CN101724586B - 嗜热脂肪芽孢杆菌及抗生素残留检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种嗜热脂肪芽孢杆菌及利用该菌株进行抗生素残留检测的方法。所筛选出的菌株保藏编号为CGMCC NO.3287；以该菌株为指示菌所建立的抗生素残留检测方法包括：菌株复壮、活化；芽孢悬浮液富集制备；紫色培养液配制；芽孢杆菌包埋；样品检测等步骤。菌株CGMCC NO.3287稳定、易保存和制备，对B-内酰胺类抗生素高度敏感, 在培养基中的均一性、分散性好, 可在65℃快速生长，代谢产酸快。本发明方法与TIC法、发酵试验方法相比，操作方便，灵敏度高，耗时为2～3h，短于国内同类方法的4h，结果易判断；与商品试剂盒相比，成本低，相当于试剂盒价格的1/7；该方法简单可行，可在一般实验室进行操作。

Description

嗜热脂肪芽孢杆菌及抗生素残留检测方法

技术领域

本发明涉及抗生素的微生物检测领域，尤其涉及一种嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)及以该菌株为指示菌进行抗生素残留检测的方法。

背景技术

抗生素是一类由微生物和其他的生物在生命活动过程中合成的代谢产物或其衍生物，其在很低的浓度时就能够抑制或干扰病原菌、病毒等的生命活动，如青霉素、四环素、金霉素、链霉素、氯霉素、磺胺类药物等。在医学上，抗生素被广泛的应用于预防和治疗多种微生物感染性疾病以及某些癌症。在奶业的源头中，抗生素使用频率很高，特别是治疗牛乳房炎，常常大剂量反复使用。据统计，约有十多种抗生素以一种或多种联合的形式采用粉剂、涂擦剂、注射剂，以及乳导管注入等方式加以应用，导致抗生素残留相当严重，在奶牛饲料中，也含有抗生素添加剂。许多抗生素如青霉素、四环素、磺胺类药物及某些氨基糖苷类抗生素等均具有抗原性，能使部分易感人群发生过敏反应。轻者表现为荨麻疹、发热、关节肿痛及蜂窝组织炎等，严重时可出现喉头水肿、呼吸困难、过敏性休克，甚至危及生命；有些抗生素具有一定毒性，长期用药对服用者的肝肾功能具有一定损伤，甚至有致癌、致畸、致突变作用；并且可引起长期摄入者体内耐药菌增加，当有重大疾病需治疗时抗菌药物失效。牛奶中抗生素残留是当前原料奶中不容忽视的问题，控制残留的发生不仅需要对奶源进行有效管理，而且要建立先进的抗生素残留检测方法，从而加强奶源质量管理。

检测牛奶及其制品中抗生素残留有多种方法，如微生物检测法；理化检测法； 免疫法等。微生物法是抗生素残留检测最早采用的方法，目前已有多种商品试剂盒，如Delvotest、CharmScien等，以及我国国标TIC法。国标TIC法费用低但存在的问题也很多，如灵敏度较低，操作繁琐，试验菌的制备和使用还没有统一的规定，不同菌株耐药性不同、灵敏度也不同等等。微生物抗生素残留检测方法所采用的菌种有嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜热乳酸链球菌、枯草芽孢杆菌以及藤黄八叠球菌等。国际乳品联合会推荐的微生物检测抗生素残留菌种为嗜热脂肪芽孢杆菌，它对抑制物质的敏感性较高，生长较为快速，所以许多抗生素检测试剂盒采用的是嗜热脂肪芽孢杆菌。国外有关嗜热脂肪芽孢杆菌的试剂盒较多，而国内的商品化试剂盒较少，且大量使用商品化试剂盒检测费用较高，开发一种操作方便、费用低、可靠、可用于大量检测样品中抗生素的检测方法势在必行。而其首要一环是筛选一个对多种抗生素普遍敏感且敏感性稳定、检出限低、生长迅速的指示菌，并抓住其有独特的生物特性指示其萌发、生长代谢。

