JP2000093158A - 微生物検出用装置 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 放射性物質を使用することのない、また容器
内部に立ち入ることのない手段によって、たとえ高濃度
の赤血球のような妨害物質が存在していても微生物を検
出することが可能である装置を提供する。 【解決手段】 この発明は、血液や他の体液のような臨
床検体および非臨床検体中の微生物の存在を、その検体
を透明な密封容器１中で滅菌培養培地３を用いて培養す
ることによって検出する装置およ機器を提供する。微生
物の存在および同定は、検体のｐＨや検体内でのＣＯ２
産生の変化を、容器内面もしくは容器を密封するために
用いた密封手段に固定した、内部に指示媒体をもつセン
サー２を用いて容器の外部から検出または測定すること
によって決定される。
内部に立ち入ることのない手段によって、たとえ高濃度
の赤血球のような妨害物質が存在していても微生物を検
出することが可能である装置を提供する。 【解決手段】 この発明は、血液や他の体液のような臨
床検体および非臨床検体中の微生物の存在を、その検体
を透明な密封容器１中で滅菌培養培地３を用いて培養す
ることによって検出する装置およ機器を提供する。微生
物の存在および同定は、検体のｐＨや検体内でのＣＯ２
産生の変化を、容器内面もしくは容器を密封するために
用いた密封手段に固定した、内部に指示媒体をもつセン
サー２を用いて容器の外部から検出または測定すること
によって決定される。
Description
【０００１】この出願は、１９８８年３月１５日出願の
出願番号第07/168,291号の一部継続出願である１９８９
年４月１３日出願の出願番号第07/322,874号の一部継続
出願である。
出願番号第07/168,291号の一部継続出願である１９８９
年４月１３日出願の出願番号第07/322,874号の一部継続
出願である。
【０００２】本発明は、増殖用培地と密封容器を用いる
検体中のｐＨもしくはＣＯ２の変化を、サンプルを調製
し容器を密封した後は容器内に何ら立ち入ることなく、
連続的に追跡する監視装置および機器を提供する。さら
にその他の利点として、本発明は、検体中の成分が呈色
測定法に影響を及ぼすことのないようにし、また、検体
中のｐＨやＣＯ２濃度を事実上連続的に監視する手段を
提供する。
検体中のｐＨもしくはＣＯ２の変化を、サンプルを調製
し容器を密封した後は容器内に何ら立ち入ることなく、
連続的に追跡する監視装置および機器を提供する。さら
にその他の利点として、本発明は、検体中の成分が呈色
測定法に影響を及ぼすことのないようにし、また、検体
中のｐＨやＣＯ２濃度を事実上連続的に監視する手段を
提供する。
【０００３】
【発明の背景】臨床検体中における微生物汚染の存在
は、従来、次のようにして測定していた。すなわち、栄
養源の存在下にその検体を培養し、一定時間後に検体中
または検体上の雰囲気中に見られる変化によって微生物
学的活性を検出することによっていた。例えば、Ahnell
らのアメリカ国特許第4,182,656号においては、サンプ
ルを、炭素１３で標識した発酵性の基質を含む培養培地
入りの容器に投じている。容器を密封し、検体を生物学
的活性を促す条件下に置き、検体上部の気体雰囲気中の
炭素１３に対する炭素１２の比を測定し、初めの比と比
較する。アメリカ国特許第4,152,213号では、次の方法
について請求がなされている。すなわち、ある検体中の
酸素消費性細菌の存在を、容器中の気体の圧力を監視す
ることによって、検体上部の雰囲気中の酸素量の減少を
検出して測定するものである。アメリカ国特許第4,073,
691号は、培養培地入りの密封容器の中の、細菌を含む
生物学的活性体の存在を測定する方法を提供するもので
あるが、この方法は、一定時間後に検体上の気体雰囲気
の特性の変化を測定することによって行なうものであ
る。気体雰囲気中のＣＯ２変化を非侵入的（non-invasi
ve）に検出する方法として、1984年４月４日に公開され
たＥＰＯ特許出願第83108468.6号に開示される、Suppma
nらによる教示がある。上記のもの、およびその他の公
開公報に記載されている方法および機器はみな、放射能
測定法か、培養後気体雰囲気中の変化を測定するために
密封容器内部に立ち入る即ち侵入するか、赤外線を通す
ような特殊な材料を必要とするか、そのいずれかであっ
た。
は、従来、次のようにして測定していた。すなわち、栄
養源の存在下にその検体を培養し、一定時間後に検体中
または検体上の雰囲気中に見られる変化によって微生物
学的活性を検出することによっていた。例えば、Ahnell
らのアメリカ国特許第4,182,656号においては、サンプ
ルを、炭素１３で標識した発酵性の基質を含む培養培地
入りの容器に投じている。容器を密封し、検体を生物学
的活性を促す条件下に置き、検体上部の気体雰囲気中の
炭素１３に対する炭素１２の比を測定し、初めの比と比
較する。アメリカ国特許第4,152,213号では、次の方法
について請求がなされている。すなわち、ある検体中の
酸素消費性細菌の存在を、容器中の気体の圧力を監視す
ることによって、検体上部の雰囲気中の酸素量の減少を
検出して測定するものである。アメリカ国特許第4,073,
691号は、培養培地入りの密封容器の中の、細菌を含む
生物学的活性体の存在を測定する方法を提供するもので
あるが、この方法は、一定時間後に検体上の気体雰囲気
の特性の変化を測定することによって行なうものであ
る。気体雰囲気中のＣＯ２変化を非侵入的（non-invasi
ve）に検出する方法として、1984年４月４日に公開され
たＥＰＯ特許出願第83108468.6号に開示される、Suppma
nらによる教示がある。上記のもの、およびその他の公
開公報に記載されている方法および機器はみな、放射能
測定法か、培養後気体雰囲気中の変化を測定するために
密封容器内部に立ち入る即ち侵入するか、赤外線を通す
ような特殊な材料を必要とするか、そのいずれかであっ
た。
【０００４】検体、特に血液培養物の微生物汚染を測定
するためのその他の既知の方法としては、温度、ｐＨ、
濁度、呈色、生物発光、インピーダンスの微小変化を測
定するものがある。一般的に、これらの方法は、細菌の
代謝副産物を検出することによって微生物汚染を測定す
るものである。微生物汚染はまた、二次培養や染色によ
って評価してもよい。これらの方法のうち、インピーダ
ンス法、放射能測定法および赤外線分光法においての
み、臨床検体の自動処理が可能である。また、インピー
ダンス法、赤外線分光法を除き、これらの方法において
は、液体検体または検体上の気体雰囲気について測定す
るために、容器内部に立ち入る必要がある。測定をする
たびごとに、汚染の可能性や、検体上の雰囲気の組成を
変える可能性があるのに加えて、これらの方法では、連
続的な測定や、長時間にわたる、短時間間隔での繰り返
しの測定をすることができない。これは重大な欠点にな
る。なぜなら、汚染生物の増殖率は生物によって、ま
た、もとのサンプル中の生物の数によって異なるので、
汚染検体によって、雰囲気や液性サンプル中にいつ検出
可能な変化が現われるのかを予想することができないか
らである。それと関連した問題として、汚染が液性サン
プルのｐＨ変化によって測定される場合は、各種の代謝
産物がそれぞれ別様にサンプルのｐＨに影響を与えるだ
ろう。例えば、アンモニアの産生はｐＨを上昇させる
が、ＣＯ２の産生はそれを下げる。異なる汚染生物の種
々の増殖率は、ある時にはｐＨの増加を招き、またある
時には減少を招くという風であって、しかも、ｐＨを広
く隔たった時間間隔で測定している場合は、いつ上昇
で、いつ下降になるか予測できない。全血液サンプル中
のｐＨ測定によって変化を検出する場合の、特に、指示
薬染料がｐＨ測定の手段である場合のもう一つの誤差原
因は、染色状態が血球の存在によって影響を受けたり、
不明瞭になったりする可能性である。比色計用の指示薬
は、検体の性質によって誘発される誤差が染色状態に影
響を及ぼさないようにすることができて始めて有効に用
いることができる。
するためのその他の既知の方法としては、温度、ｐＨ、
濁度、呈色、生物発光、インピーダンスの微小変化を測
定するものがある。一般的に、これらの方法は、細菌の
代謝副産物を検出することによって微生物汚染を測定す
るものである。微生物汚染はまた、二次培養や染色によ
って評価してもよい。これらの方法のうち、インピーダ
ンス法、放射能測定法および赤外線分光法においての
み、臨床検体の自動処理が可能である。また、インピー
ダンス法、赤外線分光法を除き、これらの方法において
は、液体検体または検体上の気体雰囲気について測定す
るために、容器内部に立ち入る必要がある。測定をする
たびごとに、汚染の可能性や、検体上の雰囲気の組成を
変える可能性があるのに加えて、これらの方法では、連
続的な測定や、長時間にわたる、短時間間隔での繰り返
しの測定をすることができない。これは重大な欠点にな
る。なぜなら、汚染生物の増殖率は生物によって、ま
た、もとのサンプル中の生物の数によって異なるので、
汚染検体によって、雰囲気や液性サンプル中にいつ検出
可能な変化が現われるのかを予想することができないか
らである。それと関連した問題として、汚染が液性サン
プルのｐＨ変化によって測定される場合は、各種の代謝
産物がそれぞれ別様にサンプルのｐＨに影響を与えるだ
ろう。例えば、アンモニアの産生はｐＨを上昇させる
が、ＣＯ２の産生はそれを下げる。異なる汚染生物の種
々の増殖率は、ある時にはｐＨの増加を招き、またある
時には減少を招くという風であって、しかも、ｐＨを広
く隔たった時間間隔で測定している場合は、いつ上昇
で、いつ下降になるか予測できない。全血液サンプル中
のｐＨ測定によって変化を検出する場合の、特に、指示
薬染料がｐＨ測定の手段である場合のもう一つの誤差原
因は、染色状態が血球の存在によって影響を受けたり、
不明瞭になったりする可能性である。比色計用の指示薬
は、検体の性質によって誘発される誤差が染色状態に影
響を及ぼさないようにすることができて始めて有効に用
いることができる。
【０００５】
【発明の概要】本発明は、血液や他の体液のような臨床
検体および非臨床検体中の微生物の存在を、その検体を
透明な、密封容器中で滅菌培養培地を用いて培養するこ
とによって検出する装置および機器に係わる。微生物の
存在および同定は、検体のｐＨや検体内でのＣＯ２産生
の変化を、容器内面もしくは容器を密封するために用い
た密封手段に固定したセンサーを用いて、検出または測
定することによって決定される。本発明によれば、高濃
度の赤血球のような妨害物質が存在しても、非放射能
性、非侵入的手段によって、微生物を検出することがで
きる。
検体および非臨床検体中の微生物の存在を、その検体を
透明な、密封容器中で滅菌培養培地を用いて培養するこ
とによって検出する装置および機器に係わる。微生物の
存在および同定は、検体のｐＨや検体内でのＣＯ２産生
の変化を、容器内面もしくは容器を密封するために用い
た密封手段に固定したセンサーを用いて、検出または測
定することによって決定される。本発明によれば、高濃
度の赤血球のような妨害物質が存在しても、非放射能
性、非侵入的手段によって、微生物を検出することがで
きる。
【０００６】
【好適実施態様の説明】本発明の機器および装置は、血
