BRPI1015021B1 - método para neutralização de antibióticos em um meio de cultura - Google Patents

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Abstract

método para neutralização de antibióticos em um meio de cultura. a presente i nvenção é dirigida a um método e meio para a neutra lização , ligação e/ou inativação de antimicrobianos 5 em uma amostra de teste. a invenção também é dirigida a um método de detectar a p r e s ença de um ou mais microorganismos em uma amostra de teste por cultivar a amostra de teste em um meio de cult ura compreendendo um ou mais compostos c ontendo amina primária .

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "MÉTODO PARA NEUTRALIZAÇÃO DE ANTIBIÓTICOS EM UM MEIO DE CULTURA". Referência remissiva a pedido relacionado 0 presente pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisional US número 61/269,953, intitulado "Method for neutralization of antibiotics in a culture médium", depositado em 1 de julho de 2009, o qual é incorporado aqui.
Campo da Invenção A presente invenção é dirigida à neutralização e/ou inativação de antibióticos em uma amostra de teste ou meio de cultura. A presente invenção também é dirigida a um método de cultivar e detectar microorganismos que podem estar presentes em uma amostra de teste.
Antecedentes da Invenção No campo de cultura e detecção de microorganismos, garrafas de cultura especializadas e máquinas para reter as garrafas de cultura são tipicamente utilizadas para detectar a presença de microorganismos em um espécime de teste. Garrafas, como aquelas reveladas nas patentes norte-americanas US números 4,945,060; 5,094,955; e 5,162,229, aqui incorporadas a título de referência, têm um meio de cultura e um sensor no interior da garrafa que é submetido a uma alteração detectável devido ao crescimento de microorganismos presentes na garrafa. A alteração no sensor é monitorada a partir do exterior da garrafa de cultura através da parede transparente da garrafa de cultura, como com um emissor de luz e detector como revelado, por exemplo, nas patentes norte-americanas US números 5,164,796 e 5,217,876, aqui incorporadas a título de referência. Para a maioria dos ensaios, as garrafas de cultura devem ser agitadas para melhores resultados. Grampos, como aqueles revelados na patente norte-americana US número 5,074,505, aqui incorporados a título de referência, podem ter as garrafas de cultura no lugar na máquina de incubação durante agitação. A detecção de microorganismos patogênicos em fluidos biológicos deve ser realizada no tempo mais curto possível, em particular, no caso de septicemia, para a qual a mortalidade permanece elevada apesar da ampla gama de antibióticos que são disponíveis para médicos. Para aumentar as chances de sobrevivência de indivíduos doentes, os médicos administram frequentemente um antibiótico ou mistura de antibióticos aos pacientes. Entretanto, é importante determinar uma terapia de antibióticos apropriada o mais rápido possível. Infelizmente, quando uma amostra de fluido corpóreo do paciente é cultivada para identificar e isolar um microorganismo infectante que poderia estar presente, antibióticos previamente administrados ao paciente podem interferir no processo de cultura. Além disso, amostras médicas podem conter soro, plasma e eritrócitos lisados que podem conter naturalmente inibidores microbianos. Amostras industriais como produtos farmacêuticos e alimentos também podem conter antimicrobianos ou preservativos que inibem o crescimento de microorganismos. Adicionalmente, quando meios de cultura são preparados, autoclave dos meios em temperaturas muito elevadas sob pressão pode resultar na formação de subprodutos tóxicos para microorganismos. A remoção ou neutralização dessas substâncias bactericidas ou inibidoras é necessária para detectar contaminação microbiana. 0 uso de resinas e adsorventes não resinosos é bem conhecido e foi anteriormente descrito para uso em procedimentos de diagnóstico médico. Em particular, essas resinas e adsorventes não resinosos mostraram ser úteis na remoção de antibióticos e outros antimicrobianos a partir de amostras de sangue. A remoção desses inibidores em amostras médicas permite recuperação e detecção mais rápida de microorganismos de modo que a identificação microbiana e teste de suscetibilidade precisa a antibiótico podem ser realizados.
Melnick e outros, na patente norte-america US número 4,145304, aqui incorporada a titulo de referência, descrevem o uso de resinas não iônicas e de permuta aniônica sintéticas para remover antimicrobianos, incluindo antibióticos, de fluidos corpóreos, desse modo permitindo recuperação de patógenos utilizando técnicas de cultura padrão. As resinas descritas são revestidas com um detergente não iônico para seletivamente remover antibióticos carregados enquanto inibe a aderência de bactérias às resinas. Após tratamento da amostra com a resina, o eluido é cultivado em um meio de crescimento. O grau de ligação de antibióticos pelas resinas é indicado como sendo dependente na capacidade de permuta total, diâmetro de poro, e área superficial da resina.
Waters, na patente norte-americana US número 4,632,902, incorporada aqui a título de referência, descreve um aperfeiçoamento em relação à Melnick por incorporar resinas de permuta de íons e resinas adsorventes não funcionais diretamente no meio de crescimento. Inibidores removidos incluem antibióticos administrados a pacientes e inibidores de ocorrência natural contidos em soro, plasma e eritrócitos lisados. As resinas não são revestidas com um detergente não iônico ou tensoativo antes do uso e o tamanho do poro da resina não é crítico.
Thorpe e outros, nas patentes norte-americanas US número 5,162,229 e 5,314,229, aqui incorporadas a título de referência, descrevem o uso de adsorventes não resinosos e resina para neutralizar, ligar ou inibir substâncias antimicrobianas que podem estar presentes em uma amostra biológica. A resina e adsorventes não resinosos descritos incluem, óxido de alumínio, silicatos de alumínio hidratado nativos coloidais, silicatos de alumínio-alcali hidratados cristalinos, silica, frústulas siliciosas, fragmentos de várias espécies de diátomos, carbono amorfo, resinas de permuta de íon, adsorventes de resina polimérica não funcionais, resina de poliestireno reticulada com benzeno de divinil e combinações das mesmas.