发明内容

本发明要解决的技术问题是筛选出不易受杂菌污染影响的、对β-内酰胺类抗生素敏感的嗜热脂肪芽孢杆菌株，并据此建立一种简单、快速、灵敏度高、能够普遍推广应用的抗生素残留微生物检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)2009，其保藏编号为CGMCC NO.3287。

一种抗生素残留检测方法，包括以下步骤：

(1)菌株活化

将权利要求1所述的嗜热脂肪芽孢杆菌CGMCC NO.3287菌株接种于斜面培养基上，调节培养基的pH值为6.8～7.2，并在50～65℃的条件下进行优化培养，并进行转种继代培养；

(2)芽孢富集悬浮

加热离心法：将斜面菌种在50～65℃下培养3～5天，用生理盐水洗下菌苔，转移至无菌容器中，充分振荡后，过滤，制成悬浮液，于70～80℃下加热悬浮液10～15min，静置过夜后，以2000r/min离心10～20min，取上清液，4000r/min离心10～20min，弃去上清液，如此反复离心洗涤4～5次后，用生理盐水将离心沉淀悬浮成芽孢悬浮液，调整其OD₆₀₀值至0.25～0.35，于0～4℃下贮存、备用；

(3)紫色培养液配制

以重量百分比计，取葡萄糖、蛋白胨及水为配制成葡萄糖为1％、蛋白胨为1％、pH值为7.0～7.3的培养液，滤膜过滤灭菌后于每100mL营养液中加1.6％的溴甲酚紫溶液0.05～0.07mL；

(4)芽孢杆菌的胶体包埋

取琼脂加热溶解于紫色培养液中制成琼脂重量百分含量为1～2％的紫色培养基，取0.1～0.4mL芽孢悬浮液与50～100mL温度为50～65℃的紫色培养基快速混匀，并迅速分装于检测小管中，于0～4℃下直立静置，密封后0～4℃下保存、备用；琼脂包埋法的优势在于生物相容性好，有利于芽孢的萌发及快速生长；

(5)样品检测

检测牛奶样品于80～85℃水浴加热10min，冷却至50～60℃，取该检测牛奶样品0.05～0.1mL加到所述检测小管中，密闭封口后于50～65℃水浴培养150min，培养液由蓝紫色变为黄色为阴性样品，培养液仍为蓝紫色则呈阳性样品。

在上述抗生素残留检测方法中，可用下述溶菌酶法替代步骤(2)中所述加热离心法：

将活化斜面菌种接种到磷酸盐缓冲液中，70～77℃加热10min，置于营养琼 脂培养18～20h，用生理盐水洗下菌苔，将菌液移种于芽孢培养基中，于55～65℃下培养4天，用10mL生理盐水洗下菌苔，并进行充分混合，以4000r/min离心15min，弃去上清液，加入含有溶菌酶的磷酸盐缓冲液，37℃温育1h，温育后离心沉淀，弃上清液，如此反复离心洗涤5～6次，用生理盐水将离心沉淀悬浮成芽孢悬浮液，将嗜热脂肪芽孢杆菌悬浮液OD₆₀₀值调整到0.25～0.35，在0～4℃条件下贮存、备用。

在上述抗生素残留检测方法中，可用下述芽孢杆菌的包埋方法替代所述步骤(4)：

取1～4mL芽孢悬浮液与15～20mL 1.5％海藻酸钠混匀，将其加入100～200mL 5％的CaCl₂溶液中，于4℃静置6h，抽滤出凝胶颗粒，用生理盐水洗净，每个检测小管内放入2～3个海藻酸钙凝胶珠，密封于0～4℃下保存，备用；海藻酸钙包埋法的优势在于制出的海藻酸钙凝胶珠疏松多孔，亲水性强，机械强度高，包埋量大和稳定性好等特点，在生产上则具有成本低，制备工艺简单和设备投资少等优点。

