CN108368534A - 用于确定废物中抗生素的测定 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于快速确定废物，例如来自工厂的液体或固体废物流中抗生素存在的简单且易于使用的方法。本发明还涉及包含用于快速确定废物中抗生素存在的测定和手册的试剂盒。

Description

用于确定废物中抗生素的测定

技术领域

本发明涉及一种用于快速确定废物中，例如来自工厂的液体或固体废物流中抗生素存在的简单且易于使用的方法。本发明还涉及包含用于快速确定废物中抗生素存在的测定和手册的试剂盒。

背景技术

抗微生物抗性是全球性重要问题之一，其不再是对未来的预测，而是正在世界各地发生，并有可能影响任何国家的任何年龄的任何人。抗微生物抗性-当细菌改变时，抗生素不再对需要其来治疗感染的人起作用-现在已成为公共健康的主要威胁。越来越多的公众呼吁采取全球性集体行动来应对这一威胁，包括关于抗微生物抗性国际条约的提案。世界各地的抗生素抗性并没有得到很好的映射，但受影响最大的国家是医疗系统较差的贫穷国家。抗微生物抗性发生的主要途径可以有以下三种：对某些类型细菌的天然抗性、基因突变、或通过从另一种细菌获得抗性。

由于微生物自身的突变，抗微生物抗性可能自发发生，随着时间推移积累抗性或滥用抗生素。抗性微生物越来越难以治疗，导致需要替代性药物或更高剂量，这两种情况对个体而言可能更昂贵或更具毒性。由于抗微生物抗性，一些感染已经变得无法治愈。

抗微生物抗性是越来越棘手的问题，每年导致数百万人死亡。抗药性的上升趋势可归因于四个主要方面：在人类群体中使用抗生素、在动物群体中使用抗生素、在人类和/或非人类来源之间抗性菌株的传播、以及抗生素在环境中的释放。

抗微生物抗性的后一个原因，抗生素在环境中释放，在农业和工业的各个环节都是一个日益严重的问题。在这方面，环境，尤其是通过例如医院和工业废水以及未经处理的城市废水等“热点”的传播和污染呈现出日益严重的公共健康问题。自从通过人类废物(用药、耕作)、动物治疗和制药业等若干来源引入抗生素以来，它们一直在污染环境。抗生素废物可能含有抗性细菌，或可能是抗性细菌发展的来源。因此，抗生素废物可能会导致抗生素抗性细菌进入环境。随着细菌快速复制，进入环境的抗性细菌在继续分裂时复制其抗性基因。另外，携带抗性基因的细菌(即抗性细菌)具有通过水平基因转移将这些基因传播到其他物种的能力。因此，即使特定抗生素不再被引入环境中，抗生素抗性基因仍会通过已经复制而没有持续暴露的细菌而持续存在。

作为后果之一，抗生素的生产者必须确保使用最清洁、最严格和可持续的方法来使生产挽救生命的药物对环境的影响最小化，而朝这个方向迈出的第一步是测量(工业)废物流中的抗生素含量。

从技术上讲，采用最先进的分析方法，这是可行的。水性流中抗生素的量可以通过若干种方法测量，所述方法包括光度测定法、电化学、气相色谱法和直接液相色谱法(Pettas和Karayannis(2004),Anal.Chim.Acta[分析化学学报]522,275-280)。缺点是这些技术费力费时，并且通常需要昂贵的设备和训练有素的人员。因此，这些方法即使不是不可能，也很难以高频率和/或在许多地点由没有特别高的技术技能的人员实施。

因此，需要简单、廉价且易于使用的方法来确定废物流中抗生素的存在和/或浓度。本披露提供了这样的方法。

已知用于确定抗生素的微生物测定已经相当长的一段时间了。这类测定的实例描述于CA 2056581、DE 3613794、EP 0005891、EP 0285792、EP 2226389、GB 1467439、WO 94/18343和WO 2005/118837中。这些分析中大多数都是为用于乳品行业而设计的，特别是用于分析奶。这些微生物测定包含即用型测定，该测定利用微生物并通过由添加到测定介质中的指示剂(例如可以给出指示信号的指示剂分子)所指示的变化给出结果。其原理是，当抗生素以足以抑制微生物生长的浓度存在于样品中时，指示剂的颜色将保持不变，而当不发生抑制时，微生物的生长伴随着酸和/或减少的代谢物的形成或其他会引起指示剂指示信号变化的现象。

不幸的是，当将这样的测定法应用于比奶更复杂的底物时，例如包含许多其他组分或甚至(半)固体废物(例如滤饼、菌丝体或来自发酵过程的浓缩残余物)的废水流，结果难以解释，并且因此不可靠。如果指示剂变化是指示剂分子颜色的变化，这种变化往往难以观察或解释。另一个可能的缺点是复合样品中的其他非抗微生物组分影响测定微生物的正常功能。

