CN102656275A - 用于中和培养基中的抗生素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于中和、结合和/或失活受试样品中的抗微生物剂的方法和装置。本发明还涉及通过在包含一种或多种含伯胺化合物的培养基中培养受试样品以检测受试样品中一种或多种微生物的存在的方法。

Description

用于中和培养基中的抗生素的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求本文并入的2009年7月1日递交的美国临时专利申请第61/269,953号，名称为“Method for Neutralization of Antibiotics in a CultureMedium(用于中和培养基中的抗生素的方法)”的权益。
发明领域
本发明涉及受试样品或培养基中的抗生素的中和和/或失活。本发明还涉及培养和检测可能存在于受试样品中的微生物的方法。
发明背景
在培养和检测微生物的领域中，专用培养瓶和用于固定培养瓶的机器通常用于检测受试样本中微生物的存在。例如在本文通过引用并入的美国专利第4,945,060号、第5,094,955号和第5,162,229号中公开的那些瓶子具有培养基和位于瓶子内部的传感器，所述传感器经历由存在于瓶中的微生物的生长引起的可检测的变化。以例如在本文通过引用并入的美国专利第5,164,796号和第5,217,876号中所公开的光发射器和探测器，从培养瓶外部通过培养瓶的透明壁监测传感器的变化。对于大部分测定，为获得最佳结果应振荡培养瓶。例如在本文通过引用并入的美国专利第5,074,505号中公开的那些夹子，能够在振荡期间将培养瓶固定在孵育机器中的适当位置。
生物流体中的病原微生物的检测应在可能的最短时间内进行，尤其在败血病的情形，尽管对医生来讲有可利用的广范围的抗生素，其死亡率仍维持高水平。为增加病人的存活机会，医师经常对患者施予抗生素或抗生素的混合物。但是，尽可能快地确定合适的抗生素治疗是重要的。不幸的是，当培养患者的体液样品以鉴定和分离可能存在的感染性微生物时，之前施予患者的抗生素可干扰培养过程。另外，医学样品可包含可能天然含有微生物抑制剂的血清、血浆和裂解的红细胞。工业样品例如药品和食品也可能包含抑制微生物生长的抗微生物剂或防腐剂。除此之外，当制备培养基时，以压力下的很高温度对培养基高压灭菌可导致对微生物有毒的副产物的形成。这些抑制性或杀菌性物质的去除或中和对检测微生物污染是必要的。
树脂和非树脂吸附剂的使用是众所周知的，且已在此前描述用于医疗诊断过程中的使用。特别地，已表明这些树脂和非树脂吸附剂在从血液样品去除抗生素和其他抗微生物剂方面是有用的。医学样品中的这些抑制剂的去除允许微生物的恢复和更快速的检测，以使微生物的鉴定和准确的抗生素敏感性测试能够进行。
本文通过引用并入的Melnick等人，美国专利第4,145,304号描述了使用合成阴离子交换树脂和非离子树脂以从体液去除包括抗生素的抗微生物剂，从而允许使用标准培养技术恢复病原体。所述树脂用非离子去污剂包被以选择性去除带电荷的抗生素同时抑制细菌粘附到树脂上。用树脂处理样品后，将洗脱物培养在生长培养基中。树脂结合抗生素的程度被表明为取决于树脂的总交换能力、孔径和表面积。
本文通过引用并入的Waters美国专利第4,632,902号描述了借助于将离子交换树脂和非功能吸附树脂直接掺入到生长介质中而对Melnick的改进。被去除的抑制剂包括施予患者的抗生素和包含于血清、血浆和裂解的红细胞中的天然存在的抑制剂。使用前未用非离子去污剂或表面活性剂包被树脂且树脂的孔的大小不是关键的。
本文通过引用并入的Thorpe等人，美国专利第5,162,229号和第5,314,229号描述了使用树脂和非树脂吸附剂以中和、结合或抑制可能存在于生物样品中的抗微生物物质。所述树脂和非树脂吸附剂包括氧化铝、天然水合硅酸铝胶体、结晶水合碱性硅酸铝、硅石、硅质硅藻(siliceousfrustules)、各种种类的硅藻(diatoms)片段、无定型碳、离子交换树脂、非功能聚合物树脂吸附剂、用二乙烯基苯交联的聚苯乙烯树脂和其组合。
尽管已知合成树脂和非树脂吸附剂可去除含有体液的培养物中的抑制性物质，这些树脂和非树脂吸附剂可能在中和或去除某些类型的抗生素中是无效的。例如，某些β-内酰胺通常用于治疗败血症，且它们在血液样品中的存在可干扰导致败血症的微生物的恢复、检测和鉴定。特别地，已证明目前本领域中使用的从血液样品中去除抗微生物剂的树脂和非树脂吸附剂在中和碳青霉烯时是极大地无效的。因此找到中和或抑制体液和非体液样品例如食品和工业产品中的抗生素的其他手段是所期望的。
本发明提供用于中和或抑制受试样品中的抗微生物剂的手段，同时帮助保留以快速方式恢复和检测微生物必要的培养基成分。通过找到用于中和和/或失活培养基中以前不能被有效中和或失活的β-内酰胺(例如，碳青霉烯)的手段，本发明解决了本领域中长期以来的需要。
发明概述
一方面，本发明包含包括使用一种或多种含伯胺化合物以中和、结合、抑制或以其他方式失活生长或培养介质中的抗微生物物质(例如，一种或多种抗生素)的装置或方法。在一个实施方案中，本发明涉及用一种或多种含伯胺化合物中和、抑制或失活培养基(例如，血液培养物)中的一种或多种抗生素。
本发明还涉及用于中和和/或失活培养基(例如，血液培养物)中的抗微生物剂的方法，该方法包括向能够支持微生物生长的培养基中加入一种或多种含伯胺化合物，其中所述一种或多种含伯胺化合物以有效中和和/或失活存在于所述培养基中的任何碳青霉烯的量存在。在一个实施方案中，抗微生物剂为碳青霉烯。在另一个实施方案中，伯胺为不含硫醇的伯胺。
