CN1772917A - 用于在抗生素存在下恢复微生物的培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种培养基及使用这种培养基用于抗生素生物负荷或无菌检查或抗生素生产区的环境检查的方法。所述培养基含有一种或多种使得微生物甚至在残留抗生素存在下也生长的二价或三价阳离子成分，优选镁、钙、铝和铁。

Description

用于在抗生素存在下恢复微生物的培养基
技术领域
本发明涉及一种用于在抗生素存在下恢复(recover)微生物的培养基及方法。更具体地，本发明涉及用于抗生素生物负荷和无菌检查的培养基。该培养基还可以用于抗生素生产设备中环境微生物的监测。
背景技术
药物、眼药等需要无菌以便不损害或伤害使用者。在产品发放之前，需要检查以确保或者存在的任何微生物在可接受的低水平或者根本没有微生物存在。
对于大多数产品，粉剂或液体，检查方法如下：
使液体(或溶解在液体中的粉剂)样品通过孔径小到足以将任何微生物捕获在其表面上的微孔过滤器过滤。
然后将过滤器放置在生长培养基如琼脂平板上或在培养基如肉汤中，或者将生长培养基施用于过滤器或过滤器下面的吸收垫，并在室温下或者在升高的温度(98°F左右)下培养一段时间以使得任何微生物生长到足够计数且如果需要的话足够鉴定的数量。
计数和鉴定检查可是视觉上的(仅是计数形成的集落数)或者可通过检测微生物存在和提供通过肉眼或仪器能看见的信号(生物或化学发光的、放射的、比色的等)的各种试剂的使用来完成。
检查困难的一类型产品是抗生素类如氟喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类、β内酰胺类(如青霉素类、头孢菌素类等)、糖肽类、脂肽类、大环内脂类、链阳性菌素类、林可胺类(lincosamides)、噁唑烷酮类(oxazolidinones)、磺胺类、多肽类，或抗真菌剂如唑类、多烯类、嘧啶合成抑制剂、葡聚糖合成抑制剂和壳多糖合成抑制剂。
抗生素设计用于杀死或抑制细菌和其它微生物。目前的检查使用一系列的洗涤试图将全部痕量抗生素从过滤器上去除以便不抑制微生物的生长。这是耗费时间、昂贵的程序且不总是起作用的。需要更好的用于抗生素生物负荷、无菌检查和环境检查的方法。
发明内容
本发明提供一种培养基和使用该培养基用于抗生素生物负荷或无菌检查或用于抗生素生产环境检查的方法。所述培养基含有一种或多种使得微生物甚至在残留抗生素存在下也生长的二价或三价阳离子成分。
使用该培养基的一种方法为通过孔径小到足以捕获可疑微生物的过滤器过滤抗生素样品，然后在含有一种或多种二价或三价阳离子成分的生长培养基上或生长培养基中培养该过滤器。然后观察或检查培养的过滤器或培养基以确定微生物的存在，且如果存在，确定存在的微生物的数量并且理想地，确定存在的微生物的类型。
生物负荷或无菌检查的第二种方法是通过在含有一种或多种二价或三价阳离子成分的培养基中或培养基上直接接种或铺板抗生素样品。使用该培养基的第三种方法是向过滤器上或直接向含有一种或多种二价或三价阳离子的培养基上或培养基中通空气。
具体实施方式
本发明涉及其中含有一种或多种二价或三价阳离子成分的生长培养基。该一种或多种二价或三价阳离子成分的存在使得微生物甚至在残留抗生素存在下也生长。这对其中残留抗生素的存在抑制微生物生长且提供假阴性结果的抗生素的生物负荷或无菌检查是有用的。这对抗生素生产环境中环境的空气监测也是有用的。
任何二价或三价阳离子成分均可用于本发明。优选实例包括，但不限于镁，优选硫酸镁和氯化镁形式；钙，优选氯化钙或柠檬酸钙形式；硫酸铝；和硫酸铁(亚铁)。
培养基中存在的二价或三价阳离子的量应该是足够克服抗生素的抑制，以使得存在的任何微生物生长。一般地，它应该是以大约0.1M到大约0.5M的量存在，优选大约0.2M到大约0.4M，更优选大约0.3M。
培养基典型地为凝胶形式，如以琼脂为基础的培养基，或液体形式，如肉汤。在这些检查中典型使用的培养基是胰酶解豆酪蛋白肉汤或琼脂(SCDB或SCDA)、液体巯基乙酸培养基(FTM)和沙氏葡糖琼脂(SDA)。其它有用的培养基包括但不限于Mueller Hinton肉汤或琼脂、营养肉汤或琼脂(琼脂可以在特定的盒中或在标准的琼脂培养皿中)。