发明内容

本披露涉及用于确定基本不含乳糖和/或含有少于0.01％(w/w)的乳糖的不含乳糖的样品中抗生素存在或不存在的方法，该方法包括以下步骤：

(a)使所述不含乳糖的样品与测定介质接触，该测定介质包含微生物、胶凝剂和能够检测该微生物的生长或抑制的指示剂，以获得不含乳糖的样品和测定介质的组装体；

(b)在没有抗生素存在于所述不含乳糖的样品中的情况下，将步骤(a)中获得的组装体孵育足够的时间以使该微生物生长；和

(c)用该指示剂检测该微生物的生长或生长的抑制，

其特征在于在步骤(a)中添加奶和/或奶粉。

本披露还涉及试剂盒，该试剂盒包含：

(a)具有测定介质的容器，该测定介质包含微生物、胶凝剂和能够检测该微生物生长或抑制的指示剂以获得混合物；

(b)包含用于确定基本上不含乳糖和/或含有小于0.01％(w/w)乳糖的不含乳糖样品中抗生素浓度的说明书的手册。

本披露还涉及溴甲酚紫或溴百里酚蓝用于确定基本不含乳糖和/或含有小于0.01％(w/w)乳糖的不含乳糖的样品中抗生素浓度的用途。本发明进一步涉及β-内酰胺降解化合物用于确定基本不含乳糖和/或含有小于0.01％(w/w)乳糖的不含乳糖样品中抗生素浓度的用途。

具体实施方式

本发明的目的是提供一种用于确定废物中抗生素的简单、廉价且易于使用的方法。还提供了包含用于应用于废物的易于使用的微生物测定和说明书的部件的试剂盒，该试剂盒包含复合物基质，例如包含许多其他组分或甚至(半)固体废物(例如滤饼、菌丝体或来自发酵过程的浓缩残余物)的废水流。

本披露提供了独特的可靠且简单的通用测试方案。

在本发明的上下文中，术语和缩写定义如下。

术语“抗生素”是指如下化合物，例如像β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类、喹诺酮类和磺胺类及其衍生物；及其任何组合。可以用本发明所述的方法或试剂盒检测其存在的抗生素的实例是但不限于氨基糖苷类(例如阿米卡星，地贝卡星，庆大霉素，卡那霉素A，新霉素B、C和E，奈替米星，西索米星，链霉素，妥布霉素等)、头孢菌素(例如7-氨基头孢烷酸、7-氨基去乙酸头孢烷酸、头孢克洛、头孢羟氨卡、头孢羟唑、头孢曲嗪、头孢唑啉、头孢拉宗、头孢卡品、头孢地尼、头孢托仑、头孢吡肟、头孢他美、头孢克肟、头孢甲肟、头孢美唑、头孢米诺、头孢地嗪、头孢尼西、头孢哌酮、头孢雷特、头孢噻利、头孢噻肟、头孢替安、头孢替坦、头孢维新、头孢西丁、头孢唑兰、头孢匹胺、头孢匹罗、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢喹肟、头孢沙定、头孢磺啶、头孢洛林、头孢他啶、头孢特仑、头孢布烯、头孢噻呋、头孢唑肟、头孢吡普、他唑巴坦、头孢曲松、头孢呋辛、头孢氨苄、头孢菌素C、头孢拉定等)、青霉素(如6-氨基青霉烷酸、阿莫西林、氨苄西林、氯唑西林、氟氯西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V等)、第一代喹诺酮类(如西诺沙星、萘啶酮酸、奥索利酸、吡哌酸、吡罗米酸、罗索沙星)、第二代喹诺酮类(如环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、洛美沙星、纳地沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、鲁氟沙星)、第三代喹诺酮类(如巴罗沙星、格帕沙星、左氧氟沙星、帕珠沙星、司帕沙星、替马沙星、托氟沙星)、第四代喹诺酮类(如克林沙星、加替沙星、吉米沙星、莫西沙星、西他沙星、曲伐沙星、普卢利沙星)、磺胺类和四环素类(例如金霉素、地美环素、赖甲环素、甲氯环素、美他环素、米诺环素、土霉素、氢吡四环素、四环素等)。重要的是，还包括仍然具有抗微生物活性的上述化合物的降解产物和/或重新排列的衍生物。

