FI97547C - Väline ja menetelmiä mikro-organismien osoittamiseksi - Google Patents

Description

97547 Väline ja menetelmiä mikro-organismien osoittamiseksi Tämä hakemus on osittain jatkoa hakemukselle, jonka sarjanumero on 07/322 874, jätetty 13.4.1989, joka taas on 5 osittain jatkoa hakemukselle, jonka sarjanumero on 07/168, 291, jätetty 15.4.1988.

Tämä keksintö tarjoaa välineen ja laitteen pH:n ja C02:n muutosten jatkuvalle seuraamiselle näytteessä käyttäen kasvualustaa ja suljettua säiliötä niin, ettei säilö liöön tunkeuduta sen jälkeen, kun näyte on valmistettu ja säiliö suljettu. Lisäksi on etuna, että keksinnön mukaisesti estetään näytteen ainesosien vaikutus kolorimetri-siin määrityksiin, ja keksintö tarjoaa käyttöön myös menetelmän pH:n tai C02:n konsentraatioiden olennaisesti jat-15 kuvaan seuraamiseen näytteestä.

Mikrobien aiheuttama kontaminaatio kliinisissä näytteissä on tavanomaisesti määritetty viljelemällä näytettä ravinteiden läsnäollessa ja osoittamalla mikrobien aktiivisuus näytteessä tai näytteen ilmatilassa tapahtu-20 neiden muutosten avulla tietyn ajan jälkeen. Esimerkiksi US-patentissa 4 182 656, Ahnell et ai, näyte asetetaan säiliöön, jossa on hiili-13-leimattua fermentoitavaa substraattia sisältävää kasvualustaa. Kun säiliö on suljettu, ja näyte laitettu biologista aktiivisuutta edistä-25 viin oloihin, määritetään hiili-13/hiili-12-suhde näyt teen ilmatilasta, ja sitä verrataan alkuperäiseen suhteeseen. US-patentissa 4 152 213, on esitetty vaatimus menetelmästä, jolla määritetään happea kuluttavien bakteerien läsnäolo näytteessä suljetussa säiliössä, osoittamalla 30 hapen määrän väheneminen näytteen yllä olevassa ilmati lassa seuraamalla kaasun painetta säiliössä. US-patentti 4 073 691 tarjoaa menetelmän biologisesti aktiivisten aineiden, mukaanluettuna bakteerit, määrittämiseksi suljetussa säiliössä, joka sisältää kasvatusalustan, mittaamal-35 la näytteen yläpuolisen ilmatilan ominaisuuksien muutoksia - 97547 2 tietyn ajan jälkeen. Ei-tunkeutuvan menetelmän C02:n muutosten osoittamiseksi ilmatilasta esittää Suppman et ai, kuten on tuotu esiin EP-hakemuksessa 83108468.6, tullut julkiseksi 4.4.1984. Menetelmät ja laitteet, joita on ku-5 vattu tässä ja muissa julkaisuissa, edellyttävät kaikki joko radiometrisen määrityksen tai tunkeutumisen suljettuun säiliöön ilmatilan muutosten mittaamiseksi viljelyn jälkeen, tai ne edellyttävät erityisiä materiaaleja, jotka läpäisevät infrapunaista valoa.

10 Muita tunnettuja menetelmiä mikrobikontaminaation mittaamiseksi näytteistä, erityisesti veriviljelyistä, ovat lämpötilan, pH:n, sameuden, värin, bioluminesenssin ja impedanssin vähäisten muutosten mittaukset. Yleensä näillä menetelmillä määritetään mikrobikontaminaatio mää-15 rittämällä bakteerien aineenvaihdunnan sivutuotteita. Mikrobikontaminaatio voidaan myös arvioida aliviljelmillä ja/tai värjäyksellä. Näistä menetelmistä vain impedanssi, radiometria ja infrapunaspektrometria antavat mahdollisuuden kliinisten näytteiden automatisoituun käsittelyyn. Ja 20 lukuunottamatta impedanssia ja infrapunamäärityksiä, näiden menetelmien toteuttaminen edellyttää myös tunkeutumisen säiliöön määrityksen tekemiseksi nestemäisestä näytteestä tai ilmatilasta näytteen yltä. Sen lisäksi, että kontaminaatio ja näytteen yläpuolisen ilmatilan aineosien 25 muuttuminen on todennäköistä joka kerran kun määritys tehdään, nämä menetelmät eivät tarjoa mahdollisuutta määritysten tekoon jatkuvasti tai toistuvasti lyhyin aikavälein pitkänä ajanjaksona. Tämä on huomattava epäkohta ottaen huomioon, että kontaminoivien organismien kasvunopeus 30 eroaa riippuen organismista ja organismien määrästä alkuperäisessä näytteessä niin, ettei voida ennustaa, milloin muutokset ilmatilassa tai nestemäisessä näytteessä ovat havaittavissa kontaminoidusta näytteestä. Tähän liittyy se ongelma, että kun kontaminaatio määritetään nestemäisen 35 näytteen pH-muutosten perusteella, monet aineenvaihdunnan

II

- 97547 3 tuotteet vaikuttavat näytteen pH:hon erilailla. Esimerkiksi ammoniakin tuotto nostaa pH:ta kun taas C02:n tuotto laskee sitä. Erilaisten kontaminoivien organismien erilaiset kasvunopeudet voivat johtaa pH:n nousuun yhdellä het-5 kellä ja laskuun toisella hetkellä, mitä ei havaita, jos pH mitataan pitkin väliajoin. Toinen virhelähde pH:n muutoksia määritettäessä kokoverinäytteistä, erityisesti kun käytetään indikaattoriväriä pH-määrityksessä, on todennäköisyys, että verisolujen läsnäolo voi vaikuttaa värin 10 ilmaantumiseen tai sekoittaa sitä. Kolorimetrisiä indikaattoreita voidaan tehokkaasti käyttää vain, jos näytteen luonteesta johtuvat virheet, ja vaikutus värin ilmaantumiseen, voidaan estää.

Tämä keksintö koskee laitetta ja välinettä mikro-15 organismien havaitsemiseksi kliinisistä näytteistä, kuten verestä tai muista ruumiinnesteistä, ja ei-kliinisistä näytteistä, viljelemällä näytteitä steriilillä kasvualustalla läpinäkyvässä suljetussa säiliössä. Mikro-organismien esiintyminen ja tunnistaminen määritetään osoitta-20 maila tai mittaamalla näytteen pH-muutokset, tai C02:n tuotto näytteessä käyttäen sensoria, joka on kiinnitetty säiliön sisäpintaan tai säiliön sulkemiseen käytettäviin välineisiin. Tämän keksinnön mukaisesti mikro-organismit voidaan osoittaa häiritsevien materiaalien, kuten suurten 25 punasolumäärien läsnäollessa, ei-radiometrisillä ja ei-tunkeutuvilla menetelmillä.

Kuvat esittävät seuraavaa:

Kuvio 1: Veriviljelyväline Tämä kuva esittää kokonaiskuvan välineen toimin-30 nallisesta osasta, detektorin kokoonpanon, jossa on (1) astia, (2) sensori, (3) ravintoalusta, (4) valonlähde, (5) fotodetektori, ja siihen liittyvä elektroniikka, joka käsittää (6) virtalähteen, (7) virran jännitekonvertteriin ja (8) alipäästösuodattimen.

- 97547 4

Jokainen detektorin kokoonpano koostuu mieluiten fotodiodista senkatussa aukossa ja yhdestä tai useammasta LED:sta, jotka on järjestetty siten, että valo lankeaa tutkittavalle pinnalle, mutta ei detektoriin itseensä.

5 Virtapiirit tässä laitteessa käsittävät vahvistimet ja suotimet säätämään signaaleja detektoreista, multiplekserit valitsemaan sopivista signaaleista ja vakiovirta-lähteet valaisimiin.

Laitetta käytettäessä koko laite asetetaan ravis-10 telijaan 37°C:seen inkubaattoriin, joka tarjoaa mikrobien kasvulle sopivat olosuhteet, ja estää huoneen valon pääsyn fotodetektoreihin.

Kuvio 2: pH-herkkyys

Sen lisäksi, että laite testattiin yksilöllisesti 15 useiden värillisten pullojen avulla, se testattiin myös pH-herkkien membraanipullojen avulla. Tämä käyrä esittää seitsemän eri detektorin keskimääräisen ulostulon voltteina, sen jälkeen kun sensori on tasapainotettu eri puskureilla pH-alueella 5,8-8,2. Yksityiskohtaiset tutkimuk-20 set osoittivat, että menetelmällä voidaan luotettavasti erottaa 0,1 pH-yksikön muutokset alueella pH 6,0-7,5.

Kuvio 3: Mikrobien kasvun aiheuttamat pH- ja C02-muutokset

Laitetta käytettiin osoittamaan mikrobien kasvua 25 sekä pH-muutosten että C02-tuoton avulla. Tästä kuvasta näkyy pH- ja C02-muutokset bakteerin, colin, kasvun seurauksena .