液サンプルや他の体液などの臨床検体および非臨床検体
中の微生物の存在を、微生物によって産生された代謝産
物の増加を測定することによって検出するための非侵入
的手段を提供する。検体を、ある微生物代謝産物の生産
を強化する特別処方の培地に加える。そして、この代謝
産物は、培養容器の底部あるいは容器の密封手段内に装
着した特定のディスポーザブルなセンサーによって検出
される。このセンサーは固体成分もしくは膜から成り、
これを接着媒体または支持媒体と呼ぶ。固体成分もしく
は膜の上にまたはその内部には、指示薬液が固定化され
ている。センサーは、容器の内面と同じ高さに、また
は、容器を密封するのに用いられる密封手段内部に、ま
たは、密封手段に接着して、指示薬液が外から見えるよ
うに装着される。センサーは、細胞、タンパク質、その
他の固体成分、もしくはその他の不透明成分すなわち有
色成分がセンサーと容器表面の間に侵入しないように、
容器に接着されてもよい。ある実施態様では、気体分子
は通過させるが、イオンの通過は妨げる膜または固層を
用いて、センサーを検体や増殖用培地から隔離する。
液サンプルや他の体液などの臨床検体および非臨床検体
中の微生物の存在を、微生物によって産生された代謝産
物の増加を測定することによって検出するための非侵入
的手段を提供する。検体を、ある微生物代謝産物の生産
を強化する特別処方の培地に加える。そして、この代謝
産物は、培養容器の底部あるいは容器の密封手段内に装
着した特定のディスポーザブルなセンサーによって検出
される。このセンサーは固体成分もしくは膜から成り、
これを接着媒体または支持媒体と呼ぶ。固体成分もしく
は膜の上にまたはその内部には、指示薬液が固定化され
ている。センサーは、容器の内面と同じ高さに、また
は、容器を密封するのに用いられる密封手段内部に、ま
たは、密封手段に接着して、指示薬液が外から見えるよ
うに装着される。センサーは、細胞、タンパク質、その
他の固体成分、もしくはその他の不透明成分すなわち有
色成分がセンサーと容器表面の間に侵入しないように、
容器に接着されてもよい。ある実施態様では、気体分子
は通過させるが、イオンの通過は妨げる膜または固層を
用いて、センサーを検体や増殖用培地から隔離する。
【０００７】本発明の好ましい実施態様は、透明である
かまたは透明な区画を持つキャップないしフタのような
密封手段を含む。センサーは、透明キャップもしくはキ
ャップの透明区画の近傍に装着されるか、または、キャ
ップの一部を形成する。容器を密封するのにキャップを
用いる場合には、指示薬の変化を、透明な密封手段を透
して読みとることができる。この実施態様に見られる利
点は、これが、大規模に容器を生産するにあたって、も
っとも経済的な方法であろうということである。
かまたは透明な区画を持つキャップないしフタのような
密封手段を含む。センサーは、透明キャップもしくはキ
ャップの透明区画の近傍に装着されるか、または、キャ
ップの一部を形成する。容器を密封するのにキャップを
用いる場合には、指示薬の変化を、透明な密封手段を透
して読みとることができる。この実施態様に見られる利
点は、これが、大規模に容器を生産するにあたって、も
っとも経済的な方法であろうということである。
【０００８】さらに好ましくは、密封手段を、カプセル
封入された指示薬ミセルを含む例えばポリマーのような
材料で形成することである。容器ないし密封手段いずれ
かの透明区画は、その材料が微生物の代謝産物に対して
浸透性を持ち、また指示薬の変化が密封手段の表面上に
見えるかぎり、必要ない。
封入された指示薬ミセルを含む例えばポリマーのような
材料で形成することである。容器ないし密封手段いずれ
かの透明区画は、その材料が微生物の代謝産物に対して
浸透性を持ち、また指示薬の変化が密封手段の表面上に
見えるかぎり、必要ない。
【０００９】本発明の別の実施態様は、少なくとも１個
の中空の貫通手段（例えばカニューレ）に結合されるセ
ンサーであって、図５に見られるようなものである。セ
ンサー中の指示薬液は、カニューレの中空の中心部と交
通している。容器は、ゴム栓のような通常の栓で密封さ
れる。センサー装置は栓の上に装着され、カニューレは
ゴム栓の仕切りを通して容器中に貫通される。被接種培
地、微生物からの気体状代謝産物、または、培地そのも
のから発生する気体は、カニューレを通じて上昇し、セ
ンサー中の指示薬の色を変化させ、つぎにこの変化を読
みとる。この実施態様の改良例としては、１個の、好ま
しくは少なくとも２個のカニューレを使用することであ
り、そのカニューレの各々が一端を、好ましくは図６に
見られるように各カニューレの一端に接続する開放端
を、センサーに挿入し、指示薬と交通させる。センサー
は、固体状ポリマーの乳濁液であっても、センサーを含
むプラスチック成形品であっても、またはこれらの要素
を組み込んだ他の形式の装置であってもよい。いずれの
場合にも、センサーは、接続通路に接している。上記の
ように、両カニューレは容器上の栓の仕切りを貫通して
容器内に挿入される。容器を撹拌すると、容器内部の液
体および／または気体が一方のカニューレに流入し、他
方から流出し、これによって、検体とセンサーとの直接
の接触が可能となる。
の中空の貫通手段（例えばカニューレ）に結合されるセ
ンサーであって、図５に見られるようなものである。セ
ンサー中の指示薬液は、カニューレの中空の中心部と交
通している。容器は、ゴム栓のような通常の栓で密封さ
れる。センサー装置は栓の上に装着され、カニューレは
ゴム栓の仕切りを通して容器中に貫通される。被接種培
地、微生物からの気体状代謝産物、または、培地そのも
のから発生する気体は、カニューレを通じて上昇し、セ
ンサー中の指示薬の色を変化させ、つぎにこの変化を読
みとる。この実施態様の改良例としては、１個の、好ま
しくは少なくとも２個のカニューレを使用することであ
り、そのカニューレの各々が一端を、好ましくは図６に
見られるように各カニューレの一端に接続する開放端
を、センサーに挿入し、指示薬と交通させる。センサー
は、固体状ポリマーの乳濁液であっても、センサーを含
むプラスチック成形品であっても、またはこれらの要素
を組み込んだ他の形式の装置であってもよい。いずれの
場合にも、センサーは、接続通路に接している。上記の
ように、両カニューレは容器上の栓の仕切りを貫通して
容器内に挿入される。容器を撹拌すると、容器内部の液
体および／または気体が一方のカニューレに流入し、他
方から流出し、これによって、検体とセンサーとの直接
の接触が可能となる。
【００１０】１ミリリットル当りわずか１個の微生物し
か含んでいないような体液（例えば血液）検体中の微生
物でも、本発明を用いることによって検出することがで
きる。このような検体は、生物集団が臨界値に達し、そ
こにおいて代謝産物の増加が測定可能になるまでに７日
間におよぶインキュベーションを要することがある。本
発明者らは、ある種の微生物において、10６ CFU/mlの
濃度でもｐＨまたはＣＯ２に測定可能な変化を引き起こ
すことを見い出した。どのような微生物でも、10７から
10８ CFU/mlの濃度では測定可能な結果を示した。
か含んでいないような体液（例えば血液）検体中の微生
物でも、本発明を用いることによって検出することがで
きる。このような検体は、生物集団が臨界値に達し、そ
こにおいて代謝産物の増加が測定可能になるまでに７日
間におよぶインキュベーションを要することがある。本
発明者らは、ある種の微生物において、10６ CFU/mlの
濃度でもｐＨまたはＣＯ２に測定可能な変化を引き起こ
すことを見い出した。どのような微生物でも、10７から
10８ CFU/mlの濃度では測定可能な結果を示した。
【００１１】本発明は、次のいくつかの点でユニークで
あり、かつ、有利である。１）微生物代謝産物が、検体
上の雰囲気中ではなく、培養瓶の液相中で測定される、
２）ユニークなディスポーザブルなセンサーを、瓶の内
面または閉鎖手段もしくは密封手段に固定したり、或い
は閉鎖手段もしく密封手段の外部から装着することがで
きるので、瓶または密封手段の透明壁の外側から、瓶そ
のものの状態（integrity）を損なうことなく測定する
ことが可能である、３）外部からの測定は、肉眼観察で
行なってもよいし、反射に基づいて測定する機器を用い
て行なってもよい、４）検体中の不透明成分すなわち有
色成分は、変化に対するセンサーの検出能力またはこれ
らの変化の測定を妨げない、５）高濃度の指示薬分子
が、センサー内の小容量部中、すなわちポリマー乳濁液
中または膜上に保持されるので、呈色変化が簡単に観察
できる。
あり、かつ、有利である。１）微生物代謝産物が、検体
上の雰囲気中ではなく、培養瓶の液相中で測定される、
２）ユニークなディスポーザブルなセンサーを、瓶の内
面または閉鎖手段もしくは密封手段に固定したり、或い
は閉鎖手段もしく密封手段の外部から装着することがで
きるので、瓶または密封手段の透明壁の外側から、瓶そ
のものの状態（integrity）を損なうことなく測定する
ことが可能である、３）外部からの測定は、肉眼観察で
行なってもよいし、反射に基づいて測定する機器を用い
て行なってもよい、４）検体中の不透明成分すなわち有
色成分は、変化に対するセンサーの検出能力またはこれ
らの変化の測定を妨げない、５）高濃度の指示薬分子
が、センサー内の小容量部中、すなわちポリマー乳濁液
中または膜上に保持されるので、呈色変化が簡単に観察
できる。
【００１２】培養瓶内に発生する変化を容器内に立ち入
ることなく測定できる別のタイプのセンサーは、圧電変
換装置(piezoelectric apparatus)（例えば圧電変換
片）を含む実施態様であって、この圧電変換装置はキャ
ップ、すなわち閉鎖手段もしくは密封手段に図７のよう
に結合される。この装置からの信号は、容器と内容物が
インキュベーション温度に達すると、自動的に０にな
る。この装置は、閉鎖手段が微生物により産生される代
謝産物の圧力によって拡張するにつれて、変形する。こ
の変形によって生じた電気信号を測定して、容器内の生
物学的活性を監視する。別の実施態様は、容器から隔離
されている、容器の密封手段を通じて結合されている装
置である。例えば、この実施態様は、中空の区画を含む
ゴム製の固体状矩形であって、その底部に圧電変換片が
あるものでもよい。変換片の下に、ゴム製の矩形を貫い
てカニューレを挿入する。カニューレの開放端は容器の
密封手段を貫いて、容器内に入いる。微生物の気体状の
呼吸産物がカニューレ内に蓄積するにつれ、カニューレ
末端と圧電変換片との間のゴムに力を加え、変換片を変
形させて中空区画に向かって押し込む。次に圧電変換片
の変形によって生じた電気信号を測定する。
ることなく測定できる別のタイプのセンサーは、圧電変
換装置(piezoelectric apparatus)（例えば圧電変換
片）を含む実施態様であって、この圧電変換装置はキャ
ップ、すなわち閉鎖手段もしくは密封手段に図７のよう
に結合される。この装置からの信号は、容器と内容物が
インキュベーション温度に達すると、自動的に０にな
る。この装置は、閉鎖手段が微生物により産生される代
謝産物の圧力によって拡張するにつれて、変形する。こ
の変形によって生じた電気信号を測定して、容器内の生
物学的活性を監視する。別の実施態様は、容器から隔離
されている、容器の密封手段を通じて結合されている装
