ES2337155T3 - Proceso para la enumeracion e identificacion de microorganismos. - Google Patents
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Abstract
Un proceso para detectar contaminación por microorganismos en una muestra líquida seleccionada de agua, productos alimenticios y fármacos y la enumeración e identificación de cualquiera de tales microorganismos que comprende las etapas secuenciales de: a) filtrar la muestra líquida a través de una membrana adecuada para la retención de microorganismos para retener los microorganismos de dicha muestra en dicha membrana; b) incubar la membrana desde alrededor de 1 hora hasta alrededor de 8 horas para el enriquecimiento de los microorganismos; d) detectar la presencia/ausencia de uno o más microorganismos en la membrana, el número y tipo de los mismos detectados, caracterizados por, entre las etapas (b) y (d) la etapa de c) someter la membrana a una etapa de amplificación en el que la etapa de amplificación contiene uno o más agentes de detección, en el que la etapa de amplificación es seleccionada a partir del grupo que consiste en la reacción polimerasa en cadena (PCR), amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) y amplificación lineal ligada (LLA).
Description
Proceso para la enumeración identificación de
microorganismos.
El presente invento se refiere a un proceso para
enumerar e identificar microorganismos. Más
particular-mente, se refiere a un proceso para
amplificar componentes específicos de los microbios presentes y
después enumerarlos en un dispositivo de membrana en una etapa
única con un tiempo de incubación mínimo o nulo basado en la
detección del producto componente amplificado. Adicionalmente, los
microbios presentes pueden ser identificados mediante este
método.
El método tradicional para determinar la
presencia o ausencia de microorganismos en líquidos tales como agua,
productos alimenticios tales como zumos o fármacos ha sido el de
filtrar el fluido a través de una membrana adecuada para atrapar
cualquier microorganismo presente en el fluido de la superficie de
la membrana. La membrana es entonces colocada en una placa con
medio de crecimiento tal como una placa Petri rellena con agar u
otro medio adecuado y luego incubada durante varios días para
permitir a las colonias desarrollarse a partir de los organismos
capturados.
Las placas son entonces retiradas y examinadas
visualmente de modo que el número de colonias presentes puede ser
contada. Si el número es suficientemente elevado, ensayos
adicionales pueden ser llevados a cabo para determinar exactamente
qué organismos están presentes. (Con frecuencia la mera presencia de
organismos no es en sí misma una indicación de que el fluido es
insalubre y se requiere un trabajo adicional para identificar los
organismos específicos).
Este proceso puede extenderse típicamente de dos
a catorce días o más dependiendo de los organismos, su tiempo de
incubación prescrito y la tasa de crecimiento y los ensayos de
identificación adicionales que necesitan ser corridos así como de
cuando una muestra es tomada durante un día hábil y cuando estará
lista en el siguiente día hábil.
Recientemente, nuevos ensayos para la detección
y enumeración de contaminantes microbianos han ayudado a reducir el
tiempo requerido para lleva a cabo ensayos hasta alrededor de 24
horas y a veces menos. Por ejemplo, la bioluminiscencia de ATP es
una reacción bioquímica que produce energía luminosa como producto;
este método ha sido usado para detectar y enumerar microbios en 1/3
del tiempo de crecimiento necesario para la detección visual en el
medio. Otras tecnologías utilizan moléculas fluorescentes, u otras
tinciones para detectar rápidamente microorganismos de una variedad
de muestras en membranas. La tecnología de hibridación de sondas ha
sido también usada para detectar y enumerar microorganismos en
membranas en ventanas de tiempo más cortas que el crecimiento en
colonias; en estos casos, los microbios que han sido hechos crecer
en una membrana durante un corto período de tiempo son hibridados
con sondas de ácidos nucleicos y tratados con un reactivo de
detección para detectar cualquier microcolonia presente en la
superficie de las membranas.