Kuvio 4: Eri mikro-organismien osoittaminen

Olennaisesti kaikki organismit vapauttavat C02 ai-30 neenvaihduntansa seurauksena. Siten tätä menetelmää voidaan käyttää hyvin suuren joukon mikro-organismeja osoittamiseen. Tästä kuvasta näkyy C02-tuoton osoittaminen seuraavien bakteerien kasvun aikana: E. colin, Gram-nega-tiivisen bakteerin, S. pyogenesin, Gram-positiivisen bak-35 teerin, P. aeru ginosan, Gram-negatiivisen ei-fermentoi- . 97547 5 van bakteerin, B. fraglliksen, anaerobin bakteerin ja C.albicansin, hiivan. Yksiköt osoittavat suhteellista OO^-konsentraatiota alustassa verrattuna C02-konsentraatioon kokeen alussa. Koska näytesäiliöt ja ravintoalusta ovat 5 huoneenlämmössä (noin 20°C), ja säiliötä ja näytettä in-kuboidaan 37°C:ssa kokeen aikana, C02 vapautuu nestemäisen näytteen yläpuoliseen tilaan ja alustaan ensimmäisten 2-4 tunnin kuluessa, johtuen COz:n vähentyneestä liu koisuudesta nesteeseen lämpötilan noustessa. Ellei säili- 10 öitä ja alustaa pidetä korkeammassa lämpötilassa ennen näytteen sisäänpanoa ja asettamista laitteeseen, mikro-organismien esiintymistä ei voida luotettavasti mitata ennen kuin minimi-C02-konsentraatio on ohitettu, tavallisesti ensimmäisten 2-4 tunnin aikana.

15 Kuvio 5: Sensori Tässä kuvassa näkyy (1) sensori, jossa on (2) ka-nyylimainen johtoputki, asetettu tunkeutumaan (3) korkin läpi (4) viljelmäsäiliöön.

Kuvio 6: Sensori 20 Tämä kuva on poikkileikkaus (1) sensorista, jossa on (2) kanava, joka yhdistää kaksi (3) johtoputkea, saattamaan kaasut ja näytteen parempaan kontaktiin indikaattorin kanssa, jotka on asetettu (4) korkin läpi (5) vil-j elmäsäi1iöön.

25 Kuvio 7: Pietsosähköinen sensori Tämä kuva on poikkileikkaus (1) sensorista, joka käsittää osana sulkumenetelmää (2) pietsosähköisen kaistaleen, joka lähettää signaalin, kun (3) säiliössä tapahtuu paineenmuutos.

30 Keksinnön mukaiset laitteet ja välineet tarjoavat ei-tunkeutuvan menetelmän mikro-organismien havaitsemiseen kliinisistä näytteistä, kuten verinäytteistä tai muista ruumiinnesteistä, ja ei-kliinlsistä näytteistä, mittaamalla mikro-organismien aineenvaihduntatuotteiden 35 lisääntymistä. Näyte lisätään erityisesti laadittuun ra- - 97547 6 vintoalustaan, joka edistää bakteereilla tiettyjen aineenvaihduntatuotteiden tuottoa, jotka osoitetaan ainutlaatuisella, kertakäyttöisellä, viljelmäsäiliön pohjaan tai säiliön sulkuvälineisiin asetetulla sensorilla. Sensori kä-5 sittää kiinteän aineen tai membraanin, jota me kutsumme kiinnitys- tai tukiaineeksi, ja sen päälle tai siihen im-mobilisoidun indikaattoriaineen. Sensori on sijoitettu säiliön sisäseinää vasten, säiliön sulkemiseen tarkoitettuihin sulkuvälineisiin tai se on kiinni sulkuvälineissä 10 siten, että indikaattoriaine on näkyvissä ulkopuolelta. Se voidaan kiinnittää säiliöön, jotta estetään solujen, proteiinien, muiden kiinteiden aineiden tai muiden läpinäkymättömien tai värillisten yhdisteiden pääsy sen ja säiliön pinnan väliin. Tietyissä suoritusmuodoissa sensori erote-15 taan näytteestä ja sen kasvatusalustasta membraanilla tai kiinteällä kerroksella, joka sallii kaasumolekyylien kulkeutumisen, mutta estää ionien kulkeutumisen.

Tämän keksinnön edullinen suoritusmuoto käsittää sulkuvälineet, kuten korkin tai kannen, jotka voivat olla 20 läpinäkyviä, tai joissa voi olla läpinäkyvä osa. Sensori asetetaan läpinäkyvän korkin tai korkinosan läheisyyteen tai osaksi korkkia. Kun käytetään korkkia sulkemaan säiliö, indikaattorin muutokset luetaan läpinäkyvän sulkuvä-lineen lävitse. Tämän sovellutuksen etuna on, että tämä 25 voi olla taloudellisin tapa tuottaa säiliöitä suuressa mittakaavassa.

Vielä edullisemmin sulkuvälineet voidaan tehdä materiaalista, kuten polymeeristä, joka sisältää koteloituja indikaattorimisellejä. Läpinäkyvä alue joko säiliös-30 sä tai sulkuvälineissä on tarpeeton, edellyttäen että materiaali läpäisee mikro-organismien aineenvaihduntatuotteita, ja muutokset indikaattorissa näkyvät sulkuvälinei-den pinnalle.

Toinen tämän keksinnön suoritusmuoto on sensori, 35 joka kiinnitetään ainakin yhteen onttoon johtoputkeen,

II

- 97547 7 kuten kanyyliin, kuten Kuvassa 5 on esitetty. Indikaatto-riväliaine sensorissa on yhteydessä kanyylin onton keskustan kanssa. Säiliö suljetaan tavanomaisella korkilla, kuten kumikorkilla. Sensorivälineistö asetetaan korkkiin 5 ja kanyyli tunkeutuu kumikorkin seinämän läpi säiliöön. Ravintoalusta, johon näyte on ympätty, mikro-organismien kaasumaiset aineenvaihduntatuotteet tai kaasut ravinto-alustasta itsestään kulkevat ylös kanyylissa ja muuttavat sensorissa indikaattorin väriä, joka sitten luetaan. Pa-10 rannuksen tähän sovellutusmuotoon tuo yhden, mutta mieluiten vähintään kahden kanyylin käyttö, joiden jokaisen toinen pää on sensorissa yhteydessä indikaattoriin, mieluiten niin, että avoin väylä yhdistää jokaisen kanyylin toisen pään, kuten Kuvassa 6 on esitetty. Sensori voi ol-15 la kiinteä polymeeriemulsio, tai valettu muovipala, joka käsittää sensorin, tai mikä tahansa muu väline, joka sisältää nämä peruspiirteet. Joka tapauksessa sensori on kosketuksessa yhdistävään väylään. Kuten yllä, kumpikin kanyyli tunkeutuu korkin seinämän läpi sisälle säiliöön.

20 Kun säiliötä ravistellaan, neste ja/tai kaasut säiliön sisällä virtaavat yhteen kanyyliin ja toisesta ulos, saattaen näytteen suoraan kontaktiin sensorin kanssa.

Mikro-organismit ruumiinnestenäytteissä, kuten veressä, jotka sisältävät niin vähän kuin yhden organismin 25 millilitrassa, voidaan osoittaa käyttäen tätä keksintöä. Sellaiset näytteet saattavat vaatia jopa seitsemän päivän inkubaation, ennen kuin organismipopulaatio saavuttaa kriittisen tason, jolla aineenvaihduntatuotteiden lisäys voidaan mitata. Me havaitsimme, että tiettyjen organis-30 mien konsentraatio 106 CFU/ml, tuotti mitattavissa olevat pH- tai C02-muutokset. Kaikki organismit olivat mitattavissa konsentraatioissa 107-108 CFU/ml.

Tämä keksintö on ainutlaatuinen ja hyödyllinen monessa suhteessa: 1) mikrobien aineenvaihduntatuotteet mi-35 tataan viljelmäpullon nestefaasista mieluummin kuin näyt- - 97547 8 teen yläpuolisesta ilmatilasta, 2) koska ainutlaatuinen kertakäyttöinen sensori kiinnitetään pullon sisäpintaan tai sulkuvälineisiin, määritykset voidaan tehdä pullon läpinäkyvän seinämän ulkopuolelta tai sulkuvälineistä 5 tarvitsematta häiritä pullossa olevaa kokonaisuutta, 3) ulkopuolelta tehtävät määritykset voidaan tehdä silmämääräisellä tarkastelulla tai välineellä, joka mittaa hei-jastussuhdetta, 4) läpinäkymättömät tai värilliset ainekset näytteessä eivät häiritse sensorin kykyä osoittaa 10 muutoksia, tai näiden muutosten mittausta ja 5) indikaat-torimolekyylien korkea konsentraatio pidetään yllä pienessä tilavuudessa sensorissa, se on, polymeeriemulsiossa tai membraanissa, niin että värinmuutos voidaan havaita helposti.