另一方面，本发明涉及用于增强培养中的微生物的恢复和检测的方法，所述方法包括：(a)制备培养基；(b)以有效中和、结合或抑制所述培养基中的抗微生物物质的量向培养基中加入至少一种含伯胺化合物；(c)用样品接种培养基；和(d)孵育和确定结果。在一个实施方案中，抗微生物剂为碳青霉烯。在另一个实施方案中，伯胺为不含硫醇的伯胺。
又另一方面，本发明涉及用于诊断由微生物引起的感染的方法，包括如下步骤：(a)获得待确定微生物存在或不存在的样本样品或受试样品，且其中所述样本样品或受试样品可包含可干扰所述微生物的生长和/或检测的一种或多种抗微生物剂；(b)向培养基中加入所述样本样品或受试样品，所述培养基包含有效中和、结合或抑制所述一种或多种抗微生物剂的量的至少一种含伯胺化合物；和(c)分析所述培养物中所述微生物的存在，其中所述微生物存在的检测表示对于所述感染的阳性诊断。在一个实施方案中，所述抗微生物剂为碳青霉烯。在另一个实施方案中，所述伯胺为不含硫醇的伯胺。又在另一个实施方案中，所述微生物的检测包括所述培养基中的所述微生物的生长的检测。
还另一方面，本发明涉及用于检测怀疑存在于样本中的微生物的装置，该装置包括可密封的样本容器，所述样本容器包括在其中可培养所述样本于培养基中的内腔，所述培养基包含至少一种含伯胺化合物，其中所述含伯胺化合物中和和/或失活可能存在于所述样本中的抗生素。
又另一方面，本发明涉及用于检测受试样品中的微生物的试剂盒，所述试剂盒包括：(1)可密封的样本容器，其具有含有培养基并可在其中培养待确定微生物存在或不存在的受试样品的内腔；和(2)补充物(supplement)，所述补充物包含一种或多种含伯胺化合物。根据本发明的这一方面，所述补充物可加入到容纳于可密封样本容器中的培养基中，因此以有效中和、结合或抑制可能存在于所述培养基中的任何抗微生物剂的量提供一种或多种含伯胺化合物。受试样品可在补充物加入培养基的同时或之后加入到培养基中，补充物以有效中和、结合或抑制可能存在于所述受试样品中的任何抗微生物剂的量提供所述一种或多种含伯胺化合物。
附图简述
图1A-为半胱氨酸存在下反应时间为0分钟之后的亚胺培南的尺寸排阻层析(SEC)的层析图。
图1B-为半胱氨酸存在下反应时间为20分钟之后的亚胺培南的尺寸排阻层析(SEC)的层析图。
图1C-为半胱氨酸存在下反应时间为60分钟之后的亚胺培南的尺寸排阻层析(SEC)的层析图。
图1D-为半胱氨酸存在下反应时间为90分钟之后的亚胺培南的尺寸排阻层析(SEC)的层析图。
图2A-为没有半胱氨酸，反应时间为0分钟之后的亚胺培南的尺寸排阻层析(SEC)的层析图。
图2B-为没有半胱氨酸，反应时间为20分钟之后的亚胺培南的尺寸排阻层析(SEC)的层析图。
图2C-为没有半胱氨酸，反应时间为60分钟之后的亚胺培南的尺寸排阻层析(SEC)的层析图。
图2D-为没有半胱氨酸，反应时间为90分钟之后的亚胺培南的尺寸排阻层析(SEC)的层析图。
图3-为表明半胱氨酸对亚胺培南存在下的金黄色葡萄球菌(S.aureus)的恢复作用的盒图。
发明详述
本发明提供用于检测含有或怀疑含有微生物的样本或受试样品中微生物的存在的方法。根据本发明，该方法包括化学中和方法，该化学中和方法包括使用含伯胺化合物以中和、结合、抑制或以其他方式失活生长或培养介质中的抗微生物物质(例如，抗生素)。在一个实施方案中，本发明涉及用含伯胺化合物中和、抑制或失活血液培养基中的一种或多种抗生素。在某些实施方案中，该含伯胺化合物可以是不含硫醇的化合物和/或羟胺。
可通过本发明的方法测试的样品包括其中怀疑或可能怀疑微生物存在和/或生长的临床和非临床样品，也包括常规或偶尔测试微生物的存在的材料的样品。受试样品可通常从约0.5ml至约50ml、从约1ml至约10ml、或从约2ml至约5ml变化。
可测试的临床样本或样本样品包括通常在临床或研究实验室中测试的任何类型的样品，包括但不限于血液、血清、血浆、血液部分(bloodfractions)、关节液、尿、精液、唾液、排泄物、脑脊液、胃内容物、阴道分泌物、组织匀浆、骨髓吸出物、骨匀浆、痰、吸出物、拭子和拭子冲洗物，其他体液，及类似物。在本发明的一个实施方案中，样品从具有或怀疑具有微生物感染的受治疗者(例如，患者)获得。在一个实施方案中，受治疗者患有或怀疑患有败血病，例如，细菌败血症或真菌败血症。样品可以是直接从受治疗者取得的血液样品。
可被测试的非临床样品还包括物质，包括但不限于食物、饮料、药品、化妆品、水(例如，饮用水、非饮用水和废水)、压舱海水、空气、土壤、污水、植物材料(例如，种子、叶子、茎、根、花、果实)、血液产品(例如，血小板、血清、血浆、血液白细胞部分等)、供体器官或组织样品、生物战样品，及类似物。该方法也特别好地适合于实时测试以监测工业、商业、和/或临床环境中的污染水平、工艺控制、质量控制，及诸如此类。
本发明的第一方面涉及使用一种或多种含伯胺化合物以中和和/或失活抗生素的方法。该方法包括以有效中和、结合和/或抑制存在于或怀疑存在于受试样品的一种或多种抗生素的量向生长或培养介质中加入一种或多种含伯胺化合物。可在用受试样品接种生长或培养介质前或同时将一种或多种含伯胺化合物加入到生长或培养介质中。尽管，不希望受理论约束，但应当相信借助于伯胺与抗生素的β-内酰胺环状结构相互作用或结合，含伯胺化合物的使用提供了用于中和抗微生物剂的化学方法。伯胺可对β-内酰胺环进行亲核攻击形成共价复合物而导致β-内酰胺抗生素的失活和/或中和。接种后，以允许可能存在于受试样品中的任何微生物的生长和检测的足够的时间和足够温度下孵育生长或培养介质和受试样品。通过本领域中的任何已知装置可检测生长。例如，可使用BacT/
Figure BDA0000127273900000061