El documento de patente norteamericana
2003-0003540-A1 mejora los ensayos
de ATP. Este captura microbios en una membrana e incuba los
organismos en medio durante varias horas hasta un día. Primero se
lleva a cabo un ensayo de enumeración (generalmente una detección
de ATP bioluminiscente) y luego las sondas PNA son usadas en un
segundo ensayo en la misma muestra para determinar la identificación
de los microbios encontrados.
Ninguno de estos ensayos sin embargo permite
tener un ensayo que detecte, enumere e identifique los
microorganismos a tiempo real (en un intervalo de pocas horas) con
la misma precisión y especificidad del ensayo visual multidía
clásico. El presente invento proporciona un ensayo único que detecta
y enumera el microorganismo en cuestión de unas pocas horas en una
membrana celular, y también permite la identificación en el mismo
procedimiento.
Los autores son conscientes de la publicación de
patente internacional WO 99/60005 (FSM Technologies Limited) que
describe métodos y un dispositivo de filtro para purificar los
ácidos nucleicos a partir de células completas en una muestra de
sangre completa. La filtración de fluidos entrecruzados es usada
para romper las membranas celulares y nucleares a través de la cual
la muestra es hecha pasar a través de la superficie de una membrana
porosa en un dispositivo de filtro, la ruta desde la entrada hasta
la salida del dispositivo está parcialmente bloqueada permitiendo
que el flujo de restos celulares por la membrana no pueda atascar
los poros.
La publicación de patente internacional WO
01/59157 (Millipore Corp) describe un ensayo para la detección,
enumeración e identificación de microorganismos en una muestra
fluida. El ensayo usa un filtro a través del cual una muestra
fluida es hecha pasar y sobre el que los organismos en el fluido son
depositados. Se incuba entonces sobre un medio de crecimiento y
tras lo cual es sometido a un ensayo de
presencia-ausencia para organismos usando un ensayo
de ATP/bioluminiscencia. La misma muestra y el filtro son entonces
sometidos a un ensayo de sonda PNA para organismos diana.
Opcionalmente, la localización de los organismos detectados por cada
ensayo pueden ser comparadas entre sí para determinar la
posibilidad de falsos positivos y su eliminación de los resultados
del ensayo.
La publicación de patente internacional WO
03/085109 (Genesystems) se refiere a un método para extraer ácidos
nucleicos de microorganismo contenidos en una mezcla compleja,
particularmente una mezcla alimenticia, que comprende al menos las
siguientes etapas: la mezcla es clarificada; los microorganismos son
retenidos en un cartucho filtrante; dichos microorganismos son
lisados; y los ácidos nucleicos son recuperados, concentrados, y
purificados: También descrito está un cartucho filtrante y un
aparato usado para llevar a cabo el método de extracción, y un
dispositivo para extraer, detectar, y si fuera necesario cuantificar
los ácidos nucleicos de los microorganismo contenidos en una mezcla
compleja.
Las características esenciales y opcionales del
presente invento son expuestas en las reivindicaciones principales
y subreivindicaciones acompañantes respectiva-mente.
Así el presente invento se refiere a un proceso para la detección,
enumeración e identificación de microorganismos en un fluido usando
filtración en membrana, amplificación dirigida y detección tales
como mediante detección fluorescente o detección colorimétrica. Un
atributo clave del presente proceso es que la etapa de amplificación
permite la detección rápida, enumeración e identificación de
organismos que están presentes. La amplificación se dirige a una
molécula seleccionada en el organismo tal como su ADN o ARN y
aumenta la presencia de la molécula a un nivel que es detectable por
cualquier número de tecnologías de detección disponibles para
confirmar que la molécula diana esté presente. El reactivo de
amplificación contiene uno o más agentes de detección para indicar
la presencia de (una) molécula(s) diana y permite
diferenciar entre las dianas seleccionadas a nivel de especie o
género o incluso filo, o reino.
La Figura 1 muestra un diagrama en bloques de
una realización preferida del presente invento.
