CN103320353B

CN103320353B - 一株指示菌株及其应用

Info

Publication number: CN103320353B
Application number: CN201310190818.XA
Authority: CN
Inventors: 陈济琛; 张慧; 刘雪杰; 蔡琪; 林新坚
Original assignee: Institute of Soil and Fertilizer Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Soil and Fertilizer Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-05-22
Filing date: 2013-05-22
Publication date: 2015-04-01
Anticipated expiration: 2033-05-22
Also published as: CN103320353A

Abstract

一株指示菌株，所述指示菌株的分类命名为： Anoxybacillus sp.FHB009，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO:M2013128。为了延长试剂盒的使用时间，采用菌株的芽孢。包埋芽孢的培养基为改良的牛肉膏蛋白胨培养基，pH值为5-10。本发明可以灵敏的检测出常用的磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、土霉素、四环素、金霉素、庆大霉素、强力霉素、青霉素、氨苄西林、氨苄青霉素等多种抗生素，且敏感限符合国标（GB/T4789.27-2008）中抗生素最高残留量标准。

Description

一株指示菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株指示菌株及其应用。

背景技术

目前，公知的微生物抑制法检测牛奶中抗生素残留的试剂盒指示菌用的是嗜热脂肪芽孢杆菌。一般为96孔板，每个微孔板中包含营养琼脂培养基、对抗生素敏感的菌株、pH指示剂。当微孔板在65℃温浴时，孢子受热萌发生长繁殖产酸，使培养基的pH值降低，培养基的颜色由紫色变为草绿色或黄色。如果牛奶中含有高于检测线的抗生素，微生物孢子萌发受到抑制不产酸，培养基保持原来的颜色。用肉眼观察颜色变化即可判断抗生素残留情况。

目前市场上商业化的微生物抑制法试剂盒多为有知识产权的国外产品，价格比较昂贵。昂贵的检测费用提高了牛奶企业的检测成本，给企业带来了巨大的成本压力。我国微生物资源丰富，为分离新型菌株作为检测指示菌株提供了可能性。本发明专利从高温环境中分离得到属于厌氧芽孢杆菌属的一株菌株，并成功利用此菌株研发检测牛奶中抗生素残留的试剂盒。

发明内容

本发明提供一株指示菌株及其应用，一种检测牛奶中抗生素残留的试剂盒，该试剂盒不仅采用自主分离的新型菌株，而且检测灵敏度能达到国际水平。

为实现上述目的，本发明方法提供的技术方案如下：

本发明首先提供了一株指示菌株，所述指示菌株的分类命名为：Anoxybacillus sp. FHB009，已于2013年4月9日保藏位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO: M 2013128。

本发明其次还提供了上述指示菌株的应用，即将所述指示菌株作为检测牛奶中抗生素残留试剂盒中的指示菌。

采用所述指示菌制备检测牛奶中抗生素残留试剂盒的步骤为：：

第一步：蘸取一环斜面保藏的指示菌种（即Anoxybacillus sp. FHB009），将其接种到液体牛肉膏蛋白胨培养基中以活化菌种，于50-60℃，100-200rpm/min条件下培养12-24h，制成种子液；

按质量百分比计，所述牛肉膏蛋白胨培养基配方为：牛肉膏0.1-1%、蛋白胨0.5-5%、氯化钠0.1-1%，调pH 为5-10；搅拌均匀后在高压灭菌锅内灭菌冷却至50-60℃室温备用；

第二步：将上述种子液按体积比为1:200均匀涂布于产芽孢固体培养基中，于50-60℃的培养箱内培养，培养3天后染色镜检，当芽孢生成率达到90%以上时停止培养并收集芽孢；

按质量百分比计，所述产芽孢固体培养基的配方为：牛肉膏0.1%-1%、大豆蛋白胨0.1%-1%、NaCL0.2%-0.6% 、MnSO₄0.001%-0.01%、pH5-8、琼脂1-2%，搅拌均匀后在高压灭菌锅内灭菌冷却至50-60℃倒平板备用；

第三步：收集芽孢：在超净工作台上，用无菌生理盐水洗下菌苔，8层灭菌纱布过滤，滤液收集于无菌离心管中；收集含有芽孢的液体，经8000 rpm/min离心15min，弃上清液；用无菌生理盐水悬浮离心后的沉淀物，8000 rpm/min离心15min，弃上清液；再用无菌生理盐水悬浮离心沉淀物，于90℃水浴20min杀死菌体；经以上处理后的芽孢悬浮液置4℃冰箱低温保存备用；