或BacT/
Figure BDA0000127273900000062
3D系统(bioMerieux，Inc.)检测生长。微生物的生长所需的时间和温度主要是物种特异性的，但通常会是从约1小时至约48小时和从约30℃至约42℃。
“有效量”意思是使用足够量的化合物以中和、结合和/或抑制存在于或怀疑存在于受试样品或培养基中的一种或多种抗生素的活性。“有效量”可以是足以产生对存在于受试样品或培养基中的一种或多种抗生素的可测量的抑制的量。抗生素的抑制可通过高效液相色谱(HPLC)或通过本领域技术人员已知的其他方法体外测量。“有效量”也可以是足以在包含抗生素的受试样品或培养基中表现微生物的可检测的生长的量，否则所述抗生素的活性将抑制或消除可检测的生长。“有效量”可以不必是完全消除存在于或怀疑存在于生长或培养介质中的一种或多种抗生素的活性的量。然而，在本发明的实践中，生长或培养介质中的一种或多种含伯胺化合物的“有效量”的使用允许微生物的生长或培养，否则其可因为被根据本发明的含伯胺化合物中和、结合和/或抑制的一种或多种抗生素的存在而被抑制或消除。通常，一种或多种含伯胺化合物的“有效量”是允许其在生长或培养介质中的终浓度为从约0.1g/L至约20g/L、从约0.5g/L至约10g/L，或从约1g/L至约5g/L的量。
在一个实施方案中，本发明是用于增强培养中的微生物的恢复和检测的方法，所述方法包括：(a)制备培养基；(b)以有效中和、结合或抑制培养基中的抗微生物物质的量向培养基中加入至少一种含伯胺化合物；(c)用待测试的样品接种培养基；和(d)孵育和确定结果。在另一个实施方案中，本发明还涉及用于中和和/或失活血液培养物中的碳青霉烯的方法，该方法包括向能够支持微生物的生长的血液培养基中加入含伯胺化合物，其中所述含伯胺化合物中和和/或失活存在于所述培养基中的任何碳青霉烯。
另一方面，本发明涉及用于诊断由微生物引起的感染的方法，包括如下步骤：(a)获得待确定微生物存在或不存在的受试样品，且其中所述受试样品可包含可干扰所述微生物的生长和/或检测的一种或多种抗微生物剂；(b)向培养基中加入所述受试样品，所述培养基包含有效中和、结合或抑制所述一种或多种抗生素的量的至少一种含伯胺化合物；和(c)分析所述培养物中所述微生物的存在(例如，所述微生物的检测或所述微生物的生长)，其中发现所述微生物的存在表示对于所述感染的阳性诊断。在向生长或培养介质中加入受试样品后，如本领域技术人员已知的，以足够的时间和足够的温度孵育生长或培养介质和受试样品，以允许可能存在于受试样品中的任何微生物的生长和检测。可通过本领域中任何已知的装置检测生长。例如，可使用BacT/
Figure BDA0000127273900000081
或BacT/3D系统(bioMerieux，Inc.)检测生长。可连续地或以特定的时间间隔获取生长读数。
通常，使用本发明的方法可中和任何已知的抗生素。一方面，本发明涉及含伯胺化合物的使用以中和和/或失活β-内酰胺抗生素。β-内酰胺抗生素是包括在其分子结构中含有β-内酰胺核心的任何抗生素剂的一大类抗生素。β-内酰胺抗生素包括但不限于青霉素、青霉素衍生物、头孢菌素、单环内酰胺、碳青霉烯和β-内酰胺酶抑制剂。
在一个实施方案中，含伯胺化合物可用来中和和/或失活青霉素和青霉素衍生物抗生素。青霉素是被称为青霉烷的一类β-内酰胺抗生素。青霉烷是共有一个相似核心骨架(R-C9H11N2O4S，其中R为可变侧链)的一组抗生素。青霉素和青霉素衍生物包括例如苄星青霉素、苄青霉素(青霉素G)、苯氧甲基青霉素(青霉素V)、普鲁卡因青霉素、苯唑青霉素、甲氧西林、萘夫西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、替莫西林、阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、羧苄青霉素、美洛西林和哌拉西林。
在另一个实施方案中，含伯胺化合物可用于中和和/或失活头孢菌素和头孢菌素衍生物。头孢菌素是共有包含7-氨基头孢烷酸的核心骨架的一组β-内酰胺抗生素。头孢菌素和头孢菌素衍生物包括例如头孢氨苄、头孢噻吩、头孢唑啉、头孢克洛、头孢呋辛、头孢孟多、头孢替坦、头孢西丁、头孢曲松、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢吡肟和头孢匹罗。
还在另一个实施方案中，含伯胺化合物可用于中和和/或失活碳青霉烯和碳青霉烯衍生物。碳青霉烯是具有广谱抗菌活性的一类β-内酰胺抗生素，且具有使其耐受β-内酰胺酶的结构。碳青霉烯和碳青霉烯衍生物包括亚胺培南、美洛培南、厄他培南、多尼培南、帕尼培南、倍他米隆、比阿培南和PZ-601。碳青霉烯在结构上与青霉素有些相似，但是在结构的位置1的硫原子已被碳原子取代，且因此该组的名字为碳青霉烯。但是，这种看起来微小的结构差异可导致在化学和生物活性方面的明显不同的作用。
又在另一个实施方案中，含伯胺化合物可用于中和和/或失活β-内酰胺酶抑制剂和β-内酰胺酶抑制剂的衍生物。β-内酰胺酶抑制剂和衍生物包括例如克拉维酸、三唑巴坦和舒巴坦。
如以上提及，根据本发明，含伯胺化合物可加入到生长或培养介质中。含伯胺化合物可在用待测试的样品接种培养基之前或与其同时直接加入到培养基中。在另一个实施方案中，含伯胺化合物可在待测试的样品加入到生长或培养介质之前直接加入到样品中。
用于微生物的培养的生长或培养介质(或培养基)的使用是已知的。合适的生长或培养介质提供了用于微生物生长的合适营养和环境条件，且应包含所要培养的微生物需要的所有营养成分。例如，示例的微生物培养基应包含水、碳源、氮源、维生素、微量元素例如钾、镁、钙和铁，和矿物质，例如硫和磷。通常地，这些需求从多种来源供应。适合繁殖条件的其他因素可包含培养基的pH、温度、通气、盐浓度和渗透压。