Embora resinas sintéticas e adsorventes não resinosos sejam conhecidas por remover substâncias inibidoras em culturas contendo fluidos corpóreos, essas resinas e adsorventes não resinosos podem ser ineficazes na neutralização ou remoção de alguns tipos de antibióticos. Por exemplo, algumas β-lactamas são comumente utilizadas no tratamento de sepse e sua presença em amostras de sangue podem interferir na recuperação, detecção e identificação do microorganismo responsável pela sepse. Em particular, resinas e adsorventes não resinosos atualmente utilizados na técnica para remover antimicrobianos de amostras de sangue provaram ser amplamente ineficazes na neutralização de carbapenemos. Portanto, é desejável encontrar outros meios para a neutralização ou inibição de antibióticos em fluidos corpóreos e amostras de fluidos não corpóreos, como alimentos e produtos industriais. A presente invenção provê um meio para a neutralização ou inibição de antimicrobianos em amostras de teste, enquanto ajuda a reter os componentes do meio necessários para recuperar e detectar microorganismos em um modo rápido. Por encontrar um meio para a neutralização e/ou inativação de β-lactamas (por exemplo, carbapenemos) que anteriormente não podiam ser efetivamente neutralizados ou inativados em um meio de cultura, a presente invenção resolve uma necessidade sentida há muito tempo na técnica. Sumário da Invenção Em um aspecto, a presente invenção envolve um meio ou método que envolve o uso de um ou mais compostos contendo amina primária para neutralizar, ligar, inibir ou de outro modo inativar uma substância antimicrobiana (por exemplo, um ou mais antibióticos) em um meio de crescimento ou cultura. Em uma modalidade, a presente invenção é dirigida à neutralização, inibição ou inativação de um ou mais antibióticos com um ou mais compostos contendo amina primária em meio de cultura (por exemplo, uma cultura de sangue). A presente invenção também é dirigida a um método para a neutralização e/ou inativação de um antimicrobiano em um meio de cultura (por exemplo, uma cultura de sangue) compreendendo adicionar um ou mais compostos contendo amina primária a um meio de cultura que é capaz de suportar crescimento de microorganismos, em que um ou mais compostos contendo amina primária estão presentes em uma quantidade eficaz que neutraliza e/ou inativa quaisquer carbapenemos presentes no meio de cultura. Em uma modalidade, o antimicrobiano é um carbapenemo. Em outra modalidade, a amina primária é uma amina primária não contendo tiol.
Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método para recuperação aumentada e detecção de microorganismos em cultura, o método compreendendo: (a) preparar o meio de cultura; (b) adicionar ao meio pelo menos um composto contendo amina primária em quantidades que são eficazes para neutralizar, ligar ou inibir substâncias antimicrobianas no meio de cultura; (c) inocular o meio com uma amostra; e (d) incubar e determinar os resultados. Em uma modalidade, o antimicrobiano é um carbapenemo. Em outra modalidade, a amina primária é uma amina primária não contendo tiol.
Ainda em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método para o diagnóstico de uma infecção causada por um microorganismo, compreendendo as etapas de: (a) obter uma amostra de espécime ou amostras de teste para a qual a presença ou ausência de um microorganismo deve ser determinada, e em que o espécime ou amostra de teste pode conter um ou mais antimicrobianos que podem interferir no crescimento e/ou detecção do microorganismo; (b) adicionar a amostra de espécime ou amostra de teste a um meio de cultura, o meio de cultura compreendendo pelo menos um composto contendo amina primária em uma quantidade que é eficaz para neutralizar, ligar ou inibir um ou mais antimicrobianos; e (c) analisar a cultura em relação à presença do microorganismo, em que a detecção da presença do microorganismo indica um diagnóstico positivo para a infecção. Em uma modalidade, o antimicrobiano é um carbapenemo. Em outra modalidade, a amina primária é uma amina primária não contendo tiol. Ainda em outra modalidade, a detecção do microorganismo compreende detecção do crescimento do microorganismo no meio de cultura.
Ainda em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um dispositivo para detectar microorganismos suspeitos de estarem em uma espécie compreendendo um recipiente de espécime vedável compreendendo uma câmara interna na qual o espécime pode ser cultivado em um meio de cultura, o meio de cultura contendo pelo menos um composto contendo amina primária, em que o composto contendo amina primária neutraliza e/ou inativa antibióticos que podem estar presentes no espécime.
Ainda em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um kit para detectar microorganismos em uma amostra de teste, o kit compreendendo: (1) um recipiente de espécime vedável, tendo uma câmara interna que compreende um meio de cultura e no qual uma amostra de teste, para a qual a presença ou ausência de um microorganismo deve ser determinada, pode ser cultivada; e (2) um suplemento compreendendo um ou mais compostos contendo amina primária. De acordo com esse aspecto da presente invenção, o suplemento pode ser adicionado ao meio de cultura contido no recipiente de espécime vedável, desse modo fornecendo um ou mais compostos contendo amina primária em uma quantidade que é eficaz para neutralizar, ligar ou inibir quaisquer antimicrobianos que podem estar presentes no meio de cultura. Uma amostra de teste pode ser adicionada ao meio de cultura, simultaneamente com, ou após adição do suplemento ao meio de cultura, o suplemento fornecendo um ou mais compostos contendo amina primária em uma quantidade que é eficaz para neutralizar, ligar ou inibir quaisquer antimicrobianos que podem estar presentes na amostra de teste.
Breve Descrição das Figuras Figura 1A - é um Cromatograma de Cromatograf ia de exclusão de Tamanho (SEC) do imipenemo na presença de cisteina após um tempo de reação de 0 min.
Figura 1B - é um Cromatograma de Cromatograf ia de exclusão de tamanho (SEC) do imipenemo na presença de cisteina após um tempo de reação de 20 min.
Figura 1C - é um Cromatograma de Cromatograf ia de exclusão de tamanho (SEC) do imipenemo na presença de cisteina após um tempo de reação de 60 min.
Figura 1D - é um Cromatograma de Cromatograf ia de exclusão de tamanho (SEC) do imipenemo na presença de cisteina após um tempo de reação de 90 min.
Figura 2A - é um Cromatograma de Cromatograf ia de exclusão de tamanho (SEC) do imipenemo sem cisteina após um tempo de reação de 0 min.
Figura 2B - é um Cromatograma de Cromatograf ia de exclusão de tamanho (SEC) do imipenemo sem cisteina após um tempo de reação de 20 min.
Figura 2C - é um Cromatograma de Cromatograf ia de exclusão de tamanho (SEC) do imipenemo sem cisteina após um tempo de reação de 60 min.
Figura 2D - é um Cromatograma de Cromatograf ia de exclusão de tamanho (SEC) de imipenemo sem cisteína após um tempo de reação de 90 min.
Figura 3 - é um bloxplot que mostra o efeito de cisteína sobre a recuperação de S. aureus na presença do imipenemo.
Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção provê métodos para detectar a presença de microorganismos em uma amostra de teste ou espécime contendo ou com suspeita de conter microorganismos. De acordo com a presente invenção, os métodos envolvem um método de neutralização química envolvendo o uso de compostos contendo amina primária para neutralizar, ligar, inibir ou de outro modo inativar uma substância antimicrobiana (por exemplo, antibióticos) em um meio de cultura ou crescimento. Em uma modalidade, a presente invenção é dirigida à neutralização, inibição ou inativação de um ou mais antibióticos com um composto contendo amina primária em meio de cultura de sangue. Em algumas modalidades, o composto contendo amina primária pode ser um composto não contendo tiol e/ou hidroxil amina.