第四步：将步骤三中收集得到的芽孢配制成芽孢量为1.0x10⁶-1.0x10⁸cfu/mL的芽孢悬液；将营养琼脂液与上述芽孢液按体积比为1-3:1混合，控制温度为50-60℃以下，得混合液C；再加入0.5-1%混合液C体积的溴甲酚紫指示剂，得混合液D；

将上述混合液D分装于96孔酶标板的微孔中，每微孔150微升；盖上铝塑膜并进行热合封口处理，温度为150-190℃，冷却至室温并装入铝塑袋中，4℃冰箱防潮避光保存；

按质量百分比计，所述溴甲酚紫浓度为1.5%；

按质量百分比计，所述营养琼脂液的配方为葡萄糖0.1-1%、蛋白胨0.5-5%、氯化钠0.1-1%、pH 5-10、琼脂1-2%，搅拌均匀后在高压灭菌锅内灭菌冷却至50-60℃室温备用。

所述试剂盒的使用方法为：

于经热合封口处理的试剂盒微孔中加入待检牛奶样品50-100微升，用塑料膜或透明胶带密封，于60-65℃水浴或恒温箱中保温2h-3h后，观察微孔颜色变化；微孔琼脂不变色，即紫色时表示为阳性结果，微孔琼脂变为黄色或草绿色表示为阴性结果。

本发明中以颜色变化为判定结果的依据为：微孔板在65℃水浴时，孢子受热萌发生长繁殖产酸，使培养基的pH值降低，溴甲酚紫（变色范围为5.2-6.8）指示颜色变化，培养基的颜色由紫色变为草绿色或黄色。如果牛奶中含有高于检测限的抗生素，孢子萌发受到抑制，不产酸，培养基保持原来的颜色。通过颜色变化即可判断检测结果。

本发明的有益效果是，在采用新型菌株的同时，可灵敏地检测出常用的磺胺、土霉素、四环素、庆大霉素、强力霉素、青霉素、氨苄西林、氨苄青霉素等多种抗生素；对β-内酰胺类抗生素尤其敏感（对β-内酰胺类抗生素中的青霉素、氨苄青霉素检测线达到4微克/升、对阿莫西林检测线为5微克/升），且敏感限符合国标（GB/T 4789.27-2008）中抗生素最高残留量标准。

应用本发明方法的指示菌作为检测牛奶中抗生素残留试剂盒中的指示菌具有低成本、高通量、检测时间短等优点，能快速的检测出牛奶样品中是否含有抗生素。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面例举具体实施例。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。本实施例中的材料如无特别说明，均为市售。

实施例一、

应用本发明的试剂盒检测并判定为某种抗生素的标准为：购买经检测不含抗生素残留的奶粉，复原为浓度13%的牛奶。配置含不同浓度抗生素的牛奶，比如含2微克/升的青霉素牛奶，试剂盒检测含2微克/升青霉素的牛奶时，表现为阳性，即说明试剂盒可以灵敏的检测出青霉素。

又如用试剂盒检测配制的含一定浓度抗生素的的牛奶（含4微克/升青霉素牛奶、含微克/升氨苄西林的牛奶、含100微克/升磺胺的牛奶）。取100微升的以上配制的牛奶样品，分别加入试剂盒微孔中，取不含抗生素残留的牛奶样品做对照。用塑料膜或透明胶带密封微孔后于60-65℃水浴中保温2.5h后观察微孔颜色变化。如果待检牛奶中含有上述浓度或高于上述浓度抗生素的牛奶时，微孔颜色为紫色，即说明试验结果呈阳性。

按上述方法配制不同浓度的各抗生素牛奶样品（如下表1）并利用本发明的试剂盒检测，结果如下（表1，表2）。

表1 本发明试剂盒对不同浓度的各抗生素的检出结果

注：“＋”表示可检测出的抗生素浓度、“－”表示不可检测出的抗生素浓度

表2 本发明试剂盒对不同抗生素的检出线

实施例二、

第一步：蘸取一环斜面保藏的指示菌种（Anoxybacillus sp. FHB009），将其接种到液体牛肉膏蛋白胨培养基中以活化菌种，于50℃，100rpm/min条件下培养12h，制成种子液；

按质量百分比计，所述牛肉膏蛋白胨培养基配方为：牛肉膏0.1%、蛋白胨0.5%、氯化钠0.1%，调pH 为5；搅拌均匀后在高压灭菌锅内灭菌冷却至50-60℃室温备用；

第二步：将上述种子液按体积比为1:200均匀涂布于产芽孢固体培养基中，于50℃的培养箱内培养，培养3天后染色镜检，当芽孢生成率达到90%以上时停止培养并收集芽孢；