且以下述方法替代所述步骤(5)：

原料奶样品于80～85℃水浴加热10min，冷却至50～60℃备用，检测时，分别向装有海藻酸钙凝胶珠的检测小管中加入0.2～0.3mL紫色培养液，再加入检测牛奶样品0.05～0.1mL，密闭封口，于50～65℃水浴培养150min，培养液由蓝紫色变为黄色为阴性样品，培养液仍为蓝紫色则呈阳性样品。

本发明具有积极有益的效果：

1.筛选出的嗜热脂肪芽孢杆菌CGMCC NO.3287具有以下特点：(1)对β-内酰胺类抗生素高度敏感；(2)菌株稳定，易保存和制备；(3)在培养基中的均一性、分散性好，而且在包被材料中检测萌发时扩散性比较强；(4)能够在65℃左右快 速生长，代谢产酸快。

2.建立了嗜热脂肪芽孢杆菌CGMCC NO.3287的芽孢制备与包埋方法。

3.利用本发明进行牛奶抗生素残留的检测时间为2～3h，短于国内同类方法的4h。

4.本发明方法与TIC法、发酵试验方法相比，操作方便，灵敏度高(对青霉素的检测极限值为0.003IU/mL，对阿莫西林抗生素的检测极限值为4ug/kg)，结果易判断；与商品试剂盒相比，成本低，相当于试剂盒价格的1/7；该方法简单可行，可在一般实验室进行操作。

本发明所述嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)2009，已于2009年9月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.3287。

具体实施方式

实施例1菌种筛选

(1)培养基制备

①营养琼脂培养基蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，将上述成分加入蒸馏水中，搅混均匀，120℃高压灭菌15min。

②大豆胰蛋白胨琼脂培养基胰蛋白胨17.0g、植物蛋白胨3.0g、氯化钠10.0g、葡萄糖2.5g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，将上述成分加入蒸馏水中，搅混均匀，120℃高压灭菌15min。

③锰盐营养琼脂培养基蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，将上述成分加入蒸馏水中，加入0.5％的硫酸锰溶液1mL，搅混均匀，120℃高压灭菌15min。

④溴钾酚紫葡萄糖蛋白胨培养基蛋白胨10g、葡萄糖5g、2％溴钾酚紫乙醇 溶液0.6mL、琼脂4.0g、蒸馏水1000mL，在蒸馏水中加入蛋白胨、葡萄糖、琼脂，加热搅拌至完全溶解，调节pH至7.2，然后再加入溴钾酚紫乙醇溶液，混匀后，115℃高压灭菌30min。

(2)筛选方法

①65℃生长能力

2006年4月从河南花花牛乳业有限公司所属乳品厂周边的5cm以下土壤深处采集土样，制成10％的土壤混悬液，80℃加热10min，应用生理盐水进行稀释分离，并倾注至营养琼脂平板中，65℃培养12h，随机挑选白色圆形菌落，转移到大豆胰蛋白胨琼脂斜面中。初步筛选出8株能够在65℃以上生长的菌株，分别为S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8。

②抗生素敏感能力

向溴钾酚紫葡萄糖蛋白胨培养基中加入1％的经过发酵试验判定为含有抗生素残留的牛奶，并接种上述大豆胰蛋白胨琼脂斜面中的各菌株，65℃培养12h，观察培养基颜色变化，各菌株颜色都为紫色，所有菌株对抗生素都有一定的敏感。

③糖发酵能力

向溴钾酚紫葡萄糖蛋白胨培养基中接种上述大豆胰蛋白胨琼脂斜面中的各菌株，65℃培养12h，观察培养基颜色变化(见表1)，挑选颜色变化为黄色的菌株(糖发酵能力较强的为S6，S8)，转移到大豆胰蛋白胨琼脂斜面中。

表1在溴钾酚紫葡萄糖蛋白胨培养基中的颜色变化

④抑菌试验

根据上述实验，选定S6，S8进行进一步的抑菌试验。

芽孢悬浮液的制备：将活化斜面菌种接种于营养琼脂培养18h～20h，用生理盐水洗下菌苔，将菌液移种于盛有250mL锰盐营养琼脂培养基的克氏瓶内，55℃培养4d，用10mL生理盐水洗下菌苔，并进行充分混合，并用灭菌纱布进行过滤，滤液以4000r/min离心15min，弃上清液，如此重复5～6次，用生理盐水悬浮芽孢，在0～4℃条件下贮存。