As amostras que podem ser testadas pelos métodos da invenção incluem amostras tanto clínicas como não clínicas nas quais a presença e/ou crescimento de microorganismos é ou de ser suspeito, bem como amostras de materiais que são rotineiramente ou ocasionalmente testados em relação à presença de microorganismos. Amostras de teste podem variar tipicamente de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 50 ml, de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 10 ml, ou de aproximadamente 2 ml a aproximadamente 5 ml.
Espécimes clínicas ou amostras de espécime que podem ser testados incluem qualquer tipo de amostra tipicamente testada em laboratórios de pesquisa ou clínica, incluindo, porém não limitados a, sangue, soro, plasma, frações de sangue, fluido de articulação, urina, sêmen, saliva, fezes, fluido cérebro-espinhal, conteúdo gástrico, secreções vaginais, homogeneizados de tecido, aspirados de medula óssea, homogeneizados de osso, esputo, aspirados, swabs e rinsates de swab, outros fluidos corpóreos, e similares. Em uma modalidade da presente invenção, amostras são obtidas de um sujeito (por exemplo, um paciente) tendo ou com suspeito de ter uma infecção microbiana. Em uma modalidade, o sujeito tem ou é suspeito de ter septicemia, por exemplo, bacteremia ou fungemia. A amostra pode ser uma amostra de sangue tirada diretamente do sujeito.
Amostras não clínicas que podem ser testadas também incluem substâncias, abrangendo, porém não limitadas a gêneros alimentícios, bebidas, produtos farmacêuticos, cosméticos, água (por exemplo, água de beber, água não potável, e água de refugo) , lastros de água do mar, ar, terra, esgoto, material de planta (por exemplo, sementes, folhas, troncos, raízes, flores, frutas), produtos de sangue (por exemplo, plaquetas, soro, plasma, frações de leucócitos, etc.), amostras de tecido ou órgão doador, amostras de bioguerra e similares. 0 método também é particularmente bem adequado para teste em tempo real para monitorar níveis de contaminação, controle de processo, controle de qualidade e similar em cenários industriais, comerciais e/ou clínicos.
Um primeiro aspecto da invenção se refere a métodos para a neutralização e/ou inativação de antibióticos utilizando um ou mais compostos contendo amina primária. 0 método compreende adicionar um ou mais compostos contendo amina primária a um meio de crescimento ou cultura em uma quantidade eficaz para neutralizar, ligar e/ou inibir um ou mais antibióticos presentes, ou com suspeita de estar presente, em uma amostra de teste. Um ou mais compostos contendo amina primária podem ser adicionados ao meio de cultura ou crescimento antes de, ou simultaneamente com inoculação do meio de crescimento ou cultura com uma amostra de teste. Embora não desejando ser limitado por teoria, acredita-se que o uso de um composto contendo amina primária forneça um meio químico para neutralização de antimicrobianos, pelo que a amina primária interage ou liga com a estrutura de anel de β-lactama do antibiótico. A amina primária pode realizar um ataque nucleofilico no anel de β-lactama formando um complexo covalente que leva à inativaçào e/ou neutralização do antibiótico de β-lactama. Após inoculação, o meio de crescimento ou cultura e amostra de teste pode ser incubado por um tempo suficiente e em uma temperatura suficiente para permitir crescimento e detecção de qualquer microorganismo que pode estar presente na amostra de teste. 0 crescimento pode ser detectado por qualquer meio conhecido na técnica. Por exemplo, o crescimento pode ser detectado utilizando um sistema BacT/ALERT® ou BacT/ALERT® 3D (bioMerieux, Inc.) o tempo e temperatura necessários para crescimento do microorganismo são amplamente específicos de espécie, porém tipicamente serão de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48horas e de aproximadamente 30°C a aproximadamente 42°C.
Uma "quantidade eficaz" significa o uso de uma quantidade suficiente de um composto para neutralizar, ligar e/ou inibir a atividade de um ou mais antibióticos presentes, ou suspeitos de estarem presentes, em uma amostra de teste ou meio de cultura. Uma "quantidade eficaz" pode ser uma quantidade suficiente para produzir uma inibição mensurável de um ou mais antibióticos presentes em uma amostra de teste ou meio. A inibição de antibióticos pode ser medida in vitro por cromatografia de liquido de alto desempenho (HPLC), ou por outros métodos conhecidos por um técnico versado no assunto. Uma "quantidade eficaz" também pode ser uma quantidade suficiente para mostrar crescimento detectável de microorganismos em uma amostra de teste ou meio de cultura contendo um antibiótico cuja atividade suprimiría de outro modo ou eliminar o crescimento detectável. Uma "quantidade eficaz" pode não necessitar ser uma quantidade que eliminaria totalmente a atividade de um ou mais antibióticos presentes, ou suspeitos de estarem presentes no meio de cultura ou crescimento. Em vez disso, na prática da presente invenção, o uso de uma "quantidade eficaz" de um ou mais compostos contendo amina primária em um meio de cultura ou crescimento para o crescimento ou cultivo de microorganismos que de outro modo seriam suprimidos ou eliminados a partir da presença de um ou mais antibióticos que são neutralizados, ligados e/ou inibidos pelo composto contendo amina primária, de acordo com a presente invenção. Tipicamente, uma "quantidade eficaz" de um ou mais compostos contendo amina primária é uma quantidade que permite uma concentração final no crescimento de meio de cultura de aproximadamente 0,1 g/L a aproximadamente 20 g/L, de aproximadamente 0,5 g/L a aproximadamente 10 g/L, ou de aproximadamente 1 g/L a aproximadamente 5 g/L.
Em uma modalidade, a presente invenção é um método para recuperação aumentada e detecção de microorganismos em cultura, o método compreendendo: (a) preparar meio de cultura; (b) adicionar ao meio pelo menos um composto contendo amina primária em quantidades que são eficazes para neutralizar, ligar ou inibir substâncias antimicrobianas no meio de cultura; (c) inocular o meio com uma amostra a ser testada; e (d) incubar e determinar os resultados. Em outra modalidade, a presente invenção também é dirigida a um método para a neutralização e/ou inativação de um carbapenemo em uma cultura de sangue compreendendo adicionar um composto contendo amina primária a um meio de cultura de sangue que é capaz de suportar crescimento de microorganismos, em que o composto contendo amina primária neutraliza e/ou inativa quaisquer carbapenemos presentes no meio de cultura.
Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para o diagnóstico de uma infecção causada por um microorganismo, compreendendo as etapas de: (a) obter uma amostra de teste para a qual a presença ou ausência de um microorganismo deve ser determinada, e em que a amostra de teste pode conter um ou mais antimicrobianos que podem interferir no crescimento e/ou detecção do microorganismo; (b) adicionar a amostra de teste a um meio de cultura, o meio de cultura compreendendo pelo menos um composto contendo amina primária em uma quantidade que é eficaz para neutralizar, ligar ou inibir um ou mais antibióticos; e (c) analisar a cultura em relação à presença do microorganismo (por exemplo, detecção do microorganismo ou crescimento do microorganismo), em que uma descoberta da presença do microorganismo indica um diagnóstico positivo para a infecção. Após adicionar a amostra de teste ao meio de cultura ou crescimento, o meio de cultura ou crescimento e amostra de teste podem ser incubados por um período de tempo suficiente e em uma temperatura suficiente, como é bem sabido por aqueles versados na técnica, para permitir crescimento de detecção de qualquer microorganismo que possa estar presente na amostra de teste. 0 crescimento pode ser detectado por qualquer meio conhecido na técnica. Por exemplo, o crescimento pode ser detectado utilizando sistemas BacT/ALERT® ou BacT/ALERT® 3D (bioMerieux, Inc.). Leituras de crescimento podem ser feitas continuamente ou em intervalos de tempo dados.
Em geral, qualquer antibiótico conhecido pode ser neutralizado utilizando os métodos da presente invenção. Em um aspecto, a presente invenção é dirigida ao uso de um composto contendo amina primária para neutralizar e/ou inativar um antibiótico de β-lactama. Antibióticos de β-lactama são uma classe ampla de antibióticos que inclui qualquer agente antibiótico que contém um núcleo de β-lactama em sua estrutura molecular. Antibióticos de β-lactama incluem, porém não são limitados a, penicilinas, derivados de penicilina, cefalosporinas, monobactams, carbapenemos, e inibidores de β-lactamase.
Em uma modalidade, compostos contendo amina primária podem ser utilizados para neutralizar e/ou inativar antibióticos de penicilina e derivados de penicilina. Penicilinas são uma classe de antibióticos β-lactama conhecidos como penams. Penams são um grupo de antibióticos que compartilham um esqueleto de núcleo similar (R-C9H11N2O4S, onde R é uma cadeia lateral variável) . Penicilinas e derivados de penicilina incluem, por exemplo, penicilina de benzatina, benzil penicilina (penicilina G) , fenoxi metil penicilina (penicilina V), penicilina procaina, oxacilina, meticilina, nafcilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, temocilina, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenixilina, mezlocilina e piperacilina.
Em outra modalidade, compostos contendo amina primária podem ser utilizados para neutralizar e/ou inativar cefalosporinas e derivados de cefalosporina. Cefalosporinas são um grupo de antibióticos de β-lactama que compartilham um esqueleto de núcleo compreendendo ácido 7-aminocefalosporânico. cefalosporinas e derivados de cefalosporina incluem, por exemplo, cefalexina, cefalotin, cefazolin, cefaclor, cefuroxima, cefamandol, cefotetan, cefoxitina, ceftrizxona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, cefepima e cefpiroma.
Ainda em outra modalidade, compostos contendo amina primária podem ser utilizados para neutralizar e/ou inativar carbapenemo e derivados de carbapenemo. Carbapenemos são uma classe de antibióticos de β-lactama com um amplo espectro de atividade antibacteriana, e têm uma estrutura que torna os mesmos resistentes à β-lactamases. Carbapenemos e derivados de carbapenemo incluem imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem, panipenem, betamipron, biapenem e PZ-601. Os carbapenemos são de certo modo estruturalmente similares às penicilinas, porém o átomo de enxofre na posição 1 da estrutura foi substituído com um átomo de carbono e consequentemente o nome do grupo, os carbapenemos. Não obstante, essa diferença estrutural aparentemente sutil pode levar a efeitos diferentes dramáticos em atividade química e biológica.
Ainda em outra modalidade, compostos contendo amina primária podem ser utilizados para neutralizar e/ou inativar inibidores de β-lactamase e derivados de inibidores de β-lactamase. Inibidores de β-lactamase e derivados incluem, por exemplo, ácido calvulânico, tazobactama e sulbactama.
Como anteriormente mencionado, de acordo com a presente invenção, o composto contendo amina primária pode ser adicionado a um meio de cultura ou crescimento. 0 composto contendo amina primária pode ser adicionado diretamente ao meio antes de ou simultaneamente com inoculação do meio com uma amostra a ser testada. Em outra modalidade, o composto contendo amina primária pode ser adicionado diretamente à amostra a ser testada, antes da amostra ser adicionada ao meio de cultura ou crescimento. 0 uso de um meio de crescimento ou cultura (ou meio) para a cultivação de microorganismos é bem conhecido. Um meio de cultura ou crescimento apropriado provê as condições ambientais e nutricionais adequadas para crescimento de microorganismos e deve conter todos os nutrientes necessários pelos microorganismos que devem ser cultivados. Por exemplo, um meio de cultura microbiológico típico de conter água, uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, vitaminas, elementos residuais como potássio, magnésio, cálcio e ferro, e minerais como enxofre e fósforo. Tipicamente, essas necessidades são fornecidas de um número de fontes. Outros fatores para condições de propagação apropriadas podem incluir pH, temperatura, aeração, concentração de sal e pressão osmótica do meio.
Além disso, é sabido que certos fatores de crescimento podem ser necessários. Um fator de crescimento é um composto orgânico que um microorganismo deve conter para crescer, porém que é tipicamente incapaz de sintetizar. Muitos microorganismos, quando fornecidos com os nutrientes listados acima, são capazes de sintetizar todos os constituintes orgânicos de seu protoplasma, incluindo aminoácidos, vitaminas, purinas e pirimadinas, ácidos graxos e outros compostos. Tipicamente, cada desses compostos essenciais pode ser sintetizado por uma seqüência discreta de reações enzimáticas, onde cada enzima é produzida sob o controle de um gene específico. Entretanto, por uma variedade de motivos algum microorganismo não pode sintetizar um ou mais desses fatores de crescimento e deve então obter aquele composto do ambiente. Fatores de crescimento exigidos podem incluir, porém não são limitados a aminoácidos, vitaminas, purinas e pirimadinas, ácidos graxos e outros compostos necessários para crescimento. 0 meio de cultura ou crescimento utilizado na prática da presente invenção pode ser qualquer crescimento conhecido de meio de cultura para o cultivo de microorganismos. Tipicamente, o meio de cultura da presente invenção compreende um meio de nutriente líquido ou caldo de nutriente. 0 meio de cultura ou caldo de nutriente da presente invenção compreende tipicamente um ou mais nutrientes conhecidos, por exemplo, o meio de cultura pode conter uma ou mais fontes de carbono (por exemplo, glicerol), fontes de nitrogênio (por exemplo, sais de amônia), açucares, sais (por exemplo, K+, Mg2+, Ca2+, Zn2+) , nutrientes e/ou água. Em uma modalidade, o meio de cultura da presente invenção pode compreender ainda um ou mais de sais de potássio, sais de sódio, glutamato de sódio, citrato de sódio, sulfato de amônio, piridoxina, citrato de amônio férrico, sulfato de magnésio, sulfato de zinco, sulfato de cobre, biotina, cloreto de cálcio ou combinações dos mesmos. Em outra modalidade, meios de finalidade geral podem ser utilizados, incluem, por exemplo, caldo de soja tríptico, caldo de infusão de coração cérebro, caldo Columbia, e caldo Brucella.