按质量百分比计，所述产芽孢固体培养基的配方为：牛肉膏0.1%-、大豆蛋白胨0.1%、NaCL0.2% 、MnSO₄0.001%、pH5、琼脂1%，搅拌均匀后在高压灭菌锅内灭菌冷却至50-60℃倒平板备用；

第四步：将步骤三中收集得到的芽孢配制成芽孢量为1.0x10⁶cfu/mL的芽孢悬液；将营养琼脂液与上述芽孢液按体积比为1:1混合，控制温度为50-60℃，得混合液C；再加入0.5%混合液C体积的溴甲酚紫指示剂，得混合液D；

将上述混合液D分装于96孔酶标板的微孔中，每微孔150微升；盖上铝塑膜并进行热合封口处理，温度为150℃，冷却至室温并装入铝塑袋中，4℃冰箱防潮避光保存；

按质量百分比计，所述溴甲酚紫浓度为1.5%；

按质量百分比计，所述营养琼脂液的配方为葡萄糖0.1%、蛋白胨0.5%、氯化钠0.1%、pH 5、琼脂1%，搅拌均匀后在高压灭菌锅内灭菌冷却至50-60℃室温备用。

所述试剂盒的使用方法为：

取超市购买的10种不同品牌的待检牛奶，于经热合封口处理的试剂盒微孔中各加入待检牛奶样品100微升，用塑料膜密封，于60℃水浴2h后，观察微孔颜色变化；（阴性对照为已知的不含抗生素的牛奶；阳性对照为加入含4微克/升青霉素的牛奶）微孔琼脂不变色，即紫色时表示为阳性结果，微孔琼脂变为黄色或草绿色表示为阴性结果。

实施例三：

第一步：蘸取一环斜面保藏的指示菌种（Anoxybacillus sp. FHB009），将其接种到液体牛肉膏蛋白胨培养基中以活化菌种，于60℃，100rpm下培养12h，制成种子液；所述牛肉膏蛋白胨培养基配方为：牛肉膏1%、蛋白胨5%、氯化钠0.1%、pH 7；搅拌均匀后在高压灭菌锅内灭菌冷却至60℃室温备用。

第二步：以将种子液接种于产芽孢固体培养基中，于50℃的高温培养箱内培养，培养3天后染色镜检，当芽孢达到90%以上时停止培养收集芽孢，芽孢悬液。所述产芽孢培养基配方为：牛肉膏1%、大豆蛋白胨1%、NaCL0.2% 、MnSO₄0.01%、pH8、琼脂2%。搅拌均匀后在高压灭菌锅内灭菌冷却至60℃倒平板备用。

第三步：将上述芽孢悬液于6000rpm条件下，离心20min，舍弃上清。用无菌生理盐水悬浮离心所得菌泥，再次以同样条件离心2次，收集菌泥置于4-10℃保存备用。

第四步：在上述菌泥中加入无菌生理盐水，使芽孢量为1.00x10⁶-1x10⁸cfu。按营养琼脂液与稀释到上述芽孢量的芽孢液按3:1混合，再加入0.5%芽孢营养琼脂混合液体积的溴甲酚紫指示剂（溴甲酚紫浓度为1.5%）。将上述芽孢液、营养琼脂液、溴甲酚紫的混合液分装于96孔酶标板的微孔中，每微孔2-4滴。盖上铝塑膜并进行热合封口，冷却至室温并装入铝塑袋中，4℃冰箱防潮避光保存。上述营养琼脂配方为：葡萄糖1%、蛋白胨5%、氯化钠0.1%、pH7、琼脂2%。搅拌均匀后在高压灭菌锅内灭菌，冷却至50-60℃室温备用。第五步在所述第四步中的试剂盒每微孔中加入待检牛奶样品100微升，用塑料膜或透明胶带密封，与60-65℃水浴或恒温箱中保温2.5h后观察微孔颜色变化。阴性对照为加入不含抗生素牛奶的微孔营养琼脂，变为黄色或草绿色表示为阴性结果；阳性对照为加入含4微克/升青霉素牛奶的微孔营养琼脂，微孔营养琼脂不变色，即为紫色表示为阳性结果。

Claims

1.一株指示菌株，其特征在于：所述指示菌株的分类命名为：Anoxybacillus sp. FHB009，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2013128。

2.如权利要求1所述的一株指示菌株的应用，其特征在于：所述指示菌株是作为检测牛奶中抗生素残留试剂盒中的指示菌。