CN104962279A - 一种no3-离子的检测试剂及应用 - Google Patents
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Abstract
一种NO3 -离子的检测试剂及应用属分析化学技术领域。建立了一种以9,10-双吡啶基乙烯蒽阳离子衍生物作为荧光探针a，用于荧光法检测pH值中性水溶液中的微量NO3 -。在水溶液中，测定NO3 -时，以470nm为荧光激发波长，测定575nm处的荧光强度，检测的浓度线性范围为1.5×10-7～2.1×10-5mol·L-1，检测限低至10-8mol·L-1。同时，在活细胞成像中，探针a与NO3 -在细胞内染色后，荧光倒置显微镜检测显示了清晰的黄色荧光细胞分布，对细胞影像拍照获得清晰的细胞轮廓影像，染色具有特定区域的选择性聚集能力。
Description
技术领域
本发明属有机合成和分析化学领域，具体地说是一种NO3 -离子的检测试剂及应用。
背景技术
阴离子在生物和环境系统中扮演着重要角色。例如，硝酸根离子可使人体正常的血红蛋白氧化而失去运输氧的能力，还可与仲胺类化合物反应生成具有致癌性亚硝胺类化合物。根据报道每升水中硝酸盐含量达数十毫克时，可能导致婴儿患高铁血红蛋白症的几率增加。因而对硝酸根离子的测定具有重要的实际意义。目前测定硝酸根离子的方法有多波长法、二阶导数法、流动注射法、离子色谱法、极谱法等。荧光光谱法由于操作简单，检测灵敏和较低的检测限，以及无需昂贵仪器设备等优点而受到越来越多的关注。但是，目前大多数的荧光探针只能用于金属离子的检测，用于阴离子检测的荧光试剂尤其是能应用到水环境的探针很少。这主要是因为阴离子一般存在于水环境中，而阴离子在水溶液中会形成很强的氢键，所以检测水溶液中的阴离子是非常困难的。因此，发展以特定阴离子为识别测定对象的荧光探针分子具有重要研究意义和实际应用价值。
另一方面，荧光探针与荧光显微技术的结合，使荧光探针在生物活性物质检测和细胞成像方面得到广泛应用。例如，美国加州大学戴维斯分校(UC Davis)生物光子学科学技术中心(CBST)的科研人员首次通过荧光标记成功地对活肿瘤细胞内部的纳米尺寸区室的运动进行了成像。这一成果为未来理解癌症和一大批其他疾病的分子原因和生物力学的突破进展带来了希望，它还促进了神经科学和干细胞等领域的研究。荧光成像分析是目前广泛应用于活细胞分析的一种高灵敏的可视化分析技术。另一方面，由于阴离子在生命活动和环境治理等方面的重要价值，如何检测和识别阴离子的研究是科研工作者的热点之一。尤其是阴离子参与调控细胞的诸多功能与性质，在细胞内起着非常重要的作用，因此，实现活体细胞内各种阴离子生理活性小分子物种的实时在线动态检测对生命科学研究与发展具有重要的价值。然而，由于阴离子具有较高的溶剂化自由能以及较大的离子半径，到目前为止，真正能够应用到环境或活细胞内阴离子荧光成像的荧光探针不多。本专利申请首次报道了一种能检测中性水溶液中微量NO3 -离子的荧光探针并将其应用于活体细胞内NO3 -阴离子荧光成像。
发明内容
本发明的目的在于研究一种能高灵敏、高选择性检测pH 值中性水溶液中微量NO3 - 的荧光光谱分析新方法并将其应用于活性细胞内NO3 - 阴离子荧光成像。本发明的目的通过发明人研制合成的新的荧光试剂，采用增强荧光光谱强度法对NO3 - 离子进行荧光光谱分析。
一种NO3 -离子检测试剂，其特征是其化学结构式为a：
分子式：C44H54Br2N2；分子量：770.72
在水溶液中的荧光激发波长是470 nm，最大发射波长是640 nm，荧光强度很弱，与NO3 -离子结合后，最大发射波长是575 nm，荧光强度明显增强，可用于NO3 -离子的检测。
上述的一种NO3 -离子的检测试剂，是指所述探针a的制备方法为以9,10-双吡啶基乙烯蒽为原料，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，与溴代辛烷烃反应，合成路线如下：