Em geral, qualquer composto contendo amina primária conhecido pode ser utilizado na prática da presente invenção. Como discutido acima, um ou mais compostos contendo amina primária podem ser adicionados ao meio de crescimento ou cultura antes de, ou simultaneamente com inoculação do meio de cultura ou crescimento com uma amostra de teste. Em uma modalidade, o composto contendo amina primária pode ser adicionado como um suplemento ao meio de cultura antes da inoculação do meio de cultura contendo amina primária com uma amostra a ser testada. Em uma modalidade alternativa, o composto contendo amina primária pode ser adicionado diretamente à amostra de teste antes da inoculação do meio de cultura com a amostra de teste contendo amina primária. Aminas primárias úteis incluem, porém não são limitadas a, uma amina primária da fórmula R-NH2 onde R é uma alquila linear ou ramificada, grupo de arila, alcarila ou aralquila tendo entre aproximadamente 1 e aproximadamente 20 átomos de carbono. Grupos R preferidos incluem, sem limitação, metila, etila, propila, isopropila, butila, sec-butila, isobutila, hexilas (lineares ou ramificadas), hepilas, octilas, nonilas, decilas, fenila, benzila, fenilas substituídas por metila, ou misturas ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade, a amina primária é uma hidroxil amina. Aminas primárias exemplares podem incluir metil amina, etanol amina, trisamina, propil amina, 2-aminoheptano, 2-amino-2-metil-1,3- propanodiol, 2-amino-2-metil-l-propanol, n-amilamina, benzilamina, 1,4-butano diamina, n-butil amina, cicloexil amina, etil amina, etilenodiamina, a-metil benzil amina, fenetil amina, isopropil amina, butil amina, sec-butil amina, iso-butilamina, e tris(hidróxi metil) amino metano.
Em algumas modalidades, aminas primárias orgânicas podem ser preferidas. Aminas primárias orgânicas apropriadas podem incluir aminas, diaminas e/ou poliaminas alifáticas, cicloalifáticas, alifáticas/aromáticas, aromáticas, como metil amina, etil amina, butil amina, estearil amina, anilina, fenil aminas substituídas por halogênio (por exemplo, 4-clorofenil amina), 1,4- diaminobutano, 1,6-diamino hexano, 1,8-diamino-hexano, 1-amino-3,3,5-trimetil-5-amino cicloexano, éster de etil lisina, éster de aminoetil lisina, 1,6,11-triaminoundecano ou 1,5-naftilenodiamina, 1,4-diaminobenzeno, p- xílilenodiamina, 2,4- e/ou 2,6-diaminotolueno peridrogenado, 2,2'- 2,4'- e/ou 4,4'-diaminodicicloexil metano, 2,4-, 2,6-diaminotolueno e suas misturas, 4,4'-, 2,4'- e/ou 2,2'-difenil metano diamina e suas misturas, bem como derivados isoméricos, oligoméricos ou poliméricos com peso molecular mais elevado dessas aminas e poliaminas. Outras aminas possíveis são conhecidas da técnica anterior.
Aminas preferidas para a presente invenção são as diaminas e poliaminas da série difenil metano (MDA, aminas monoméricas, oligoméricas e poliméricas), 2,4-, 2,6-diaminotolueno (TODA, toluoilenodiaminas), por exemplo, misturas técnicas de 2,4-, 2,6-diaminotolueno (TODA, toluoilenodiaminas), em uma razão de peso de 80:20, isoforona diamina e hexametilenodiamina. Os isocianatos correspondentes diisocianatodifenil metano (MDI, isocianatos monoméricos, oligoméricos e poliméricos), diisocianato de tolueno (TDI), diisocianato de hexametileno (HDI), e diisocianato de isoforona (IPDI) são obtidos na fosgenação.
Em outras modalidades, a amina primária pode ser um aminoácido. Aminoácidos exemplares incluem, porém não são limitados a, alanina, arginina, asparagina, aspartato, cisteina, glutamato, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenil alanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
Em algumas modalidades, o uso de um hidroxil amina pode ser preferido. Como uma pessoa versada na técnica está bem ciente, hidroxil aminas incluem genericamente compostos tendo a fórmula NH2OH e sais dos mesmos. Hidroxil aminas úteis exemplificados incluem, porém não são limitados a metanol amina, etanol amina, propanol amina, butanol amina, pentanol amina, hexanol amina, heptanol amina, octanol amina, nonanol amina e decanol amina.
Grupos de tiol ou grupos de sulfidrila tendem a ser expurgadores de oxigênio, e desse modo podem interferir em compostos de um meio de cultura ou crescimento e/ou crescimento de microorganismo em um meio de cultura ou crescimento. Como tal, em algumas modalidades o uso de uma ou mais aminas primárias não contendo tiol pode ser preferido. Como uma pessoa versada na técnica está bem ciente, aminas primárias não contendo tiol podem incluir quaisquer compostos contendo amina primária conhecidos que não contem um grupo de tiol. Exemplos de Aminas primárias não contendo tiol incluem, porém não são limitados a metil amina, etanol amina, trisamina, propil amina, 2-aminoeptano, 2-amino-2-metil-l,3 propanol, 2-amino-2-metil-1-propanol, n-amilamina, benzilamina, 1,4-butano diamina, n-butil amina, cicloexil amina, etil amina, etileno diamina, a-metil benzil amina, fenetil amina, isopropil amina, butil amina, sec-butil amina, iso-butil amina, e tris(hidróxi metil) aminometanol. Ainda em outra modalidade, o uso de um aminoácido não contendo tiol pode ser preferido. Aminoácidos não contendo tiol úteis incluem, porém não são limitados a, alanina, arginina, asparagina, aspartato, glutamato, glutamima, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, fenil alanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
Em outra modalidade, a amina primária pode ser ligada a, ou imobilizada em um suporte sólido ou um veiculo polimérico, e o complexo de suporte de amina primária adicionado a uma garrafa ou meio de cultura, como discutido aqui. Em geral, o suporte pode ser qualquer material no qual um partner de ligação pode ser imobilizado, como nitrocelulose, silica, poliestireno, polipropileno, cloreto de polivinil, EVA, vidro, carbono, carbono vítreo, negro de fumo, nanotubos de carbono ou fibrilas, platina, paládio, ouro, prata, cloreto de prata, irídio ou ródio. Em uma modalidade, o suporte sólido pode ser veículos poliméricos, por exemplo, gel de silica modificado, vidro, especialmente "vidro de poro controlado", poliéster, poliamida, álcool de polivinil, polisiloxano, poliestireno ou similar. Em outra modalidade, suportes sólidos úteis podem incluir, porém não são limitados a, silica e resinas macroporosas neutras como copolímeros de estireno e divinil benzeno.