另外，已知可能需要某些生长因子。生长因子是为了生长微生物必须含有但通常不能合成的有机化合物。当提供了上面列出的营养成分时，许多微生物能够合成包括氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶、脂肪酸和其他化合物的其原生质的所有有机组分。通常地，这些必需化合物的每一种可通过不连续顺序的酶反应合成，其中每种酶在特定基因的调控下产生。然而，由于各种原因某些微生物不能合成这些生长因子的一种或多种，则必须从环境中获得那种化合物。所需生长因子可包括但不限于氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶、脂肪酸和其他生长所需化合物。
用于本发明的实践的生长或培养介质可以是用于微生物培养的任何已知生长或培养介质。通常，本发明的培养基包括液体营养培养基或营养肉汤。本发明的培养基或营养肉汤通常包括一种或多种已知营养成分，例如，培养基可包含一种或多种碳源(例如，甘油)、氮源(例如，铵盐)、糖、盐(例如K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+)、营养成分和/或水。在一个实施方式中，本发明的培养基还可包含一种或多种钾盐、钠盐、谷氨酸钠、柠檬酸钠、硫酸铵、吡哆醇、柠檬酸铁铵、硫酸镁、硫酸锌、硫酸铜、生物素、氯化钙，或其组合。在另一个实施方案中，可使用包括例如胰酶大豆肉汤、脑心浸出液肉汤、哥伦比亚肉汤和布氏肉汤的通用培养基。
通常，任何已知的含伯胺化合物可用于本发明的实践中。如上讨论，一种或多种含伯胺化合物可在用受试样品接种生长或培养介质之前或与其同时加入到生长或培养介质中。在一个实施方案中，所述含伯胺化合物可作为补充物在用待测试的样品接种含伯胺的培养基之前加入到培养基中。在替代实施方案中，含伯胺化合物可在用含伯胺受试样品接种培养基之前直接加入到受试样品中。有用的伯胺包括但不限于式R-NH2的伯胺，其中R为具有约1个至约20个碳原子的线性的或支链的烃基(alkyl)、芳基、烃芳基或芳烃基基团。优选的R基团包括不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、己基(线性的或支链的)、庚基、辛基、壬基、癸基、苯基、苯甲基、甲基取代的苯基，或其混合物或其组合。在一个实施方案中，伯胺为羟胺。示例的伯胺可包括甲胺、乙醇胺、缓血酸胺、丙胺、2-氨基庚烷、2-氨基-2-甲基-1，3丙二醇、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、正戊胺、苄胺、1，4-丁二胺、正丁胺、环己胺、乙胺、乙二胺、α-甲基苄胺、苯乙胺、异丙胺、丁胺、仲丁胺、异丁胺和三(羟甲基)氨基甲烷。
在某些实施方案中，可优选有机伯胺。合适的有机伯胺可包括脂肪族、脂环族、脂肪/芳香族、芳香族的胺、二胺和/或多胺，例如甲胺、乙胺、丁胺、十八烷胺、苯胺、卤素取代的苯胺(例如，4-氯苯胺)、1，4-丁二胺、1，6-己二胺、1，8-己二胺、1-氨基-3，3，5-三甲基-5-环己胺、赖氨酸乙基酯、赖氨酸氨乙基酯、1，6，11-三氨基十一烷或1，5-萘二胺、1，4-苯二胺、对苯二甲胺、全氢化2，4-和/或2，6-二氨基甲苯、2，2′-、2，4′-和/或4，4′-二氨基二环己基甲烷、2，4-、2，6-二氨基甲苯和其混合物、4，4′-、2，4′-和/或2，2′-二苯甲烷二胺和其混合物、以及这些胺和多胺的更高分子量的异聚、寡聚或多聚衍生物。其他可能的胺是现有技术中已知的。用于本发明的优选胺是二苯甲烷系列的二胺和多胺(MDA，单聚、寡聚和多聚的胺)、2，4-、2，6-二氨基甲苯(TDA，甲苯二胺)，例如以质量比为80∶20的2，4-、2，6-二氨基甲苯(TDA，甲苯二胺)的技术混合物、异佛尔酮二胺和六亚甲基二胺。相应的异氰酸酯二异氰酸根合二苯甲烷(MDI，单聚、寡聚和多聚的异氰酸酯)、甲苯二异氰酸酯(TDI)、六亚甲基二异氰酸酯(HDI)和异佛尔酮二异氰酸酯(IPDI)以光气化作用获得。
在其他的实施方案中，伯胺可以是氨基酸。示例的氨基酸包括但不限于丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在某些实施方案中，优选使用羟胺。如本领域技术人员清楚知晓的，羟胺通常包括具有式NH2OH的化合物，和其盐。示例的有用的羟胺包括但不限于甲醇胺、乙醇胺、丙醇胺、丁醇胺、戊醇胺、己醇胺、庚醇胺、辛醇胺、壬醇胺和癸醇胺。
硫醇基团或巯基基团倾向于为氧的清除剂，且因此可干扰生长或培养介质中的成分和/或生长或培养介质中的微生物生长。因此，在某些实施方案中，可优选使用一种或多种不含硫醇的伯胺。如本领域技术人员清楚知晓的，不含硫醇的伯胺可包含任何已知的不含有硫醇基团的含伯胺化合物。示例的不含硫醇的伯胺包括但不限于甲胺、乙醇胺、缓血酸胺、丙胺、2-氨基庚烷、2-氨基-2-甲基-1，3丙二醇、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、正戊胺、苄胺、1，4-丁二胺、正丁胺、环己胺、乙胺、乙二胺、α-甲基苄胺、苯乙胺、异丙胺、丁胺、仲丁胺、异丁胺和三(羟甲基)氨基甲烷。还在另一个实施方案中，可优选使用不含硫醇的氨基酸。有用的不含硫醇的氨基酸包括但不限于丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在另一个实施方案中，如本文讨论的，伯胺可结合到或固定到固相支持体或聚合物载体上，而向培养基或培养瓶加入伯胺-支持体复合物。通常，支持体可以是结合配偶体能够固定于其上的任何材料，例如硝化纤维素、硅石、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、EVA、玻璃、碳、玻璃碳、炭黑、碳纳米管或纤维、铂、钯、金、银、氯化银、铱或铑。在一个实施方案中，固相支持体可以是聚合物载体，例如改性硅胶、玻璃、尤其是“可控孔度玻璃”、聚酯、聚酰胺、聚乙烯醇、聚硅氧烷、聚苯乙烯或类似的固相支持体。在另一个实施方案中，有用的固相支持体可包括但不限于硅石和中性大孔树脂，例如苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物。