置である。例えば、この実施態様は、中空の区画を含む
ゴム製の固体状矩形であって、その底部に圧電変換片が
あるものでもよい。変換片の下に、ゴム製の矩形を貫い
てカニューレを挿入する。カニューレの開放端は容器の
密封手段を貫いて、容器内に入いる。微生物の気体状の
呼吸産物がカニューレ内に蓄積するにつれ、カニューレ
末端と圧電変換片との間のゴムに力を加え、変換片を変
形させて中空区画に向かって押し込む。次に圧電変換片
の変形によって生じた電気信号を測定する。
【００１３】上記装置の別の実施態様は、１個以上のカ
ニューレを使用して、ゴム装置に侵入する気体の量を増
したものである。２個のカニューレを使用すれば、セン
サーに出入りする流れは、例えば、横に寝かせた瓶を傾
けた場合に見られる潮の干満様の流れのように、より滑
らかになる。
ニューレを使用して、ゴム装置に侵入する気体の量を増
したものである。２個のカニューレを使用すれば、セン
サーに出入りする流れは、例えば、横に寝かせた瓶を傾
けた場合に見られる潮の干満様の流れのように、より滑
らかになる。
【００１４】複雑な微生物培地を形成する栄養成分は、
微生物が使用する代謝経路を左右する。有機酸、塩基、
各種気体は、与えられた栄養源に応じた比率で生産され
る。これらの生産物はまた、微生物の種ごとにまちまち
である。液体培地中にこれらの生産物があると、それは
液のｐＨを変えることがある。本発明に使用されるセン
サーはｐＨ感受性指示薬を含み、これによって、環境の
ｐＨ変化に応じて測定可能な変化が得られる。ｐＨセン
サーを気体透過性且つイオン不透過性の膜でおおった実
施態様では、指示薬ｐＨを左右する気体の存在、例え
ば、ＣＯ２やアンモニアが測定される。したがって、微
生物の増殖は培養液中のｐＨ変化か、または培養液に溶
解した気体を測定するかのいずれかによって検出される
が、そのいずれの指示も、微生物が生産する気体状代謝
産物によってもたらされる。
微生物が使用する代謝経路を左右する。有機酸、塩基、
各種気体は、与えられた栄養源に応じた比率で生産され
る。これらの生産物はまた、微生物の種ごとにまちまち
である。液体培地中にこれらの生産物があると、それは
液のｐＨを変えることがある。本発明に使用されるセン
サーはｐＨ感受性指示薬を含み、これによって、環境の
ｐＨ変化に応じて測定可能な変化が得られる。ｐＨセン
サーを気体透過性且つイオン不透過性の膜でおおった実
施態様では、指示薬ｐＨを左右する気体の存在、例え
ば、ＣＯ２やアンモニアが測定される。したがって、微
生物の増殖は培養液中のｐＨ変化か、または培養液に溶
解した気体を測定するかのいずれかによって検出される
が、そのいずれの指示も、微生物が生産する気体状代謝
産物によってもたらされる。
【００１５】ＣＯ２センサーとｐＨセンサーには二つの
共通成分がある。すなわち、ｐＨ指示薬として有用な分
子種と、接着／支持媒体とである。ｐＨ指示薬は支持媒
体に共有的にも、非共有的にも結合されることができ
る。あるいは、指示薬をポリマーマトリックス内部に封
入してもよい、例えば、硬化前にポリマーマトリックス
内部に乳濁状態でカプセル封入してもよい。ｐＨセンサ
ーとして用いるためには、指示薬は培地と接触していな
ければならない。ＣＯ２センサーは第三の成分、すなわ
ち指示膜を検体や増殖用培地と完全に隔離する半透性の
物質を持つ。半透膜層は分離膜であってもよいし、或い
は、検体や増殖用培地に接する硬化ポリマーが完全な半
透膜を形成してもよい。上記センサーは、適当な透明容
器もしくは透明な密封手段内部に、適当な接着剤を用い
て接着される。これらセンサーはまた、密封手段の構成
部分を含んでいてもよいし、あるいは、密封手段に固定
されてもよいし、またはその場で硬化するポリマーマト
リックス内に乳濁させた指示薬として容器内に固定され
てもよい。また、微生物の代謝産物、または検体を含む
増殖用培地がセンサーに接触することができるかぎり、
これらセンサーを容器の外側に設置してもよい。
共通成分がある。すなわち、ｐＨ指示薬として有用な分
子種と、接着／支持媒体とである。ｐＨ指示薬は支持媒
体に共有的にも、非共有的にも結合されることができ
る。あるいは、指示薬をポリマーマトリックス内部に封
入してもよい、例えば、硬化前にポリマーマトリックス
内部に乳濁状態でカプセル封入してもよい。ｐＨセンサ
ーとして用いるためには、指示薬は培地と接触していな
ければならない。ＣＯ２センサーは第三の成分、すなわ
ち指示膜を検体や増殖用培地と完全に隔離する半透性の
物質を持つ。半透膜層は分離膜であってもよいし、或い
は、検体や増殖用培地に接する硬化ポリマーが完全な半
透膜を形成してもよい。上記センサーは、適当な透明容
器もしくは透明な密封手段内部に、適当な接着剤を用い
て接着される。これらセンサーはまた、密封手段の構成
部分を含んでいてもよいし、あるいは、密封手段に固定
されてもよいし、またはその場で硬化するポリマーマト
リックス内に乳濁させた指示薬として容器内に固定され
てもよい。また、微生物の代謝産物、または検体を含む
増殖用培地がセンサーに接触することができるかぎり、
これらセンサーを容器の外側に設置してもよい。
【００１６】ｐＨセンサーあるいはＣＯ２センサー中に
活性分子種として、各種の蛍光性、視覚化可能なｐＨ指
示薬を用いることができる。一般に、指示薬の選択に関
する唯一の制限は、既存の前面蛍光法（front surface
fluorescence technology）や反射法によって簡単に測
定できるような、許容し得るｐＨの動作領域と波長変化
を持っていなければならないということである。
活性分子種として、各種の蛍光性、視覚化可能なｐＨ指
示薬を用いることができる。一般に、指示薬の選択に関
する唯一の制限は、既存の前面蛍光法（front surface
fluorescence technology）や反射法によって簡単に測
定できるような、許容し得るｐＨの動作領域と波長変化
を持っていなければならないということである。
【００１７】培養液中のｐＨ変化を検出するための本発
明センサーは、約5.0から約8.0の範囲のｐＨにわたって
蛍光強度や可視色の変化を呈することが好ましい。
明センサーは、約5.0から約8.0の範囲のｐＨにわたって
蛍光強度や可視色の変化を呈することが好ましい。
【００１８】ＣＯ２センサー用の指示薬は、好ましくは
ｐＨ約１３から約５の間で、もっとも好ましくはｐＨ約
１３から約９の間で、蛍光強度や可視色の変化を呈する
ことが望ましい。これによって、ＣＯ２濃度の変化を検
出することができる。ある種のｐＨ指示薬分子だけが支
持媒体に共有的もしくは非共有的に結合し、それらのｐ
Ｈ指示特性を保持することができる。本発明者らは、キ
サンテン、フェノールフタレイン、フェノールスルフォ
ンフタレイン群に属する指示薬が有効であることを見い
出した。これらの具体例としては、フルオレセイン、ク
マリン、フェノールフタレイン、チモールフタレイン、
ブロモチモールブルー、チモールブルー、キシレノール
ブルー、α−ナフトールベンゼインが含まれる。
ｐＨ約１３から約５の間で、もっとも好ましくはｐＨ約
１３から約９の間で、蛍光強度や可視色の変化を呈する
ことが望ましい。これによって、ＣＯ２濃度の変化を検
出することができる。ある種のｐＨ指示薬分子だけが支
持媒体に共有的もしくは非共有的に結合し、それらのｐ
Ｈ指示特性を保持することができる。本発明者らは、キ
サンテン、フェノールフタレイン、フェノールスルフォ
ンフタレイン群に属する指示薬が有効であることを見い
出した。これらの具体例としては、フルオレセイン、ク
マリン、フェノールフタレイン、チモールフタレイン、
ブロモチモールブルー、チモールブルー、キシレノール
ブルー、α−ナフトールベンゼインが含まれる。
【００１９】接着／支持媒体は、ｐＨ指示薬を有機反応
を用いて共有的に結合させることのできるセルロースで
あってもよい。ｐＨ指示薬の非共有的結合は、イオン性
支持材料（例えば、正または負のゼータ・ポテンシャル
を持つナイロン膜）を用いて実現することができる。使
用可能な他のイオン性支持材料としては、陽性または陰
性に帯電したイオン性樹脂、例えばジエチルアミノエチ
ル（ＤＥＡＥ）樹脂すなわちＤＥＡＥセルロースがあ
る。指示膜が微生物増殖用培地と直接接触している場合
には、支持材料をタンパク質で前処理することが必要に
なるかもしれない。
を用いて共有的に結合させることのできるセルロースで
あってもよい。ｐＨ指示薬の非共有的結合は、イオン性
支持材料（例えば、正または負のゼータ・ポテンシャル
を持つナイロン膜）を用いて実現することができる。使
用可能な他のイオン性支持材料としては、陽性または陰
性に帯電したイオン性樹脂、例えばジエチルアミノエチ
ル（ＤＥＡＥ）樹脂すなわちＤＥＡＥセルロースがあ
る。指示膜が微生物増殖用培地と直接接触している場合
には、支持材料をタンパク質で前処理することが必要に
なるかもしれない。
【００２０】ｐＨ指示薬センサーは、微生物増殖用培地
のｐＨ環境によるｐＨ変化を直接検出する。しかしなが
ら、これらのセンサーを、培養液中の気体（例えば、二
酸化炭素、アンモニア）に対して、選択的に反応させる
ことができる。この反応は、気体の拡散は選択的に許容
するが、イオンの通過は阻止する性質を持つことを特徴
とする選択的半透性組成物すなわち膜（例えば、シリコ
ン、ラテックス、テフロンもしくは各種プラスチック）
でセンサーを被覆することによって実現することができ
る。ポリマーマトリックス内部に封じ込められた指示薬
を含むセンサーについては、マトリックスを形成するポ
リマーは、気体の通過は許すがイオンは阻止するような
半透性隔壁として作用することも可能である。
のｐＨ環境によるｐＨ変化を直接検出する。しかしなが
ら、これらのセンサーを、培養液中の気体（例えば、二
酸化炭素、アンモニア）に対して、選択的に反応させる
ことができる。この反応は、気体の拡散は選択的に許容
するが、イオンの通過は阻止する性質を持つことを特徴
とする選択的半透性組成物すなわち膜（例えば、シリコ
ン、ラテックス、テフロンもしくは各種プラスチック）
でセンサーを被覆することによって実現することができ
る。ポリマーマトリックス内部に封じ込められた指示薬
を含むセンサーについては、マトリックスを形成するポ
リマーは、気体の通過は許すがイオンは阻止するような
半透性隔壁として作用することも可能である。
【００２１】カプセル封入された指示薬の実施態様にお
いては、ＣＯ２センサーは４つの成分から成る。第１の
成分は、可視性もしくは蛍光性ｐＨ指示薬であり、これ
は６から１０のｐＨ範囲で反応する。この基準に合致す
る指示薬の具体例としては、ブロモチモールブルー、チ
モールブルー、キシレノールブルー、フェノールフタレ
イン、クマリン、フルオレセインがある。第２の成分は
水酸化ナトリウムまたはそれと等価な塩基であって、こ
れは、選ばれたｐＨ指示薬によるＣＯ２検出のために、
至適なｐＨ環境を維持する。第３の成分はグリセロール
またはそれと等価な乳化剤であって、これは未硬化のポ
リマー内に乳濁する指示薬溶液の微小滴を形成すること
ができる。第４の成分はシリコンのような未硬化のポリ
マーであって、これは指示薬のために適正な環境を維持
する。化学的性質からも、物理的性質からも、または硬
化の必要性という点からも指示薬の化学的活性に影響を
与えないポリマーであれば、気体に対しては透過性を持