术语“测定介质”是指溶液、固体形式的组合物，或优选地凝胶状基质(如溶胶或凝胶)形式的组合物。如果测定介质具有凝胶状基质的形式，则其可能包含胶凝剂。本领域技术人员将理解，固体测定介质可以基于载体材料，例如陶瓷、棉花、玻璃、金属颗粒、纸、任何形状或形式的聚合物、硅酸盐、海绵、羊毛等。通常，测定介质包含一个或多个指示剂。测定介质可以包含一种或多种类型的微生物或酶作为检测剂和至少一种营养素。测定介质可以具有包含微生物、指示剂和营养素的片剂、圆盘或纸滤器的形式。这三种组成可以以单一片剂存在，但也可以以两种或更多种片剂存在。当然，也可以使用结合呈固体、液体和/或凝胶状形式的测定介质的测定。在实施例中，将微生物、指示剂和营养素引入琼脂溶液中。允许琼脂溶液固化以形成测定介质，使得微生物保持存活，但由于例如低温，微生物不能繁殖。在实施例中，测定介质中胶凝剂的量在2g.l^-1和100g.l^-1之间，优选在5g.l^-1和50g.l^-1之间，更优选在10g.l^-1和20g.l^-1之间，最优选在12g.l^-1和15g.l^-1之间。在优选的实施例中，胶凝剂是琼脂。任选地，测定介质还可以含有一种或多种缓冲液、稳定剂、表面活性剂、盐、以正面(改进敏感性)或负面(降低敏感性)方式改变对某些抗微生物化合物的敏感性的物质、增粘-剂或其任何组合。当介质中存在缓冲液时，可以在介质组分的混合过程中添加缓冲液，或者可以将组分溶解和/或悬浮于缓冲液中。合适的缓冲剂包含但不限于丙氨酸、磷酸钾和磷酸钠。改变对某些抗微生物化合物敏感性的物质的实例是抗叶酸剂(如欧美德普、四氧普林、和甲氧苄氨嘧啶)，其提高微生物对提高对四环素敏感性的磺胺化合物或者草酸或氢氟酸的盐或者钙螯合剂的敏感性。半胱氨酸和青霉素结合蛋白是已知降低对某些抗微生物化合物的敏感性的化合物。增粘剂-的实例包含但不限于抗坏血酸甲基硅烷醇果胶酸酯、卡波姆、羧甲基纤维素、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、鲸蜡酯、椰子酰胺DEA、乳化蜡、葡萄糖、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、月桂酰胺DEA、亚油酰胺DEA、硅酸镁铝、麦芽糖糊精、PEG-8二硬脂酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、PVP/十六碳烯共聚物、氯化钠、硫酸钠、大豆油酰胺丙基甜菜碱、黄原胶等。合适的稳定剂是例如胶体二氧化硅。可替代地，上述测定介质的任选成分也可以以外源方式添加。测定介质可以包含在任何类型的容器内；经常使用的容器是管、微量滴定板和培养皿。只要观察到指示剂变化是可能的，容器可以具有任何形状和尺寸并来自可用的任何材料。可以视觉观察指示剂变化，但是也可以使用样品读数装置(例如扫描仪)来观察。任选地，用于在孵育期间密封填充有测定介质的所述容器的装置和/或具有使用说明书的插入物和/或用于设定孵育所需时间的装置是测定系统的一部分。任选地，对测定介质进行灭菌。通常将pH调节到所需的值。本发明的方法可以包括混合样品(例如与其他样品一起，但也可与例如盐、缓冲化合物、稳定剂、同位素标记的化合物、荧光标记的化合物等一起)、在添加到测定介质中之前浓缩和/或进一步稀释(例如用稀释液，如水)样品。

术语“CFU”是菌落形成单位的缩写，并且是指微生物的数量、微生物的孢子、部分发芽的微生物孢子和/或能够产生微生物菌落的营养细胞。所述CFU的浓度表示为菌落形成单位/ml的测定介质(CFU.ml^-1)并且通常在1x 10⁵CFU.ml^-1至1x 10¹²CFU.ml^-1，优选地1x10⁶至1x 10¹⁰CFU.ml^-1，更优选地2x 10⁶至1x 10⁹CFU.ml^-1，最优选地5x 10⁶至1x 10⁸CFU.ml^-1，或仍更优选地5x10⁶至2x 10⁷CFU.ml^-1的范围内。

术语“胶凝剂”是指有助于将混合物变成凝胶或呈其呈凝胶形式的化合物或物质。胶凝剂的合适实例是琼脂、海藻酸及其盐、角叉菜胶、明胶、羟丙基瓜尔胶及其衍生物、刺槐豆胶(角豆胶)、加工的麒麟菜属海藻等。

在本发明的上下文中，术语“指示剂”是指用于测量(例如通过改变颜色或荧光)测定介质相对于特定组分(例如酸、碱、氧化剂或还原剂)存在下的条件的物质。指示剂在从一种状态变化到另一种状态时提供可检测的信号，例如颜色或荧光的变化。指示剂可以是pH指示剂、氧化还原指示剂或其组合。本文的术语指示剂还可以是指两种或更多种指示剂。合适的指示剂的实例对于本领域技术人员是熟知的(参见手册H.J.Conn’s BiologicalStains[H.J.Conn的生物染料]，R.D.Lillie编辑，巴尔的摩，1969)。特别有用的指示剂是，在从一种状态变化到另一种状态时，提供视觉上可检测的信号，例如颜色或荧光的变化。测定介质中指示剂的量在0.01g.l^-1和50g.l^-1测定介质之间，优选在0.1g.l^-1和10g.l^-1之间，更优选在0.5g.l^-1和5g.l^-1之间，最优选在1g.l^-1和3g.l^-1之间。此类指示剂可以容易地选自如下手册：‘H.J.Conn’s Biological Stains[H.J.Conn的生物染料]’，R.D.Lillie编辑，巴尔的摩，1969。优选的指示剂是pH指示剂和/或氧化还原指示剂。合适的指示剂的实例是酸性蓝120、酸性橙51、酸性黄38、茜素酸、茜素蓝、天青A、天青B、碱性蓝3、亮蓝、亮甲酚蓝、亮藏花精(Brilliant Crocein)MOO、亮黄、溴甲酚绿、溴甲酚紫、溴酚蓝、溴酚红、溴百里酚蓝、氯甲酚绿、刚果红、间甲酚紫、花青、蓝胭脂红、杰纳斯绿B、石蕊、亚甲蓝、甲基红、尼罗蓝A、菲那夫扎显(Nitrazol Yellow)(也称为硝嗪黄)、邻硝基酚、对硝基酚、1,10邻二氮杂菲、酚酞、酚红、番红O、硫素、百里酚蓝、甲苯胺蓝和二甲酚蓝。优选的指示剂是在从4.5至8.0，优选从5.0至7.5，更优选从5.5至7.0的pH范围内改变颜色的指示剂，优选这些是溴甲酚绿、溴甲酚紫、溴百里酚蓝、甲基红或酚红，最优选溴甲酚紫或溴百里酚蓝。