15 Toinen sensorityyppi, jolla voidaan mitata viljel- mäpullon sisällä tapahtuvia muutoksia tunkeutumatta säiliöön, on sovellutus, joka koostuu pietsosähköisestä laitteesta, kuten pietsosähköisestä kaistaleesta, joka on kiinnitetty korkkiin, se on sulkuvälineisiin, kuten Ku-20 vassa 7 on esitetty. Signaali laitteesta nollataan automaattisesti, kun säiliö ja sen sisältö saavuttavat inku-baatiolämpötilan. Laite vääntyy kun kansi laajenee mikro-organismien aineenvaihduntatuotteiden aiheuttaman paineen vuoksi. Tämän vääntymisen tuottamat sähköiset signaalit 25 mitataan säiliön sisällä tapahtuvan biologisen aktiivisuuden määrittämiseksi. Toinen sovellutusmuoto on laite, erillään säiliöstä, joka on kiinni siinä säiliön sulkuvä-lineiden välityksellä. Tämä sovellutusmuoto voi esimerkiksi olla kiinteä kuminen suorakulmio, jossa on ontto 30 osa, jonka tyvellä on pietsosähköinen kaistale. Kaistaleen alla on kanyyli, joka on sijoitettu kulkemaan kumisen suorakulmion lävitse. Kanyylin ulostuleva pää kulkee säiliön sulkuvälineiden läpi säiliöön. Kun mikro-organismien kaasumaiset hengitystuotteet kertyvät kanyy-35 liin, paine jonka ne saavat aikaan, pakottaa kumin, joka

II

9 97547 sijaitsee kanyylin pään ja pietsosähköisen kaistaleen välillä, vääntymään ja työntämään kaistaletta onttoon osaan. Pietsosähköisen kaistaleen vääntymisen aiheuttama sähköinen signaali mitataan.

5 Yllä kuvatun laitteen toinen sovellutusmuoto on käyttää useampaa kuin yhtä kanyylia, ja täten lisätä ku-mikappaleeseen tulevan kaasun määrää. Kahden kanyylin käyttö saa aikaan helpomman virtauksen sensoriin ja siitä ulos, kuin vuoroveden kaltaisen virtauksen, kun kyljel-10 lään makaavaa pulloa kieritetään.

Ravinteet, jotka muodostavat kompleksisen mikro-bialustan, vaikuttavat mikro-organismien käyttämiin ai-neenvaihduntareitteihin. Orgaanisia happoja, emäksiä ja erilaisia kaasuja tuotetaan suhteissa, jotka riippuvat 15 saatavilla olevista ravinteista. Nämä tuotteet eroavat myös eri mikro-organismilajien välillä. Näiden tuotteiden läsnäolo nestemäisessä ravintoalustassa voi muuttaa sen pH:ta. Keksinnön mukaiset sensorit sisältävät pH-herkkiä indikaattoreita, jotka antavat mitattavan muutoksen ympä-20 ristön pH: n muutoksen seurauksena. Sovellutusmuodossa, jossa pH^-sensori on peitetty kaasuja läpäisevällä, ioneja läpäisemättömällä membraanilla, indikaattorin pH:hon vaikuttavien kaasujen, kuten C02:n tai ammoniakin, läsnäolo mitataan. Täten voidaan osoittaa mikrobien kasvu joko 25 nestemäisen ravintoalustan pH-muutoksilla tai mittaamalla alustaan liuenneita kaasuja, kummankin osoituksen saavat aikaan mikro-organismien tuottamat kaasumaiset aineenvaihduntatuotteet. Hiilidioksidi on universaali aineenvaihduntatuote, jota kaikki organismit tuottavat, ja 30 siksi se on edullisin aineenvaihduntatuote mikrobien kasvun osoittamiseen.

C02- ja pH-sensoreilla on kaksi yhteistä komponenttia, molekyylilaji, joka on käyttökelpoinen pH-indikaatto-rina ja kiinnitys/tukiaine. pH-indikaattori voi olla kiin-35 nitetty joko kovalenttisesti tai ei-kovalenttisesti tuki- 10 97547 aineeseen. Vaihtoehtoisesti, indikaattori voi olla koteloitu polymeerimatriisiin, kuten emulsifioimalla polymee-rimatriisiin ennen kovetusta. Toimiakseen pH-sensorina, indikaattorin tulee olla yhteydessä nestemäiseen ravinto-5 alustaan. C02-sensorissa on kolmas komponentti, puoliläpäisevä aine, joka täydellisesti erottaa indikaattorimembraa-nin näytteestä ja kasvualustasta. Puoliläpäisevä kerros voi olla erillinen membraani, vaihtoehtoisesti kovetettu polymeeri näytteen ja kasvualustan vierellä voi muodostaa 10 sisäisen puoliläpäisevän kalvon. Nämä sensorit on kiinnitetty sopivan läpinäkyvän astian sisään tai läpinäkyvään sulkuvälineeseen sopivalla kiinnitysaineella. Ne voivat myös muodostaa sulkuvälineen sisäosan tai olla kiinnitettyinä sulkuvälineeseen tai astiaan indikaattorina, joka on 15 emulsifioitu polymeerimatriisiin, kovetettu in situ. Ne voivat myös sijaita säiliön ulkopuolella, edellyttäen että on menetelmä, joka sallii mikro-organismien aineenvaihduntatuotteiden tai kasvualustan, joka sisältää näytteen, yhteyden sensoriin.

20 Suurta määrää erilaisia fluoresoivia ja näkyviä pH- indikaattoreita voidaan käyttää aktiivisena molekyylila-jina pH- ja C02-sensoreissa. Yleisesti ottaen ainoat rajoitukset indikaattorien valinnassa ovat edellytykset, että niillä on hyväksyttävät dynaamiset pH-alueet ja aallon-25 pituuden muutokset, jotka ovat helposti mitattavissa nykyisillä pintamittaukseen perustuvalla fluoresenssilla (front surface fluorescence) tai reflektanssiteknolo-gioilla.

Sensorit pH-muutosten osoittamiseen kasvualustas-30 sa, osoittavat keksinnön mukaisesti mieluiten muutoksen fluoresenssin intensiteetissä tai näkyvässä värissä pH-alueella 5,0-8,0.

C02-sensorin indikaattorien tulisi osoittaa muutos fluoresenssin intensiteetissä tai näkyvässä värissä mie-35 luiten pH 13 ja 5 välillä, ja kaikkein mieluiten pH 13 ja

II

. 97547 11 9 välillä, jotta havaitaan muutokset C02-konsentraatios-sa. Vain tietyt pH-indikaattorimolekyylit voidaan sitoa kovalenttisesti tai ei-kovalenttisesti tukiaineeseen, ja säilyttää niiden pH:n osoitusominaisuudet. Me totesimme 5 indikaattoreiden, jotka kuuluvat ksantiini-, fenoliftale-iini- ja fenolisulfoniftaleiiniryhmiin olevan käyttökelpoisia. Näitä ovat esimerkiksi fluoreskeiini, kumariini, fenolftaleiini, tymolftaleiini, bromitymolisininen, tymo-lisininen, ksylenolisininen ja ä-naftolibentseiini.

10 Kiinnitys/tukiaine voi olla sellaista ainetta, kuten selluloosaa, johon pH-indikaattori voidaan sitoa kovalenttisesti käyttäen orgaanisia reaktioita. pH-indikaattorin ei-kovalenttinen kiinnitys voidaan toteuttaa käyttämällä ionitukiaineita, kuten nylonmembraaneja, 15 joilla on positiivinen tai negatiivinen zetapotentiaali.

Muita ionitukiaineita, joita voidaan käyttää, ovat positiivisesti tai negatiivisesti varatut ionihartsit, kuten dietyyliaminoetyyli (DEAE) -hartsi tai DEAE-selluloosa. Tukiaineen esikäsittely proteiinilla voi olla tarpeen, jos 20 indikaattorimembraanin tulee olla suorassa yhteydessä mik robien kasvualustaan.

pH-indikaattorisensorit mittaavat pH-muutoksia suoraan mikrobien kasvualustan pH-olojen mukaan. Kuitenkin nämä sensorit voidaan saattaa reagoimaan selektiivi-25 sesti kaasuihin (esim. hiilidioksidiin, ammoniakkiin) nestemäisessä kasvualustassa, päällystämällä ne selektiivisesti puoliläpäisevällä yhdisteellä tai kalvolla, kuten silikonilla, lateksilla, teflonilla tai erilaisilla muoveilla, joiden ominaisuutena on kyky selektiivisesti sal-30 lia kaasun diffuusio ja estää ionien kulku. Sensoreissa, jotka käsittävät indikaattorin koteloituna polymeerimat-riisiin, polymeeri, joka muodostaa matriisin, voi toimia puoliläpäisevänä esteenä, joka sallii kaasujen kulun, mutta ei ionien kulkua.

- 97547 12

Koteloiduissa indikaattorisovellutuksissa C02-sen-sori koostuu neljästä osasta. Ensimmäinen osa on visuaalinen tai fluoresoiva pH-indikaattori, joka on reaktio-kykyinen pH-alueella 6-10. Esimerkkejä indikaattoreista, 5 jotka täyttävät nämä vaatimukset, ovat bromitymo-lisininen, tymolisininen, ksylenolisininen, fenolftaleii-ni, kumariini ja fluoreskeiini. Toinen osa on natriumhyd-roksidi tai vastaava emäs, joka ylläpitää optimi pH-olot valitulla pH-indikaattorilla suoritettavaa C02:n osoitus-10 ta varten. Kolmas osa on glyseroli tai vastaava emulgoi-misaine, joka voi tuottaa indikaattoriliuoksen pisaroita emulgoituna kovettamattomaan polymeeriin. Neljäs osa on kovettamaton polymeeri, kuten silikoni, joka ylläpitää sopivat olosuhteet indikaattorille. Mitä tahansa polymee-15 riä voidaan käyttää, joka ei vaikuta indikaattorin kemialliseen aktiivisuuteen, joko sen omien kemiallisten tai fysikaalisten ominaisuuksien vuoksi, tai sen kovettumis-vaatimusten vuoksi; edellyttäen, että se läpäisee kaasuja, mutta ei ioneja, ja että nämä ominaisuudet eivät muutu 20 steriloitaessa. Muita käyttökelpoisia sililkonipolymeerejä ovat sellaiset, jotka kovettuvat korkeassa lämpötilassa, katalyyttisellä aktiivisuudella tai ultraviolettivulka-noinnilla. Emulsio valmistetaan neljästä komponentista ja polymeeri kovetetaan, jotta saadaan pH-indikaattoripisa-25 roiden ympärille puoliläpäisevä matriisi, joka sallii C02:n ja muiden kaasujen selektiivisen diffuusion nestemäisestä mikrobialustasta, saaden aikaan mitattavan muutoksen indikaattorissa. Sensori voidaan valmistaa erikseen, esim. muotissa, kovettaa, ja sen jälkeen kiinnittää viljelypul-30 loon sopivalla kiinnitysaineella, kuten silikoniliimalla.

