95±1.19ng/ml， 35.66±3.03ng/ml，61.20±8.78ng/ml，93.84±11.38ng/ml和952.08±140.67ng/ml。
其中，所述血清为外观澄清透明，除外黄疸、溶血、脂血及乳糜等异常性状，除外HIV、甲肝、乙肝、丙肝等病毒感染性的人血清。
所述癌胚抗原(CEA)候选标准物质在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：(i)校准CEA检测系统；(ii)提高多系统对个体患者CEA检测结果的一致性和/或可比性。
本发明通过研究癌胚抗原(CEA)参考物质的互通性，遴选合适的WHO 73/601 稀释液基质改进不同检测系统CEA检测结果的可比性，从而为研制的癌胚抗原参考物质进行准确赋值，推进CEA检测的标准化和一致化。
本发明的实验，采用PBS缓冲液为基质稀释的WHO CEA标准物质作为校准品去校准CEA各检测系统，然后去检测能代表临床实际检测状况的40份单个患者个体血清盘。结果表明，经校准之后各个系统间的一致化程度比校准前有了明显提高，系统间的变异系数降低为8.65％，满足生物生变异导出的CV最优要求。校准前后，系统之间相关性有明显提高。同时本发明制备的CEA候选标准物质(BCCL物质)为人血清的混合物，在经过融解、混匀、过滤、分装，再冻融后在各检测系统间仍然具有互通性，为以后CEA标准化和EQA计划提供可选的互通性参考物质。
附图说明
图1为WHO CEA 73/601被不同稀释液稀释后检测系统检测结果的可比性。
图2为6种检测系统中CEA相关标准物质互通性评估结果。
图3为罗氏、索灵和贝克曼3系统低浓度水平定值标准曲线。
图4罗氏、索灵和贝克曼3系统高浓度水平定值标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1、一种癌胚抗原参考物质准确赋值的方法
1.材料与方法
1.1研究对象
1)在北京朝阳医院检验科收集CEA低、中、高不同浓度水平的40份临床验后血清样本，且这些样本无溶血和乳糜。浓度范围在2.41～1180.10ng/ml(Beckman DXI800测定)，每一样本至少2.5ml，均匀分为6份，保存于-80℃冰箱备用。
2)CEA标准参考物质WHO 73/601，购自英国国家生物制品检定所(NIBSC)；
3)癌胚抗原(CEA)候选标准物质(BCCL研制的CEA候选参考物质)的制备方法如下：完全遵照ISO指南34及WHO关于制备标准物质血清原料的收集指南，收集 CEA高值血清和体检健康人群血清。使用50ml聚乙烯密闭离心管直接收集并混合血清，不加任何添加物或防腐剂。收集后的血清管编号、记录体积后，75％酒精或碘酒消毒瓶体表面并密封，立即放入-80℃冰箱。收集的所有血清标本澄清透明，除外溶血与乳糜等异常性状，除外HIV抗体、HBV阳性的标本。从-80℃冰箱取出收集的血清，置于室温融化。将融化后的高值和正常血清，分别充分混匀后，各取出约0.5mL，使用Beckman DXI800全自动化学发光免疫分析仪测定。根据测定值，应用体检健康人群血清将CEA高值血清稀释为6个不同浓度水平的血清，目标浓度约4ng/mL、20 ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL，每个浓度水平600mL。将制备的每一浓度水平的血清标本放入锥形瓶中，用磁力搅拌器充分混匀1小时；混匀后的血清标本依次用0.8μm滤膜、0.45μm滤膜、0.2μm滤膜过滤。所有的容器及过滤装置须在120℃条件下高压灭菌；将过滤好的无菌血清，用移液器分装到无菌聚乙烯分装管中，每管0.6mL，密封。所有操作须在生物安全柜中无菌操作。分装管的标签需标注血清CEA浓度水平、编号、分装时间等内容。分装后的血清立即放入-80℃冰箱中保存。6个浓度水平的人源基质CEA成分分析标准物质各300支，每支约0.6mL。
1.2仪器与试剂
1)Abbott Architect i2000免疫分析仪、CEA测定试剂盒(美国雅培诊断产品有限公司)； Beckman DXI800免疫分析仪、CEA测定试剂盒(美国贝克曼库尔特有限公司)；RocheCobas e601免疫分析仪、CEA测定试剂盒(罗氏诊断产品有限公司)；Diasorin Liaison XL免疫分析仪、CEA测定试剂盒(索灵诊断医疗设备有限公司)；Maccura i3000免疫分析仪、CEA测定试剂盒(迈克生物有限公司)；Autobio 2000免疫分析仪、CEA 测定试剂盒(安图生物有限公司)。