术语“不含乳糖的样品”是指不是奶或其他含乳糖乳制品的样品。不含乳糖的样品是指需要确定其中是否存在抗生素并且与奶样品有所区分的样品，为此，现有技术抗生素测定被广泛应用并被认可。不含乳糖也涵盖基本上不含乳糖。通常，不含乳糖的样品含有小于0.01％(w/w)的乳糖，例如从0.0001％(w/w)至0.01％(w/w)的乳糖，优选从0.00001％(w/w)至0.005％(w/w)的乳糖。乳糖含量可以根据技术人员已知的方法确定。优选地根据ISO22662:2007确定乳糖含量。本发明上下文中不含乳糖的样品的实例包括来自工厂的工业废物流(包括水性和固体废物流)的样品，来自废水和地表水(如河流、湖泊、溪流等)的样品，和来自兽医尿液或粪便的样品。用于本发明的不含乳糖的样品可以来自液体(例如水，废水，工艺用水，污水，饮用水，应用于例如游泳池、桑拿浴和温室的水，以及冷却水)。它可以是来自农业来源、渔业、船舶压载、冷却塔、废水处理厂、发电厂、化学工业(例如纺织工业、造纸和纸浆工业、印刷工业、钢铁工业、焦炭工业、石油工业、农药工业、涂料工业、医疗和牙科工业、溶剂工业、制药工业、木材防腐化学工业和食品工业)的水。所述液体可以是来自上述来源中的任何一种的流入废水和/或流、流出废水和/或流、或中间废水和/或流。

术语“微生物”是指对抗生素敏感的微生物，其存在或不存在通过其生长来确定。

如本文所用的术语“营养素”是指促进和/或为微生物生长所需的营养物质或成分。合适的营养素取决于测定介质中使用的微生物。测定介质可以包含两种或更多种不同的营养素。它们包含但不限于可同化的碳源，例如碳水化合物，如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和右旋糖；可同化的氮源，例如氨基酸，如蛋白胨或胰蛋白胨；维生素和生长因子来源，例如牛肉或酵母提取物；和矿物质来源，例如碱土金属盐，如钡或钙的盐。

术语“奶粉(powdered milk或dried milk)”是指通过蒸发奶至干燥而制成的人造乳制品。干燥奶的一个目的是保存它；奶粉比液态奶具有更长的保质期，并且由于其含水量低，不需要冷藏。另一个目的是减少体积，实现经济运输。奶粉和乳制品包括干全脂奶、无脂(脱脂)干奶、干酪乳、干乳清产品和干乳品共混物等物品。

在本发明的上下文中，术语“孢子”是指通过微生物产生并能够发育成新的个体微生物的原始通常单细胞的、通常对环境有抗性的休眠或生殖体。

在第一方面，本发明涉及用于确定基本不含乳糖和/或含有少于0.01％(w/w)的乳糖的不含乳糖的样品中抗生素存在或不存在的方法，该方法包括以下步骤：

(a)使所述不含乳糖的样品与测定介质接触，该测定介质包含微生物、胶凝剂和能够检测该微生物的生长或抑制的指示剂，以获得不含乳糖的样品和测定介质的组装体；

(b)在没有抗生素存在于所述不含乳糖的样品中的情况下，将步骤(a)中获得的组装体孵育足够的时间以使该微生物生长；和

(c)用该指示剂检测该微生物的生长或生长的抑制，

其特征在于在步骤(a)中添加奶和/或奶粉。

令人惊讶的是，发现与在不存在(奶粉)奶的情况下进行类似测定相比，将奶或奶粉添加到待测试存在或不存在抗生素的不含乳糖的样品中导致提高的准确性和易检测性。如本发明的背景技术中所述，进行用于确定奶中的抗生素的微生物测定是熟知的。也有报道使用微生物测定来确定不是源自乳品行业的样品中的抗生素；通常这些是水性不含乳糖的液体。然而，在现有技术中没有建议通过向所述不含乳糖的样品中添加(奶粉)奶来进行不含乳糖样品中抗生素的确定，更不用说改进。这一观察背后的机制尚未完全理解。无论与奶对测定介质的影响是否有关，微生物(的生长)、对指示剂的着色作用、或与待分析的不含乳糖样品的化学或物理相互作用目前是推测性的并且在现有技术中未得到支持。