Em outro aspecto da presente invenção, o meio de cultura ou crescimento pode compreender ainda um ou mais adsorventes para a neutralização, inibição e/ou remoção de substâncias antimicrobianas adicionais que podem estar presentes em uma amostra de teste. Genericamente, substâncias antimicrobianas incluem, entre outras, antibióticos, antibióticos em amostras de fluido corpóreo, preservativos, bacteriostáticos, bactericidas, e quaisquer subprodutos tóxicos produzidos durante a preparação de meio de cultura. Substâncias antimicrobianas também incluem componentes de ocorrência natural em sangue como complemento e anticorpos. 0 termo "adsorvente" para fins desse pedido, inclui todos os materiais adsorventes que neutralizam, ligam e inibem substâncias antimicrobianas. Esses adsorventes incluem resinas e adsorventes não resinosos como definido nas patentes US números 4.145.304; 4.632.902; 5.162.229. e 5.314.229.
Como utilizado aqui, "resina" é uma subclasse de adsorventes, e é adicionalmente definido como incluindo resinas sintéticas e de ocorrência natural, por exemplo, resinas de permuta de ion, adsorventes de resina polimérica não funcionais e, em particular, resinas de poliestireno reticuladas com divinil benzeno. Resinas úteis podem incluir, porém não são limitadas àquelas reveladas nas patentes US 4.145.304 e 4.632.902. por exemplo, resinas úteis podem incluir resinas de permuta de cátion carregadas com sódio, hidrogênio e amônio como: BIO REX AG 50W — X2, X4, X6, X8, Χίο, X12, e Xie da BIO-RAD Laboratories, DOWEX 50W — Χ2, Χ4, Χε, Χθ, Χ10, Χΐ2, e Χίε da Dow Chemical Company e Rexyn 101 da Fisher Scientific Co., todas as quais são resinas de poliestireno de ácido forte tendo grupo funcional SO3’. Resinas não funcionais úteis podem incluir resinas XAD fabricadas por Rohm & Haas e resinas SM vendidas por BioRad. Por exemplo, resinas de permuta de ânion carregadas de cloreto, formato, acetato e hidróxido foram genericamente consideradas adequadas. Especificamente, resinas de permuta aniônica carregadas de cloreto em combinação com resinas adsorventes vendidas sob as seguintes marcas registradas podem ser eficazes na prática da invenção. DOWEX 1-X8 da Dow Chemical Company, DUOLITE A-109 da Diamond Shamrock Company e AMBERLITE IRA400 da Rohm & Haas, todas as quais são resinas de base forte tendo grupos funcionais de amônio quaternário de poliestireno; DUOLITE A-7 da Diamond Shamrock Company e AMBERLITE IR45 da Rohm & Haas, que são fracamente básicas e têm grupos funcionais de amina terciária. Em algumas modalidades, as resinas de permuta de anion e cátion podem ser preferivelmente utilizadas em combinação com uma resina não funcional como as resinas XAD da Rohm & Haas e resina SM da BioRad, particularmente resina XAD-4 que é um copolímero não funcional de estireno e divinil benzeno.
Como utilizado aqui "adsorventes não resinosos" são outra subclasse de adsorventes e são definidos como adsorventes não resina sintéticos e de ocorrência natural e peneiras moleculares que podem ser utilizados para clarificar, desodorizar, descolorir, e filtrar. Alguns dos adsorventes não resinosos são iguais àqueles utilizados durante a produção de antibióticos para remover antibióticos de meio de cultura que crescem em bactérias que produzem antibiótico. Adsorventes não resinosos úteis incluem aqueles revelados nas patentes US números 5.162.229 e 5.314.229, por exemplo, absorventes não resinosos úteis incluem várias formas de: 1) óxido de alumínio (alumina), 2) silicatos de alumínio hidratado nativo coloidal (argilas), como bentonita, caulim, e terra de fuller, 3) silicatos de alumínio alcalino hidratados cristalinos (zeólitos de cálcio ou sódio), 4) silica (silica gel, contas de silica) como Davisil, 5) frústulas siliciosas e fragmentos de várias espécies de diátomos (terra infusória, terra diatomácea) como Celite™ (Manville Products Corpooration, Denver, Co., EUA) e 6) carbono amorfo (em particular, carvão ativado) como Carboraffin, Norit™ (American Norit Company Inc., Jacksonville, Fia, EUA), Opocerby e Ultracarbon. Adsorvente de Carvão ativado de ocorrência natural, que foi utilizado para evitar os efeitos letais de oxidação em meio de transporte e meio de crescimento, também podem ser utilizados. Esse meio foi utilizado para o transporte de organismos fastidiosos como Neisseria gonorrhoeae e o cultivo de espécie de Legionella. Adsorventes não resinosos não exigem pré-tratamento com um tensoativo para funcionar. 0 tratamento com tensoativos pode até mesmo diminuir as capacidades absortivas desses materiais. 0 uso de adsorventes em uma razão apropriada para meio também pode remover subprodutos tóxicos produzidos em meios submetidos à autoclave e ainda fornecer um meio de cultura nutritivo ótimo enquanto mantém a capacidade de neutralizar substâncias antimicrobianas. As resinas e/ou adsorventes não resinosos podem estar presentes no meio de cultura de aproximadamente 0,1 g a aproximadamente 10 g por garrafa.
Os presentes adsorventes não são limitados ao uso em um dispositivo ou garrafa de cultura. Podem ser adicionados a qualquer meio de cultura padrão, que é então inoculado com uma amostra, incubado na temperatura correta por um período de tempo apropriado para o tipo de amostra sendo testada, enquanto normalmente agitado ou balançado para expor mais área superficial do absorvente ao líquido, para melhor contatar quaisquer organismos presentes com nutrientes e evitar áreas de concentração elevada de subprodutos metabólicos. As temperaturas e períodos de tempo necessários para a determinação de crescimento de microorganismo são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e variam de certo modo entre tipos diferentes de organismos.
Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um dispositivo para detectar microorganismos suspeitos de estarem em uma amostra de teste ou espécime compreendendo um recipiente vedável que compreende uma câmara interna na qual a amostra de teste ou espécime pode ser cultivada em um meio de cultura ou crescimento, o meio de cultura ou crescimento contendo pelo menos um composto contendo amina primária, em que o composto contendo amina primária neutraliza, liga e/ou inativa um ou mais antibióticos (por exemplo, carbapenemos) presentes no espécime. Em uma modalidade, o dispositivo é uma garrafa de cultura de sangue, como descrito, por exemplo, nas patentes US números 5.094.955 e 5.162.229. De acordo com esse aspecto da presente invenção, uma amostra de teste é introduzida no dispositivo, e o dispositivo é incubado até que crescimento positivo seja detectado ou genericamente até 5-7 dias terem passado e nenhum crescimento ser detectado.
Em outra modalidade, o composto contendo amina primária pode ser incluído em um suplemento que pode ser adicionado ao meio de cultura antes de, ou simultaneamente com inoculação do meio de cultura com a amostra a ser testada. Em uma modalidade alternativa, o suplemento contendo amina primária pode ser adicionado diretamente à amostra de teste, antes da inoculação de garrafa e meio de cultura com a amostra de teste contendo amina primária. 0 suplemento pode compreender ainda um ou mais nutrientes e/ou componentes conhecidos por aqueles versados na técnica como sendo benéficos para o cultivo de microorganismos. Por exemplo, o suplemento da presente invenção pode compreender adicionalmente um ou mais açúcares, fontes de carbono, fontes de nitrogênio, minerais, sais, aminoácidos, vitaminas, purinas e pirimadinas, ácidos graxos e outros componentes. Após adição do suplemento e inoculação do meio de cultura com a amostra a ser testada, o meio de cultura e amostra podem ser cultivados por um período de tempo suficiente e em uma temperatura suficiente para permitir o crescimento e detecção de qualquer microorganismo que possa estar presente na amostra de teste.
Ainda em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um kit para detectar microorganismos em uma amostra de teste, o kit compreendendo: (1) um recipiente de espécime vedável, tendo uma câmara interna que compreende um meio de cultura e no qual uma amostra de teste, para a qual a presença ou ausência de um microorganismo deve ser determinada, pode ser cultivada; e (2) um suplemento compreendendo um ou mais compostos contendo amina primária. De acordo com esse aspecto da presente invenção, o suplemento pode ser adicionado ao meio de cultura contido no recipiente de espécime vedável, desse modo fornecendo um ou mais compostos contendo amina primária em uma quantidade que é eficaz para neutralizar, ligar ou inibir quaisquer antimicrobianos que podem estar presentes no meio de cultura. Uma amostra de teste pode ser adicionada ao meio de cultura, simultaneamente com, ou após adição do suplemento ao meio de cultura, o suplemento fornecendo um ou mais compostos contendo amina primária em uma quantidade que é eficaz para neutralização, ligação, ou inibição de quaisquer antimicrobianos que podem estar presentes na amostra de teste. 0 suplemento do kit compreende ainda um segundo recipiente ou frasco compreendendo um ou mais compostos contendo amina primária. Em uma modalidade, o segundo recipiente ou frasco compreende um ou mais compostos contendo amina primária suspensos em um tampão de estabilização. Tampões de estabilização são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Em outra modalidade, um ou mais compostos contendo amina primária presentes no recipiente ou frasco podem ser liofilizados. De acordo com essa modalidade, um ou mais compostos contendo amina primária liofilizados podem ser suspensos novamente em um tampão de resuspensão ou tampão de estabilização antes de ser adicionado ao meio de cultura no recipiente de espécime. Ainda em outra modalidade, o kit da presente invenção pode fornecer ainda um terceiro recipiente ou frasco compreendendo o tampão de estabilização ou resuspensão.
Como técnicos versados no assunto estão cientes, a presença de microorganismos pode ser determinada por detectar ou medir alterações no pH do espécime ou produção de C02 em um espécime utilizando um sensor descartável afixado à superfície interior do recipiente, como descrito, por exemplo, nas patentes US números 4.945.060 e 5.164.796, que são incorporados aqui a título de referência. De acordo com as revelações de '060 e '796, microorganismos podem ser detectados na presença de materiais interferentes, como grandes concentrações de hemácias, através de meio não radiométrico e não invasivo. À medida que o nível de pH e/ou CO2 no espécime muda, as características de refletir e/ou absorver luz do sensor descartável alterarão de acordo. A quantidade de alteração das propriedades refletivas do sensor é detectada por um mecanismo de recebimento e emissão que fornece sinais a um dispositivo para monitorar a quantidade de reflexo/absorção visível e a taxa de alteração. A taxa e quantidade são então analisadas para prever e determinar a presença de crescimento microbiano no espécime ou amostra. 0 sensor pode ser amostrado e/ou monitorado continuamente ou em intervalos de tempo freqtientes permitindo a coleta de uma característica detalhada da quantidade e taxa de alteração de sensor. Como descrito na técnica, o meio sensor pode compreender uma membrana e um meio indicador, o meio indicador sendo selecionado por sua capacidade em exibir uma alteração detectável quando exposto a produtos da atividade metabólica de um organismo. Como sabido por aqueles versados na técnica, as alterações na aparência do meio sensor podem ser continuamente monitoradas a partir do exterior do recipiente através de uma seção transparente do recipiente.
Esse dispositivo ou garrafa de cultura de sangue também pode incluir materiais no meio de cultura como os materiais resinosos, como descrito nas patentes US números 4,145,304 e 4,632902, e materiais adsorventes não resinosos, como descrito nas patentes US números 5,162,229 e 5,314,229, ou combinações dos mesmos, que neutralizam, ligam ou inibem quaisquer outras substâncias antimicrobianas que podem estar presentes na amostra de teste de meio de cultura. As resinas e/ou adsorventes não resinosos podem estar presentes no dispositivo de aproximadamente 0,1 g a aproximadamente 10 g por garrafa. A presente invenção pode ser incorporada em muitas formas diferentes e não deve ser interpretada como limitada às modalidades expostas aqui. Em vez disso, essas modalidades são fornecidas de modo que essa revelação seja completa, e passe totalmente o escopo da invenção para aqueles versados na técnica. Por exemplo, características ilustradas com relação a uma modalidade podem ser incorporadas em outras modalidades, e características ilustradas com relação a uma modalidade específica podem ser deletadas daquela modalidade. Além disso, inúmeras variações e adições às modalidades sugeridas aqui serão evidentes por técnicos versados no assunto à luz da presente revelação, que não se afastam da presente invenção. A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por um técnico versado no assunto, à qual a presente invenção pertence. A terminologia utilizada na descrição da invenção é para fins de descrever modalidades específicas somente e não pretende ser limitadora da invenção.