El presente invento se refiere a un proceso para
la detección rápida, enumeración e identificación de microorganismos
en fluido o sólidos solubles tales como polvos, sales, cremas,
tabletas, etc. Tales fluidos incluyen pero no se limitan a agua,
potable o no, lácteos tales como leche, cerveza, vino, refrescos,
zumos de frutas, fármacos, parenterales, muestras de aire
bacteriano, etc.
La rápida tecnología actual permite detectar y
enumerar microorganismos en bastante menos tiempo que los métodos
clásicos de crecimiento para colonias visibles en agar o filtros de
membrana. Sin embargo, estos organismos detectados permanecen sin
identificar. Esta idea se dirige a la necesidad de una detección
inmediata y un sistema de enumeración, y permite la identificación
posible de los organismos detectados con sondas específicas frente
a los grupos de especies o géneros en las reacciones de
amplificación, o a niveles superiores con sondas específicas de
filos, o clases.
El producto visualizado es una reacción de
amplificación dirigida, asociada a membrana tal como, pero que no
incluye, el método basado en la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) acoplado a una membrana compuesta de los dominios
hidrofílicos unidos por rejillas hidrofóbicas tales como los usados
en el sistema MicroStar^{TM} disponible a través de Millipore
Corporation of Billerica, Massachusetts. Hay varios componentes: una
membrana hidrofílica cubierta con una rejilla hidrofóbica,
reactivos que llevan a cabo la amplificación diana que consiste en
ácidos nucleicos, o cebadores peptídicos de ácidos nucleicos,
enzimas, tampones y detergentes, una sonda de detección
fluorescente construida en el cóctel de amplificación, y una funda
de mylar o plástico en el que la reacción sería realizada). Los
dispositivos requeridos son un sistema de control de temperatura
para mantener la temperatura apropiada para las reacción de
amplificación diana; por ejemplo, un ciclador de temperaturas sería
necesario para la reacción de PCR. También un dispositivo de
detección para contar pocillos hidrofílicos en la membrana de
rejilla que exhibe una señal positiva es requerida. El dispositivo
de detección podría ser tan simple como una lámpara de ultravioleta
de mano, o un dispositivo complejo como un dispositivo
MicroStar.
El producto puede ser usado de la siguiente
manera. Una muestra que contiene microorganismos sería filtrada a
través de la membrana de rejillas y los organismos contaminantes
capturados al contrario que el método de filtración de flujo
entrecruzado que rompe las células descrito en el anteriormente
mencionado documento WO 99/60005. Tras el lavado, los reactivos de
amplificación serían rociados en la membrana de superficie, y la
membrana sería colocada en la funda de película Mylar® y sellada. La
funda sellada con la membrana y los reactivos serían entonces
colocados en los dispositivos para controlar el entorno de la
reacción de amplificación. Por ejemplo, para una reacción de PCR,
esto consistiría en el ciclador de temperaturas. Tras completar el
ciclo, la muestra se colocaría en el dispositivo de detección. El
dispositivo detectaría esos pocillos que contienen una señal
positiva producida por la sonda de detección fluorescente, o algún
reactivo similar. Una señal positiva sería consistente con la
presencia de un contaminante microbiano diana. Los ensayos podrían
ser específicos para los microorganismos a nivel de especies,
géneros o grupos incluyendo bacterias, levadura y moho, virus y
protozoos. Por ejemplo, el ensayo podría dirigirse al ácido nucleico
de la especie bacteriana Pseudomonas aeruginosa, todas las
pseudomonas verdaderas, o dirigiéndose ampliamente a todas las
bacterias gram-negativas, o todas las bacterias.
Esto permitiría obtener una medida de los diferentes tipos de
organismos en la muestra de ensayo, y determinar la identidad de
cualquier microbio en particular de interés para el usuario.