在第一实施例中，所述微生物是芽孢杆菌属、大肠杆菌或链球菌属的菌株。在另外的实施例中，所述微生物是嗜热微生物，例如嗜热脂肪芽孢杆菌或嗜热链球菌。测定介质可以包含一种或多种类型的微生物作为检测剂。可以将微生物作为能够产生菌落的单位或CFU引入测定介质中。孵育步骤(b)中微生物的生长发生在预定的时间段内，优选0.5至4小时，更优选在1至3.5小时之间，最优选在2.0至3.25小时之间的时间跨度内。优选地，使微生物的生长在预定温度，优选地微生物的最佳生长温度下进行。例如当使用嗜热微生物时，所述温度优选在40℃和70℃之间，更优选50℃和65℃之间，最优选60℃和64℃之间。任选地，所述反应可以借助恒温装置进行。在恒温装置的帮助下，样品可以保持在预先设定的温度，例如微生物显示充分生长的温度下。优选地，所述恒温装置以这样的方式设计，使得可以容纳填充有测定介质的容器。任选地，将恒温装置连接到用于设定孵育所需时间的装置上，使得在预设时间段失效之后停止加热和/或冷却。可替代地，微生物生长所需的时间等于没有任何消毒剂的校准样品引起指示剂变化所需的时间。

在第二实施例中，在步骤(a)之前从所述不含乳糖的样品中去除固体。这种去除可以使用技术人员可用的操作(例如离心、倾析、过滤等)来实现。任选地，当所述不含乳糖的样品含有许多固体或甚至是固体时，有利的是首先将样品与水性溶液混合，然后去除固体。所述水性溶液可以是奶或与水混合的奶粉。

在第三实施例中，存在于合并的不含乳糖的样品加上添加的奶或奶粉中的乳糖的量为从1％至10％(w/w)，优选从2％至5％(w/w)。

在第四实施例中，进行对照测试，由此在步骤(a)中添加已知量的抗生素。所述抗生素可以是任何抗生素，并且优选是青霉素G K。

在第五实施例中，进行对照测试，由此在步骤(a)中添加已知量的β-内酰胺降解化合物。所述β-内酰胺降解化合物可以是任何β-内酰胺降解化合物，并且优选是β-内酰胺酶。

虽然对照测试对于本发明的方法的正常运行不是强制性的，但本领域技术人员理解，当第四和第五实施例的对照测试与第一方面的方法一起进行时，结果的可靠性提高。

在第六实施例中，本发明提供了用于确定不含乳糖样品中抗生素浓度的方法，该方法包括以下步骤：

(a)通过添加奶制备稀释范围的所述不含乳糖的样品；

(b)使步骤(a)中获得的每种稀释液与包含微生物、营养素和指示剂的测定介质接触；

(c)在样品中不存在抗生素的情况下，将步骤(b)中获得的每种混合物孵育一段时间以使微生物生长；

(d)用该指示剂检测该微生物的生长或生长的抑制；

(e)用能够抑制该微生物生长的最高稀释因子确定稀释液；

(f)确定在步骤(e)中确定的稀释液中抗生素的浓度，和

(g)通过将在步骤(f)中确定的浓度乘以用于制备该稀释液的在步骤(e)中确定的稀释因子来确定所述不含乳糖的样品中抗生素的浓度。

通过观察存在或不存在指示剂变化，来检测微生物的生长或生长抑制。优选地，这是针对稀释范围的每个稀释液进行的。例如，当指示剂的变化是颜色变化时，可以在视觉上观察颜色变化。然而，在本发明的实施例中，使用产生数字图像数据的排列或产生模拟图像数据并将所述模拟图像数据转换为数字图像数据的排列来确定颜色改变，然后由计算机处理器解释所述数字图像数据。在WO 03/033728中描述了这样的排列，例如可以是样品读取装置，例如与个人计算机连接的扫描仪。用这样的排列，可以扫描测试板中每个样品的底面。反射光的颜色和亮度被记录在三个变量中，每个变量描述一个颜色分量，例如所谓的L*a*b*模型。在L*a*b*模型中，色谱被分成二维矩阵。通过两个变量“a”和“b”记录该矩阵中颜色的位置。变量L表示强度(例如，从浅蓝色到深蓝色)。有可能制定一个包含a值、b值和L值的标准来构成复合函数，如下所示：

Z＝w_L.L+w_a.a+w_b.b

其中w_L、w_a和w_b分别是L值、a值和b值的加权因子。这些加权因子的值可以通过“判别分析”的方式来计算，使得该组意味着显示与扩散有关的最大距离。通过将L*a*b*模型中的两种或更多种颜色组分以预定的方式组合(这取决于消毒剂的类型和样品)，可以进行精确的检测。实际上，对于每种消毒剂，测定应该在阳性和阴性结果之间切换的某个Z值是以实验方式预先确定的。如果需要，上述读取和计算机设备可以与加热设备(如WO 2007/090683中所述的恒温装置)组合在一起。

在本发明的第二方面中，提供了用于进行本发明第一方面的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)具有测定介质的容器，该测定介质包含微生物、胶凝剂和能够检测该微生物生长或抑制的指示剂以获得混合物，和(b)用于进行本发明第一方面的方法的手册，例如包含用于确定基本上不含乳糖和/或含有小于0.01％(w/w)乳糖的不含乳糖样品中抗生素浓度的说明书的手册。这样的试剂盒包含一个或多个包含如上所述的测定介质的容器。只要观察到指示剂变化是可能的，容器可以是具有任何形状和尺寸的测试管并来自可用的任何材料。而且，容器可以是多个孔，例如并入微量滴定板中的那些。