つが、イオンに対しては透過性を持たず、滅菌操作に掛
けられてもこれらの性質を変えないものである限り、ど
んなものでも用いることができる。他にも、十分使用に
耐えるシリコン・ポリマーとして、高温、触媒活性、あ
るいは紫外線による加硫によって硬化するものが挙げら
れる。これらの４成分から乳濁液を調製し、ポリマーを
硬化し、ｐＨ指示薬の微小滴の周囲に半透性マトリック
スを形成する。このマトリックスは微生物増殖用培地か
ら発生するＣＯ２や他の気体を選択的に拡散させ、その
結果、指示薬に測定可能な変化をもたらすことができ
る。センサーは別個に、例えば、成形品として硬化させ
て調製され、次に、シリコン接着剤のような適当な接着
剤を用いて培養瓶に接着される。あるいは、センサーを
瓶の底部に形成し、その場で硬化させるのが好ましい。
硬化後、センサー付きの瓶を、オートクレーブに掛ける
といった方法によって、滅菌する。オートクレーブして
滅菌処理する前に、増殖用培地を瓶の中に導入すること
ができると都合がよい。別の代替方法として、センサー
を、容器の内面、例えばマイクロタイタープレートの底
部に噴霧し、薄層を形成する方法がある。滅菌していな
いものであってもよい適当な培地を各ウェルに加え、検
体を接種する。これらのプレートは、通常、センサーに
呈色変化を記録させるのに、たった４〜６時間のインキ
ュベーション時間を要するのみである。
いては、ＣＯ２センサーは４つの成分から成る。第１の
成分は、可視性もしくは蛍光性ｐＨ指示薬であり、これ
は６から１０のｐＨ範囲で反応する。この基準に合致す
る指示薬の具体例としては、ブロモチモールブルー、チ
モールブルー、キシレノールブルー、フェノールフタレ
イン、クマリン、フルオレセインがある。第２の成分は
水酸化ナトリウムまたはそれと等価な塩基であって、こ
れは、選ばれたｐＨ指示薬によるＣＯ２検出のために、
至適なｐＨ環境を維持する。第３の成分はグリセロール
またはそれと等価な乳化剤であって、これは未硬化のポ
リマー内に乳濁する指示薬溶液の微小滴を形成すること
ができる。第４の成分はシリコンのような未硬化のポリ
マーであって、これは指示薬のために適正な環境を維持
する。化学的性質からも、物理的性質からも、または硬
化の必要性という点からも指示薬の化学的活性に影響を
与えないポリマーであれば、気体に対しては透過性を持
つが、イオンに対しては透過性を持たず、滅菌操作に掛
けられてもこれらの性質を変えないものである限り、ど
んなものでも用いることができる。他にも、十分使用に
耐えるシリコン・ポリマーとして、高温、触媒活性、あ
るいは紫外線による加硫によって硬化するものが挙げら
れる。これらの４成分から乳濁液を調製し、ポリマーを
硬化し、ｐＨ指示薬の微小滴の周囲に半透性マトリック
スを形成する。このマトリックスは微生物増殖用培地か
ら発生するＣＯ２や他の気体を選択的に拡散させ、その
結果、指示薬に測定可能な変化をもたらすことができ
る。センサーは別個に、例えば、成形品として硬化させ
て調製され、次に、シリコン接着剤のような適当な接着
剤を用いて培養瓶に接着される。あるいは、センサーを
瓶の底部に形成し、その場で硬化させるのが好ましい。
硬化後、センサー付きの瓶を、オートクレーブに掛ける
といった方法によって、滅菌する。オートクレーブして
滅菌処理する前に、増殖用培地を瓶の中に導入すること
ができると都合がよい。別の代替方法として、センサー
を、容器の内面、例えばマイクロタイタープレートの底
部に噴霧し、薄層を形成する方法がある。滅菌していな
いものであってもよい適当な培地を各ウェルに加え、検
体を接種する。これらのプレートは、通常、センサーに
呈色変化を記録させるのに、たった４〜６時間のインキ
ュベーション時間を要するのみである。
【００２２】
【実施例】以下に掲げるセンサーの特定例は、本発明の
各種使用例を例示するためのものであって、特許請求の
範囲を限定するものではない。
各種使用例を例示するためのものであって、特許請求の
範囲を限定するものではない。
【００２３】実施例１ 非蛍光性指示薬ｐＨセンサーの
調製 正のゼータ・ポテンシャル（ゼータ・プローブ、BioRa
d）を持つように改良を加えたナイロン膜をトリプシン
処理大豆ブロス（Tryptic Soy Broth）の３％溶液中に
入れ、回転式振盪機で静かに振盪しながら、室温で約１
時間浸潤させた。脱イオン水を用いてナイロン膜から過
剰のトリプシン処理大豆ブロスを完全に洗い落とした。
洗った膜を、0.1N NaOH に溶解したｐＨ指示薬（ブロモ
チモールブルー）の0.0001〜0.1％溶液に移し入れた。
この膜を、静かに振盪しながら、室温で１時間反応させ
た。膜から指示薬が洗い出されなくなるまで、脱イオン
水で徹底的に洗浄して膜から余分の指示薬溶液を除去し
た。ｐＨ指示膜を、２４時間空気乾燥し、１１／１６イ
ンチの円を膜からパンチした。
調製 正のゼータ・ポテンシャル（ゼータ・プローブ、BioRa
d）を持つように改良を加えたナイロン膜をトリプシン
処理大豆ブロス（Tryptic Soy Broth）の３％溶液中に
入れ、回転式振盪機で静かに振盪しながら、室温で約１
時間浸潤させた。脱イオン水を用いてナイロン膜から過
剰のトリプシン処理大豆ブロスを完全に洗い落とした。
洗った膜を、0.1N NaOH に溶解したｐＨ指示薬（ブロモ
チモールブルー）の0.0001〜0.1％溶液に移し入れた。
この膜を、静かに振盪しながら、室温で１時間反応させ
た。膜から指示薬が洗い出されなくなるまで、脱イオン
水で徹底的に洗浄して膜から余分の指示薬溶液を除去し
た。ｐＨ指示膜を、２４時間空気乾燥し、１１／１６イ
ンチの円を膜からパンチした。
【００２４】ｐＨ指示薬膜を、シリコン接着剤（GE 250
1 シリコン密封剤、透明）を用いてガラス容器の底部に
接着した。これらの瓶を微生物増殖用培地で満たし、オ
ートクレーブで滅菌した。
1 シリコン密封剤、透明）を用いてガラス容器の底部に
接着した。これらの瓶を微生物増殖用培地で満たし、オ
ートクレーブで滅菌した。
【００２５】実施例２ 非蛍光性指示薬ＣＯ２センサー
の調製 正のゼータ・ポテンシャル（ゼータ・プローブ、BioRa
d）を持つように改良を加えたナイロン膜を、0.1N NaOH
に溶解した 0.001〜0.1％キシレノールブルーと0.0001
〜0.1％ブロモチモールブルーとを含む指示薬溶液中に
入れた。静かに振盪しながら、膜を室温で１時間反応さ
せた。指示薬と反応させた後、膜を脱イオン水で徹底的
に洗って、過剰の指示薬を除去した。指示薬膜を２４時
間空気乾燥し、１１／１６インチの円をその膜からパン
チした。次に、その指示薬膜を、透明なガラス瓶の底部
内面にシリコン接着剤（GE 2501シリコン密封剤、透
明）を用いて接着し、シリコン接着剤の第二の層を指示
薬膜の上にかぶせ、ナイロン指示薬膜を完全に密封し
た。
の調製 正のゼータ・ポテンシャル（ゼータ・プローブ、BioRa
d）を持つように改良を加えたナイロン膜を、0.1N NaOH
に溶解した 0.001〜0.1％キシレノールブルーと0.0001
〜0.1％ブロモチモールブルーとを含む指示薬溶液中に
入れた。静かに振盪しながら、膜を室温で１時間反応さ
せた。指示薬と反応させた後、膜を脱イオン水で徹底的
に洗って、過剰の指示薬を除去した。指示薬膜を２４時
間空気乾燥し、１１／１６インチの円をその膜からパン
チした。次に、その指示薬膜を、透明なガラス瓶の底部
内面にシリコン接着剤（GE 2501シリコン密封剤、透
明）を用いて接着し、シリコン接着剤の第二の層を指示
薬膜の上にかぶせ、ナイロン指示薬膜を完全に密封し
た。
【００２６】これらの瓶を、微生物増殖用培地で満た
し、オートクレーブで滅菌した。
し、オートクレーブで滅菌した。
【００２７】実施例３ Ａ．カプセル封入指示薬センサ
ーの調製 25−75％グリセロールを含む0.0005−0.5N NaOHに溶解
した、 0.1−1.0％フェノールフタレイン、キシレノー
ルブルー、またはブロモチモールブルーの保存液を調製
した。指示薬−NaOH−グリセロール保存液の 0.1−0.5m
lを、未硬化のＲＴＶホワイトシリコン（GEシリコンI
I、白）1.0ｇに加え、微細な乳濁液が形成されるまで混
合した。このシリコン−指示薬乳濁液を定量分配注射器
に入れ、0.1-0.2 mlをガラス瓶の底部に滴下すると、乳
濁液は、ガラス瓶の底部に均等に分布した。指示薬−シ
リコン乳濁液センサーを、５０％未満の相対湿度の大気
中で、室温下、最低２４時間をかけて硬化させた。硬化
後、ＣＯ２センサー付きの瓶を、微生物増殖用培地で満
たし、オートクレーブにて滅菌した。
ーの調製 25−75％グリセロールを含む0.0005−0.5N NaOHに溶解
した、 0.1−1.0％フェノールフタレイン、キシレノー
ルブルー、またはブロモチモールブルーの保存液を調製
した。指示薬−NaOH−グリセロール保存液の 0.1−0.5m
lを、未硬化のＲＴＶホワイトシリコン（GEシリコンI
I、白）1.0ｇに加え、微細な乳濁液が形成されるまで混
合した。このシリコン−指示薬乳濁液を定量分配注射器
に入れ、0.1-0.2 mlをガラス瓶の底部に滴下すると、乳
濁液は、ガラス瓶の底部に均等に分布した。指示薬−シ
リコン乳濁液センサーを、５０％未満の相対湿度の大気
中で、室温下、最低２４時間をかけて硬化させた。硬化
後、ＣＯ２センサー付きの瓶を、微生物増殖用培地で満
たし、オートクレーブにて滅菌した。
【００２８】Ｂ．微生物汚染自動検出装置 微生物増殖によって生じるｐＨ変化およびＣＯ２産生の
いずれもが、１９８９年５月１５日出願の、アメリカ国
特許出願第07/322,874号，第07/168,291号，第07/351,4
76号に記載の機器を用いて、検出・測定できる。
いずれもが、１９８９年５月１５日出願の、アメリカ国
特許出願第07/322,874号，第07/168,291号，第07/351,4
76号に記載の機器を用いて、検出・測定できる。
【００２９】この機器によって監視されるセンサーは、
増殖する、すなわち代謝を営む微生物がいると色を変化
させる指示薬を含んでいる。呈色変化は肉眼でも明らか
であるかも知れないけれども、この機器を使用すること
は、客観性、感度、測定の連続性という利点を与える。
好ましい実施態様では、この機器は、実際にはセンサー
の呈色変化をモニターする可視光の反射率計となる。す
べてのサンプルの連続監視を可能にするためには、各サ
ンプルに対し１個の検出器を当てることが好ましい。こ
れに代わる他の方法については、当業者にとって自明で
あろう。その中には、例えば、検体容器を１個以上の静
止検出器の前を通過させたり、あるいは１個以上の検出
器を、静止検体の前を通過させるという、従来の手法の
実施などがある。
増殖する、すなわち代謝を営む微生物がいると色を変化
させる指示薬を含んでいる。呈色変化は肉眼でも明らか
であるかも知れないけれども、この機器を使用すること
は、客観性、感度、測定の連続性という利点を与える。
好ましい実施態様では、この機器は、実際にはセンサー
の呈色変化をモニターする可視光の反射率計となる。す
べてのサンプルの連続監視を可能にするためには、各サ
ンプルに対し１個の検出器を当てることが好ましい。こ
れに代わる他の方法については、当業者にとって自明で
あろう。その中には、例えば、検体容器を１個以上の静
止検出器の前を通過させたり、あるいは１個以上の検出