抗生素溶液的配制：准确称取适量青霉素、链霉素、卡钠霉素、庆大霉素，用磷酸盐缓冲液溶解并定容为5mg/mL的标准溶液，然后稀释至500ug/mL，50ug/mL，5ug/mL；当天配制，当天使用。

检验用平板的制备：取90mm灭菌玻璃培养皿，底层加10mL灭菌的抗生素检测用培养基营养琼脂，凝固后上层加入5mL含有浓度为1×10⁸cfu/mL芽孢的溴钾酚紫葡萄糖蛋白胨培养基，凝固后备用。

测定：将各抗生素溶液0.1mL加入于检验用平板上的4个纸片上，65℃培养4h，测量抑菌圈直径。每个样品，取三次平行试验平均值，抑菌实验结果见表2。

表2各菌株对抗生素抑菌性指标

实施例2菌株鉴定

对实施例1中所分离的菌株S8，通过生物学特性观察，进行进一步的形态鉴定，结果如下：

(1)生理鉴定

在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上培养只形成针头大小的菌落，菌体杆状，不形成丝状体，具有周身鞭毛，能运动，芽孢椭圆形，亚端生或端生，通常使孢囊膨大，能够引起高温杀菌乳平酸腐败和甜凝乳等变质现象；最低生长温度为28℃，最适生长温度为50～65℃，最高生长温度为70～77℃，在pH6.8～7.2的培养基中生长良好，当pH值接近5时就不能生长。

(2)生化鉴定：

65℃培养能够快速生长：葡萄糖，产酸；

沙氏葡萄糖肉汤，阴性；

吲哚，阴性；

硝酸盐，50～85％的阳性；

靛基质为阴性；

V-P反应，阴性；

7％NaCl肉汤，阴性；

柠檬酸盐，阴性；

酸性胰胨，不生长。

从菌株的各项形态特征、培养特征和生理生化特征表明该菌株属芽孢杆菌属，且其在65℃培养能够快速生长，所以将该菌株鉴定为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)，发明人将其命名为2009。

实施例3一种抗生素残留检测方法，包括以下步骤：

(1)菌株活化

嗜热脂肪芽孢杆菌CGMCC NO.3287菌株接种于胰蛋白胨大豆的斜面培养基上，调节培养基的pH值为7.2，并在65℃的条件下进行优化培养，每周转种一次；

(2)芽孢富集悬浮

加热离心法：将斜面菌种在65℃下培养4天，用10mL生理盐水洗下菌苔，转移至内装少量玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡，无菌棉花过滤至无菌容器中，制成一定浓度的悬浮液，将悬浮液在70～80℃加热10min，静置过夜，2000r/min离心15min，取上清液，4000r/min离心15min，如此反复离心洗涤4～5次后，用生理盐水将离心沉淀悬浮成芽孢悬浮液，调整其OD₆₀₀值到0.30，贮存于0～4℃。

(3)紫色营养液配制

以葡萄糖、蛋白胨及水为原料，配制成葡萄糖为1％、蛋白胨为1％、pH值为7.0～7.3的营养液，滤膜过滤灭菌后每100mL营养液中加1.6％的溴甲酚紫溶液0.05～0.07mL；

(4)芽孢杆菌的胶体包埋

取琼脂加热溶解于紫色培养液中制成琼脂重量百分含量为1～2％的紫色培养基，取0.1mL(芽孢数为10⁴)芽孢悬浮液与50mL温度为60℃的紫色培养基快速混匀，并迅速分装于检测小管(每管0.5mL)中，于0～4℃下直立静置，密封后0～4℃下保存、备用；

(5)样品检测

检测牛奶样品于80℃水浴加热10min，冷却至55℃，取该检测牛奶样品0.05mL加到所述检测小管中，密闭封口后于65℃水浴培养150min，培养液由蓝紫色变为黄色为阴性样品，培养液仍为蓝紫色则呈阳性样品。