用于进行本发明第一方面的方法的手册应该至少含有用于样品处理的说明书，所述样品处理包括通过过滤或离心的方式任选除去固体以及如本发明第一方面中所述添加奶或奶粉。

在第一实施例中，所述试剂盒包含一个或多个含有奶粉的容器。

在第二实施例中，所述试剂盒包含采样装置，该采样装置是在其辅助下可以将液体添加到所述测定介质中的装置。优选地，这样的装置是容器，任选地具有体积标记。更优选地，这样的装置是注射器、移液管或自动移液系统。这样的注射器或移液管可以以这样的方式设计，使得在只有一种操作模式的情况下，可以从待分析的液体中抽出预定体积。任选地，可以应用本领域中已知的系统，利用该系统可以用一次简单处理来操作一个以上的注射器或移液管。本发明的第二方面的目的是提供如下试剂盒，该试剂盒允许根据本发明的第一方面简单地添加待添加的一定量的液体。

在第三实施例中，所述试剂盒包含用于在孵育期间密封包含测定介质的所述容器的装置。

在第四实施例中，所述试剂盒包含一个或多个容器，所述容器含有已知量的抗生素用于进行对照测试。所述抗生素可以是任何抗生素，并且优选是青霉素G K。

在第五实施例中，所述试剂盒包含一个或多个容器，所述容器含有已知量的β-内酰胺降解化合物用于进行对照测试。所述β-内酰胺降解化合物可以是任何β-内酰胺降解化合物，并且优选是β-内酰胺酶。

在本发明第二方面的第六实施例中，所述试剂盒包含恒温装置，借助于所述恒温装置可将样品保持在预设温度下，例如微生物显示充分生长的温度。优选地，所述恒温装置以这样的方式设计，使得可以容纳填充有测定介质的所述容器。任选地，将恒温装置连接到用于设定孵育所需时间的装置上，使得在预设时间段失效之后停止加热和/或冷却。

在第七实施例中，所述试剂盒包含装载有计算机程序的数据载体，所述计算机程序适于指示计算机分析从样品读取装置获得的数字数据。所述数据载体可以是适合于存储数字信息的任何载体，例如CD-ROM、软磁盘、DVD、记忆棒、磁带等。有利的是，装载有计算机程序的所述数据载体提供了容易访问适用于本发明方法的最新可用计算机程序。

在本发明的第三方面，提供了一种包含含有少于0.01％w/w乳糖的无乳糖样品、微生物、胶凝剂、指示剂以及奶和奶粉中的一种的组合物。这种组合物是将本发明第一方面的方法应用于不含乳糖的样品时的结果，所述样品是例如来自工厂的工业废物流(包括水性和固体废物流)的样品，来自废水和地表水(如河流、湖泊、溪流等)的样品，和来自兽医尿液或粪便的样品。

在本发明的第四方面，提供了溴甲酚紫或溴百里酚蓝或β-内酰胺降解化合物用于确定基本不含乳糖和/或含有小于0.01％(w/w)乳糖的不含乳糖样品中抗生素浓度的用途。

实例

实例1

用于确定废水中抗生素的手册

以下是可作为本发明试剂盒中的手册包括在其中的内容的非限制性实例。

环境：

确保执行抗生素测定的环境不含β-内酰胺。如果在房间本身中无法保证，可以使用超净工作台作为替代。

设备/配件：

-离心，2ml离心管(转速15.000rpm)

-水浴，其温度可以设定在37℃和65℃

-pH计

-具有用于存储样品的单独隔室的冷冻机；冷冻机内可以作为替代的封闭箱

-10μl-100μl和100μl-1000μl的Eppendorf移液管

-100μl盒1000μl的Eppendorf移液管点

-2.0ml的离心管

-具有螺帽的10ml的离心管

-具有螺帽的50ml的Greiner离心管

-Milli Q水系统

-Delvotest SP NT安瓿(或可比较的微生物抗生素测定)

-容量瓶(100ml和200ml，用Millipore水灭菌并冲洗4次)

化学品：

-1N氢氧化钠(不含β-内酰胺)

-1N盐酸(不含β-内酰胺)

-β-内酰胺酶BS(例如供应商AG科学产品编号L-2467)

-全脂奶(不含β-内酰胺)；作为替代，可以使用奶粉，1克奶粉在10ml MilliQ水中。奶可以存放在冷冻机(保质期3个月)。使用前将冷冻的奶慢慢解冻至室温。

对于所有奶来源，重要的是要证明奶在测定中不会产生阳性反应。

-青霉素G K

溶液制备：

-稀释水：在50ml的新Greiner离心管中添加40ml的Milli Q水

-β-内酰胺酶溶液：在2ml的离心管中称重50mg并添加2ml的Milli Q水。如果在测定过程中需要更少或更多，则调整量

-1N氢氧化钠：在50ml的新Greiner离心管中称重1克NaOH，并溶解于25ml的MilliQ水中并混合

-1N盐酸：将24克Milli Q水添加到50ml的新Greiner离心管中并添加0.9ml浓HCl并混合

-4ppb青霉素G K储备液：在100ml容量瓶中称取准确的44mg青霉素G K(90％纯度)并进行溶解并用Milli Q水填满并混合(溶液A)。将1.0ml溶液A添加到100ml容量瓶中并用Milli Q水填满并混合(溶液B)。在100ml容量瓶中添加1.0ml溶液B并用Milli Q水填满并混合(溶液C)。在50ml的Greiner离心管中称取5.0克溶液C并添加45.0克奶并混合(4ppb储备液)。将该溶液分配到若干个10ml的离心管中，将每个试管分别标记并在-18℃下冷冻(每管4ml，并且保质期为3个月)