La figura 1 muestra un proceso preferido según
el presente invento. En este proceso, como primera etapa 10, una
muestra en forma fluida es obtenida a partir del producto a ser
diagnosticado. Por ejemplo, un muestreo del entorno, tal como un
suministro de agua o una muestra de agua del río, pozo o reservorio
es obtenida. Para un alimento o producto farmacéutico, una muestra
es tomada a partir del patrón (típicamente este es el patrón final
aunque no es necesario que sea así). Si está en la forma líquida es
simplemente usado como es o puede ser, si es necesario, debido a
que la viscosidad sea diluida con agua desionizada. Si es en la
forma sólida, se disuelve o dispensa en un líquido adecuado,
típicamente agua o un alcohol.
Se filtra entonces a través del filtro de
membrana en la segunda etapa 12. El filtro es entonces tratado en
la etapa 16 con un agente de amplificación que contiene uno o más de
los agentes detectores seleccionados. El filtro es entonces
colocado en un dispositivo de amplificación, tal como un
termociclador para amplificación por PCR, durante un tiempo
suficiente para amplificar la muestra a un nivel que puede ser
detectado o enumerado en la etapa 18 bien a través de un
dispositivo mecánico o eléctrico o visual.
Una etapa de incubación 14 es incluida antes de
la etapa de amplificación 16 a modo de permitir que una microcolonia
se desarrolle desde los microbios retenidos individualmente
aumentando así el número de organismos disponibles para la
amplificación. Tras la etapa de amplificación, los organismos son
enumerados y/o identificados en la etapa 18.
Un dispositivo preferido de soporte para el
filtro es un embudo de filtro MILLIFLEX^{TM} que tiene 50 mm de
diámetro y una capacidad de 100 ml, disponible a partir de Millipore
Corporation of Billerica, Massachusetts. Otros dispositivos tales
como Steritest^{TM} o unidades de filtración de Sterifil®
disponibles de Millipore Corporation of Billerica, Massachusetts
que tienen rejillas hidrofóbicas formadas sobre y a través de una
membrana hidrofílica añadida puede también ser usada, o soportes de
membrana tales como como soportes de vidrio o filtros de acero
inoxidable o embudos. Tales dispositivos son bien conocidos y están
disponibles a partir de una variedad de fuentes incluyendo
Millipore Corporation of Billerica, Massachusetts y Fischer
Scientific, Inc, de Pittsburgh, Pensilvania.
Una membrana preferida es un filtro
MicroStar^{TM}, disponible de Millipore Corporation of Billerica,
Massachusetts. Este filtro es un filtro de PVDF de tamaño de poro
nominal de 0,45 que tiene una serie de compartimentos hidrofílicos
separados mediante particiones hidrofóbicas que se extienden a
través de la profundidad entera del filtro. Otros filtros que
pueden ser útiles en este invento serían también hidrofílicos y
contiene algún tipo de partición hidrofóbica.
Como se trata en relación a la realización de la
Figura 1 anterior, la muestra filtrada es sujeta a una etapa de
incubación 14. Preferiblemente, se consigue colocando el filtro en
contacto con un medio de crecimiento tal como diversos agares o
medios líquidos. La incubación es un período corto de tiempo,
típicamente desde alrededor de 1 a alrededor de 8 horas,
preferiblemente desde alrededor de 1 a alrededor de 4 horas. La
incubación permite que los microbios individuales capturados en la
membrana se dividan en mayor número de organismo para la
amplificación haciendo la detección más rápida y más fácil,
especialmente cuando la diana en los organismos es difícil de
amplificar.
El filtro es sometido a la etapa de
amplificación durante un período de tiempo corto, típicamente desde
1 a 5 horas. La longitud de tiempo depende de la precisión
necesaria para el ensayo, la velocidad de amplificación para la
tecnología de amplificación seleccionada, el(los)
agente(s) de detección seleccionado(s), la velocidad
deseada del ensayo vs. la precisión de los resultados del ensayo y
otros factores tales.