Vaihtoehtoisesti, ja mieluiten, sensori muodostetaan pullon pohjalla ja kovetetaan in situ. Kovettamisen jälkeen pullo steriloidaan sensorin kanssa, esim. autoklavoimalla. Ravintoalusta voi olla tarkoituksenmukaista lisätä pulloon 35 ennen autoklavointia ja steriloida samassa käsittelyssä.

il - 97547 13

Yksi vaihtoehto on suihkuttaa sensori säiliön sisäpinnalle, esim. mikrotiitterilevyn pohjalle, ohueksi kerrokseksi. Soveltuvaa alustaa, joka voi olla epästerii-liä, lisätään jokaiseen kaivoon ja näyte siirrostetaan. On 5 havaittu, että nämä levyt tarvitsevat yleensä vain 4-6 tunnin inkubaatioajan, jotta värinmuutos sensorissa havaitaan.

Seuraavien yksityiskohtaisten esimerkkien sensoreista on tarkoitus kuvata keksinnön eri käyttötapoja, 10 mutta ei rajoittaa sen vaatimuksissa määriteltyjä puitteita.

Esimerkki 1

Ei-fluoresoivan indikaattorin sisältävien pH-sen- soreiden valmistus 15 Nylonmembraanit, jotka oli muunnettu sisältämään positiivisen zetapotentiaalin (Zeta Probe, BioRad), asetettiin 3 % Tryptic Soy Broth -liuokseen ja niitä liotettiin yhden tunnin ajan huoneenlämmössä hellävaraisessa ravistelussa pyöröravistelijassa. Ylimäärä Tryptic Soy 20 Brothia pestiin perusteellisesti nylonmembraaneista de- ionisoidulla vedellä. Pestyt membraanit asetettiin 0,0001-0,1 % pH-indikaattoriliuokseen (bromitymolisininen), joka oli liuotettu 0,1 N NaOH:iin. Membraanien annettiin reagoida yhden tunnin ajan huoneenlämmössä hellävaraisessa 25 ravistelussa. Ylimäärä indikaattoriliuosta poistettiin membraaneista pesemällä niitä perusteellisesti deionisoi-dulla vedellä, kunnes yhtään indikaattoria ei havaittu peseytyvän membraaneista. pH-indikaattorimembraaneja ilma-kuivattiin 24 tuntia, ja niistä lävistettiin 28-41 cm ym-30 pyröitä. pH-indikaattorimembraanit kiinnitettiin lasias- tioiden pohjaan silikoniliimalla (GE 2501 Silicone Sealant, kirkas). Nämä pullot täytettiin mikrobien ravintoalustalla ja steriloitiin autoklavoimalla.

- 97547 14

Esimerkki 2

Ei-fluoresoivan indikaattorin sisältävien C02-sen- soreiden valmistus

Nylonmembraanit, jotka oli muunnettu sisältämään 5 positiivisen zetapotentiaalin (Zeta Probe, Bio Rad), asetettiin indikaattoriliuokseen, joka koostui 0,001-0,1 % ksylenolisinisestä ja 0,0001-0,1 % bromitymolisinisestä liuotettuna 0,1 N NaOH:iin. Membraanien annettiin reagoida yhden tunnin ajan huoneenlämmössä hellävaraisessa ra-10 vistelussa. Indikaattoriliuoksen kanssa reagoinnin jälkeen membraanit pestiin perusteellisesti deionisoidulla vedellä ylimääräisen indikaattorin poistamiseksi. Indi-kaattorimembraaneja ilmakuivattiin 24 tuntia ja niistä lävistettiin 28-41 cm ympyröitä. Indikaattorimembraanit 15 kiinnitettiin sitten kirkkaiden lasipullojen pohjan sisäpintaan silikoniliimalla (GE 2501 Silicone Sealant II, kirkas) ja toinen kerros silikoniliimaa levitettiin indi-kaattorimembraanien päälle sinetöimään nylon-indikaatto-rimembraani täydellisesti.

20 Nämä pullot täytettiin mikrobien ravintoalustalla ja steriloitiin autoklavoimalla.

Esimerkki 3 A. Koteloidun indikaattorin sisältävien sensorei- den valmistus • 25 Valmistettiin kantaliuokset 0,1-1,0 % fenolftale- iinista, ksylenolisinisestä tai bromitymolisinisestä 0,0005-0,5 N NaOH:ssa, joka sisälsi 25-75 % glyserolia. 0,1-0,5 ml indikaattori-NaOH-glyseroli -kantaliuosta lisättiin 1,0 grammaan kovettamatonta RTV valkoista sili-30 konia (GE Silicone II, valkoinen), ja sekoitettiin kunnes muodostui ohut emulsio. Silikoni-indikaattoriemulsio pantiin ruiskuun, ja sitä jaettiin 0,1-0,2 ml lasipullon pohjalle, emulsio levittyi tasaisesti pullon pohjalle. Indikaattori-silikoni-emulsiosensorin annettiin kovettua 35 vähintään 24 tuntia ympäröivässä lämpötilassa atmosfää- 15 97547 rissä, jonka suhteellinen kosteus oli vähemmän kuin 50 %. Kovettamisen jälkeen C02-sensorin sisältävät pullot täytettiin mikrobien ravintoalustalla ja steriloitiin auto-klavoimalla.

5 B. Laite mikrobikontaminaation automaattiseksi osoittamiseksi

Sekä pH-muutos että C02-tuotto mikrobien kasvun seurauksena voidaan osoittaa ja määrittää käyttäen laitetta, joka kuvataan vireillä olevissa U.S. patenttihakemuksissa, 10 sarjanumerot 07/322 874, 07/168 291 ja 07/351 476, jätetty 15.5.1989, jotka liitetään tähän viitteinä.

Tämän laitteen sensorit sisältävät indikaattorit, jotka vaihtavat väriä kun kasvavia tai metaboloivia mikrobeja on läsnä. Vaikka värinmuutokset voivat olla ilmei-15 siä paljaalle silmälle, instrumentin käyttö tarjoaa objektiivisuuden, herkkyyden ja mittauksen jatkuvuuden edut. Edullisessa sovellutusmuodossa laite on oleellisesti näkyvän valon reflektometri, joka mittaa sensorin värinmuuto-ksia. Jotta saavutetaan kaikkien näytteiden jatkuva mit-20 taus, on toivottavaa, että joka näytteelle on detektori.

Muut vaihtoehdot ovat ilmeisiä asiaan perehtyneille, kuten tavanomaisten menetelmien käyttö siirtämään näytesäiliöitä yhden tai useamman paikallaan pysyvän detektorin ohi tai siirtämään yhtä tai useampaa detektoria paikallaan pysy-25 vien näytteiden ohi.

Edullisessa suoritusmuodossa käytetään paikallaan-pysyviä valaisimia ja detektoreita. Hehkulamppuja ja valokaari lamppuja voidaan myös käyttää valonlähteinä yhdessä peilien, linssien, optisten kuitujen ja muiden valoa 30 sensoriin suuntaavien välineiden kanssa.

C. Kasvatusalustojen valmistusohjeet Alusta, jota käytetään mikrobien osoittamiseen pH-muutoksen avulla laitteessa, joka on kuvattu Esimerkissä 3 B yllä, käsittää 3 % Tryptic Soy Brothia (D1FC0), 0,5 % 97547 16

Proteose Peptonia (DIFCO) No. 3, 1,25 % D-glukoosla, 1 % L-arginiinia, 0,01 % L-kysteiiniä ja antikoagulanttia, 0,05 % SPS natriumpolysulfonaattia. Tällä ravintoalustalla on alhainen puskurikapasiteetti niin, että mitkä ta-5 hansa aineenvaihduntatuotteet, jotka vaikuttavat pH:hon, muuttavat helposti alustan pH:ta. Glukoosi on fermentoi-tava hiilihydraatti, joka mikrobien käyttäessä sitä aineenvaihdunnassaan aiheuttaa orgaanisten happojen tuoton, jotka puolestaan saavat aikaan pH:n laskun. Arginiinia 10 lisätään substraatiksi niille ei-fermentoiville mikro-organismeille (esim. Pseudomonas aeruginosa), jotka eivät normaalisti käytä glukoosia aineenvaihdunnassaan. Argi-niinin lisäys saa aikaan emäksisten aineenvaihduntatuotteiden vapautumisen, mikä aiheuttaa alustan pH:n nousun.

15 Jos mitataan Pseudomonas aeruginosan C02-tuottoa, ei lisätä arginiinia. Muita hiilihydraatteja tai aminohappoja voidaan lisätä alustaan indusoimaan pH-muutoksia, kun eri mikro-organismilajit käyttävät niitä aineenvaihdunnassaan.