-2ppb青霉素G K测试液：从冷冻机中取出储备青霉素G K管，并缓慢解冻至室温。将600μl青霉素G K储备液与600μl全脂奶混合，并进行混合。

采样过程：

在采样、储存和运输过程中，确保不引入β-内酰胺是至关重要的。为了尽量减少污染的机会，需要以下步骤：

1.戴上手套和干净的实验服以避免污染

2.用40ml样品填充两个50ml的Greiner离心管，并在添加后直接关闭螺帽

3.标记样品管并确保标签上的文字是可读的

4.将两个管直接放入从未使用的塑料袋中，并用束线带将其封闭

5.也可以在塑料袋上标注与样品管本身上所述的相同信息

6.如果未直接进行测定，则在-18℃将两个样品管储存在塑料袋中。在-18℃储存必须在采样后15分钟内完成

预处理：

如果冷冻样品，则在进行分析前一天将样品放在冰箱(3℃-10℃)中来对样品进行解冻。

1.在50ml的Greiner离心管中称取2克并添加25ml Milli Q水并混合至均匀悬浮液；确保两相都充分混合，特别是在干或经干燥的样品的情况下

2.在室温下摇动样品至少10分钟

3.用1N NaOH或1N HCl将pH调节至6.2-6.8

4.填充两个2ml离心管

5.以14.000rpm离心10min

明确的上限将用于进一步分析。

测定预处理：

对于三种不同的测定有三种不同的样品预处理；取决于可以进行以下这些测定中的任何或全部的要求：

1.正常测定

2.标准添加测定

3.酶降解测定

为了规划执行这些不同的预处理活动，考虑到酶预处理需要至少2小时的前置时间。

1.正常测定预处理：

在2.0ml的离心管中添加600μl清澈样品溶液并添加600μl奶，并且直接盖上盖子并混合；可以直接分析该混合物。

2.标准添加测定预处理：

在2ml离心管中添加600μl样品溶液并添加600μl 2ppb青霉素G K测试溶液，盖上盖子并混合；可以直接分析该混合物。

3.酶降解测定预处理：

在2.0ml的离心管中添加700μl清澈样品溶液并添加100μlβ-内酰胺酶溶液，并直接盖上盖子并混合。将离心管置于37℃的水浴中2小时，两小时后冷却并添加700μl奶并混合；可以直接分析该混合物。

抗生素确定执行：

观察Delvotest SP NT安瓿(或类似产品)中包含的一般说明。下表中给出了填充在样品表中的假想的实例。在第一行中，添加空白(奶)和2ppb青霉素G K测试溶液。该实例中应用了以下用于不同测定的代码：N为正常测定；S为标准添加测定；E为酶降解测定。

表：样品表的实例：

从所有样品溶液中用100μl的Eppendorf移液管取100μl装入Delvotest SP NT安瓿中。随着移液管的点，安瓿的管盖顶部将被穿透，并且将100μl添加到安瓿中。将安瓿在65℃的水浴中放置2.5h。用胶带密封安瓿。2.5h后，将安瓿从水浴中取出。检查空白是否为黄色，如果不是，则将水浴时间延长30min。

结果解释：

黄色为阴性，并且紫色为阳性。阳性意味着样品中存在高于2ppb(以青霉素G K计算)的抗微生物活性。

正常测定结果：

-紫色意指抗微生物活性>2ppb，并且黄色为<2ppb。

标准添加测定结果：

-如果样品在正常测定中是黄色的而在标准添加测定中是紫色的：抗微生物活性水平<2ppb

-如果样品在正常测定中是黄色的而在标准添加测定中是黄色的：有一个矩阵效果结果不可信。需要稀释样品。

-如果在正常测定中样品是紫色的，则不能使用标准添加测定。

酶降解测定：

-如果样品在正常测定中是紫色的而在酶降解测定中是紫色的。这些结果不能相信。样品需要用更高量的酶重新分析。

-如果样品在正常测定中是紫色的而在酶降解测定中是黄色的：抗微生物活性水平>2ppb。

-如果样品在正常测定中是黄色的，则酶降解测定不会给出任何进一步有用的信息。

计算抗微生物活性：

结果可以计算如下(该方法的限制是2ppb，2ppb是2μg.l^-1)：

-样品：2g.25ml^-1，其为80g.l^-1

-用奶稀释2倍＝>40g.l^-1

-如果紫色的样品意指40克中存在>2μg的抗微生物活性。

-2μg.40g^-1＝>50μg.kg^-1＝>>50ppb抗微生物活性。

-如果是黄色，<50ppb的抗微生物活性。

实例2

确定添加和不添加奶的样品中的抗生素

使用可商购的(帝斯曼食品配料有限公司(DSM Food Specialties B.V.)，代尔夫特，荷兰)Delvotest SP NT(类似于供应商手册)分析两个样品，即空白(水)和2ppb青霉素GK测试溶液。将两个安瓿中填充空白样品。根据实例1中所述的说明，向一个(在本实例中使用来自荷兰超市的普通低脂奶)中添加奶，并且向另一个中添加相同量的水。另外，向两个安瓿中填充2ppb青霉素G K测试溶液，并再次根据实例1中所述的说明，向一个中添加奶，并且向另一个中添加相同量的水。将填充有样品的安瓿在64℃+/-2℃下孵育，并在若干个时间点视觉记录安瓿中琼脂的颜色。上述实验以一式五份进行，并将平均观察结果总结在下表中。