用于抗生素生物负荷水平或无菌检查的典型方法是通过孔径小到足以捕获任何微生物的过滤器过滤抗生素样品，然后在生长培养基存在下培养该过滤器以使得微生物生长到适于检测的数量。
这些过滤器典型地具有0.45微米或以下的孔径；在一些情况下，优选孔径从大约0.1微米直到1.2微米。过滤器可由任何合适的通常用于包括但不限于以纤维素为基础的过滤器在内的这些应用的材料制成，这些材料如再生纤维素、混合纤维素酯、乙酸纤维素、硝酸纤维素、硝化纤维素等、PVDF、尼龙类、聚碳酸酯类以及聚砜类如聚砜、聚醚砜、聚芳砜和聚苯砜。
这些过滤器从许多供应商可商购获得。合适的过滤器包括可从Massachusetts，Billerica的Millipore公司获得的S-PakTM混合纤维素酯过滤器和DuraporePVDF过滤器。
过滤器的贮器(holder)可以仅是不锈装置如漏斗或其可以是一次性、预先灭菌的含过滤器装置如SteritestTM装置、MicropreSureTM装置、Sterisure装置、Milliflex过滤器单元或MicrofilS装置，这些装置均可从Massachusetts，Billerica的Millipore公司获得。
尤其是对无菌检查，使用密封检查如SteritestTM装置，使得在一个封闭的系统中进行全部检查(取样、过滤、加入培养基和培养)。这一设计显著地降低外来污染和随后的假阳性危险。
设备中环境微生物水平检查的典型方法是通过具有培养基盒的装置过滤空气样品，微生物能留在并保持在培养基盒上，然后在该培养基上培养以使得微生物生长到适合于检测的数量。已知的一种这样系统是可从Massachusetts，Billerica的Millipore公司获得的M AirT系统。也参见US 6,094,997和6,240,768。其它的方法包括只是将填充有选择的培养基的敞开的培养皿置于待研究的环境中并使得微生物降落以聚集在培养基表面上。然后培养和观察培养皿。其它方法可以是和是本领域普通技术人员使用的。
一般地，将施用于培养基的样品培养一段时间以使得捕获的微生物有些生长，以便能容易地检测它们。对于传统的方法，这一时间可从对于空气监测或生物负荷样本而言的最少3天至对于无菌检查而言的14天的范围。一般地，在大约3-14天之间，更一般地在大约7至14天之间。可以在室温(20℃左右)直到更高温度如54℃左右下培养样品。典型的温度范围是20至35℃。
计数和鉴定检查可以是用裸眼或者通过显微镜或其它放大装置进行的视觉上的检查(仅是计数形成的集落数)。或者，可以是更复杂的，使用各种检测各种微生物成分存在的试剂，如DNA或RNA探针、ATP的试剂；指示这些成分存在的生物发光和其它这样众所周知的化学/生物化学试剂和/或检测指示生物存在和存在的生物的类型的这些试剂的仪器。例如，用一个众所周知的系统培养微生物，溶解它们，然后使用试剂检测其中的ATP。ATP的存在通过荧光素(luciferine)和荧光素酶生物发光反应来观察。一个出售的这种系统Microstarsystem可从Massachusetts，Billerica的Millipore公司获得。基于色谱指示剂、荧光指示剂等的其它系统也是本领域已知的。
实施例1(直接接种)
将200集落形成单位(cfu)金黄色葡萄球菌(S.aureus)(ATCC6538)接种在含有SCDB培养基的试管中，该SCDB培养基为镁阳离子或环丙沙星抗生素存在或不存在情况。样品A与环丙沙星样品(100μg/ml)一起使用并且不含有二价阳离子成分。B与环丙沙星(100μg/ml)一起使用并且含有0.5M镁阳离子。C与对照一起使用并且含有0.5M与B相同的二价阳离子。D与对照一起使用并且不含二价阳离子。
结果显示在表1中：
                            表1
  抗生素   微生物   加入肉汤中的二价阳离子   结果
  环丙沙星   金黄色葡萄球菌   没有   不生长
  环丙沙星   金黄色葡萄球菌   0.5M   生长
  没有   金黄色葡萄球菌   0.5M   生长
  没有   金黄色葡萄球菌   没有   生长
实施例2(过滤)