器を、静止検体の前を通過させるという、従来の手法の
実施などがある。
【００３０】好ましい実施態様では、固体状態の照明器
と検出器を使用する。照明としての白熱灯やアーク灯光
源を、ミラー、レンズ、光ファイバー、その他光をセン
サーに向けるための手段と組み合わせて使用することも
できる。
と検出器を使用する。照明としての白熱灯やアーク灯光
源を、ミラー、レンズ、光ファイバー、その他光をセン
サーに向けるための手段と組み合わせて使用することも
できる。
【００３１】Ｃ．培養培地の処方 前記実施例３に記載した機器を用いて、ｐＨの変化で微
生物を検出する場合に用いられる培地は、３％トリプシ
ン処理大豆ブロス（DIFCO）,0.5％プロテオース・ペプ
トン（Proteose Peptone）(DIFCO) #3,1.25% Ｄ−グル
コース、1% Ｌ−アルギニン、0.01% Ｌ−システイン、
および抗凝固剤（0.05％ポリスルホン酸ナトリウム(SP
S)）から成る。この培地の緩衝能は低いので、ｐＨに作
用する代謝産物はどんなものでも簡単にその液体培地の
ｐＨを変化させることになる。グルコースは発酵可能な
炭水化物であり、微生物によって代謝されると、有機酸
を産生することになり、これがｐＨの減少を招く。アル
ギニンは、通常、グルコースを代謝しない非発酵性微生
物（すなわち、Pseudomonas aeruginosa）用のマトリッ
クスとして加える。アルギニン添加により基礎代謝産物
が放出されることになり、これが培地ｐＨの増加を招
く。もしPseudomonas aeruginosaによるＣＯ２産生を測
定するつもりならば、アルギニンは含めない。培地に他
の炭水化物またはアミノ酸を取り込むことによって、他
の微生物種によって代謝された場合、ｐＨ変化を起こす
ことができるようにしてもよい。
生物を検出する場合に用いられる培地は、３％トリプシ
ン処理大豆ブロス（DIFCO）,0.5％プロテオース・ペプ
トン（Proteose Peptone）(DIFCO) #3,1.25% Ｄ−グル
コース、1% Ｌ−アルギニン、0.01% Ｌ−システイン、
および抗凝固剤（0.05％ポリスルホン酸ナトリウム(SP
S)）から成る。この培地の緩衝能は低いので、ｐＨに作
用する代謝産物はどんなものでも簡単にその液体培地の
ｐＨを変化させることになる。グルコースは発酵可能な
炭水化物であり、微生物によって代謝されると、有機酸
を産生することになり、これがｐＨの減少を招く。アル
ギニンは、通常、グルコースを代謝しない非発酵性微生
物（すなわち、Pseudomonas aeruginosa）用のマトリッ
クスとして加える。アルギニン添加により基礎代謝産物
が放出されることになり、これが培地ｐＨの増加を招
く。もしPseudomonas aeruginosaによるＣＯ２産生を測
定するつもりならば、アルギニンは含めない。培地に他
の炭水化物またはアミノ酸を取り込むことによって、他
の微生物種によって代謝された場合、ｐＨ変化を起こす
ことができるようにしてもよい。
【００３２】Ｄ．接種培養を用いるテスト 上記３Ａに記載したような瓶を、前記３Ｂの培地３０ml
で満たし、オートクレーブにより滅菌した。各瓶に、第
１表に掲げる微生物の一種を接種した。瓶を前記の機器
に設置し、３５℃で２４〜４８時間接種した。センサー
に変化が認められた場合、瓶は微生物を含むものとして
記録された。
で満たし、オートクレーブにより滅菌した。各瓶に、第
１表に掲げる微生物の一種を接種した。瓶を前記の機器
に設置し、３５℃で２４〜４８時間接種した。センサー
に変化が認められた場合、瓶は微生物を含むものとして
記録された。
【００３３】第１表に挙げた微生物は、前記のように本
発明を用いることによって検出されたものである。
発明を用いることによって検出されたものである。
【００３４】 第 １ 表 接種培養において検出された微生物 腸内細菌科 非発酵菌 Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Enterobacter cloacae Pseudomonas putrifaciens Citrobacter freundi Xanthomonas maitophilia Klebsiella pneumoniae Acinerobacter sp. Providencia rettgeri Eikenella corrodens Proteus mirabilis Moraxella sp. Salmonella Ｂ群 Achromobacter ＶＤ群 Serratia marcesans 嫌気性菌 Yersinia enterocolitica Bacteroides fragilis ブドウ状球菌属 Bacteroides melaninogenicus コアグラーゼ陰性ブドウ球菌 Bacteroides asaccharolyticus S. aureus Clostridium perfringens 連鎖球菌属 Fusobacterium necrophorum S. pneumoniae Veillonella parvula Ａ群 Peptostreptococcus anaerobius Ｂ群 Peptococcus magnus Ｃ群 Peptococcus asaccharolyticus Ｄ群−非腸球菌種 Bacteroides ovatus 腸球菌種 Eubacterium limosum Viridans 群連鎖球菌種 Eubacterium alactolyticum 連鎖球菌栄養変異種 他の微生物 イースト Haemophilus influenzae Candida albicans Haemophilus parainfluenzae Cryptococcus neoformans Neisseria meningitidis Rhodotorula rubra Vibrio parahemoliticus Torulopsis glabrata Neisseria gonorrhoeae Branhamella catarrhalis Aeromonas hydrophilia Listeria monocytogenes Gardnerella vaginalis Campylobacter jejuni これらの結果から、前記微生物、同種の他の微生物、お
よび検出可能な気体を産生したり、液体培地のｐＨに影
響を及ぼす微生物のいずれについても、本発明を用いて
検出することが可能である。
よび検出可能な気体を産生したり、液体培地のｐＨに影
響を及ぼす微生物のいずれについても、本発明を用いて
検出することが可能である。
【００３５】純粋培養物を含む検体がテストするサンプ
ルとしてはもっとも好ましいものであるが、他にも、例
えば被感染体液、固体を液化したもの、固体のすすぎ液
等の単一の優先生物を含む検体や、食品加工工場、製造
現場、食肉包装工場、湖、河川等に見られる汚濁液につ
いても、接種物として用いることができる。特に、血液
培養瓶から得た血液は、直接、あらかじめ調製したマイ
クロタイターウェルに接種すれば、その結果を通常４〜
６時間以内に読みとることができる。もっとも、ある種
の微生物については、センサーに呈色変化をもたらすの
に最大２４時間を要することもあるけれども。したがっ
て、陽性検体の微生物は、適切に調製したマイクロタイ
ターウェルに、例えば血液培養瓶からの陽性培養物を直
接接種し、特徴的な増殖パターンが現われるまでインキ
ュベートすることによって同定することができる。
ルとしてはもっとも好ましいものであるが、他にも、例
えば被感染体液、固体を液化したもの、固体のすすぎ液
等の単一の優先生物を含む検体や、食品加工工場、製造
現場、食肉包装工場、湖、河川等に見られる汚濁液につ
いても、接種物として用いることができる。特に、血液
培養瓶から得た血液は、直接、あらかじめ調製したマイ
クロタイターウェルに接種すれば、その結果を通常４〜
６時間以内に読みとることができる。もっとも、ある種
の微生物については、センサーに呈色変化をもたらすの
に最大２４時間を要することもあるけれども。したがっ
て、陽性検体の微生物は、適切に調製したマイクロタイ
ターウェルに、例えば血液培養瓶からの陽性培養物を直
接接種し、特徴的な増殖パターンが現われるまでインキ
ュベートすることによって同定することができる。
【００３６】実施例４ 非蛍光性乳濁指示薬センサーの
調製 このセンサーは、ｐＨ４〜１０にわたって色を変化させ
る、イーストマン・コダックのユニバーサル指示薬液を
含む。
調製 このセンサーは、ｐＨ４〜１０にわたって色を変化させ
る、イーストマン・コダックのユニバーサル指示薬液を
含む。
【００３７】Ａ．ユニバーサル指示薬の調製 イーストマン・コダック社（Rochester ，ニューヨー
ク）から入手した、イソプロパノールに溶解したユニバ
ーサル指示薬液５０mlを、回転式エバポレーターを用
い、減圧下で、４０℃に加熱して蒸発乾固させた。この
溶液を、ＨＰＬＣ用イソプロパノール４mlに再度溶解し
た。この濃厚なユニバーサル指示薬２mlに、10N NaOH
１０μl を加えた。
ク）から入手した、イソプロパノールに溶解したユニバ
ーサル指示薬液５０mlを、回転式エバポレーターを用
い、減圧下で、４０℃に加熱して蒸発乾固させた。この
溶液を、ＨＰＬＣ用イソプロパノール４mlに再度溶解し
た。この濃厚なユニバーサル指示薬２mlに、10N NaOH
１０μl を加えた。
【００３８】Ｂ．シリコン乳濁液の調製 ＧＥシリコンRTV 615成分Ａ（ゼネラル・エレクトリッ
ク・カンパニー、Waterford,ニューヨーク）１０ｇをガ
ラス瓶に分取した。ユニバーサル指示薬／NaOH溶液２m
l，グリセロール１ｇおよびホワイトシリコン色素０．
３ｇを、シリコン成分Ａに加えた。４成分を、テフロン
棒で静かに撹拌して、混合した。材料を十分に混合した
後、ＧＥシリコンRTV 615成分Ｂ１ｇを乳濁液に加え
た。この乳濁液を、前と同様、手動撹拌により静かに混
合した。この乳濁液を真空デシケーター中で約５分間脱
気した。次に、この乳濁液を、「エアー・ブラシ」噴霧
機に装着した加圧式定量分配注射器に移した。シリコン
乳濁センサーを、あらかじめＧＥシリコン・プライマー
SS 4120でコートした９６ウェルポリスチレンマイクロ
タイタープレート中に噴霧した。
ク・カンパニー、Waterford,ニューヨーク）１０ｇをガ
ラス瓶に分取した。ユニバーサル指示薬／NaOH溶液２m
l，グリセロール１ｇおよびホワイトシリコン色素０．
３ｇを、シリコン成分Ａに加えた。４成分を、テフロン
棒で静かに撹拌して、混合した。材料を十分に混合した
後、ＧＥシリコンRTV 615成分Ｂ１ｇを乳濁液に加え
た。この乳濁液を、前と同様、手動撹拌により静かに混
合した。この乳濁液を真空デシケーター中で約５分間脱
気した。次に、この乳濁液を、「エアー・ブラシ」噴霧
機に装着した加圧式定量分配注射器に移した。シリコン
乳濁センサーを、あらかじめＧＥシリコン・プライマー
SS 4120でコートした９６ウェルポリスチレンマイクロ
タイタープレート中に噴霧した。
【００３９】実施例４は、ｐＨ指示薬としてユニバーサ
ル指示薬を用いたけれども、他の指示薬、例えば第２表
に挙げた、Dawsonら（Data for Biochemical Research,
2ndedition, p.623, Clarendon Press, Oxford, 196