从表中可以看出，没有抗生素存在的空白样品将导致琼脂层中微生物的生长，其进而导致pH的变化和指示剂的颜色从紫色变为黄色(表中的符号--+、-++和+++分别表示颜色从紫色到黄色的部分至完全变化)。而青霉素G K测试溶液的样品由于青霉素G K对空白样品中微生物的生长的抑制作用而没有显示任何颜色变化，在奶存在下120min后就可以观察到颜色开始变化，而在没有添加奶的情况下只能在180min后看到这种观察结果。此外，在奶存在下，完全颜色变化也会更迅速地发生。

实例3

确定添加和不添加奶的样品中的抗生素

用各种其他样品(例如过程中废物流和发酵菌丝体滤饼的提取物)重复实例2，并且在样品中不存在抗生素的情况下，证实了实例2中观察到的效果(与不存在奶的相比，奶存在下的Delvotest SP NT测试安瓿的琼脂层中的指示剂的颜色变化较快)。

Claims (19)

1.一种用于确定基本不含乳糖和/或含有少于0.01％(w/w)的乳糖的不含乳糖的样品中抗生素存在或不存在的方法，该方法包括以下步骤：

(a)使所述不含乳糖的样品与测定介质接触，该测定介质包含微生物、胶凝剂和能够检测该微生物的生长或抑制的指示剂，以获得不含乳糖的样品和测定介质的组装体；

(b)在没有抗生素存在于所述不含乳糖的样品中的情况下，将步骤(a)中获得的组装体孵育足够的时间以使该微生物生长；和

(c)用该指示剂检测该微生物的生长或生长的抑制，

该方法特征在于在步骤(a)中添加奶和/或奶粉。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述测定介质还包含营养素。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述指示剂是溴甲酚紫或溴百里酚蓝。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述微生物是嗜热的。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述微生物是嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述胶凝剂为琼脂。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前从所述不含乳糖的样品中去除固体。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述不含乳糖的样品加所述添加的奶或奶粉中的乳糖的量为从2％至5％(w/w)。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，该方法还包括选自以下的对照测试：

(i)在步骤(a)中添加已知量的抗生素，或者

(ii)在步骤(a)中添加已知量的β-内酰胺降解化合物，或者

(iii)(i)和(ii)的组合。

10.一种用于确定基本不含乳糖和/或含有少于0.01％(w/w)的乳糖的不含乳糖的样品中抗生素浓度的方法，该方法包括以下步骤：

(a)通过添加奶制备稀释范围的所述不含乳糖的样品；

(b)使步骤(a)中获得的每种稀释液与包含微生物、营养素和能够检测微生物生长或抑制的指示剂的测定介质接触以获得混合物；

(c)在样品中不存在抗生素的情况下，将步骤(b)中获得的每种混合物孵育足够的时间以使微生物生长；

(d)用该指示剂检测该微生物的生长或生长的抑制；

(e)用能够抑制该微生物生长的最高稀释因子确定稀释液；

(f)确定在步骤(e)中确定的稀释液中抗生素的浓度，和

(g)通过将在步骤(f)中确定的浓度乘以用于制备该稀释液的在步骤(e)中确定的稀释因子来确定所述不含乳糖的样品中抗生素的浓度。

11.一种试剂盒，该试剂盒包含：

(a)具有测定介质的容器，该测定介质包含微生物、胶凝剂和能够检测该微生物生长或抑制的指示剂以获得混合物；

(b)包含用于确定基本上不含乳糖和/或含有小于0.01％(w/w)乳糖的不含乳糖样品中抗生素浓度的说明书的手册。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中在步骤(b)中，该手册包含用于执行如权利要求1至10中任一项所述的方法的说明书。

13.根据权利要求11至12中任一项所述的试剂盒，该试剂盒还包含含有奶粉的容器。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的试剂盒，该试剂盒还包括采样装置。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的试剂盒，该试剂盒还包含具有已知量的抗生素的容器和/或具有已知量的β-内酰胺降解化合物的容器。

16.根据权利要求11至15中任一项所述的试剂盒，该试剂盒还包含恒温装置。

17.一种组合物，其包含含有少于0.01％w/w乳糖的无乳糖样品、微生物、胶凝剂、指示剂以及奶和奶粉中的一种。

18.溴甲酚紫或溴百里酚蓝用于确定基本不含乳糖和/或含有小于0.01％(w/w)乳糖的不含乳糖的样品中抗生素浓度的用途。

19.β-内酰胺降解化合物用于确定基本不含乳糖和/或含有小于0.01％(w/w)乳糖的不含乳糖样品中抗生素浓度的用途。