氧氟沙星抗生素样品(10ml，4mg/ml)通过四个含Durapore薄膜的Milliflex漏斗中的两个过滤。每个薄膜滤器用USP Fluid A漂洗剂漂洗6次，每次100ml，最后一次的漂洗剂大约含有20至60cfu大肠杆菌(E.coli)(ATCC 8739)。USP Fluid A中大肠杆菌对照也通过Millifiex漏斗过滤。然后将所有的薄膜放在作为样品A、B、C和D的生长培养基(胰酶解豆酪蛋白琼脂)上。A与氧氟沙星样品一起使用并且不含有二价阳离子成分。B与氧氟沙星一起使用并且含有0.5M二价阳离子(镁)。C与对照一起使用并且含有0.5％的B的二价阳离子。D与对照一起使用并且不含二价阳离子。
结果显示在表2中：
                          表2
  抗生素   微生物   加入琼脂中的二价阳离子   结果
  氧氟沙星   大肠杆菌   没有   不生长
  氧氟沙星   大肠杆菌   0.5M   生长
  没有   大肠杆菌   0.5M   生长
  没有   大肠杆菌   没有   生长
从这些实施例可见，在抗生素存在下，除非培养基含有二价阳离子，否则微生物生长受到抑制。这使得抗生素生物负荷和无菌检查的发生，同时限制或消除假阴性的可能。
实施例3(无菌检查)
氧氟沙星抗生素样品(20ml，40mg/ml)通过四对每个含有Durapore薄膜的SteritestTM罐装置中的两对过滤。每个薄膜滤器用USP Fluid A漂洗剂漂洗3次，每次100ml，最后一次的漂洗剂大约含有30cfu枯草芽胞杆菌(B.subtilis)(ATCC 6633)。USP Fluid A中的枯草芽胞杆菌对照也通过SteritestTM装置过滤。然后将生长培养基(胰酶解豆酪蛋白琼脂)A、B、C和D加入每个罐。
结果显示在表3中：
                          表3
  抗生素   微生物   加入肉汤中的二价阳离子   结果
  氧氟沙星   枯草芽胞杆菌   没有   不生长
  氧氟沙星   枯草芽胞杆菌   0.5M   生长
  没有   枯草芽胞杆菌   0.5M   生长
  没有   枯草芽胞杆菌   没有   生长
用含有浓度为0.1、0.2、0.3和0.4M镁阳离子的二价阳离子的SCDB对氧氟沙星显示有相似的结果。另外，用含有浓度为0.3M的二价阳离子的SCDB对其它两个氟喹诺酮类：莫西沙星(moxifloxacin)和环丙沙星也显示有相似的结果。
实施例4(空气监测检查)
抗生素生产车间中空气监测的一种方法是用空气冲击琼脂表面，在琼脂表面聚集微生物和抗生素。这一检查通过将微生物涂布在含不同量镁阳离子的琼脂表面上，然后将含有抗生素的纸片(disk)置于琼脂表面上来模拟。测量每个纸片周围的抑制区，指示培养基中和抗生素作用的能力(下面的方法与在临床微生物学中使用的药敏纸片试验(susceptibility disc test)相似)。
将金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)(ATCC 9027)或大肠杆菌(ATCC 25922)涂布在含有0.1M、0.2M、0.3M、0.4M或0.5M镁阳离子的SCDA琼脂表面。然后将浸泡已知量抗生素的纸片放在琼脂平板上的细菌上。将平板培养并测量细菌生长抑制区。该细菌生长抑制区的减少表明含阳离子培养基的保护作用。对三种抗生素，氧氟沙星(氟喹诺酮类)、链霉素(氨基糖苷类)和强力霉素(四环素类)的结果显示在表4中。
                                  表4
                             抑制区mm
  抗生素   微生物   0.0M阳离子   0.1M阳离子   0.2M阳离子   0.3M阳离子   0.4M阳离子   0.5M阳离子
  氧氟沙星(5μg)   金黄色葡萄球菌   23   11   8   6   7   6
  氧氟沙星(5μg)   铜绿假单胞菌   20   6   6   6   6   6
  氧氟沙星(5μg)   大肠杆菌   26   13   13   13   12   12
  链霉素(10μg)   金黄色葡萄球菌   17   12   Np   7   Np   8
  链霉素(10μg)   铜绿假单胞菌   11   6   Np   6   Np   6
  链霉素(10μg)   大肠杆菌   14   12   Np   9   Np   6