核磁共振氢谱： 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ: 9.06(d, J=5 Hz,, 4H), 8.95(d, J=15 Hz, 2H), 8.51(d, J=5 Hz, 4H), 8.41(m, , 4H), 7.63(m, , 4H), 7.28(d, J=15 Hz, 2H), 4.55(t, J=20Hz, 4H), 1.93(t, J=20Hz, 4H), 1.93(m, 20H), 0.83(m, 6H)。
所述的一种NO3 -离子检测试剂的应用，是指用于检测中性水溶液中微量NO3 -离子的荧光光谱分析。
上述的一种NO3 -离子检测试剂的应用，是指用于水溶液中微量NO3 -离子的定性或定量分析，定量分析的线性浓度范围1.5×10-7～2.1×10-5 mol·L-1；定性分析检测限低至10-8 mol·L-1。
所述的一种NO3 -离子检测试剂的应用，是指其它阴离子F-，Cl-，Br-， HSO4 -，SO4 2-，AcO-， BF4 -，H2PO4 -在浓度与NO3 - 浓度相当时，不干扰NO3 - 的测定。
上述的一种NO3 -离子检测试剂的应用，是指用于对活体细胞内NO3 -离子染色后的荧光成像，对细胞影像拍照获得清晰的细胞轮廓影像。
上述的一种NO3 -离子检测试剂的应用，所指的细胞为活体的PC3细胞。
上述的一种NO3 -离子检测试剂的应用，所指的细胞为活体PC3人体前列腺癌细胞。
上述的一种NO3 -离子检测试剂的应用，是指用探针a对细胞内NO3 - 进行染色，用荧光倒置显微镜观测活体细胞，染色成像的具体方法为：活性PC3细胞经复苏接种于含10%胎牛血清以及含1%双抗的培养基（RPMI 1640）中，在温度为37℃，5% CO2及饱和湿度为100%的培养箱中培养，每隔2-3天传代1次，选择生长状态良好的细胞接种于12孔板中培养，密度为2×104个/ml，次日用新鲜培养基清洗细胞两次，将细胞浸入含5 μmol·L-1探针a （900 μL培养基 + 100 μmol·L-1探针a的CH3OH/H2O混合溶液100μL）中，在37℃，5% CO2、饱和湿度100% 的培养箱中孵育30 min，吸出含探针a的培养液，用新鲜培养基清洗细胞三次，荧光倒置显微镜下观察并进行亮场和暗场拍照；再浸入含20 μmol·L-1 NO3 - 溶液（900 μL 培养基 + 500 μmol·L-1 NO3 -溶液100μL），在37℃、5% CO2、饱和湿度100%的培养箱中孵育30 min，进行细胞内探针对NO3 -染色，吸出含NO3 - 溶液的培养液，染色后的细胞再用新鲜培养基清洗三次，在荧光倒置显微镜下观察探针对细胞内NO3 - 染色后的荧光成像，对细胞影像拍照获得清晰的细胞轮廓影像。
上述的一种NO3 -离子检测试剂的应用，是指细胞成像中，探针a和NO3 -都能渗透到活体PC3细胞内，细胞呈圆滑饱满状，探针与细胞具有良好的相容性，未见细胞凋亡，对细胞无毒性；探针与NO3 - 在细胞内染色后，荧光倒置显微镜检测显示了清晰的黄色荧光细胞分布，染色具有特定区域的选择性聚集能力。
上述的一种NO3 -离子检测试剂的应用，是指所用的试剂为分析纯或生化试剂，所用水为二次蒸馏水或生理盐水；所用活体PC3细胞为人体前列腺癌细胞；所用的拍照设备为荧光倒置显微镜。
上述的一种NO3 -离子检测试剂的应用，满足了（1）良好的水溶性；（2）在生理条件下具有良好的热稳定性；（3）良好的膜穿透性，并且对细胞是无毒的；（4）对NO3 -具有选择性、高灵敏的荧光增强作用，有较长的激发波长和较高的发光产率。利用探针a在活体细胞内与NO3 -的染色作用，用荧光倒置显微镜能清晰获得发射黄色荧光的细胞图像。发明了一种新颖的活体细胞内的荧光成像技术。