9）から引用したものも採用することができる。
ル指示薬を用いたけれども、他の指示薬、例えば第２表
に挙げた、Dawsonら（Data for Biochemical Research,
2ndedition, p.623, Clarendon Press, Oxford, 196
9）から引用したものも採用することができる。
【００４０】
【表１】
【００４１】ｐＨ指示薬を含むセンサーを用いて検出で
きるＣＯ２やＮＨ３は別にして、他の代謝性気体産物は
それら産物に特定の指示薬を用いて監視することができ
る。例えば、ニトロプルシドナトリウムを指示薬として
含む本発明のセンサーを硫化水素の検出に用いることが
できる。
きるＣＯ２やＮＨ３は別にして、他の代謝性気体産物は
それら産物に特定の指示薬を用いて監視することができ
る。例えば、ニトロプルシドナトリウムを指示薬として
含む本発明のセンサーを硫化水素の検出に用いることが
できる。
【００４２】実施例５ ＣＯ２ 産生の検出による微生
物の同定 実施例４で調製した乳濁センサーの薄層を３層、あらか
じめ準備した非滅菌マイクロタイタープレート上に噴霧
する。各層は次の層をかぶせる前に乾燥させる。このセ
ンサーの最後の層を乾燥させた後、２００μｌの培地を
このマイクロタイタープレートの各ウェルに入れる。サ
ンプルおよび陰性コントロールに使用した培地は、組成
の明確な、栄養制限を加えた培地であって、２３個のマ
イクロタイターウェルの各々に対して異なる炭素源を含
んでいる。陰性コントロール・ウェルは炭素源を含んで
いない。陽性コントロール・ウェルは、組成の不明確
な、富裕培地を含んでいる。次ぎに、各ウェルに、検体
を、ウェル当りほぼ１０６微生物数の割で接種する。こ
のマイクロタイタープレートを、各ウェルがそれぞれ独
立に密封されるように、密封し、３５℃で最大６時間イ
ンキュベートする。このマイクロタイタープレートを、
インキュベーション後１時間から、１時間おきに、呈色
変化がないかどうかチェックする。陰性コントロールと
陽性コントロールの間に約４０％の差が認められたら、
プレートの読み取りを行なってよい。各ウェルに見られ
る呈色変化は、特定の炭素源消費に関する全体パターン
を形成するが、これを微生物の同定に用いる。
物の同定 実施例４で調製した乳濁センサーの薄層を３層、あらか
じめ準備した非滅菌マイクロタイタープレート上に噴霧
する。各層は次の層をかぶせる前に乾燥させる。このセ
ンサーの最後の層を乾燥させた後、２００μｌの培地を
このマイクロタイタープレートの各ウェルに入れる。サ
ンプルおよび陰性コントロールに使用した培地は、組成
の明確な、栄養制限を加えた培地であって、２３個のマ
イクロタイターウェルの各々に対して異なる炭素源を含
んでいる。陰性コントロール・ウェルは炭素源を含んで
いない。陽性コントロール・ウェルは、組成の不明確
な、富裕培地を含んでいる。次ぎに、各ウェルに、検体
を、ウェル当りほぼ１０６微生物数の割で接種する。こ
のマイクロタイタープレートを、各ウェルがそれぞれ独
立に密封されるように、密封し、３５℃で最大６時間イ
ンキュベートする。このマイクロタイタープレートを、
インキュベーション後１時間から、１時間おきに、呈色
変化がないかどうかチェックする。陰性コントロールと
陽性コントロールの間に約４０％の差が認められたら、
プレートの読み取りを行なってよい。各ウェルに見られ
る呈色変化は、特定の炭素源消費に関する全体パターン
を形成するが、これを微生物の同定に用いる。
【００４３】実施例６ マイクロタイタープレート中の
炭素源による、微生物の区別 Ａ．二酸化炭素センサー・プレートの調製 ５０mlのコダック・ユニバーサル指示薬を蒸発乾固さ
せ、２mlの HPLC 級イソプロパノールに再懸濁した。２
mlの水に溶解した２４０ｍｇのフェノールフタレイン、
ナトリウム塩を、この濃厚なユニバーサル指示薬液１ml
に加えた。CAPSバッファー（3-(cyclohexlamino)-1-pro
panesulfonic acid）、pH 10.4、500 mMのもの150μｌ
を、このフェノールフタレイン／ユニバーサル指示薬液
と混合した。この溶液を、あらかじめ約１５分間脱気し
た、１０ｇの GE RTV 615Aシリコンに加えた。シリコン
と指示薬の乳濁液を手動撹拌で混合した。0.1ｇのホワ
イトシリコン色素と、２ｇの GE RTV 615 Bをこの混合
物に加えた。この混合物を手動混合し、約５分間脱気し
た。この乳濁液を「エアーブラッシ」噴霧器に装着した
加圧式定量分配注射器に移し、あらかじめＧＥシリコン
・プライマーSS 4120のコートを２層噴霧して形成した
ポリスチレン製２４ウェル・プレートに噴霧した。指示
薬／シリコン乳濁液の十分量をウェルに噴霧し、その底
面にコートした。次ぎに、このプレートを加湿したオー
ブンに移し、５０℃で一晩硬化した。この噴霧過程を、
３日連続で繰り返し、ウェルに対して、合計３層のコー
ティングを施した。
炭素源による、微生物の区別 Ａ．二酸化炭素センサー・プレートの調製 ５０mlのコダック・ユニバーサル指示薬を蒸発乾固さ
せ、２mlの HPLC 級イソプロパノールに再懸濁した。２
mlの水に溶解した２４０ｍｇのフェノールフタレイン、
ナトリウム塩を、この濃厚なユニバーサル指示薬液１ml
に加えた。CAPSバッファー（3-(cyclohexlamino)-1-pro
panesulfonic acid）、pH 10.4、500 mMのもの150μｌ
を、このフェノールフタレイン／ユニバーサル指示薬液
と混合した。この溶液を、あらかじめ約１５分間脱気し
た、１０ｇの GE RTV 615Aシリコンに加えた。シリコン
と指示薬の乳濁液を手動撹拌で混合した。0.1ｇのホワ
イトシリコン色素と、２ｇの GE RTV 615 Bをこの混合
物に加えた。この混合物を手動混合し、約５分間脱気し
た。この乳濁液を「エアーブラッシ」噴霧器に装着した
加圧式定量分配注射器に移し、あらかじめＧＥシリコン
・プライマーSS 4120のコートを２層噴霧して形成した
ポリスチレン製２４ウェル・プレートに噴霧した。指示
薬／シリコン乳濁液の十分量をウェルに噴霧し、その底
面にコートした。次ぎに、このプレートを加湿したオー
ブンに移し、５０℃で一晩硬化した。この噴霧過程を、
３日連続で繰り返し、ウェルに対して、合計３層のコー
ティングを施した。
【００４４】Ｂ．テ ス ト 法 ２種の微生物、Escherichia coli（ATCC番号11775）とP
seudomonas aeruginosa（ATCC 番号1014）の両菌株
を、実施例３Ｃで記載した複合培地中で、振盪しなが
ら、３７℃で、一晩（１７時間）増殖させた。この微生
物を、11950-X-gで、４℃、２０分間遠心し、採取し
た。上清を捨て、微生物を 0.9％滅菌生食液中に、ＯＤ
６６０＝5.0になるまで再懸濁した。
seudomonas aeruginosa（ATCC 番号1014）の両菌株
を、実施例３Ｃで記載した複合培地中で、振盪しなが
ら、３７℃で、一晩（１７時間）増殖させた。この微生
物を、11950-X-gで、４℃、２０分間遠心し、採取し
た。上清を捨て、微生物を 0.9％滅菌生食液中に、ＯＤ
６６０＝5.0になるまで再懸濁した。
【００４５】あらかじめ調製したマイクロタイタープレ
ートの各ウェルには、下記の３種の培地の内１つが１ml
含まれた。 ａ）50mM Hepes緩衝液、pH 7.2で緩衝させた最少培地で
あって、炭素源を含まないもの（陰性コントロール）。 ｂ）陰性コントロールと同一培地、ただし、これは0.5
％ブロモコハク酸を含む。 ｃ）組成不明の、トリプチカーゼ・ソイ・イースト（Tr
ypticase soy yeast）抽出物培地であって、50mM Hepe
s, pH 7.2で緩衝させたもの（陽性コントロール）。
ートの各ウェルには、下記の３種の培地の内１つが１ml
含まれた。 ａ）50mM Hepes緩衝液、pH 7.2で緩衝させた最少培地で
あって、炭素源を含まないもの（陰性コントロール）。 ｂ）陰性コントロールと同一培地、ただし、これは0.5
％ブロモコハク酸を含む。 ｃ）組成不明の、トリプチカーゼ・ソイ・イースト（Tr
ypticase soy yeast）抽出物培地であって、50mM Hepe
s, pH 7.2で緩衝させたもの（陽性コントロール）。
【００４６】調製した微生物の各々についてその２０μ
ｌを、それぞれの種類の培地を含む２重ウェルに加え
た。
ｌを、それぞれの種類の培地を含む２重ウェルに加え
た。
【００４７】ウェルをコルク栓で密封し、プレートを３
７℃でインキュベートした。プレート底部のセンサーに
現われた呈色変化は、６時間にわたって、肉眼で監視し
た。約４時間後、２個の異なるパターンを認めることが
できた。各微生物に対する陰性コントロールは、呈色変
化を示さなかった（ウェルは紫色のままであった）。E.
coli に対する陽性コントロール・ウェルは、紫から
緑、黄、橙へと変化した。これは、センサーのｐＨが１
０から約６まで変化したことを示している。P. aerugin
osaに対する陽性コントロール・ウェルは、紫から、
緑、黄へと変化した（センサーのｐＨが１０から約７へ
と変化したことを示す）。ブロモコハク酸培地入りのウ
ェルにおいて、この２種の微生物間で、もっとも明確な
差が認められた。これは、この炭素源を用いると、この
２種の微生物に、増殖能力、ＣＯ２産生能力に差が現わ
れることと関連している。ブロモコハク酸は、P. aerug
inosaにとっては好ましい炭素源であるが、E. coli は
この炭素源をほんの僅か利用してＣＯ２を産生すること
ができる。４時間にわたってインキュベーションする
と、ブロモコハク酸とE. coli を含むウェルの呈色変化
は紫から緑に変わるが、これは、センサーのｐＨが１０
から８．５に変化したことを示す。ブロモコハク酸とP.
aeruginosa を含むウェルの色は、４時間で、紫から、
緑、黄、オレンジへと変化した。この呈色変化は、１０
から約６へのｐＨ変化を示している。
７℃でインキュベートした。プレート底部のセンサーに
現われた呈色変化は、６時間にわたって、肉眼で監視し
た。約４時間後、２個の異なるパターンを認めることが
できた。各微生物に対する陰性コントロールは、呈色変
化を示さなかった（ウェルは紫色のままであった）。E.
coli に対する陽性コントロール・ウェルは、紫から
緑、黄、橙へと変化した。これは、センサーのｐＨが１
０から約６まで変化したことを示している。P. aerugin
osaに対する陽性コントロール・ウェルは、紫から、
緑、黄へと変化した（センサーのｐＨが１０から約７へ
と変化したことを示す）。ブロモコハク酸培地入りのウ
ェルにおいて、この２種の微生物間で、もっとも明確な
差が認められた。これは、この炭素源を用いると、この
２種の微生物に、増殖能力、ＣＯ２産生能力に差が現わ
れることと関連している。ブロモコハク酸は、P. aerug
inosaにとっては好ましい炭素源であるが、E. coli は
この炭素源をほんの僅か利用してＣＯ２を産生すること
ができる。４時間にわたってインキュベーションする
と、ブロモコハク酸とE. coli を含むウェルの呈色変化
は紫から緑に変わるが、これは、センサーのｐＨが１０
から８．５に変化したことを示す。ブロモコハク酸とP.