本发明的另一方面，生长或培养介质还可包含用于中和、抑制和/或去除可能存在于受试样品中的其他抗微生物物质的一种或多种吸附剂。通常，除其他以外，抗微生物物质包括抗生素、体液样品中的抗生素、防腐剂、抑菌剂、杀菌剂，和制备培养基过程中产生的任何有毒副产物。抗微生物物质还包括血液中天然存在的组分例如补体和抗体。
用于本申请目的的术语“吸附剂”包括中和、结合和抑制抗微生物物质的所有吸附剂材料。这些吸附剂包括如在美国专利第4,145,304号、第4,632,902号、第5,162,229号和第5,314,229号中所定义的树脂和非树脂吸附剂。
如本文所使用的，“树脂”是一亚类吸附剂，且被进一步定义为包括天然存在的和合成的树脂，例如离子交换树脂、非功能聚合物树脂吸附剂和，特别是，用二乙烯基苯交联的聚苯乙烯树脂。有用的树脂可包括但不限于在美国专利第4,145,304号和第4,632,902号中公开的那些树脂。例如，有用的树脂可包括带有钠、氢和铵的阳离子交换树脂例如：来自BIO-RADLaboratories的BIO REX AG 50W--X2、X4、X6、X8、X10、X12和X16、来自Dow Chemical公司的DOWEX 50W--X2、X4、X6、X8、X10、X12和X16，和来自Fisher Scientific公司的Rexyn 101，所有这些都是带有SO3-官能团的强酸聚苯乙烯树脂。有用的非功能树脂可包括由Rohm&Haas生产的XAD树脂和由BioRad出售的SM树脂。已发现例如带有氯化物、甲酸盐、醋酸盐和氢氧化物的阴离子交换树脂通常是适合的。特别地，与以如下商标出售的吸附树脂组合的带有氯化物的阴离子交换树脂在本发明的实践中可以是有效的。来自Dow Chemical公司的DOWEX 1-X8、来自DiamondShamrock公司的DOULITE A-109和来自Rohm&Haas的AMBERLITEIRA400，所有这些都是带有聚苯乙烯季铵官能团的强碱树脂；来自Diamond Shamrock公司的DOULITE A-7和来自Rohm&Haas的AMBERLITE IR45，是弱碱性的且带有叔胺官能团。在某些实施方案中，阳离子交换树脂和阴离子交换树脂可优选与非功能树脂例如来自Rohm&Haas的XAD树脂和来自BioRad的SM树脂、尤其是为苯乙烯和二乙烯基苯的非功能共聚物的XAD-4树脂组合使用。
如本文所用的“非树脂吸附剂”是另一亚类的吸附剂，且被定义为能够用于净化、脱臭、脱色和过滤的天然存在的和合成的非树脂吸附剂和分子筛。这些非树脂吸附剂中的一些与抗生素生产过程中被用来从生长产抗生素细菌的培养基中去除抗生素的那些非树脂吸附剂相同。有用的非树脂吸附剂包括在美国专利第5,162,229号和第5,134,229号中公开的那些非树脂吸附剂。例如，有用的非树脂吸附剂包括各种形式的1)氧化铝(矾土)，2)天然水合硅酸铝胶体(粘土)，例如膨润土、高岭土和漂白土，3)结晶水合碱性硅酸铝(钠或钙沸石)，4)硅石(硅胶、硅石珠)例如Davisil，5)硅质硅藻和各种种类硅藻的片段(纤毛虫土，硅藻土)例如CeliteTM(Manville Products公司，Denver，Colo.，美国)和6)无定形炭(尤其是，活性炭)例如糖用活性炭(Carboraffin)、NoritTM(American Norit CompanyInc.，Jacksonville，Fla.，美国)、Opocerbyl和Ultracarbon。也可使用已被用于阻止运送培养基和生长培养基中氧化的致死效应的天然存在的吸附剂活性炭。这种培养基已被用于例如淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)的挑剔生物体的运送和军团菌属(Legionella)物种的培养。非树脂吸附剂不需要用表面活性剂预处理以发挥功能。用表面活性剂处理甚至可减少这些材料的吸附能力。
使用与培养基合理比例的吸附剂也可去除产生于高压灭菌培养基中的毒性副产物，且还提供了最佳营养培养基同时维持中和抗微生物物质的能力。树脂和/或非树脂吸附剂可以从每瓶约0.1g至约10g存在于培养基中。
该吸附剂不限于用在装置或培养瓶中。它们可被加入到任何标准培养基中，然后用样品接种该培养基，在正确的温度下孵育持续用于被检测的样品类型的适当时间，通常同时摇动或振荡以将更多的吸附剂表面积暴露于液体，以使存在的任何生物体与营养成分更好地接触和以避免高浓度代谢副产物的区域。用于确定微生物生长所需的温度和时间段是本领域技术人员众所周知的，且在不同类型的生物体之间略微变化。
另一方面，本发明涉及用于检测怀疑存在于受试样品或样本中的微生物的装置，其包括可密封的容器，该容器包括内腔，受试样品或样本可在内腔中培养于生长或培养介质中，所述生长或培养介质含有至少一种含伯胺化合物，其中所述含伯胺化合物中和、结合和/或失活存在于所述样本中的一种或多种抗生素(例如，碳青霉烯)。在一个实施方案中，所述装置是例如在美国专利第5,094,955号和第5,162,229中所述的血液培养瓶。根据本发明的这一方面，将受试样品引入到该装置中，且孵育该装置直到或者阳性生长被检测到，或者通常地直到已经过5-7天且没有检测到生长。