20 D. Testit, joissa käytetään luokiteltuja viljelmiä

Edellä kohdassa 3 A kuvatut pullot täytettiin 30 ml:11a edellä kohdassa 3 B esitettyä ravintoalustaa ja steriloitiin autoklavoimalla. Jokaiseen pulloon ympättiin yksi Taulukossa 1 luetelluista organismeista. Pullot ase-25 tettiin edellä kuvattuun laitteeseen, ja niitä inkuboi-tiin 35°C:ssa 24-48 tuntia. Kun sensorissa havaittiin muutos, pullon merkittiin sisältävän mikro-organismin.

Taulukossa 1 luetellut mikro-organismit on osoitettu käyttäen keksintöä, kuten edellä on kuvattu.

30 11 17 97547

Taulukko 1

Organismit, jotka osoitettiin luokitelluista viljelmistä

Enterobacteriaceae Ei-fermentoivat 5

Eschericia coli Pseudomonas aeruginosa

Enterobacter cloacae Pseudomonas putrifa- ciens

Citrobacter freundi Xanthomonas_maito- 10 philia

Klebsiella pneumoniae Acinerobacter sp.

Providencia rettgeri Eikenella corrodens

Proteus mirabilis Moraxella sp.

Salmonella Ryhmä B Achromobacter Ryhmä VD

15 Serratia marcesans

Yersinia enterocolitica

Staphylococcus spp. Anaerobit 20 Koagulaasi-negatiiviset Bacteroides fragilis stafylokokit Bacteroides S. aureus melaninogenicus

Bacteroides

Steptococcus spp. asaccharolyticus 25 Clostridium perfringens S. pneumoniae Fusobacterium necro- phorum

Ryhmä A Veillonella parvula

Ryhmä B Peptostreptococcus 30 Ryhmä C anaerobius

Ryhmä D - ei enterokokit Peptococcus magnus

Enterokokit Peptococcus

Viridans-ryhmän asaccharolyticus streptokokit Bacteroides ovatus 35 Ravinteiden osalta Eubacterlum limosum - 97547 18 erilaiset streptokokit Eubacterium ala- ctolyticum

Hiivat Muut mikro-organismit 5

Candida albicans Haemophilus influenzae

Cryptococcus neoformans Haemophilus_parain- fluenzae

Rhodotorula rubra Neisseria meningitidis 10 Torulopsis glabrata Vibrio parahemoliticus

Neisseria gonorrhoeae

Branhamella_catarr- halis

Aeromonas hydrophilia 15 Listeria monocytogenes

Gardnerella vaginalis Campylobacter jejuni Nämä tulokset osoittavat, että nämä organismit, mitkä ta-20 hansa saman tyyppiset muut organismit ja mitkä tahansa organismit, jotka tuottavat havaittavia kaasuja, tai jotka muuttavat nestemäisen kasvualustan pH:ta, voidaan osoittaa käyttämällä keksintöä.

Vaikka näyte, joka sisältää puhdasviljelmän, on 25 paras testinäyte, muita näytteitä, jotka sisältävät pääasiassa yhden organismin, kuten infektoidut ruumiinnesteet, kiinteä aine, joka on nesteytynyt, kiinteän aineen huuhteluneste tai muut sameat nesteet, kuten ne, joita on ravinnon jalostuslaitoksissa, tuotantolaitoksissa, lihan-30 pakkauslaitoksissa tai järvissä ja joissa, voidaan käyttää ymppeinä. Erityisesti veri, joka on otettu verivilje-lypullosta, voidaan suoraan siirrostaa käsiteltyihin mik-rotiitterilevyjen kaivoihin, ja tulokset voidaan yleensä lukea neljästä kuuteen tunnissa, vaikka jotkin mikro-or-35 ganismit saattavat tarvita 24 tuntia tuottaakseen värin- 11 97547 19 muutoksen sensoriin. Täten voidaan tunnistaa organismit positiivisista näytteistä siirrostamalla näyte, esim. ve-riviljelypullosta, suoraan sopivasti käsiteltyihin mik-rotiitterilevyj en kaivoihin, ja inkuboimalla, kunnes 5 luonteenomaiset kasvumallit ilmenevät.

Esimerkki 4

Ei-fluoresoivan emulsioindikaattorin sisältävien sensoreiden valmistus Tämä sensori sisältää Eastman Kodakin Universal 10 Indicator-liuosta, joka vaihtaa väriä pH:ssa 4-10.

A. Universal Indicatorin valmistus: 50 ml tilavuus Universal Indicator -liuosta iso-propanolissa, hankittu Eastman Kodak Companystä, Roches-terista, N.Y., haihdutettiin kuiviin kuumentamalla 15 40°C:ssa alipaineessa pyöröhaihduttajassa. Liuos liuotet tiin uudelleen 4 ml HPLC -laatuista isopropanolia. 10 mikrolitraa 10 N NaOH lisättiin 2 ml:aan konsentroitua Universal Indicatoria.

B. Silikoniemulsion valmistus 20 10 grammaa GE silikoni RTV 615 osaa A (General

Electric Company, Waterford, N. Y. ) laitettiin lasias-tiaan. Kaksi millilitraa Universal Indicator/NaOH -liuosta, 1 gramma glyserolia ja 0,3 grammaa valkoista siliko-nipigmenttiä lisättiin silikoni A osaan. Neljä osaa se-25 koitettiin käsin, sekoittamalla varovaisesti teflonsau- valla. Kun aineet olivat hyvin sekoittuneet, 1 gramma GE-silikoni RTV 615 osaa B lisättiin emulsioon. Emulsiota sekoitettiin varovasti, kuten aiemmin, sekoittamalla käsin. Emulsiosta poistettiin kaasuja tyhjiössä eksikkaat-30 torissa 5 minuutin ajan. Emulsio siirrettiin sitten paineistettuun ruiskuun, joka oli asennettu "air brush” su-muttimeen. Silikoniemulsiosensori ruiskutettiin 96 kaivon polystyreeni-mikrotiitterilevyille, jotka oli aiemmin päällystetty GE-silikoni pohjustuksella SS 4120.

- 97547 20

Vaikka Esimerkissä 4 käytettiin Universal Indikaattoria pH indikaattorina, muut indikaattorit, kuten ne, jotka on lueteltu Taulukossa 2, ja esitetty julkaisussa Dawson et ai, Data dor Biochemical Research, 2 painos, p.

5 623, Claredon Press, Oxford, 1969, ovat hyväksyttäviä.

ti 21 97547

Taulukko 2

Happo-emäs -indikaattorit

Indikaattori Valmistus Hapan Emäksinen pH

5 (yleisnimi) 0,1 9/250 ml väri väri alue

Kresolipuna vesi. jossa 2.62 punainen keltainen 0.2-1,8

(Hapan alue) ml 0,1 N NaOH

m-Kresoli- vesi. Jossa 2,72 punainen keltainen 1,0-2,6

10 purppura nl 0,1 N NaOH

(hapan alue) Tynoli- slni vesi, jossa 2,15 punainen keltainen 1,2-2.8

(hapan alue) nl 0.1 N NaOH

2Tropaeolin vesi punainen keltainen 1,3-3,0 15 00

Metyylikel- 90 % EtOH punainen keltainen 2,9-4,0 täinen

Bromlfenoll- vesi. jossa 1,49 keltainen purppura 3,0-4,6

sininen ml 0,1 N NaOH

20 Tetrabromi- vesi, jossa 1,0 ml keltainen sininen 3,0-4,6

fenolisini- 0,1 N NaOH

nen keltainen sininen 3,0-4,6

Congo- vesi tai violetti puna- 3,0-5,0 punainen 80 % EtOH oranssi 25 Metyyli- vapaa happo:vesi punainen oranssi- oranssi Na-suola: vesi, keltainen 3,1-4,4 jossa 3 ml 0,1 N HCl

Bromikreso- vesi, jossa 1,43 keltainen sininen 3,6-5,2

30 livihreä ml 0,1 N NaOH

(sininen)

Metyyli- Na-suola: vesi punainen keltainen 4,2-6,3 punainen vapaa happo: 60 % EtOh 35 Kloori- vesi. Jossa 2*36 keltainen violetti- 4,8-6,4 fenoli- ml 0,1 N NaOH punainen punainen

Bromi- vesi, jossa 1,85 keltainen violetti 5,2-6.8

kresoli- ml 0,1 N NaOH

40 purppura

Azolitmiini vesi punainen sininen 5,0-8,0 (litmus)

Bromitymoll- vesi, jossa 1,6 keltainen sininen 6,0-7,6

sininen ml 0,1 N NaOH

45 Fenoli- vesi. Jossa 2.82 keltainen punainen 6,8-8,4

punainen nl 0.1 N NaOH

- 97547 22

Neutraali- 70 % EtOH punainen oranaai- 6,8-8.0 puna ruakaa

Kreaoli- veai, Joaaa 2.62 kaltainen punainen 7,2-8.8

puna (emäks. ml 0,1 N NaOH

5 alue) m-Kreaoll- vesi. Joaaa 2.62 keltainen purppura 7,6-9,2

purppura ml 0,1 N NaOH

(emäks.alue)

Tymoli- vesi. Jossa 2.15 keltainen sininen 8.0-9.6

10 sininen ml 0.1 N NaOH

(emäks.alue)

Fenolitale- 70 * EtOH (60 * väritön vaalean- 8.3-10.0

Uni cellosolve) punainen

Tymolftale- 90 % EtOH väritön sininen 9.3-10.5 15 iini AIitariini- EtOH keltainen punainen 10.1-12.0 keltainen

Tropaeolilnl vesi keltainen oranssi 11,1-12.7 0 20

Lukuunottamatta C02:a ja NH3:a, jotka osoitetaan käyttämällä pH-indikaattorin sisältäviä sensoreita, muut aineenvaihdunnan kaasumaiset tuotteet voidaan havaita käyt-25 tämällä niille spesifisiä indikaattoreita. Esimerkiksi keksinnön mukaista sensoria, joka sisältää natrium-nitroprussidia indikaattorina, voidaan käyttää vetysul-fidin osoittamiseen.