实施例4一种抗生素残留检测方法，与实施例3基本相同，不同之处在于，以下述溶菌酶法替代步骤(2)中所述加热离心法：

将活化斜面菌种接种到磷酸盐缓冲液中，75℃加热10min，置于营养琼脂培养20h，用生理盐水洗下菌苔，将菌液移种于盛有250mL芽孢培养基的克氏瓶内，55℃培养4天，用10mL生理盐水洗下菌苔，并进行充分混合，以4000r/min离心 15min，弃去上清液，加入含有溶菌酶的磷酸盐缓冲液，37℃温育1h，温育后的悬浮液8000r/min离心15min，弃去上清液，如此反复离心洗涤5～6次，用生理盐水悬浮芽孢，将嗜热脂肪芽孢杆菌悬浮液OD₆₀₀值调整到0.29，在0～4℃条件下贮存备用。

实施例5一种抗生素残留检测方法，与实施例3基本相同，不同之处在于，以下述芽孢杆菌的包埋方法替代所述步骤(4)：

取4mL芽孢悬浮液与20mL 1.5％海藻酸钠混匀，用6号针头挤入200mL 5％的CaCl₂溶液中，于4℃静置6h，抽滤出凝胶颗粒，用生理盐水洗净，每个检测小管内放入2～3个海藻酸钙凝胶珠，密封0～4℃保存、备用；

且以下述方法替代所述步骤(5)：

原料奶样品于80℃水浴加热10min，冷却至55℃备用，检测时，分别向装有海藻酸钙凝胶珠的检测小管中加入0.2mL紫色培养液，再加入检测牛奶样品0.05～0.1mL，密闭封口，于65℃水浴培养150min，培养液由蓝紫色变为黄色为阴性样品，培养液仍为蓝紫色则呈阳性样品。

实施例6包埋芽孢与未包埋芽孢的比较

将同一批次的富集芽孢悬浮液一部分用海藻酸钙包埋，一部分直接保存在悬浮液中，同时放在0～4℃保存。将保存的芽孢，分别在一周内用平板计数检测其存活芽孢数量(个/mL)，见表3。

表3存放时间的比较

从表3中可以看出包埋的芽孢存活数量在一周内变化很小，而未芽孢存活数量在一周之内变化较大，大部分丧失了活力。这表明，包埋的芽孢存放时间较 长，便于保存。

实施例7稳定性实验

按实施例3中的方法制备好检测小管于4℃下依次保存1周、2周、3周、4周，分别进行检测并记录其阴性检测时间，见表4。

表3阴性检测时间变化

从表4可以看出，由于芽孢有一个衰减的过程，因此芽孢数量会有一定的减少，阴性检测时间会随着时间的延长有所变化；阴性检测时间变化较小，说明芽孢较为稳定，从而能够保证试验的稳定性。为保证试验的准确性，每次试验应做一阴性对照.其准确的检测判定时间以阴性对照为准。本发明方法检测牛奶中抗生素残留的稳定性前三周都稳定在136min内，到第四周为150min，所以此方法的检测稳定性为一个月。

实施例8与其他检测方法的对照试验

制备相同待测样各40份，分别采取小样发酵法、TTC法(国标GB5409-85)、试剂盒法(ECLIPSE50)和试纸条法(青霉素类)与本方法进行对照检测其灵敏度。检测结果见表5。

阳性率分别为小样发酵法22.5％，TTC法25％，本方法23.75％，试剂盒法26.25％，试纸条法32.5％。本发明方法的灵敏度介于小样发酵与试剂盒法之间，灵敏度具有可靠性。小样发酵法的灵敏度较低，国标TTC法可疑样品份数较多，而且操作比较复杂，菌液浓度难以控制；试剂盒法和试纸条法操作都比较简单，其中试纸条法时间比较短，但它们经过商品化，成本较高，一般一个样品成本在20元左右，广大奶牛场和乳品厂难以承受；本发明方法可以使每个样品的检测成本控制在5元之内，大大降低了检测成本。