在另一个实施方案中，含伯胺化合物可被包含在可在待测试的样品接种培养基之前或与其同时加入到培养基中的补充物中。在替代实施方案中，含伯胺补充物可在用含伯胺受试样品接种瓶子和培养基之前直接加入到受试样品中。补充物还可包含本领域技术人员已知的有益于微生物培养的一种或多种营养成分和/或组分。例如，本发明的补充物可另外包括一种或多种糖、碳源、氮源、矿物质、盐、氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶、脂肪酸和其他化合物。在加入补充物和用待测试的样品接种培养基之后，以足够的时间和在足够的温度孵育培养基和样品以允许可能存在于受试样品中的任何微生物的生长和检测。
另一方面，本发明涉及用于检测受试样品中的微生物的试剂盒，所述试剂盒包括：(1)可密封的样本容器，其具有包含培养基并可在其中培养待确定微生物存在或不存在的受试样品的内腔；和(2)补充物，所述补充物包含一种或多种含伯胺化合物。根据本发明的这一方面，补充物可加入到包含在可密封的样本容器中的培养基中，从而以有效中和、结合或抑制可能存在于所述培养基中的任何抗微生物剂的量提供一种或多种含伯胺化合物。受试样品可在补充物加入培养基的同时或之后加入到培养基中，补充物以有效中和、结合或抑制可能存在于所述受试样品中的任何抗微生物剂的量提供一种或多种含伯胺化合物。该试剂盒的补充物进一步包括含有一种或多种含伯胺化合物的第二容器或小瓶。在一个实施方案中，第二容器或小瓶含有悬浮于稳定缓冲液中的一种或多种含伯胺化合物。稳定缓冲液是本领域技术人员众所周知的。在另一个实施方案中，存在于所述容器或小瓶中的一种或多种含伯胺化合物可以是冻干的。根据这一实施方案，在加入到样本容器中的培养基中之前，可将冻干的一种或多种含伯胺化合物重悬于重悬缓冲液或稳定缓冲液中。还在另一个实施方案中，本发明的试剂盒可进一步提供包含所述重悬缓冲液或稳定缓冲液的第三容器或小瓶。
如本领域技术人员所知，使用例如本文通过引用并入的美国专利第4,945,060号和第5,164,796号中所述的附在容器内表面的一次性传感器，可通过检测或测量样本pH的变化或样本内CO2的产生来确定微生物的存在。根据‘060和‘796的公开内容，可在干扰性材料例如大浓度的血红细胞存在下，通过非辐射和非侵入方法检测微生物。当样本内的pH和/或CO2水平变化时，一次性传感器的光反射和/或吸收特征将相应变化。传感器的反射特征的变化量由发射和接收机制检测，该机制给装置提供信号以监测可见反射/吸收的量和变化速度。然后分析速度和量以预测和确定样本或样品内的微生物生长的存在。传感器可被连续或以频繁的时间间隔抽样和/或监测以允许收集传感器变化的量和速度的详细特征。如本领域所述，传感器装置可包括膜和指示剂培养基，指示剂培养基以其当暴露于生物体代谢活动的产物时显示可检测的变化的能力而被选择。如本领域技术人员已知的，传感器装置的外观变化可通过容器的透明部分从容器外部连续监测。
这一装置或血液培养瓶也可在培养基中包含中和、结合或抑制可能存在于培养基的受试样品中的任何其他抗微生物物质的材料，例如美国专利第4,145,304号和第4,632,902号中所述的树脂材料和如美国专利第5,162,229号和第5,314,229中所述的非树脂吸附剂材料，或者其组合。树脂和/或非树脂吸附剂可以从每瓶约0.1g至约10g存在于装置中。
本发明可体现于许多不同形式中且不应解释为局限于本文列举的实施方案。而是，提供这些实施方案以使得本公开内容详尽和完整，且将向本领域技术人员完全表达本发明的范围。例如，有关一个实施方案说明的特征可以整合到其他实施方案中，且可从该实施方案中删除有关一个具体实施方案说明的特征。除此之外，鉴于本公开内容，不偏离本发明的对本文建议的实施方案的各种改变和补充对本领域技术人员将是明显的。
除非另外限定，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域中普通技术人员通常理解的相同的含义。本文用于本发明的说明中的术语是仅为了描述具体实施方案的目的且并不是指对本发明的限制。
提供下面实施例以进一步说明本发明的特征，但并不意味着以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1.使用半胱氨酸中和亚胺培南
通过在玻璃螺旋帽管中溶解1.8克亚胺培南于10mL的14mMK2HPO4(pH 7.0)中来制备USP级亚胺培南储存溶液。通过在2mL聚丙烯离心管中溶解31.3mg半胱氨酸于1.08mL的14mM K2HPO4中来制备半胱氨酸储存溶液。
通过将2.2mL亚胺培南储存溶液和7.8mL的14mM K2HPO4组合达到终浓度40μg/mL以制备无半胱氨酸的亚胺培南反应。然后将总10mL体积加入到含有树脂吸附剂的BacT/Alert培养瓶中。短暂振荡瓶子以混合并取出500μL体积用于分析。然后在36℃将瓶子置于BacT/
Figure BDA0000127273900000161
3D仪器(bioMerieux，Inc.，Missouri，美国)中并在20、40、60和90分钟间隔取出另外的500μL样品用于分析(见图2A-2D)。