Esimerkki 5 30 Mikro-organismien tunnistus C02-tuoton osoituksen perusteella

Kolme ohutta kerrosta emulsiosensoria, joka on valmistettu, kuten Esimerkissä 4, ruiskutetaan esikäsitellyl-le epästeriilille mikrotiitterilevylle. Jokaisen kerroksen 35 annetaan kuivua ennen seuraavan kerroksen ruiskuttamista.

Sen jälkeen kun viimeisen sensorikerroksen on annettu kuivua, 200 mikrolitraa ravintoalustaa annostellaan jokaiseen mikrotiitterilevyn kaivoon. Ravintoalusta, jota käytetään näytteille ja negatiivisille kontrolleille, on määritelty, 40 ravinneköyhä alusta, joka sisältää erilaisen hiilenlähteen

II

23 97547 jokaista kahtakymmentäkolmea mikrotiitterilevyn kaivoa varten. Negatiivinen kontrollikaivo ei sisällä hiilenläh-dettä. Positiivinen kontrollikaivo sisältää määrittelemättömän, runsasravinteisen alustan. Jokaiseen kaivoon siir-5 rostetaan sitten noin 106 organismia näytteessä. Mikrotiit-terilevy suljetaan siten, että jokainen kaivo suljetaan erilleen toisista, ja sitä inkuboidaan 35°C:ssa kuusi tuntia. Mikrotiitterilevy tarkastetaan värinmuutosten suhteen tunnin välein, alkaen tunnin päästä inkubaation aloituk-10 sesta. Kun noin 40 % ero negatiivisen ja positiivisen kontrollin välillä on havaittavissa, levy on valmis luettavaksi. Jokaisessa kaivossa nähtävät värinmuutokset muodostavat täydellisen mallin spesifisen hiilenlähteen käytöstä, mitä käytetään mikro-organismin tunnistamiseen.

15 Esimerkki 6

Mikro-organismien erottaminen hiilenlähteiden perusteella mikrotiitterilevyillä A. Hiilidioksidi-sensorilevyjen valmistus 50 ml Kodak Universal Indicatoria haihdutettiin 20 kuiviin ja suspendoitiin uudelleen 2 ml:aan HPLC -laatuista isopropanolia. 240 mg fenolftaleiini natriumsuolaa, liuotettuna 2 ml:aan vettä, lisättiin 1 ml:aan konsentroitua Universal Indicator -liuosta. 150 mikrolitraa CAPS-puskuria (3-(sykloheksyyliamino)-1-propaanisulfonihappo), 25 pH 10,4, 500 mM, sekoitettiin fenolftaleiini/Universal

Indicator -liuokseen. Tämä liuos lisättiin 10 grammaan GE RTV 615 A silikonia, josta oli poistettu kaasua 15 minuutin ajan. Silikoni ja indikaattoriemulsio sekoitettiin käsin sekoittamalla. 0,1 grammaa valkoista silikonipig-30 menttiä ja 2 grammaa GE RTV 615 B:tä lisättiin seokseen.

Seosta sekoitettiin käsin ja siitä poistettiin kaasuja 15 minuutin ajan. Emulsio siirrettiin paineistettuun ruiskuun, joka oli asennettu "air brush" sumuttimeen, ja ruiskutettiin 24 kaivon polystyreenilevylle, jolle oli aiemmin 35 ruiskutettu kaksi kerrosta GE silikonipohjustetta SS 4120.

24 97547

Indikaattori/silikoniemulsiota ruiskutettiin kaivoihin kylliksi päällystämään pohjapinta. Levy asetettiin sitten kostutettuun uuniin ja kovetettiin 50°C:ssa yli yön. Tämä ruiskutusprosessi toistettiin kolmena peräkkäisenä päivänä 5 niin, että kaivoissa oli yhteensä kolme päällystyskerros-ta.

B. Testausmenetelmä

Kahta organismia, Eschericia coli (ATCC numero 11775) ja Pseudomonas aeruginosa (ATCC numero 1014), mo-10 lemmat tyyppikantoja, kasvatettiin yli yön (17 tuntia) kompleksisella alustalla, kuten Esimerkissä 3 C on kuvattu, 37°C:ssa, ravistelussa. Organismit kerättiin, sentri-fugoitiin alas 11950-X-g:llä 4°C:ssa 20 min. Supematantti kadettiin pois ja organismit suspendoitiin uudelleen 0,9 % 15 steriiliin suolaliuokseen optiseen tiheyteen OD660 = 5,0.

Jokainen käsitellyn mikrotiitterilevyn kaivo sisälsi 1 ml yhtä seuraavista kolmesta ravintoalustasta: a) minimaalialusta, puskuroitu 50 mM Hepes-pusku-rilla, pH 7,2, ei hiilenlähdettä (negatiivinen kontrol- 20 li); b) sama alusta kuin negatiivisessa kontrollissa, paitsi että se sisälsi 0,5 % bromimeripihkahappoa; ja c) määrittämätön alusta Tryptikaasi-soija-hiiva-uutealustaa, puskuroitu 50 mM Hepes-puskurilla, pH 7,2 25 (positiivinen kontrolli)

Kaksikymmentä mikrolitraa jokaista valmisteltua organismia lisättiin kahteen, jokaista ravintoalustatyyppiä sisältävään verrokkikaivoon.

Kaivot suljettiin korkeilla ja levyjä inkuboitiin 30 37°C:ssa. Sensorin värinmuutokset levyn pohjalla havain noitiin silmänvaraisesti kuuden tunnin aikana. Noin neljän tunnin jälkeen voitiin havaita kaksi eriävää mallia. Kummankaan organismin negatiiviset kontrollit eivät muuttaneet väriä (kaivot säilyivät purppuraisina). E. colin po-35 sitiiviset kontrollikaivot muuttuivat purppurasta vihreik- 25 97547 si, siitä keltaisiksi, siitä oransseiksi, indikoiden sensorin pH:n muutosta 10:stä noin 6:een. P. aeruginosan positiiviset kontrollikaivot muutuivat purppurasta vihreiksi ja siitä keltaisiksi (sensorin pH:n muutos 10:stä noin 5 7:ään). Kaivoissa, joissa oli bromimeripihkahappoa, näkyi suurin ero organismien välillä. Tämä korreloi kahden organismin eroavan kyvyn kanssa kasvaa ja tuottaa C02, kun ne käyttävät tätä hiilenlähdettä. Bromimeripihkahappo on edullinen hiilenlähde P. aeruginosalle, kun taas E. coli 10 pystyy käyttämään tätä hiilenlähdettä vain vähäisessä määrin tuottamaan C02. Neljän tunnin inkubaatioajan kuluessa väri kaivoissa, joissa oli bromimeripihkahappoa ja E. coli, vaihtui purppurasta vihreään, indikoiden sensorin pH:n muutosta 10:stä 8,5:een. Kaivot, jotka sisälsivät 15 bromimeripihkahappoa ja P. aeruginosan, muuttivat väriä purppurasta vihreään, siitä keltaiseen ja siitä oranssiin neljän tunnin kuluessa. Tämä värinmuutos indikoi pH:n muutosta 10:stä noin 6:een.

Sensorit osoittivat täten E.colin ja P. aeruginosan 20 tyyppikantojen eron, mitä tulee niiden kykyyn käyttää bromimeripihkahappoa hiilenlähteenään.

Mikrobien tunnistus perustuen kasvun inhibitioon

Mikrobien tunnistus käyttäen kuvattuja C02-senso-reita, voi myös perustua kasvun inhibition periaatteelle.

25 Tämä menetelmä poikkeaa klassisista biokemiallisista tunnistusmenetelmistä, vaikka tunnistus perustuu inhiboivien aineiden, kuten väriaineiden, antibioottien ja muiden aineiden aiheuttamaan selektiiviseen kasvun estoon. Jälleen kerran, C02:n tuotto on kasvun mittana. Kasvumallilla, joka 30 ilmenee näiden inhiboivien aineiden läsnäollessa, tunnistetaan testattava mikro-organismilaji. Kasvun määrää verrataan kasvukontrollikaivoon, joka ei sisällä inhibiittoria. Profiili johdetaan käyttäen kaksivaiheista toisen asteen erotusanalyysiä (two-stage quadratic discriminate 26 97547 analysis), joka pohjautuu inhiboivien aineiden testisarjan antamiin tuloksiin.