  强力霉素(30μg)   金黄色葡萄球菌   25   13   Np   11   Np   13
  强力霉素(30μg)   铜绿假单胞菌   6   6   Np   6   Np   6
  强力霉素(30μg)   大肠杆菌   18   6   Np   6   Np   6
Np：没有进行
对八个其它喹诺酮剂，环丙沙星、莫西沙星、依诺沙星(enoxocin)、恩诺沙星、左氧氟沙星、lemofloxacin、诺氟沙星和司帕沙星观察到相似的结果。

Claims (27)

1.一种用于在抗生素存在下生长微生物的培养基，所述培养基包含用于一种或多种类型微生物的生长培养基和含有选自二价和三价阳离子的一种或多种阳离子的一种或多种成分。
2.权利要求1的培养基，其中所述一种或多种阳离子选自如下一组：镁、钙、铝和铁。
3.权利要求1的培养基，其中所述一种或多种阳离子选自如下一组：硫酸镁、氯化镁、氯化钙、柠檬酸钙、硫酸铝和硫酸铁。
4.权利要求1的培养基，其中所述一种或多种阳离子选自如下一组：镁和钙。
5.权利要求1的培养基，其中所述一种或多种阳离子选自如下一组：硫酸镁、氯化镁、氯化钙和柠檬酸钙。
6.权利要求1的培养基，其中所述一种或多种阳离子选自如下一组：镁、钙、铝和铁的二价和三价阳离子。
7.权利要求1的培养基，其中所述培养基是选自如下一组的形式：凝胶或肉汤。
8.权利要求1的培养基，其中所述培养基选自如下一组：胰酶解豆酪蛋白肉汤、胰酶解豆酪蛋白琼脂、液体巯基乙酸培养基、沙氏葡糖琼脂、Mueller Hinton肉汤、Mueller Hinton琼脂、营养肉汤和营养琼脂。
9.权利要求1的培养基，其中所述培养基是凝胶。
10.权利要求1的培养基，其中所述培养基是肉汤。
11.权利要求1的培养基，其中所述培养基是选自如下一组的肉汤：胰酶解豆酪蛋白、液体巯基乙酸培养基、Mueller Hinton肉汤和营养肉汤。
12.权利要求1的培养基，其中所述一种或多种阳离子成分在大约0.1M至大约0.5M的范围内。
13.权利要求1的培养基，其中所述一种或多种阳离子成分在大约0.2M至大约0.4M的范围内。
14.权利要求1的培养基，其中所述二价阳离子成分在培养基中的量为大约0.3M。
15.一种用于检测在抗生素存在下微生物存在的方法，所述方法包括如下步骤：
提供待检查的含有抗生素的样品、贮器和贮器内的生长培养基，其中所述培养基含有一种或多种选自如下一组的阳离子成分：镁、钙、铝和铁的二价和三价阳离子；
将样品与生长培养基接触并在预选定的温度下培养培养基预选定的时间，和
观察培养基以确定任何微生物的存在。
16.权利要求15的方法，所述方法进一步包括在培养前提供过滤器，通过所述过滤器过滤样品并将过滤器放置在生长培养基上。
17.权利要求15的方法，所述方法进一步包括在培养前提供过滤器，通过所述过滤器过滤样品并将过滤器放置在生长培养基上，并且其中所述过滤器具有大约0.1微米至大约1.2微米的孔径且由选自如下一组的材料形成：再生纤维素、混合纤维素酯、乙酸纤维素、硝酸纤维素、硝化纤维素、PVDF、尼龙类、聚碳酸酯类、聚砜类、聚醚砜类、聚芳砜类和聚苯砜类。
18.权利要求15的方法，其中将所述样品选自如下一组：液体和溶解在液体中粉剂。
19.权利要求15的方法，其中所述样品是来自抗生素生产的生产区的空气。
20.权利要求15的方法，其中将所述过滤器/培养基在20℃至54℃的温度下培养大约0至7天的时间。
21.权利要求15的方法，其中将所述过滤器/培养基在20℃至54℃的温度下培养大约7至大约14天的时间。
22.权利要求15的方法，其中所述一种或多种阳离子成分在大约0.1M至大约0.5M的范围内。
23.权利要求15的方法，其中所述一种或多种阳离子成分在大约0.2M至大约0.4M的范围内。
24.权利要求15的方法，其中所述一种或多种阳离子成分的量为大约0.3M。
25.权利要求1的培养基，其中所述培养基是凝胶并且所述凝胶是以琼脂为基础的。
26.权利要求15的方法，其中所述观察选自如下一组：集落形成单位的视觉上的计数或微生物成分存在的生物或化学发光检测。
27.权利要求15的方法，其中所述观察通过检测用于指示微生物成分存在的试剂来完成。
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