通过将2.2mL亚胺培南储存溶液和7.8mL的14mM K2HPO4组合达到终浓度40μg/mL以制备有半胱氨酸的亚胺培南反应。然后将总10mL体积加入到含有树脂吸附剂的BacT/Alert培养瓶中。然后加入半胱氨酸储存溶液的500μL样品以达到半胱氨酸终浓度为4mM。短暂振荡瓶子以混合并取出500μL体积以用于分析。然后在36℃将瓶子置于BacT/
Figure BDA0000127273900000162
3D仪器(bioMerieux，Inc.，Missouri，美国)中并在20、40、60和90分钟间隔取出另外的500μL样品用于分析(见图1A-1B)。
在配备了带有以1-mL/分钟流速的100mM Na2HPO4、ph 6.5的流动相的BioSepTM-SEC-2000(Phenomenex)尺寸排阻HPLC柱的HPLC上分析反应样品。在300nm监测反应且每个样品的总分析时间为16分钟。
含有亚胺培南和半胱氨酸的瓶子显示在20、40、60和90分钟后分别约70％、85％、89％和91％的亚胺培南减少(见表1)。但是，90分钟后仅含有亚胺培南的瓶子没有显示亚胺培南减少(见表2)。
表1-亚胺培南+半胱氨酸反应
Figure BDA0000127273900000171
表2-亚胺培南+无半胱氨酸对照
实施例2.有或没有半胱氨酸时含有亚胺培南的树脂瓶中的生长表现
通过溶解4.0mg亚胺培南于100mL的磷酸盐缓冲液(PBS)、pH 7.0中制备亚胺培南溶液，并通过0.2μ滤器过滤除菌。通过溶解300mg半胱氨酸于10mL PBS中制备半胱氨酸并通过0.2μ滤器过滤除菌，通过加入500μL以在BacT/
Figure BDA0000127273900000173
瓶(bioMerieux Inc，Missouri，美国)中达到终浓度为4mM。过夜孵育后准备金黄色葡萄球菌培养物至终浓度为30-300CFU(菌落形成单位)/500μL。
准备含有树脂吸附剂的BacT/
Figure BDA0000127273900000174
培养瓶(bioMerieux Inc，Missouri，美国)一式三份用于如下评估：
通过加入仅10mL无菌过滤的PBS或10mL无菌过滤的PBS加500μL半胱氨酸溶液准备生长对照。通过添加10mL亚胺培南溶液准备用于亚胺培南活性的对照。通过添加10mL亚胺培南溶液加500μL半胱氨酸溶液准备亚胺培南/半胱氨酸反应。每个瓶子接收500μL金黄色葡萄球菌培养物且然后在36℃置于BacT/
Figure BDA0000127273900000181
3D仪器(bioMerieux Inc，Missouri，美国)中并监测生长5天。
5天后无半胱氨酸、含有亚胺培南的所有瓶子为金黄色葡萄球菌生长阴性。然而，28小时内含有亚胺培南和半胱氨酸的3个瓶子中的2个为金黄色葡萄球菌生长阳性。

Claims (30)

1.一种用于中和和/或失活培养基中的碳青霉烯的方法，所述方法包括向能够支持微生物生长的培养基中加入一种或多种含伯胺化合物，其中所述一种或多种含伯胺化合物以有效中和和/或失活可能存在于所述培养基中的任何碳青霉烯的量存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基还包含有效中和和/或失活存在于所述受试样品中的任何其他抗生素的一种或多种吸附剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中将怀疑含有微生物的受试样品加入到所述培养基中，并在足以使得所述受试样品中的任何微生物生长的条件下培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述含伯胺化合物作为补充物在所述受试样品之前或与其同时添加到所述培养基中。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述伯胺包含式R-NH2的伯胺，其中R为具有约1个至约20个碳原子的线性的或支链的烃基、芳基、烃芳基或芳烃基基团。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述伯胺选自由甲胺、乙醇胺、缓血酸胺、丙胺、2-氨基庚烷、2-氨基-2-甲基-1，3丙二醇、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、正戊胺、苄胺、1，4-丁二胺、正丁胺、环己胺、乙胺、乙二胺、α-甲基苄胺、苯乙胺、异丙胺、丁胺、仲丁胺、异丁胺和三(羟甲基)氨基甲烷组成的组。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述伯胺为氨基酸。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述含伯胺化合物为半胱氨酸。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述伯胺固定在固相支持体上，且其中所述固相支持体为硝化纤维素、硅石、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、EVA、玻璃、碳、玻璃碳、炭黑、碳纳米管或纤维、铂、钯、金、银、氯化银、铱、铑、或聚合物载体。
10.一种用于中和和/或失活培养基中的抗微生物剂的方法，所述方法包括向能够支持微生物生长的所述培养基中加入一种或多种不含硫醇的伯胺，其中所述一种或多种不含硫醇的伯胺以有效中和和/或失活可能存在于所述培养基中的任何抗微生物剂的量存在。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述培养基还包含有效中和和/或失活存在于所述受试样品中的任何其他抗生素的一种或多种吸附剂。