表5各种方法的比较

Claims (4)

1.一种嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)2009，其保藏编号为CGMCCNO.3287。

2.一种β-内酰胺类抗生素残留检测方法，包括以下步骤：

(1)菌株活化

将权利要求1所述的嗜热脂肪芽孢杆菌CGMCC NO.3287菌株接种于斜面培养基上，调节培养基的pH值为6.8～7.2，于50～65℃下进行优化培养，并进行转种继代培养；

(2)芽孢富集悬浮

加热离心法：将斜面菌种在50～65℃下培养3～5天，用生理盐水洗下菌苔，转移至无菌容器中，充分振荡后，过滤，制成悬浮液，于70～80℃下加热悬浮液10～15min，静置过夜后，以2000r/min离心10～20min，取上清液，4000r/min离心10～20min，弃去上清液，如此反复离心洗涤4～5次后，用生理盐水将离心沉淀悬浮成芽孢悬浮液，调整其OD₆₀₀值至0.25～0.35，于0～4℃下贮存、备用；

(3)紫色培养液配制

以重量百分比计，取葡萄糖、蛋白胨及水配制成葡萄糖为1％、蛋白胨为1％、pH值为7.0～7.3的培养液，滤膜过滤灭菌后于每100mL营养液中加1.6％的溴甲酚紫溶液0.05～0.07mL；

(4)芽孢杆菌的胶体包埋

取琼脂加热溶解于紫色培养液中制成琼脂重量百分含量为1～2％的紫色培养基，取0.1～0.4mL芽孢悬浮液与50～100mL温度为50～65℃的紫色培养基快速混匀，并迅速分装于检测小管中，于0～4℃下直立静置，密封后0～4℃下保存、备用；

(5)样品检测

检测牛奶样品于80～85℃水浴加热10min，冷却至50～60℃，取该检测牛奶样品0.05～0.1mL加到所述检测小管中，密闭封口后于50～65℃水浴培养150min，培养液由蓝紫色变为黄色为阴性样品，培养液仍为蓝紫色则呈阳性样品。

3.根据权利要求2所述的β-内酰胺类抗生素残留检测方法，其特征在于，以下述溶菌酶法替代步骤(2)中所述加热离心法：

将活化斜面菌种接种到磷酸盐缓冲液中，70～77℃加热10min，置于营养琼脂培养18～20h，用生理盐水洗下菌苔，将菌液移种于芽孢培养基中，于55～65℃下培养4天，用10mL生理盐水洗下菌苔，并进行充分混合，以4000r/min离心15min，弃去上清液，加入含有溶菌酶的磷酸盐缓冲液，37℃温育1h，温育后离心沉淀，弃上清液，如此反复离心洗涤5～6次，用生理盐水将离心沉淀悬浮成芽孢悬浮液，将嗜热脂肪芽孢杆菌悬浮液OD₆₀₀值调整到0.25～0.35，在0～4℃条件下贮存、备用。

4.根据权利要求2所述的β-内酰胺类抗生素残留检测方法，其特征在于，以下述芽孢杆菌的包埋方法替代所述步骤(4)：

取1～4mL芽孢悬浮液与15～20mL 1.5％海藻酸钠混匀，将其加入100～200mL 5％的CaCl₂溶液中，于4℃静置6h，抽滤出凝胶颗粒，用生理盐水洗净，每个检测小管内放入2～3个海藻酸钙凝胶珠，密封于0～4℃下保存，备用；

且以下述方法替代所述步骤(5)：

原料奶样品于80～85℃水浴加热10min，冷却至50～60℃备用，检测时，分别向装有海藻酸钙凝胶珠的检测小管中加入0.2～0.3mL紫色培养液，再加入检测牛奶样品0.05～0.1mL，密闭封口，于50～65℃水浴培养150min，培养液由蓝紫色变为黄色为阴性样品，培养液仍为蓝紫色则呈阳性样品。