发明效果：本发明用于pH值中性水溶中微量NO3 -离子的定性和定量分析，定量分析的浓度线性范围宽为1.5×10-7～2.1×10-5 mol·L-1，检测限低至10-8 mol·L-1，同时，其它阴离子F-，Cl-，Br-， HSO4 -，SO4 2-，AcO-， BF4 -，H2PO4 -在浓度相当时不干扰测定。此外，荧光成像分析是目前广泛应用于活细胞分析的一种高灵敏的可视化分析技术。因此发现对NO3 -阴离子活体细胞内荧光成像的方法具有较强的科学研究意义和实际应用价值。本发明首次报道了在生理条件下，利用荧光成像技术观察活体细胞内NO3 - 阴离子聚集情况。在细胞成像中，探针a和NO3 - 都能渗透到活体PC3细胞内，细胞呈圆滑饱满状，探针与细胞具有良好的相容性，未见细胞凋亡，对细胞无毒性；探针与NO3 - 在细胞内染色后，荧光倒置显微镜检测显示了清晰的黄色荧光细胞分布，对细胞影像拍照获得清晰的细胞轮廓影像，染色具有特定区域的选择性聚集能力。
附图说明
图1荧光探针a的晶体结构。
图2 荧光探针a的核磁共振氢谱
图3荧光探针a (1.00×10-5 mol·L-1)的水溶液在不同阴离子(1.00×10-54mol·L-1) F-，Cl-，Br-， HSO4 -，SO4 2-，AcO-， BF4 -，H2PO4 -存在下的荧光光谱。NO3 - 的加入使a 在575 nm处的荧光强度增强。而其他上述实验阴离子的加入，，几乎不会改变a的荧光强度。测试的激发波长为470 nm。
图4 其它阴离子对探针a检测NO3 - 的荧光强度影响。在浓度为1.00×10-5 mol·L-1的a的水溶液中，加入2.00×10-4 mol·L-1的NO3 - 后测定a在波长为575 nm处的荧光强度值。再分别向a- NO3 -混合溶液中加入等量的其他阴离子：F-，Cl-，Br-， HSO4 -，SO4 2-，AcO-， BF4 -，H2PO4 -后的荧光强度值的变化。表明其它实验阴离子没有引起a- NO3 - 体系荧光强度的变化。测试的激发波长为470 nm。
图5 365nm紫外灯照射下浓度为1.00×10-5 mol·L-1 荧光分子a的水溶液中加入10倍不同阴离子后的颜色变化。
图6不同浓度的NO3 - 对探针a的荧光滴定光谱图。在浓度为1.00×10-5 mol·L-1试剂a的水溶液中分别加入不同浓度NO3 -到a溶液中，随着NO3 - 的加入，分别测得的荧光光谱。在575 nm处的发射峰逐渐升高。测试的激发波长为360nm。
图7探针a的荧光光谱法检测NO3 - 的校准曲线。纵坐标为发射波长为575 nm处的荧光强度值，横坐标为NO3 - 的浓度。激发波长为470 nm。NO3 - 响应的浓度线性范围为1.5×10-7～2.1×10-5 mol·L-1。
图8 探针a与NO3 - 对PC3细胞的荧光倒置显微镜拍摄照片。
8-1为PC3细胞内只有探针a（浓度为5 μmol·L-1）时的亮场显微照片，细胞呈饱满状态，证明该探针a在实验浓度内对PC3细胞没有毒性；8-2为PC3细胞内只有探针a（浓度为5 μmol·L- 1）时的暗场荧光显微照片；8-3为PC3细胞内同时有探针a（浓度为5 μmol·L- 1）和NO3 -（浓度为20 μmol·L- 1）存在时的亮场显微照片；8-4为PC3细胞内同时有探针a（浓度为5 μmol·L-1）和NO3 -（浓度为20 μmol·L- 1）存在时的暗场荧光显微照片，荧光倒置显微镜观测到清晰的黄色荧光的细胞分布，证明a与NO3 -离子在细胞内实现了染色，呈现细胞染色荧光成像。
具体实施方式
实施例一：
称量390 mg 9,10-双吡啶基乙烯蒽，放入25 mL圆底烧瓶中，加入8 mL无水N,N-二甲基甲酰胺，在加入400 mg 溴代辛烷，加热回流24h。冷却后过滤，固体分别用二氯甲烷，石油醚淋洗再用乙腈溶液溶解重结晶的红色固体粉末a（230 mg, 产率30%）。
实施例二：
（1）探针a溶液的配制：称取7.7 mg的a，用二次蒸馏水溶解，配制成10.0 mL溶液，浓度为1.00×10-3mol·L-1；根据需要用蒸馏水逐级稀释到1.00×10-5 mol·L-1的浓度；（2）NO3 - 标准溶液：称取30.4 mg 四丁基硝酸铵，用二次蒸馏水溶解，并配制成100mL溶液，NO3 - 的浓度为2.00×10-3 mol·L-1；根据需要用二次蒸馏水逐级稀释到适宜的浓度；其它共存金属离子溶液的配制相同。