Tämä tunnistustapa on nopea menetelmä, josta saadaan tulokset 3-6 tunnissa. Jälleen kerran, tällä tavalla 5 voidaan testata puhdistettuja mikro-organismikantoja, jotka on kasvatettu agarmaljoilla, kuten tavanomaisissa menetelmissä, mutta siinä voidaan käyttää ymppinä myös suoraan ruumiinnesteitä, kuten verta, tai ruumiinnesteitä, joita on viljelty mikro-organismipopulaation lisämiseksi, sillä 10 häiritsevät aineet eivät vaikuta siihen.

Esimerkki 6.

Inhibitiomalli testimikro-organismeille käyttäen silikoniemulsio C02-sensoreita

Mikrotiitterilevyt (96 litteäpohjäistä kaivoa), 15 jotka sisälsivät 0,05 % ksylenolisini-silikoniemulsiosen-soria, täytettiin 100 mikrolitralla mikrobien kasvatusalustaa, joka ei sisältänyt inhibiittoreita (kasvun kontrollikaivot) ja kahdeksallatoista erilaisella väriaineella, antibiootilla ja muulla inhiboivalla aineella.

20 inhibiittorien lopulliset konsentraatiot saatiin lisäämällä 100 mikrolitraa ymppiä (lopullinen ympin määrä 5 x 107 cfu/ml) asiaankuuluvaa mikro-organismia. Inhibiittoreiden konsentraatiot määritettiin ennalta antamaan eroa kasvun määrille (inhibitio), jotta saadaan malli, joka on erilai-25 nen eri gram-negatiivisten mikro-organismilajien välillä.

Mikrotiitterilevy suljettiin siirrostuksen jälkeen paineelle herkällä muovi-levynsulkijalla ja alkulukemat mitattiin reflektanssimittarilla. Levy asetettiin sitten 37°C:een inkubaattoriin. Neljän tunnin inkubaation jälkeen 30 levy poistettiin ja lopulliset reflektanssilukemat otettiin.

Tulokset Taulukossa 3 osoittavat kasvumallin, ei kasvua, tai keskimääräisen kasvun neljälle testiorganis-mille kahdeksantoista inhibiittorin kanssa. Inhibitiomal-35 li on selkeästi erilainen jokaiselle testatulle mikro-or- 27 97547 ganismilajille, siten erottaen organismin toisista lajeista.

Taulukko 3

Inhibitiomalli testiorganismeille käyttäen silikoniemul- 5 siosensoreita

Inhiboiva Escherichia Proteus Pseudomonas Alcaliqenes coli mirabilis aeruginosa odorans aine 335B21 ^1583- -Ϊ35ΙΪ~ "33585'

Akriflaviini 5%a 68% ST% 55% 30 mcg^

Brilliant vihreä 1°4% 84\ 101% 37%

Kobolttikloridi *7% ®7% 7^% SYLiini 78-cg”' 107' 56' »«'

Sykloseriini 8% 26% 66% 27% 240 meg

Dibromisalisyyli- 83% 38% 88% 25% 15 happo 750 meg

Dodekyyliamiini 99% 108% 118% 106% 18,75 meg

Floksuridiini 35% 79% 75%

Malakiittivihreä 107% 87% 66% 3 meg

Metyleenisini ^0% ®0% 90% 56% 255 meg 20 Omadiinidisulfidi 71% 94% 36% 5,5 meg

Natriumatisidi 35% 47% 47% 75 meg

Thallous-asetaatti40% 68% 34% 47% 150 meg

Karbenisilliini 54% 69% 89% 77% 40 meg

Kefaiotiini 53% 26% 108% 66% „ 13,5 meg

Kolistiini 3% 114% 34% -44% 13 meg

Kanamysiini 66% 44% 105% 95% 5,4 meg

Novobiosiini 9% 48% 85% 16% 48 meg 1 2 3 4 5 6 2 1. American Type Culture Collection (ATCC) numero 3 2. Kasvuprosentti antibiootin läsnäollessa verrattuna kas 4 vun kontrolliin. Jossa ei ollut antibiootteja. Kasvu on 5 määritetty reflektanssimääränä emulsiosensorista, joka 6 mittaa tuotetun hiilidioksidin määrän.

97547 28

Kuten edellä on kuvattu, olemassaolevat tekniikat mikrobien testaamiseksi pohjautuvat visuaaliseen tai foto-metriseen, testiorganismien kasvusta johtuvan sameuden määritykseen, tai kasvun määrittämiseen fluorogeenisten 5 substraattien käytön avulla. Keksinnön mukaiset polymee-riemulsio C02-sensorlt määrittävät kasvun testiorganismien tuottaman C02:n määrän mukaan.

Antimikrobinen herkkyys C02-sensoritekniikkaamme voidaan käyttää kolmella 10 antimikrobisen herkkyyden mittausmenetelmällä. Ensimmäinen menetelmä on klassinen menetelmä, jolla määritetään antibioottien pienin inhiboiva konsentraatio (minimal inhibitory concentrations, MIC) testiorganismille. Laimennus-sarja, jossa laimennuskerroin on kaksi, valituista anti-15 biooteista pitoisuuksissa, jotka kattavat systeemisen terapeuttisen alan, tehdään mikrotiitterilevyn kaivoihin, jotka sisältävät kasvatusalustaa ja C02-sensorin. Kaivoihin ympätään noin 105 CFU/ml testiorganismia ja kaivot suljetaan. Levyä inkuboidaan 37°C:ssa 24 tuntia. Inkubaation 20 jälkeen on pienin inhiboiva konsentraatio tietylle antibiootille siinä kaivossa, jossa on sen laimein liuos, joka ei aiheuta sensorin muutosta, mitattuna visuaalisesti tai reflektanssilla, mikä indikoi C02:n tuoton puuttumista ja siten testiorganismin kasvun puuttumista.

25 Toinen menetelmä on nopea MIC määritys käyttäen kah ta ennalta määritettyä antibioottikonsentraatiota, jotka kattavat käyttökelpoisen systeemisen terapeuttisen alan, ja kasvun kontrollikaivoa. Kaivoihin ympätään noin 106-107 CFU/ml testiorganismia, ne suljetaan, ja niitä inkuboidaan 30 37°C:ssa 3-6 tuntia. Inkubaatioajan kuluessa C02-sensoreita tarkkaillaan reflektometrillä ottaen jatkuvia, ajoittaisia tai alku- ja loppulukemia. Pienin inhiboiva konsentraatio antibiootille tietyn mikro-organismin suhteen voidaan määrittää regressioanalyysillä arvoista, jotka määrittävät 29 97547 C02-tuoton tason, tuoton nopeutumisen tai C02:n kokonaistuoton .

Kolmas menetelmä herkkyyden testaamiseksi on myöskin nopea menetelmä, joka vaatii 3-6 tunnin inkubaation.

5 Kuitenkin, tässä menetelmässä käytetään vain yhtä antibi-oottikonsentraatiota kasvatusalustassa. Se sisältää kasvun kontrollin, ja siinä edellytetään testiorganismiympin olevan noin 105-107 CFU/ml. Sensoreilla tarkkaillaan C02-tuot-toa, ja vertailu ennalta tunnettuihin tunnusmerkkeihin 10 indikoi, onko testiorganismi herkkä, kohtalaisen herkkä vai resistentti tietylle antibiootille.

Mikro-organismien puhdaskantoja, jotka on eristetty potilasnäytteistä käyttäen tavanomaisia mikrobiologisia menetelmiä, voidaan käyttää tässä C02 sensorimenetelmässä.

15 Keksinnön tarjoama suuri etu on kuitenkin se, että suora ymppäys potilasnäytteillä tai veriviljelyillä on mahdollista ilman, että organismia tarvitsee eristää, sillä häiritsevät aineet, kuten veressä tai muissa ruumiinnesteissä esiintyvät aineet, eivät vaikuta kasvun osoittamiseen täl-20 lä menetelmällä. Potilaiden verinäytteitä tai muita ruumiinnesteitä sisältäviä näytteitä voidaan ensin viljellä inkuboimalla niitä, jotta mikro-organismipopulaatiota lisätään. Näytettä voidaan käyttää suoraan ymppäykseen vielä viljelyn jälkeenkin.

25 Esimerkki 7

Antimikrobinen herkkyysmalli testimikro-organismeil-le käyttäen silikoniemulsio C02-sensoreita Mikrotiitterilevyt (96 tasapohjaista kaivoa), jotka sisälsivät 0,05 % ksylenolisini-silikoniemulsiosensoria 30 kaivojen pohjalla, täytettiin 100 mikrolitralla mikrobien kasvatusalustaa, joka ei sisältänyt antibiootteja (kasvun kontrollikaivot), tai joka sisälsi jotakin yhdeksästä eri antibioottiluokkiin kuuluvista antibiooteista. Antibioottien lopulliset konsentraatiot saatiin lisäämällä 100 mik-35 rolitraa ymppiä (lopullinen ymppi 5 x 107 CFU/ml) asiaan- - 97547 30 kuuluvaa mikro-organismia. Käytetyt antibioottien konsen-traatiot edustavat niitä, joita käytettiin määrittämään, onko testiorganismi herkkä, kohtalaisen herkkä vai resistentti tietylle antibiootille. Mikrotiitterilevy suljet-5 tiin siirostuksen jälkeen paineelle herkällä muovi-levyn- sulkijalla, ja alkulukemat mitattiin reflektanssimittaril-la. Levy asetettiin sitten 37°Creen inkubaattoriin. Neljän tunnin inkubaation jälkeen levy poistettiin ja lopulliset reflektanssilukemat mitattiin.