Métodos adecuado para la amplificación incluyen
sistemas basados en ácidos nucleicos tales como amplificación por
reacción polimerasa en cadena (PCR) en el que una secuencia de ADN o
ARN en la célula contaminante es amplificada mediante un agente de
amplificación. La PCR es típicamente llevada a cabo colocando el
sustrato (en este caso un filtro) que contiene el organismo a ser
amplificado, y habiendo sido tratado con el agente de amplificación
durante el ciclo a temperaturas elevadas durante un período de
tiempo desde alrededor de 30 minutos a 90 minutos en un
termociclador. Los kits disponibles comercialmente para llevar a
cabo la etapa de amplificación por PCR están disponibles a partir
de Applied Biosystems, Inc. o Roche Diagnostics. Los termocicladores
están disponibles a partir de estas mismas compañías.
Otras posibles tecnologías de amplificación
incluyen pero no se limitan a amplificación basada en las secuencias
de ácidos nucleicos (NASBA) disponibles de Biomerieux,
amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) disponibles de
Becton Dickinson, o amplificación lineal ligada (LLA) disponibles de
Biorad. Véase también el documento de patente europea EP
1407050A2.
Debería entenderse que los ensayos corridos aquí
con etapas de amplificación son bien en células únicas o en
microcolonias de microorganismos que se desarrollan a partir de
células únicas capturadas sobre la membrana, especialmente si se
usa una etapa de incubación, es decir, una es enumerando los números
de organismos individuales en una muestra de ensayo mediante la
detección de moléculas diana que han sido amplificadas a partir de
esos mismos organismos únicos más que detectar los organismos
individuales directamente.
Tras un período de tiempo adecuado para el
filtro en la etapa de amplificación, el filtro es retirado y
sometido a una etapa de enumeración 18.
Un ensayo de enumeración preferido es mediante
la detección de fluorescencia de la diana amplificada. La molécula
diana es entonces detectada a través del agente detector incorporado
en el reactivo de amplificación tal como una marca fluorescente,
una marca radioactiva, una marca colorimétrica y similares. El
agente es entonces leído visualmente o digitalmente a través de un
dispositivo de imagen tal como una cámara CCD con procesador de
imagen. Un sistema tal es vendido como systema MicroStar^{TM},
disponible de Millipore Corporation of Billerica, Massachusetts.
Por cualquier medio que se use, el recuento y localización de las
colonias microbianas detectadas pueden ser hechas.
Durante el ensayo de enumeración, la muestra
puede ser también sometida a un ensayo de identificación para los
organismos diana. Estos pueden ser diseñados de modo que hibriden
específicamente con una especie única o un género entero. Los
agentes detectores contienen una marca tal como una enzima, hapteno,
fluoróforo o radioisótopo para indicar la presencia en la muestra.
Tales agentes están disponibles a partir de una variedad de fuentes
incluyendo Sigma Genosys, y pueden consistir en moléculas
reflectoras, sondas fluorescentes doblemente marcadas, o sondas
marcadas fluorescentes para describir sondas fluorescentes, sin
embargo sistemas de detección quimioluminiscentes, colorimétricos,
o radiológicos pueden ser también usados.
Se puede seleccionar uno o más de tales agentes
para detectar uno o más tipos de organismos. Existen algunos para
organismos individuales tales como E. Coli o Salmonella
sp., L. brevis, etc, mientras que otros son más
universales y simplemente detectan la presencia del género de
bacteria o si el organismo que ha de ser capturado es simplemente
una bacteria, una levadura o un hongo. Dependiendo del agente
seleccionado, se puede usar una película de rayos X, un dispositivo
de detección de fluorescencia o colorimetría u otro dispositivo tal
para detectar la presencia de la marca de los agentes que han sido
amplificados con la molécula diana tal como el ADN o ARN del
organismo y por lo tanto identificar el número y tipo de cada
organismo diana presente.