12.根据权利要求10所述的方法，其中将怀疑含有微生物的受试样品加入到所述培养基中，且在足以使得所述受试样品中的任何微生物生长的条件下培养。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述不含硫醇的伯胺作为补充物在所述受试样品之前或与其同时加入到所述培养基中。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗生素包含一种或多种β-内酰胺抗生素，且其中所述β-内酰胺抗生素选自由包括但不限于青霉素、头孢菌素、单环内酰胺、碳青霉烯和其衍生物的β-内酰胺抗生素组成的组。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述不含硫醇的伯胺选自由甲胺、乙醇胺、缓血酸胺、丙胺、2-氨基庚烷、2-氨基-2-甲基-1，3丙二醇、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、正戊胺、苄胺、1，4-丁二胺、正丁胺、环己胺、乙胺、乙二胺、α-甲基苄胺、苯乙胺、异丙胺、丁胺、仲丁胺、异丁胺和三(羟甲基)氨基甲烷组成的组。
16.根据权利要求10所述的方法，其中所述伯胺为羟胺。
17.根据权利要求10所述的方法，其中所述伯胺固定在固相支持体上，且其中所述固相支持体为硝化纤维素、硅石、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、EVA、玻璃、碳、玻璃碳、炭黑、碳纳米管或纤维、铂、钯、金、银、氯化银、铱、铑、或聚合物载体。
18.一种用于诊断由微生物引起的感染的方法，所述方法包括如下步骤：(a)获得待确定所述微生物存在或不存在的受试样品，且其中所述受试样品可包含可干扰所述微生物的生长和/或检测的一种或多种碳青霉烯抗生素；(b)向培养基中加入所述受试样品，所述培养基包含有效中和、结合或抑制所述碳青霉烯的量的至少一种含伯胺化合物；和(c)分析所述培养物中所述微生物的存在，其中存在所述微生物的检测表示对于所述感染的阳性诊断。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述受试样品和所述培养基在所述步骤(c)之前以用于所述微生物生长的足够的时间和足够温度下孵育。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述培养基还包含有效中和和/或失活存在于所述受试样品中的任何其他抗生素的一种或多种吸附剂。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述样品为选自由血液、血清、血浆、血液部分、尿和唾液样品组成的组的临床样品。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述含伯胺化合物作为补充物在所述受试样品之前或与其同时添加到所述培养基中。
23.根据权利要求18所述的方法，其中所述含伯胺化合物包含式R-NH2的伯胺，其中R为具有约1个至约20个碳原子的线性的或支链的烃基、芳基、烃芳基或芳烃基基团。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述含伯胺化合物选自由甲胺、乙醇胺、缓血酸胺、丙胺、2-氨基庚烷、2-氨基-2-甲基-1，3丙二醇、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、正戊胺、苄胺、1，4-丁二胺、正丁胺、环己胺、乙胺、乙二胺、α-甲基苄胺、苯乙胺、异丙胺、丁胺、仲丁胺、异丁胺和三(羟甲基)氨基甲烷组成的组。
25.一种用于检测受试样品中的微生物的试剂盒，所述试剂盒包括：(1)可密封的样本容器，所述可密封的样本容器具有包含培养基并可在其中培养受试样品的内腔；和(2)补充物，所述补充物包含一种或多种含伯胺化合物。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述补充物加入到所述样本容器和所述培养基中，且其中所述一种或多种含伯胺化合物以有效中和、结合或抑制可能存在于所述培养基中的任何抗微生物剂的量存在于所述培养基中。
27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中受试样品添加到所述样本容器和所述培养基中，且其中所述伯胺以有效中和、结合或抑制可能存在于所述受试样品中的任何抗微生物剂的量存在于所述培养基中。
28.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述可密封的样本容器和所述培养基通过高压灭菌法灭菌。
29.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述含伯胺化合物包含式R-NH2的伯胺，其中R为具有约1个至约20个碳原子的线性的或支链的烃基、芳基、烃芳基或芳烃基基团。
30.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述含伯胺化合物选自由甲胺、乙醇胺、缓血酸胺、丙胺、2-氨基庚烷、2-氨基-2-甲基-1，3丙二醇、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、正戊胺、苄胺、1，4-丁二胺、正丁胺、环己胺、乙胺、乙二胺、α-甲基苄胺、苯乙胺、异丙胺、丁胺、仲丁胺、异丁胺和三(羟甲基)氨基甲烷组成的组。
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