实施例三：
在10.0 mL 容量瓶中加入探针a的水储备液(1.00×10-4 mol·L-1，1mL)，阴离子NO3 -（1.00×10-3 mol·L-1，1 mL）。用二次蒸馏水溶液稀释至刻度，摇匀，移入3cm的石英比色皿进行荧光光谱测定。探针a溶液荧光光谱测定的激发波长为470 nm。在水溶液中，探针a（1.00×10-5 mol·L-1）本身具有很弱的荧光发射，在紫外灯下基本观察不到荧光。加入NO3 -（1.00×10-4 mol·L-1）后使探针a溶液在575 nm处的荧光显著增强，其他实验阴离子F-，Cl-，Br-， HSO4 -，SO4 2-，AcO-， BF4 -，H2PO4 - 对探针a溶液均无明显的信号响应，表明探针a仅对NO3 -有选择性荧光增强检测响应性能（附图3和图4）。
在上述荧光法测试条件下，探针a检测NO3 - 的荧光强度在上述其它阴离子分别或共同作为共存离子存在于探针a- NO3 - 混合溶液中，对探针a检测NO3 -的荧光强度影响的相对偏差在 5%以内，不干扰测定（附图5）。
在水溶液中，以470/575 nm为荧光激发和发射波长，测定NO3 - 浓度改变时相应的探针a溶液的荧光强度变化（附图6），获得校准曲线（附图7）。分别由校正曲线的斜率和测定10次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针a检测特定离子的浓度线性范围和检出限列于表1。
所用试剂为分析纯试剂，试验用水为二次蒸馏水。所用荧光分光光度计型号为 Cary Eclipse荧光分光光度计，美国VARIAN公司制造。
实施例四：
活体PC3细胞的荧光显微成像
（1）探针a溶液的配制方法：称取77 mg的a，用CH3OH/H2O（v/v， 1/99）溶解，配制成100mL溶液，浓度为1.00×10-3 mol·L-1；
（2）NO3 - 标准溶液：称取20.0 mg分析纯KNO3，用生理盐水溶解，配制成100mL溶液，浓度为2.00×10-3 mol·L-1；根据需要用生理盐水逐级稀释到适宜的浓度；
（3）1万单位（IU）/mL双抗溶液：将青霉素钠（80万单位）溶于40mL D-hanks溶液中，配成终浓度2万单位/mL；将硫酸链霉素（160万单位）溶于80mL D-hanks溶液中，配成终浓度2万单位/mL。分别取等体积的青霉素钠溶液和硫酸链霉素溶液混合，得到青霉素钠和硫酸链霉素的终浓度均为1万单位/mL的溶液；针式滤器（0.22um进口微孔滤膜）过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用。
（4）0.25 %胰蛋白酶：称取0.25g胰蛋白酶，溶解于100mL的D-hanks液中，针式滤器（0.22um进口微孔滤膜）过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用。
（5）0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）：将0.02gEDTA，溶解于100mL的D-hanks液中，针式滤器（0.22um进口微孔滤膜）过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用。
（6）培养液：用无菌移液管量取10mL已灭活的胎牛血清、90mL培养基（改良型RPMI-1640）以及1mL双抗液混合于100mL的无菌培养瓶中，2~8℃保存备用。
（7）复苏细胞
从-80℃冰箱内取出PC3细胞，置于37℃的水中快速晃动细胞冻存管，于1-2分钟内完全解冻，在无菌操作台内，将其吸入离心管内，加约11ml培养液（含10%胎牛血清，1%双抗液）混均，并将此细胞悬液于1000 r/min离心机上离心5min，去除上层清液，将底部沉淀的细胞加培养液轻吹打散混均转移到培养瓶内，使培养瓶中培养液体积在5-7mL内，并置入37 ℃，含5% CO2的培养箱内进行培养。