2)稀释液：PBS缓冲液(包含Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，pH值为7.2-7.4)；健康混合人血清；无糖DMEM培养基(Gibco,A14430-01)；MEM培养基 (Gibco,51200-038)；RPMI1640培养基(Sigma,R7509-500ML)。
1.3方法
将不同配置成份的稀释液稀释的9个浓度水平的WHO标物(即WHO 73/601)、3 个水平BCCL物质、随机穿插在40个临床患者血清样本中，分别使用6种检测系统同批测定，所有样本分别测定3次。
1)WHO73/601标准溶液的配置
WHO73/601CEA标准物质的原始浓度为浓度为200IU/mL(11834ng/mL)，根据WHO73/601说明书，用PBS(P)、健康混合人血清(XQ)、DMEM(D)、MEM(M)和 RPMI 1640(RP)5种稀释液分别将其稀释为9个不同浓度水平，各平均分为6等份。稀释后的WHO73/601分别标记为P1-P9,XQ1-XQ9,D1-D9,M1-M9和RP1-RP9,浓度范围在1.18～473.37ng/ml。5种不同稀释液成分的WHO73/601标准溶液分别在罗氏、雅培、贝克曼、索灵、迈克和安图6种国内外不同检测系统上同批测定，所有样本分别测定3次，比较5种不同稀释液成分的WHO73/601标准溶液在6种检测系统中测定均值及其变异系数(CV％)，使用Microsoft
2010进行统计学分析。
2)CEA参考物质互通性
按照美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute， CLSI)C53文件，在6种检测系统上对血清样本结果两两进行Deming回归，得到回归线和相应的95％置信区间。位于95％置信区间内的参考物质，认为该物质在两系统间具有互通性；位于置信区间外的物质，则认为该物质在两系统间无互通性[5-6]。
3)校准前后检测系统检测结果差异的比较
用不同配置成份的稀释液将WHO CEA73/601稀释成9个浓度水平以评价其溯源可靠性，用其校准罗氏、索灵和贝克曼3个国内外不同试剂品牌的CEA检测系统，比校准前后这3个检测系统对40份患者血清的检测结果的差异。
4)BCCL候选参考物质定值
PBS缓冲液作为稀释液配置9个浓度水平的WHO CEA73/601工作液(P1-P9)与6 个不同浓度BCCL参考物质(C1-C6)分别准备3份平行样，在罗氏、索灵和贝克曼 CEA检测系统上同时检测，每支样本测定3次，连续测定2天。用国际标准物质稀释后的理论浓度为纵坐标，实际测定浓度为横坐标，每个系统做出一条直线，即采用直线拟合的方法分别建立3个系统低值(4.05ng/ml-32.71ng/ml)和高值(63.40ng/ml -490.74ng/ml)标准曲线，将BCCL候选参考物质样本测出值，计算均值代入直线方程，得出某一定值，再将3个系统的定值结果取均值，最终得出BCCL候选参考物质的定值，低浓度C1-C3的定值采用低值曲线(P2-P5)校准的结果计算得到，高浓度 C4-C6的定值采用高值曲线(P6-P9)校准的结果计算得到。
1.4统计学处理：使用Microsoft
2010进行统计学分析。
2结果
2.1CEA结果可比
6种检测系统测定5种稀释液分别稀释的9个不同浓度水平WHO标物，计算6 种检测系统测定均值的变异系数(CV％)，PBS缓冲液为基质稀释的WHO73/601在各系统间的差异最小，平均变异系数为14.66％，其余四种稀释液XQ、RP、D和M稀释的WHO73/601在各系统间的平均变异系数分别为18.31％，21.62％，26.85％和26.34％。 5种不同稀释液成分的WHO73/601标准溶液在6种检测系统中测定均值及其变异系数 (CV％)见表1和图1。
表1：6种检测系统测定均值及其平均变异系数(CV％)
2.2 CEA参考物质在6种检测系统的互通性评估
参考物质在6种检测系统互通性评估结果见图2。BCCL研制的人血清基质CEA 候选参考物质(自制标物)在6种检测系统间均具有互通性。所有稀释液稀释的WHO CEA标物在最低浓度水平(1.18ng/ml)时均不具有互通性，其余稀释浓度水平的WHO CEA标物仅在罗氏/索灵、罗氏/贝克曼、索灵/贝克曼3个系统组合间均具有互通性。