aeruginosa を含むウェルの色は、４時間で、紫から、
緑、黄、オレンジへと変化した。この呈色変化は、１０
から約６へのｐＨ変化を示している。
【００４８】したがって、これらセンサーを用いて、ブ
ロモコハク酸を炭素源として利用する能力に基づいて、
E. coli とP. aeruginosa の２種を区別することができ
た。
ロモコハク酸を炭素源として利用する能力に基づいて、
E. coli とP. aeruginosa の２種を区別することができ
た。
【００４９】増殖抑制に基づく微生物の同定 前記ＣＯ２センサーを用いた微生物同定は、増殖抑制の
原理に基づいても実施できる。このシステムは、古典的
な、生化学的な特定システムとは異なる。なぜなら、こ
の場合、同定は、静菌剤（inhibitory agents）、例え
ば、染料、抗生物質およびその他の物質による選択的増
殖抑制に基づいているからである。ここでも、ＣＯ２産
生が増殖の尺度となる。これら静菌剤の存在下に生じる
増殖パターンに基づいて、テスト微生物の種が同定され
る。増殖量を、静菌剤を含まない増殖コントロール・ウ
ェルと比較する。１群の静菌剤から得られた結果に基づ
き、２段階の二次判別分析法（two-stage quadratic di
scriminate analysis）を用いて、プロフィールが得ら
れる。
原理に基づいても実施できる。このシステムは、古典的
な、生化学的な特定システムとは異なる。なぜなら、こ
の場合、同定は、静菌剤（inhibitory agents）、例え
ば、染料、抗生物質およびその他の物質による選択的増
殖抑制に基づいているからである。ここでも、ＣＯ２産
生が増殖の尺度となる。これら静菌剤の存在下に生じる
増殖パターンに基づいて、テスト微生物の種が同定され
る。増殖量を、静菌剤を含まない増殖コントロール・ウ
ェルと比較する。１群の静菌剤から得られた結果に基づ
き、２段階の二次判別分析法（two-stage quadratic di
scriminate analysis）を用いて、プロフィールが得ら
れる。
【００５０】この同定システムは、結果が３−６時間で
得られる迅速な方法である。ここでも、このシステム
は、従来の方法と同様、寒天プレート上で増殖させた微
生物の純粋種についてテストすることができるが、ま
た、血液のような体液、または微生物集団を拡大するた
めに培養された体液を、直接、接種することもできる。
なぜなら、このシステムは妨害物質の作用を受けないか
らである。
得られる迅速な方法である。ここでも、このシステム
は、従来の方法と同様、寒天プレート上で増殖させた微
生物の純粋種についてテストすることができるが、ま
た、血液のような体液、または微生物集団を拡大するた
めに培養された体液を、直接、接種することもできる。
なぜなら、このシステムは妨害物質の作用を受けないか
らである。
【００５１】実施例６ シリコン乳濁ＣＯ２ センサー
による代表的微生物の抑制パターン 0.05％キシレノールブルー・シリコン乳濁センサーを含
むマイクロタイタープレート（９６個の平底ウェル）
を、静菌剤を含んでいない１００μｌの微生物増殖用培
地（増殖コントロールウェル）、並びに１８種の染料、
抗生物質およびその他の抑制物質を含む１００μlの微
生物増殖用培地で満たした。静菌剤の最終濃度は、代表
的な微生物の接種物（最終接種量は5×10７ CFU/mlであ
る）１００μｌを加えた後、得られた。静菌剤の濃度
は、株間の区別ができるパターンが得られるように、グ
ラム陰性菌株間に増殖量の差をもたらすようあらかじめ
決められた。
による代表的微生物の抑制パターン 0.05％キシレノールブルー・シリコン乳濁センサーを含
むマイクロタイタープレート（９６個の平底ウェル）
を、静菌剤を含んでいない１００μｌの微生物増殖用培
地（増殖コントロールウェル）、並びに１８種の染料、
抗生物質およびその他の抑制物質を含む１００μlの微
生物増殖用培地で満たした。静菌剤の最終濃度は、代表
的な微生物の接種物（最終接種量は5×10７ CFU/mlであ
る）１００μｌを加えた後、得られた。静菌剤の濃度
は、株間の区別ができるパターンが得られるように、グ
ラム陰性菌株間に増殖量の差をもたらすようあらかじめ
決められた。
【００５２】マイクロタイタートレーに接種した後、こ
れを、圧感受性プラスチック・プレート密封器で密封
し、最初の読み取りを反射率読み取り器で行なった。次
に、プレートを３７℃のインキュベーターに移した。４
時間インキュベーションした後、プレートを取り出し、
最後の反射率読み取りを行なった。
れを、圧感受性プラスチック・プレート密封器で密封
し、最初の読み取りを反射率読み取り器で行なった。次
に、プレートを３７℃のインキュベーターに移した。４
時間インキュベーションした後、プレートを取り出し、
最後の反射率読み取りを行なった。
【００５３】第３表の結果は、１８種の静菌剤を用いた
場合の、４種のテスト細菌の、増殖、非増殖、中程度の
増殖のパターンを示す。抑制のパターンは、テストした
微生物株の各々について明らかに異なっており、したが
ってその微生物を他の菌種から区別することができる。
場合の、４種のテスト細菌の、増殖、非増殖、中程度の
増殖のパターンを示す。抑制のパターンは、テストした
微生物株の各々について明らかに異なっており、したが
ってその微生物を他の菌種から区別することができる。
【００５４】
【表２】
【００５５】既に述べたように、微生物テストのための
既存の技術は、テスト微生物の増殖によって生ずる濁度
を視覚的にもしくは分光学的に測定すること、または、
蛍光物質の消費による増殖測定に基づいている。本発明
のポリマー乳濁ＣＯ２センサーは、増殖を、テスト微生
物が産生するＣＯ２の量によって測定する。
既存の技術は、テスト微生物の増殖によって生ずる濁度
を視覚的にもしくは分光学的に測定すること、または、
蛍光物質の消費による増殖測定に基づいている。本発明
のポリマー乳濁ＣＯ２センサーは、増殖を、テスト微生
物が産生するＣＯ２の量によって測定する。
【００５６】抗生物質感受性 本発明者らのＣＯ２センサー技術は、３種の抗生物質感
受性測定法に用いることができる。最初の方法は、テス
ト微生物に対する抗生物質の最小抑制濃度（ＭＩＣ）を
定量する古典的方法である。選んだ抗生物質を、全身治
療範囲（systemic therapeutic range）に及ぶ濃度で、
連続的に２倍希釈したものを、増殖用培地とＣＯ２セン
サーを含むマイクロタイターウェル中で調製する。ウェ
ルに約10 ５ CFU/mlのテスト微生物を接種し、ウェルを
密封する。このプレートを３７℃で２４時間インキュベ
ートする。インキュベーション後、特定の抗生物質の最
小抑制濃度を決めるわけであるが、それは、肉眼または
反射率を測定して定量した場合、センサーに変化の見ら
れない、すなわちＣＯ２産生を示さず、従ってテスト微
生物の増殖を示さない、最大希釈のウェルである。
受性測定法に用いることができる。最初の方法は、テス
ト微生物に対する抗生物質の最小抑制濃度（ＭＩＣ）を
定量する古典的方法である。選んだ抗生物質を、全身治
療範囲（systemic therapeutic range）に及ぶ濃度で、
連続的に２倍希釈したものを、増殖用培地とＣＯ２セン
サーを含むマイクロタイターウェル中で調製する。ウェ
ルに約10 ５ CFU/mlのテスト微生物を接種し、ウェルを
密封する。このプレートを３７℃で２４時間インキュベ
ートする。インキュベーション後、特定の抗生物質の最
小抑制濃度を決めるわけであるが、それは、肉眼または
反射率を測定して定量した場合、センサーに変化の見ら
れない、すなわちＣＯ２産生を示さず、従ってテスト微
生物の増殖を示さない、最大希釈のウェルである。
【００５７】第２の方法は、ＭＩＣの迅速定量法であっ
て、これは、有用な全身治療範囲に及ぶ、２つのあらか
じめ定めた抗生物質濃度と、増殖コントロール・ウェル
とを用いる。これらのウェルに、約10６−10７ CFU/ml
のテスト微生物を接種し、密封し、３７℃で３−６時間
インキュベートする。インキュベーション時に、反射率
計を用いて、連続的に、定期的に、または、最初と最後
に読み取りを行なって、ＣＯ２センサーを監視する。あ
る特定の微生物に対する抗生物質の最小抑制濃度は、Ｃ
Ｏ２産生の速度、加速度または全量から決まる値を回帰
分析することによって求めることができる。
て、これは、有用な全身治療範囲に及ぶ、２つのあらか
じめ定めた抗生物質濃度と、増殖コントロール・ウェル
とを用いる。これらのウェルに、約10６−10７ CFU/ml
のテスト微生物を接種し、密封し、３７℃で３−６時間
インキュベートする。インキュベーション時に、反射率
計を用いて、連続的に、定期的に、または、最初と最後
に読み取りを行なって、ＣＯ２センサーを監視する。あ
る特定の微生物に対する抗生物質の最小抑制濃度は、Ｃ
Ｏ２産生の速度、加速度または全量から決まる値を回帰
分析することによって求めることができる。
【００５８】感受性テストに関する第３の方法も、３−
６時間のインキュベーションを要する迅速方法である。
しかしながら、この方法は、増殖用培地に溶解した単一
の濃度の抗生物質を用いる。増殖コントロールを含み、
かつ、約10５−10７CFU/mlのテスト微生物の接種物が必
要である。センサーを通じてＣＯ２産生が監視され、あ
らかじめ定められた基準と比較することによって、テス
ト微生物が特定の抗生物質に対して感受性を有するか、
中程度の感受性を有するか、または耐性であるかが分か
る。
６時間のインキュベーションを要する迅速方法である。
しかしながら、この方法は、増殖用培地に溶解した単一
の濃度の抗生物質を用いる。増殖コントロールを含み、
かつ、約10５−10７CFU/mlのテスト微生物の接種物が必
要である。センサーを通じてＣＯ２産生が監視され、あ
らかじめ定められた基準と比較することによって、テス
ト微生物が特定の抗生物質に対して感受性を有するか、
中程度の感受性を有するか、または耐性であるかが分か
る。
【００５９】患者検体から標準的微生物学的手法を用い
て分離した微生物の純粋株を、このＣＯ２センサー・シ
ステムに使用してもよい。しかしながら、この発明の与
える大きな利点は、微生物を分離する手間をかけること
なく、患者の検体や血液培養物を直接接種することが可
能であるということであって、これは、このシステムに
よる増殖検出が、血液や他の体液中に見られるような干
渉性物質の影響を受けないからである。患者からの、血
液や他の体液検体は、まず、インキュベーションして培
養し、微生物集団を拡大する。この検体を、培養した
後、直接接種に使用してもよい。
て分離した微生物の純粋株を、このＣＯ２センサー・シ
ステムに使用してもよい。しかしながら、この発明の与
える大きな利点は、微生物を分離する手間をかけること
なく、患者の検体や血液培養物を直接接種することが可
能であるということであって、これは、このシステムに
よる増殖検出が、血液や他の体液中に見られるような干
渉性物質の影響を受けないからである。患者からの、血
液や他の体液検体は、まず、インキュベーションして培
養し、微生物集団を拡大する。この検体を、培養した
後、直接接種に使用してもよい。
【００６０】実施例７ シリコン乳濁ＣＯ２センサーに
よる代表的微生物の抗生物質感受性パターン 底部に0.05％キシレノールブルー・シリコン乳濁センサ
ーを含むマイクロタイタープレート（９６個の平底ウェ
ル）を、抗生物質を含まない（増殖コントロール・ウェ
ル）、または９種類の異なる抗生物質を含む、１００μ
ｌの微生物増殖用培地で満たした。抗生物質の最終濃度
は、１００μｌの、代表的な微生物の接種物（5×10７
CFU/mlの最終接種量）添加後に得られた。用いた抗生物
質の濃度は、テスト微生物が特定の抗生物質に対して感
受性が高い、中間、抵抗性を持つ、のいずれであるかを
決めるのに用いられたものであることを表わす。
よる代表的微生物の抗生物質感受性パターン 底部に0.05％キシレノールブルー・シリコン乳濁センサ
ーを含むマイクロタイタープレート（９６個の平底ウェ
ル）を、抗生物質を含まない（増殖コントロール・ウェ
ル）、または９種類の異なる抗生物質を含む、１００μ
ｌの微生物増殖用培地で満たした。抗生物質の最終濃度
は、１００μｌの、代表的な微生物の接種物（5×10７
CFU/mlの最終接種量）添加後に得られた。用いた抗生物
質の濃度は、テスト微生物が特定の抗生物質に対して感
受性が高い、中間、抵抗性を持つ、のいずれであるかを
決めるのに用いられたものであることを表わす。
【００６１】マイクロタイタートレーに接種した後、圧
感受性プラスチック・プレート密封器によって密封し、
最初の読み取りは反射率読み取り器によって行なった。
次に、プレートを３７℃のインキュベーターに移した。
４時間のインキュベーション後、プレートを取り出し、
最後の反射率の読み取りを行なった。
感受性プラスチック・プレート密封器によって密封し、