（8）观察→传代→接板
每日更换一次培养液，并在显微镜下观察细胞生长情况，直至PC3细胞贴壁长满于整个培养瓶壁上，即可传代，在无菌操作台内倒掉旧培养液，加入1mL的EDTA液侵入细胞30s后倒掉，再加入1mL的胰蛋白酶液进行消化，在显微镜下观察直至细胞缩小变圆后，拍打培养瓶使细胞脱落并立即加入适量培养液阻止消化，将它一分为二培养于2个培养瓶中，待传代后的细胞贴壁铺满于整个培养瓶壁上时，与传代操作相同，加入EDTA和胰蛋白酶后使细胞消化脱落并立即加入3mL的培养液阻止消化，准备接种于12孔板内。在每个孔板内加入200mL的已阻止消化的细胞液，再加适量新培养液混均后将孔板置入37 ℃，含5% CO2的培养箱内进行培养。
（9）细胞染色
次日观察孔板内的细胞生长状况，待细胞贴壁生成，弃去旧培养液，用新培养液洗涤2次，备用。
A组：往细胞培养板的3个孔内加入5×10-6 mol·L-1的探针a液（5×10-6 mol·L-1的探针a：1800 mL的培养液+200 mL CH3OH/ H2O（v/v，1/99）混合溶剂配制的1×10-4 mol·L-1 的储备液）；在37 ℃，含5%CO2的培养箱内孵育30分钟，用新鲜的改良型RPMI-1640培养基洗两次，置于荧光倒置显微镜下进行明场和暗场成像拍照。（附图8-1、8-2）
B组：经过步骤A处理过的PC3细胞，一一对应分别浸入浓度为5×10-6 mol·L-1、1×10-5 mol·L-1、2×10-5 mol·L-1 的NO3 - 溶液中，在37 ℃，含5% CO2的培养箱内孵育30分钟后，吸出培养液，所得细胞用新鲜的改良型RPMI-1640培养基洗两次，置于荧光倒置显微镜下进行暗场荧光成像拍照，细胞呈现黄色荧光图像。说明在PC3细胞内探针a对NO3 - 染色成功。（附图8-3、8-4）
本发明所用荧光分光光度计型号为 Cary Eclipse荧光分光光度计，美国VARIAN公司生产；ThermoFisher 8000储水型CO2细胞培养箱；IX-71型荧光倒置相差显微镜，日本Olympus公司；AR1530/C电子天平；25cm2细胞培养瓶，美国Corning公司立式压力蒸汽灭菌器（LS-B75）；DHG-9230A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。
Claims (7)
1.一种NO3 -离子的检测试剂，其特征是其化学结构式为a：
分子式：C44H54Br2N2；分子量：770.72
在水溶液中的荧光激发波长是470 nm，最大发射波长是640 nm，荧光强度很弱，与NO3 -离子结合后，最大发射波长是575 nm，荧光强度明显增强，可用于NO3 -离子的检测。
2.按照权利要求1所述的一种NO3 -离子检测试剂的应用，其特征是用于检测水溶液中微量NO3 -离子的荧光光谱分析。
3.根据权利要求2所述的一种NO3 -离子检测试剂的应用，其特征是用于水溶液中微量NO3 -离子的定性或定量分析，定量分析的线性浓度范围1.5×10-7～2.1×10-5 mol·L-1；定性分析检测限低至10-8 mol·L-1。
4.根据权利要求2或3所述的一种NO3 -离子检测试剂的应用，其特征是其它阴离子F-，Cl-，Br-， HSO4 -，SO4 2-，AcO-， BF4 -，H2PO4 -在浓度与NO3 - 浓度相当时，不干扰NO3 - 的测定。
5.按照权利要求1所述的一种NO3 -离子检测试剂的应用，其特征是用于对活体细胞内NO3 -离子染色后的荧光成像，对细胞影像拍照获得清晰的细胞轮廓影像。
6.根据权利要求5所述的一种NO3 -离子检测试剂的应用，其特征是所指的细胞为活体的PC3细胞。
7.根据权利要求6所述的一种NO3 -离子检测试剂的应用，其特征是所指的细胞为活体PC3人体前列腺癌细胞。
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