2.3校准前后检测系统检测结果差异的比较
用不同配置成份的稀释液将WHO73/601稀释成9个浓度水平以评价其溯源可靠性，用除最低浓度外的8个水平标准溶液校准罗氏、索灵和贝克曼3个国内外不同试剂品牌的CEA检测系统，用国际标准物质稀释后的8个理论浓度为纵坐标，实际测定浓度为横坐标，建立标准曲线，比校准前后这3个检测系统对40份患者血清的检测结果的差异。PBS缓冲液为基质稀释的WHO CEA标准物质在各系统间的差异最小，以其校准后的40份患者系统间样本均值变异系数(CV)中位值从校准前的14.47％下降到8.65％，小于基于生物学变异度导出的最优CV(CV＝12.37％)。结果见表2。
表2：3种CEA检测系统校准前后的可比性
2.4 CEA候选参考物质定值结果
罗氏、索灵和贝克曼3个系统定值标准曲线斜率分别为1.3-1.2，相关系数R的范围为0.999-1，见图3-4。3系统对BCCL研制的候选参考物质联合定值结果分别为 3.65±0.36ng/ml,16.95±1.19ng/ml,35.66±3.03ng/ml,61.20±8.78ng/ml，93.84±11.38ng/ml, 和952.08±140.67ng/ml。
癌胚抗原是最常用的检测指标之一，是结直肠癌根治手术术后监测最常用的指标。检验结果的一致性一直是检验界质量管理的目标。检验结果缺乏一致性，可能对患者的诊疗产生严重的影响。绝大多数CEA试剂生产商都声称其校准品溯源到CEA国际标准物质WHO 73/601，而后者在制作过程中蛋白质结构及抗原表位可能发生变化。另外，不同稀释液对抗原抗体结合力也可能带来影响。本发明通过考察不同稀释对 WHO 73/601稀释法和其在多系统间互通性研究，遴选合适的CEA国际标准物质WHO 73/601稀释液。本研究选用5种常见的缓冲液进行比较，将5种不同配置成份的稀释液稀释的9个浓度水平(1.18～473.37ng/ml)的CEA参考物质WHO73/601，通过在6 种检测中系统测定发现，PBS缓冲液为基质稀释的WHO CEA标准物质在各系统间的差异最小，PBS缓冲液是5种稀释液基质中的最佳选择。
实现检验结果一致性的必然途径是检测方法的标准化，其关键是保证检测结果的可溯源性[7]。
临床实验室标准化研究文件CLSI EP14[8]给出了基质效应的评价方法，但该方案要求一种方法基于参考方法。本研究选用的这6种检测系统皆为临床常用的方法，我们按照CLSI C53方案对参考物质的互通性进行了分析[9]。结果显示BCCL物质在各检测系统间具有良好的互通性。具有互通性的参考物质在标准化计划中发挥着极其重要的作用，在校准溯源链中不互通的参考物质会造成结果的不一致性。在EQA计划中使用互通性的参考物质是未来的必然趋势[10]，因为不互通的EQA物质可能会使EQA结果无法解释甚至造成错误的结论[11]。我们制造的BCCL物质为人血清的混合物，在经过融解、混匀、过滤、分装，再冻融后仍然具有互通性，为以后CEA标准化和EQA 计划提供可选的互通性参考物质。
本次的实验，采用PBS缓冲液为基质稀释的WHO CEA标准物质作为校准品去校准CEA各检测系统，然后去检测能代表临床实际检测状况的40份单个患者个体血清盘。结果表明，经校准之后各个系统间的一致化程度比校准前有了明显提高，系统间的变异系数降低为8.65％，满足生物生变异导出的CV最优要求。校准前后，系统之间相关性有明显提高。
总之，CEA的标准化仍需进一步努力，冰冻混合人血清候选标准物质在各检测系统间具有互通性，在标准化计划和EQA计划中可发挥重要作用。使用WHO CEA标准物质73/601进行量值溯源过程中，应该选用适当的基质，以保证校准品赋值的准确性。
参考文献：
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[11]Zhang S,Zeng J,Zhang C,Li Y,Zhao H,Cheng F,et al.Commutability ofpossible external quality assessment materials for cardiac troponinmeasurement.PLoS One,2014,9(7): e102046。