最初の読み取りは反射率読み取り器によって行なった。
次に、プレートを３７℃のインキュベーターに移した。
４時間のインキュベーション後、プレートを取り出し、
最後の反射率の読み取りを行なった。
【００６２】第４表の結果は、４種のテスト微生物の、
９種類の抗生物質に対する、増殖、非増殖、中程度の増
殖のパターンを示す。これは、これらの微生物の、抗生
物質に対する感受性のパターンを表わす。テストした微
生物は、その感受性パターンを異にしているが、これ
は、その生理学的な構造が異なるためである。
９種類の抗生物質に対する、増殖、非増殖、中程度の増
殖のパターンを示す。これは、これらの微生物の、抗生
物質に対する感受性のパターンを表わす。テストした微
生物は、その感受性パターンを異にしているが、これ
は、その生理学的な構造が異なるためである。
【００６３】
【表３】
【図１】この図は、装置の機能的部分全体の外観を示し
たもの、すなわち検出器集合体であり、容器（１）、セ
ンサー（２）、培養培地（３）、光源（４）、光検出器
（５）、および付属の電子機器であり、この中には電源
（６）、電流・電圧変換器（７）、低周波濾波器（８）
が含まれる。各検出器集合体はできれば、対向腔所に埋
め込んだ光ダイオードと１個以上のＬＥＤを次のように
並べたものが望ましい。すなわち、光は、監視面には当
たるが、検出器そのものには直接には当たらないように
なっていることが望ましい。この実施態様の電子回路
は、増幅器、検出器からの信号を調整するためのフィル
ター、入手可能な信号の中から適当なものを選び出すた
めの多重化装置、光源用の定電流電源を含む。動作時に
は、装置全体を、３７℃のインキュベーター内の振とう
機の上に置く。これは、微生物増殖に適する環境を提供
し、また、室内灯が光検出器に作用するのを排除するた
めである。
たもの、すなわち検出器集合体であり、容器（１）、セ
ンサー（２）、培養培地（３）、光源（４）、光検出器
（５）、および付属の電子機器であり、この中には電源
（６）、電流・電圧変換器（７）、低周波濾波器（８）
が含まれる。各検出器集合体はできれば、対向腔所に埋
め込んだ光ダイオードと１個以上のＬＥＤを次のように
並べたものが望ましい。すなわち、光は、監視面には当
たるが、検出器そのものには直接には当たらないように
なっていることが望ましい。この実施態様の電子回路
は、増幅器、検出器からの信号を調整するためのフィル
ター、入手可能な信号の中から適当なものを選び出すた
めの多重化装置、光源用の定電流電源を含む。動作時に
は、装置全体を、３７℃のインキュベーター内の振とう
機の上に置く。これは、微生物増殖に適する環境を提供
し、また、室内灯が光検出器に作用するのを排除するた
めである。
【図２】装置を、各種呈色瓶について主観的にテストす
る傍ら、ｐＨ感受性膜を持つ瓶によってテストした。こ
の図は、5.8から8.2までのｐＨ範囲にわたる各種バッフ
ァーでセンサーを平衡化させた後、７個の異なる検出器
から得られた電圧出力の平均値を示したものである。詳
しく調べてみると、このシステムは、ｐＨ6.0から7.5ま
で0.1ｐＨ単位の変化を確実に区別できることが分かっ
た。
る傍ら、ｐＨ感受性膜を持つ瓶によってテストした。こ
の図は、5.8から8.2までのｐＨ範囲にわたる各種バッフ
ァーでセンサーを平衡化させた後、７個の異なる検出器
から得られた電圧出力の平均値を示したものである。詳
しく調べてみると、このシステムは、ｐＨ6.0から7.5ま
で0.1ｐＨ単位の変化を確実に区別できることが分かっ
た。
【図３】この装置は、ｐＨ変化およびＣＯ２産生の両方
に基づいて微生物増殖を検出するのに用いられた。この
図は、細菌、E. coliの増殖によって生じたｐＨおよび
ＣＯ２の変化を示す。
に基づいて微生物増殖を検出するのに用いられた。この
図は、細菌、E. coliの増殖によって生じたｐＨおよび
ＣＯ２の変化を示す。
【図４】ほとんどすべての微生物が、代謝の過程におい
てＣＯ２ を放出する。したがって、このシステムはき
わめて広範囲の微生物の検出に用いることができる。こ
の図は、グラム陰性細菌E. coli，グラム陽性細菌S. py
ogenes，グラム陰性非発酵性細菌P. aeruginosa，嫌気
性細菌B. fragilis，酵母C. albicansの増殖中に形成さ
れるＣＯ２の検出を示したものである。単位は、測定開
始時のＣＯ２濃度に対する、培養液中のＣＯ２濃度の相
対値を表わす。サンプル容器と培養液は室温におき（約
２０℃）、測定中は、容器とサンプルは３７℃でインキ
ュベートしているので、ＣＯ２は、最初の２−４時間
は、液性サンプルと培養液直上の空間に放出される。こ
れは、液体中へのＣＯ２の溶解性が、温度が上昇するに
つれて、低下するためである。サンプルの注入と装置へ
の設置の前に、容器や培養液を高温に置かない限り、通
常最初の２−４時間以内に最小ＣＯ２濃度を通過するま
では、微生物存在を示す確かな測定値は得られない。
てＣＯ２ を放出する。したがって、このシステムはき
わめて広範囲の微生物の検出に用いることができる。こ
の図は、グラム陰性細菌E. coli，グラム陽性細菌S. py
ogenes，グラム陰性非発酵性細菌P. aeruginosa，嫌気
性細菌B. fragilis，酵母C. albicansの増殖中に形成さ
れるＣＯ２の検出を示したものである。単位は、測定開
始時のＣＯ２濃度に対する、培養液中のＣＯ２濃度の相
対値を表わす。サンプル容器と培養液は室温におき（約
２０℃）、測定中は、容器とサンプルは３７℃でインキ
ュベートしているので、ＣＯ２は、最初の２−４時間
は、液性サンプルと培養液直上の空間に放出される。こ
れは、液体中へのＣＯ２の溶解性が、温度が上昇するに
つれて、低下するためである。サンプルの注入と装置へ
の設置の前に、容器や培養液を高温に置かない限り、通
常最初の２−４時間以内に最小ＣＯ２濃度を通過するま
では、微生物存在を示す確かな測定値は得られない。
【図５】この図は、センサー（１）を、付属のカニュー
レ貫通手段（２）と共に示したもので、このカニューレ
は、栓（３）を貫通し、培養容器（４）内に挿入され
る。
レ貫通手段（２）と共に示したもので、このカニューレ
は、栓（３）を貫通し、培養容器（４）内に挿入され
る。
【図６】この図は、下記のものの断面図である。すなわ
ち、センサー（１）であって、それに通路（２）が付属
し、この通路は、２本のカニューレ貫通手段（３）を結
びつけている。これらの貫通手段は、気体やサンプルを
指示薬と広く接触させるためのもので、栓（４）を貫通
して、培養容器（５）内に挿入される。
ち、センサー（１）であって、それに通路（２）が付属
し、この通路は、２本のカニューレ貫通手段（３）を結
びつけている。これらの貫通手段は、気体やサンプルを
指示薬と広く接触させるためのもので、栓（４）を貫通
して、培養容器（５）内に挿入される。
【図７】この図は、下記のものの断面図である。すなわ
ち、センサー装置（１）であって、これは圧電変換片
（２）を密封手段の一部として組み込んでおり、この圧
電変換片は、圧変化が容器（３）の内部で生ずると、信
号を送り出す。
ち、センサー装置（１）であって、これは圧電変換片
（２）を密封手段の一部として組み込んでおり、この圧
電変換片は、圧変化が容器（３）の内部で生ずると、信
号を送り出す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 サーマン・クレイ・ソープ アメリカ合衆国、ノース・カロライナ・ 27704、ダラム、ミラン・ストリート、 1407 (72)発明者 ジエームズ・ローレンス・ダイグイセツ ピ・ジユニア アメリカ合衆国、ノース・カロライナ・ 27712、ダラム、レイジイ・リバー・4218 (72)発明者 マイケル・ジヨン・カランドラ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 08873、サマーセツト、デイケンズ・コー ト・187 (72)発明者 リチヤード・コーニリアス・ドリスコル アメリカ合衆国、ノース・カロライナ・ 27614、ローリイ、トリゴ・トレイル・ 10721 (72)発明者 カーメラ・スー・ムーデイ アメリカ合衆国、ノース・カロライナ・ 27565、オツクスフオード、カレツジ・ス トリート・419
Claims (2)
- 【請求項１】 検体中の生物学的活性を連続的に追跡す
る監視装置であって、密封可能な検体容器を含み、この
容器が、培養培地を用いて検体を培養できる内部室と、
圧電変換装置を含む変形可能な密封手段とを有し、これ
によって、前記容器内部の生物の代謝活性によって前記
容器内部に発生した圧変化の結果、密封手段および圧電
変換装置が変形すると測定可能な電気信号が発生する、
ことを特徴とする装置。 - 【請求項２】 密封可能な容器の密封手段を貫通するた
めの少なくとも１個の中空貫通手段と、圧電変換装置を
含む可変形部とから成るセンサー手段であって、中空貫
通手段はその一端をセンサー手段に埋没させており、中
空貫通手段内部の圧変化の結果生じたセンサー手段の可
変形部の変形が圧電変換装置を通じて測定可能な電気信
号を発生させる、ことを特徴とするセンサー手段。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US480398 | 1990-02-15 | ||
| US07/480,398 US5094955A (en) | 1988-03-15 | 1990-02-15 | Device and method for detecting microorganisms |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3106958A Division JP3010565B2 (ja) | 1990-02-15 | 1991-02-15 | 微生物検出用装置および方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000093158A true JP2000093158A (ja) | 2000-04-04 |
| JP3121596B2 JP3121596B2 (ja) | 2001-01-09 |
Family
ID=23907812
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3106958A Expired - Lifetime JP3010565B2 (ja) | 1990-02-15 | 1991-02-15 | 微生物検出用装置および方法 |
| JP11292807A Expired - Lifetime JP3121596B2 (ja) | 1990-02-15 | 1999-10-14 | 微生物検出用装置 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3106958A Expired - Lifetime JP3010565B2 (ja) | 1990-02-15 | 1991-02-15 | 微生物検出用装置および方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (3) | EP2039755A3 (ja) |
| JP (2) | JP3010565B2 (ja) |
| KR (2) | KR0183402B1 (ja) |
| AT (2) | ATE414137T1 (ja) |
| AU (1) | AU647450B2 (ja) |
| CA (1) | CA2035728C (ja) |
| DE (2) | DE69127387T2 (ja) |
| DK (2) | DK0446972T3 (ja) |
| ES (2) | ES2317647T3 (ja) |
| FI (1) | FI97547C (ja) |
| GR (1) | GR3025352T3 (ja) |
| IE (2) | IE20090339A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA91737B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010081938A (ja) * | 2008-09-30 | 2010-04-15 | Tyco Healthcare Group Lp | 微生物検出アセンブリ |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP2010081938A (ja) * | 2008-09-30 | 2010-04-15 | Tyco Healthcare Group Lp | 微生物検出アセンブリ |
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