Claims (10)
1. Un proceso para detectar contaminación por
microorganismos en una muestra líquida seleccionada de agua,
productos alimenticios y fármacos y la enumeración e identificación
de cualquiera de tales microorganismos que comprende las etapas
secuenciales de:
a) filtrar la muestra líquida a través de una
membrana adecuada para la retención de microorganismos para retener
los microorganismos de dicha muestra en dicha membrana;
b) incubar la membrana desde alrededor de 1 hora
hasta alrededor de 8 horas para el enriquecimiento de los
microorganismos;
d) detectar la presencia/ausencia de uno o más
microorganismos en la membrana, el número y tipo de los mismos
detectados, caracterizados por, entre las etapas (b) y (d) la
etapa de
c) someter la membrana a una etapa de
amplificación en el que la etapa de amplificación contiene uno o más
agentes de detección, en el que la etapa de amplificación es
seleccionada a partir del grupo que consiste en la reacción
polimerasa en cadena (PCR), amplificación basada en la secuencia de
ácidos nucleicos (NASBA), amplificación por desplazamiento de hebra
(SDA) y amplificación lineal ligada (LLA).
2. El proceso de la reivindicación 1, en el que
la muestra líquida es desde 50 a 1000 mililitros.
3. El proceso de la reivindicación 1 ó 2, en el
que la membrana es seleccionada a partir del grupo que consiste en
membrana de PVDF que tiene áreas hidrofílicas separadas por
particiones hidrofóbicas.
4. El proceso de cualquier reivindicación
precedente, en el que la etapa de amplificación tiene lugar desde
un período de tiempo desde alrededor de 30 a alrededor de 90
minutos.
5. El proceso de cualquier reivindicación
precedente, en el que la amplificación es un sistema de
amplificación basado en ácidos nucleicos.
6. El proceso de la reivindicación 5, en el
que
a) el agente de detección es seleccionado del
grupo que consiste en una sonda de ácidos nucleicos marcada
fluorescentemente o una sonda de ácidos nucleicos peptídica y
mezclas de las mismas y es leída mediante un sistema de imagen
digital, o
b) la amplificación es un sistema de
amplificación basada en ácidos nucleicos en forma de reacción
polimerasa en cadena (PCR) y el agente de detección es seleccionado
del grupo que consiste en un ácido nucleico marcado
fluorescentemente, sonda de ácidos nucleicos peptídica y mezclas de
las mismas y es leída mediante un sistema de imagen digital, o
c) el reactivo es seleccionado a partir del
grupo que consiste en una diana de ADN y una diana de ARN y el
agente de detección es seleccionado a partir del grupo que consiste
en un ácido nucleico marcado fluorescentemente, una sonda de ácidos
nucleicos peptídica y mezclas de las mismas y es leída mediante un
sistema de imagen digital, o
d) la amplificación es un sistema de
amplificación basada en ácidos nucleicos en forma de reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), siendo el reactivo seleccionado del
grupo que consiste en una diana de ADN y una diana de ARN y el
agente de detección es seleccionado a partir del grupo que consiste
en un ácido nucleico marcado fluorescente-mente,
una sonda de ácidos nucleicos peptídica y mezclas de las mismas y es
leída mediante un sistema de imagen digital.
7. El proceso de cualquier reivindicación
precedente, en el que el agente de detección es leído mediante un
proceso seleccionado a partir del grupo que consiste en películas de
rayos X, detección visual de una reacción colorimétrica en la
membrana, detección visual de una marca fluorescente o mediante
imagen digital.
8. El proceso de la reivindicación 1, en el que
la membrana es sometida a dicha etapa de amplificación durante un
tiempo desde alrededor de 30 minutos hasta alrededor de 90 minutos
en un dispositivo controlado por la temperatura, tal como un
termociclador.
9. El proceso de la reivindicación 1, en el que
la membrana es incubada desde 1 a alrededor de 4 horas.
10. El proceso de la reivindicación 1, en el que
el agente de detección es seleccionado de entre una marca
fluorescente, una marca radioactiva, una marca colorimétrica y una
marca enzimática.
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