Claims (9)
1.一种基于量值溯源的癌胚抗原候选标准物质多系统定值方法，是采用CEA国际标准物质进行量值溯源的方式对CEA候选标准物质进行定值，包括如下步骤：
1)将所述CEA国际标准物质采用PBS缓冲液进行稀释，得到系列不同浓度的所述CEA国际标准物质的稀释溶液，并计算获得各稀释溶液中CEA国际标准物质的理论浓度；
2)采用N个CEA定量检测系统分别测定步骤1)中获得的各稀释溶液中CEA国际标准物质的浓度；
3)针对所述N个CEA定量检测系统中的每个CEA定量检测系统，均采用步骤1)获得的各稀释溶液中CEA国际标准物质的理论浓度和步骤2)中获得的各稀释溶液中CEA国际标准物质的测定浓度进行线性拟合，得到CEA国际标准物质定值标准曲线；即N个CEA定量检测系统得到N个相对应的CEA定值标准曲线；
4)将所述CEA候选标准物质用步骤1)中所述的PBS缓冲液进行稀释，得到CEA候选标准物质稀释溶液；再采用所述N个CEA定量检测系统分别测定所述CEA候选标准物质稀释溶液中CEA的浓度；
5)针对所述N个CEA定量检测系统中的每个CEA定量检测系统，均将步骤4)获得的所述CEA候选标准物质稀释溶液中CEA的测定浓度代入到步骤3)获得的相应的CEA定量检测系统的CEA定值标准曲线的方程，从而获得所述CEA候选标准物质稀释溶液中CEA的浓度；
6)将步骤5)获得的针对所述N个CEA定量检测系统测定的所述CEA候选标准物质稀释溶液中CEA的浓度求平均值，所得均值即为所述CEA候选标准物质中CEA浓度的最终定值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中所述CEA国际标准物质为WHOCEA73/601；
所述步骤1)中，所述CEA国际标准物质的稀释溶液中CEA国际标准物质的最低浓度大于1.18ng/ml，优选的最低浓度不小于3.70ng/ml；
所述步骤1)中，所述PBS缓冲液的pH值为7.2-7.4。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述CEA国际标准物质的稀释溶液中CEA国际标准物质的浓度范围为3.70ng/ml-473.37ng/ml。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述N为2以上的自然数；
所述的系统包括用于定量检测CEA的仪器和所使用的试剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中所述CEA定量检测系统包括Abbott Architect i2000免疫分析仪；Beckman DXI800免疫分析仪；Roche Cobas e601免疫分析仪；Diasorin Liaison XL免疫分析仪；Maccura i3000免疫分析仪；Autobio 2000免疫分析仪；
优选的，所述CEA定量检测系统包括Beckman DXI800免疫分析仪；Roche Cobas e601免疫分析仪；Diasorin Liaison XL免疫分析仪。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中所述CEA候选标准物质为权利要求7或8所述的CEA候选标准物质。
7.一种CEA候选标准物质，为含CEA的混合人血清基质。
8.根据权利要求7所述的CEA候选标准物质，其特征在于：所述含CEA的混合人血清基质按照下述方法制备得到：收集不同个体的CEA高值血清和体检健康人群血清，将所述CEA高值血清和健康人群血清分别混合均匀，使用所述体检健康人群血清将CEA高值血清稀释为6个不同浓度水平的CEA血清溶液；再分别对6种不同CEA浓度的血清溶液中的CEA进行定值，得到如下6种浓度的CEA候选标准物质：3.65±0.36ng/ml，16.95±1.19ng/ml，35.66±3.03ng/ml，61.20±8.78ng/ml，93.84±11.38ng/ml和952.08±140.67ng/ml。
9.权利要求7或8所述的所述CEA候选标准物质在如下任一中的应用：
(i)校准CEA检测系统；
(ii)提高多个CEA检测系统对个体患者CEA检测结果的一致性和/或可比性。
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