10 Tulokset Taulukossa 4 osoittavat kasvumallin, ei kasvua, tai keskimääräisen kasvun neljälle testiorganis-mille yhdeksän antibioottiluokan kanssa. Tämä osoittaa organismin herkkyystyypin antibiooteille. Testatut organismit eroavat herkkyysmalliltaan fysiologisen luonteensa 15 erojen vuoksi.

II

31 97547

Taulukko 4

Antlmikrobinen herkkyysmalli testimikro-organis-meille käyttäen silikoniemulsio C02-sensoreita Mikro-organismi 5 Antibiootti Escherichia Pseudomonas Staphylococcus Streptococcus coli aeruginosa aureus faecalis 291941 2 3 27Θ53 25923 29212

Metisilliini lll%a 146% 16% 116% 5 mcg3 10

Penisilliini G 103% 149% 45% 108% 0,2 units

Kanamysiini 91% 72% 13% 95% 22 meg 15 Klooriamfenikoli 14% 88% 45% 19% 4 meg

Tetrasykliini 76% 120% 15% 109% 0. 5 meg

Vankomysiini 94% 106% 22% 15% 20 10 mcg

Nalidiksaanihappo 18% 109% 80% 116% 15 meg

Nitrofurantoiini 14% 112% 33% 110% 15 meg 25

Trimetopriimi/- 88% 86% 86% 80% sulfa 18 meg

American Type Culture Collection (ATCC) numero 30 2. Kasvuprosentti antibiootin läsnäollessa verrattuna kas 2 vun kontrolliin, jossa ei ollut antibiootteja. Kasvu on määritetty reflektanssin määränä emulsiosensorista, mikä mittaa tuotetun hiilidioksidin määrän.

3

Mikrogrammaa millilitrassa 35

Claims (28)

32 97547

1. Väline näytteen biologisen aktiivisuuden jatkuvaan tarkkailuun, tunnettu siitä, että se käsit- 5 tää suljettavissa olevan, sulkuvälineellä varustetun näy-tesäiliön, jossa on sisällä kammio, jossa näytettä voidaan viljellä kasvatusalustassa, ja sensorin, jolloin muutoksia sensorin ulkonäössä voidaan tarkkailla jatkuvasti mainitun säiliön ulkopuolelta läpinäkyvän osan läpi siten, 10 ettei biologisen aktiivisuuden tarkkailu häiritse mainitun säiliön koskemattomuutta sulkemisen jälkeen, mainitun sensorin käsittäessä membraanin ja indikaattoriaineen, joka indikaattoriaine on valittu niin, että sillä on kyky ilmaista havaittavissa oleva muutos, kun se saatetaan or-15 ganismin metabolisen aktiivisuuden tuotteiden vaikutuksen alaiseksi, ja jonka säiliön mainittu sulkemisväline käsittää mainitun sensorin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnettu siitä, että sulkemisväline, jota käytetään säi- 20 liön sulkemiseen, käsittää mainitun läpinäkyvän osan.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnettu siitä, että sensori ruiskutetaan läpinäkyvään osaan.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, t u n -25 n e t t u siitä, että indikaattoriaine käsittää vähintään yhden molekyylilajin, joka on herkkä pH:lie.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnettu siitä, että indikaattoriaine on molekyylilaji, joka on herkkä NH3:n läsnäololle.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen väline, tun nettu siitä, että indikaattoriaine käsittää molekyy-lilajien yhdistelmän, joka on herkkä sarjalle eri pH:itä.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnettu siitä, että sensori käsittää varauksellisen 3 5 membraanin. Il 33 97547

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen väline, tunnettu siitä, että sensori käsittää positiivisesti varatun membraanin.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen väline, t u n -5 n e t t u siitä, että sensori käsittää negatiivisesti varatun membraanin.

10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen väline, tunnettu siitä, että sensori käsittää positiivisesti varatun nylonmembräänin.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tun nettu siitä, että sensori on erotettu näytteestä mainitussa säiliössä puoliläpäisevällä membraanilla.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen väline, t u n -n e t t u siitä, että puoliläpäisevä membraani käsittää 15 membraanin, joka on muodostettu in situ.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnettu siitä, että sensori käsittää indikaattoriaine-pisaroita, jotka on immobilisoitu polymeerimatriisiin, ja polymeerimatriisi muodostaa membraanin.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tun nettu siitä, että sensori käsittää indikaattoriaineen ja vähintään yhden onton läpäisyvälineen, jolloin toinen pää on yhteydessä sensoriin, minkä avulla neste, joka kulkee onttoon läpäisyvälineeseen, joutuu kontaktiin sensorin 25 kanssa, ja jolloin läpäisyvälineen toinen pää tunkeutuu suljettavan säiliön sulkuvälineen läpi.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen väline, tunnettu siitä, että sensori käsittää vähintään kaksi läpäisyvälinettä, jotka ovat yhteydessä indikaattoriainee- 30 seen.

16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen väline, tunnettu siitä, että membraani on varauksellinen membraani .

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen väline, t u n- 35. e t t u siitä, että varauksellinen membraani on positiivisesti varattu membraani. 34 97547

18. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnettu siitä, että se käsittää suuren määrän erillisiä näytesäiliöitä, jolloin ainakin yksi säiliöistä sisältää sensorin.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen väline, tun nettu siitä, että se käsittää mikrotiitterilevyn.

20. Patenttivaatimuksen 18 mukainen väline, tunnettu siitä, että sensori on viety jokaisen säiliön sisään nestemäisenä emulsiona, joka on kovetettu in situ.

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen väline, tun nettu siitä, että emulsio pannaan sisään jokaiseen kuoppaan ruiskuttamalla.

22. Menetelmä mikro-organismin herkkyyden määrittämiseksi Inhiboivalle aineelle, tunnettu siitä, 15 että ennalta määrätty määrä inhiboivaa ainetta laitetaan patenttivaatimuksen 19 mukaisen mikrotiitterilevyn kuoppaan, laitetaan kuoppaan viljelty näyte, joka sisältää 20 mikro-organismeja, suljetaan kuoppa inhiboivan aineen ja näytteen si-säänpanon jälkeen, inkuboidaan kuoppaa ja osoitetaan indikaattoriaineessa tapahtuneet muu- 25 tokset, jotka mikro-organismien metaboliaprosesseissa tuo tetut kaasut ovat aiheuttaneet.

23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljeltyä näytettä käytetään suoraan erottamatta tutkittavia mikro-organismeja muista 30 kiinteistä tai värillisistä aineista näytteessä, ja että inhiboiva aine on antibiootti. Il 35 97547

24. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ennalta valittuja inhiboivia aineita laitetaan ennalta määritellyt määrät suureen määrään yksittäisiä kuop-5 pia, laitetaan viljelty näyte, joka sisältää mikro-organismeja, jokaiseen yksittäiseen kuoppaan sekä kontrolli-kuoppiin, jotka eivät sisällä inhiboivaa ainetta, suljetaan kuopat, 10 inkuboidaan suljettuja kuoppia ja osoitetaan indikaattoriaineessa tapahtuneet muutokset, jotka mikro-organismien metaboliaprosesseissa tuotetut kaasut ovat aiheuttaneet.

25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi kasvu mallin määrittelyn, ei kasvua- tai keskimääräisen kasvun määrittelyn kuopista, jotka sisältävät inhiboivia aineita, ja kasvun mallin vertailun eri tyyppisten organismien tunnettuihin kasvumalleihin.

26. Menetelmä mikro-organismien tunnistamiseksi, tunnettu siitä, että erilaisia spesifisiä hiilenlähteitä sisältävää ravintoalustaa laitetaan patenttivaatimuksen 18 mukaisen välineen säiliöihin, 25 jokaiseen säiliöön siirrostetaan ymppi, suljetaan jokainen säiliö, inkuboidaan suljettuja säiliöitä, osoitetaan indikaattoriaineessa tapahtuneet muutokset, jotka mikro-organismien metaboliaprosesseissa tuote- 30 tut kaasut ovat aiheuttaneet, ja verrataan indikaattoriaineen muutoksia eri säiliöissä, jotta havaitaan kasvumalli.

27. Väline näytteen biologisen aktiivisuuden jatkuvaan tarkkailuun, tunnettu siitä, että se käsit- 35 tää suljettavan näytesäiliön, joka sisältää kammion, jossa 36 97547 näytettä voidaan viljellä kasvatusalustassa, ja vääntymään pystyvän sulkuvälineen, joka käsittää pietsosähköisen laitteen, jonka avulla tuotetaan mitattavia sähköisiä signaaleja, kun sulkuväline ja sen pietsosähköinen laite 5 vääntyy säiliössä tapahtuvan paineenmuutoksen seurauksena, jonka paineenmuutoksen aiheuttaa organismien metabolinen aktiivisuus säiliössä.

28. Sensori, tunnettu siitä, että se käsittää vähintään yhden onton läpäisyvälineen suljettavan 10 säiliön sulkuvälineen lävistämiseksi, jonka välineen toinen pää on upotettu sensoriin, ja vääntyvän osan, joka käsittää pietsosähköisen laitteen, jonka avulla sensorin vääntyvän osan vääntyminen onton läpäisyvälineen sisällä tapahtuvan paineen muutoksen seurauksena aiheuttaa mitat-15 tavien sähköisten signaalien tuoton pietsosähköisessä laitteessa. ti 37 97547