Os seguintes exemplos são dados para ilustrar adicionalmente características da invenção, porém não pretendem limitar o escopo da invenção de modo algum. Exemplos Exemplo 1. Uso de cisteína para neutralizar Imipenemo Uma solução de material de imipenemo do tipo USP foi preparada por dissolver 1,8 gramas em 10 mL de 14 mM K2HPO4 (pH 7,0) em um tubo de vidro com tampa de atarraxar. Uma solução de material de cisteína foi preparada por dissolver 31,3 mg em 1,08 mL de 14 mM K2HPO4 em um tubo de centrífuga de 2 mL de polipropileno.
Uma reação de imipenemo sem cisteína foi preparada por combinar 2,2 mL da solução de imipenemo de material com 7,8 mL de 14 mM K2HPO4 a uma concentração final de 40 ug/mL. O volume total de 10 mL foi então adicionado a uma garrafa de cultura de BacT/Alert contendo adsorventes de resina. A garrafa foi brevemente agitada para misturar e 500 uL de volume foram removidos para análise. A garrafa foi então colocada em um instrumento BacT/Alert® 3D (bioMerieux, Inc., Missouri, EUA) a 36°C e amostras de 500 uL adicionais foram removidas em intervalos de 20, 40, 60 e 90 minutos para análise (vide as figuras 2A-2D).
Uma reação de imipenemo com cisteína foi preparada por combinar 2,2 mL da solução de imipenemo de material com 7,8 mL de 15 mM K2HPO4 a uma concentração final de 4 0 ug/mL. O volume total de 10 mL foi então adicionado a uma garrafa de cultura BacT/Alert contendo adsorventes de resina. Uma amostra de 500 uL da solução de material de cisteina foi então adicionada a uma concentração final de cisteina de 4 mM. A garrafa foi brevemente agitada para misturar e 500 uL de volume foram removidos para análise. A garrafa foi então colocada em um instrumento BacT/Alert® 3D (bioMerieux, Inc., Missouri, EUA) a 36°C e amostras adicionais de 500 uL foram removidas em intervalos de 20, 40, 60 e 90 minutos para análise (vide as figuras 1A-1B).
Amostras de reação foram analisadas em um HPLC equipado com uma coluna HPLC de exclusão de tamanho BioSep™ SEC-2000 (Phenomenex) com uma fase móvel de 100 mM Na2HPO4, pH 6,5 em uma taxa de fluxo de 1 mL/minuto. As reações foram monitoradas a 300 nm e o tempo de análise total por amostra foi de 16 minutos. A garrafa contendo tanto imipenemo como cisteina mostrou uma redução de imipenemo de aproximadamente 70%, 85%, 89% e 91% após 20, 40, 60 e 90 minutos, respectivamente (vide a tabela 1) . Entretanto, após 90 minutos a garrafa contendo somente imipenemo não mostrou redução em imipenemo (vide a figura, Tabela 2).
Tabela 1 - reação de Impinememo + cisteina Tabela 2 - Controle de imipenemo + sem cisteína Exemplo 2. Desempenho de crescimento em garrafa de resina contendo imipenemo com e sem cisteína Uma solução de imipenemo foi preparada por dissolver 4,0 mg de imipenemo em 100 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,0, e filtrada estéril através de um filtro de 0,2 u. cisteína foi preparada por dissolver 300 mg em 10 mL de PBS e filtrada estéril através de um filtro 0,2 u para obter uma concentração final em garrafas BacT/Alert® (bioMerieux Inc., Missouri, EUA) de 4 mM com a adição de 500 uL. Uma cultura de S. aureus foi preparada após incubação durante a noite a uma concentração final de 30-300 CFU (unidades de formação de colônia)/500 uL.
Garrafas de cultura BacT/Alert® (bioMerieux Inc., Missouri, EUA) contendo adsorventes de resina foram preparadas para avaliação em triplicata como a seguir: Controles de crescimento foram preparados por adicionar 10 mL de PBS filtrado estéril individualmente ou 10 mL de PBS filtrado estéril mais 500 uL de solução de cisteína. Um controle para a atividade de imipenemo foi preparado por adicionar 10 mL de solução de imipenemo. A reação de imipenemo/cisteína foi preparada por adicionar 10 mL de solução de imipenemo mais 500 uL de solução de cisteína. Cada garrafa recebeu 500 uL da cultura de S. aureus e foi então colocada em um instrumento BacT/Alert 3D® (bioMerieux Inc., Missouri, EUA) a 36°C e monitorada em relação a crescimento durante cinco dias.
Após 5 dias todas as garrafas contendo imipenemo sem cisteína foram negativas para crescimento de S. aureus. entretanto, em 28 horas 2 das 3 garrafas contendo imipenemo e cisteína foram positivas para crescimento de S. aureus.
REIVINDICAÇÕES

Claims (4)

1. Método para a neutralização e/ou inativação de um carbapenemo em um meio de cultura, o método sendo caracterizado pelo fato de que compreende adicionar cisteína a um meio de cultura capaz de suportar o crescimento de microorganismos, em que a dita cisteína está presente em uma quantidade eficaz para neutralização e/ou inativação de quaisquer carbapenemos que podem estar presentes no meio de cultura, a referida quantidade eficaz compreendendo uma concentração final de 0,5 g / L a 20 g / L; em que o referido meio de cultura compreende ainda um ou mais adsorventes eficazes para neutralizar e / ou inativar quaisquer antibióticos adicionais, e em que pelo menos um dos referidos adsorventes é uma resina.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma amostra de teste suspeita de conter microorganismos é adicionada ao meio de cultura e cultivada sob condições suficientes para crescimento de quaisquer microorganismos na amostra de teste e em que a cisteína é adicionada ao meio de cultura como um suplemento antes de, ou simultaneamente com, a amostra de teste.
3. Método para o diagnóstico de uma infecção causada por um microorganismo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) obter uma amostra de teste para a qual a presença ou ausência do microorganismo deve ser determinada, e em que a amostra de teste pode conter um ou mais antibióticos de carbapeneno que podem interferir no crescimento e/ou detecção do microorganismo; (b) adicionar a amostra de teste a um meio de cultura, o meio de cultura compreendendo pelo menos cisteína em uma quantidade que é eficaz para neutralizar, ligar ou inibir carbapenemos, a referida quantidade eficaz compreendendo uma concentração final de 0,5 g / L a 20 g / L; e (c) analisar a cultura em relação à presença do microorganismo, em que a detecção da presença do microorganismo indica um diagnostico positivo para a infecção, em que o referido meio de cultura compreende ainda um ou mais adsorventes eficazes para neutralizar e/ou inativar quaisquer antibióticos adicionais, e em que pelo menos um dos referidos adsorventes é uma resina.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a amostra de teste é uma amostra clínica selecionada do grupo que consiste em sangue, soro, plasma, frações de sangue, urina e amostras de saliva e em que a dita cisteína é adicionada ao meio de cultura como um suplemento antes de, ou simultaneamente com a amostra de teste.
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