JP6430481B2 - 合成および内因性の細菌システムにおけるタンパク質分解の調整可能な制御 - Google Patents

合成および内因性の細菌システムにおけるタンパク質分解の調整可能な制御 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、2013年3月13日に出願された米国仮出願第61/779,547号の35U.S.C.§119（e）による恩典を主張する。その内容は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
配列表
本願は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含有している。2014年3月13日に作成されたそのASCIIコピーの名前は、701586-075801-PCT_SL.txtであり、サイズは40,144バイトである。
政府の支援
本発明は、National Institutes of Healthによって授与された契約番号OD003644、およびOffice of Naval Researchによって授与された契約番号N00014-11-1-0725の下で、政府の支援を受けて作成された。政府は本発明における一定の権利を有している。
背景
細菌における内因性の標的タンパク質分解は、急速な分解のためにタンパク質を内因性のClpXPプロテアーゼおよびClpAPプロテアーゼへ差し向けるため、小さいペプチドssrAを使用するtmRNAシステムを通して、一部分、起こる6,7。生物学者は、細菌において8、そして最近では真核生物において9、付着したタンパク質の分解速度を修飾するために、大腸菌（E.coli）ssrAタグ（ec-ssrA）のバリアントを使用しているが、優勢なClpXPプロテアーゼは、構成的に発現されており、多くの細胞過程における不可欠の役割のため、簡単には調節され得ないため、これらのタグは、細菌における分解の調整可能な制御を提供しない10。Davisら11は、このシステムにおける誘導可能な分解を可能にするため、修飾型ec-ssrAタグおよびスプリットSspBアダプターを使用したが、その技術は、tmRNAシステムのゲノム破壊を必要とし、ec-ssrAによって媒介される分解を使用する既存の遺伝子構築物と適合性がない。低分子によって誘導される分解を可能にする最近の真核生物分解システムは、細菌に存在しない内因性分解機構に頼る12-14。
概要
細菌におけるタンパク質分解の調整可能な制御は、合成遺伝子回路を開発し、天然の細胞システムを調査するために利用可能な遺伝子ツールセットを拡張する一つの手段である。本明細書に記載された方法および組成物は、メソプラズマ・フローラム（Mesoplasma florum）tmRNAシステムの構成要素を使用することによって、標的遺伝子のタンパク質レベルの調整可能な制御を提供する、大腸菌およびラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）における合成分解システムの生成に一部関する。付着したタンパク質の初期レベルおよび誘導可能な分解速度の両方の独立した制御を可能にする分解タグバリアントが、本明細書に提供される。そのような分解タグバリアントは、合成回路開発、ならびに、例えば、ペプチドグリカン生合成、細胞分裂、および走化性運動を含むコア細菌過程の外因性の制御において使用され得る。さらに、本明細書に記載された合成分解システムは、簡便であり、モジュール式であり、小さいペプチドタグおよび単一のプロテアーゼ遺伝子のみを必要とし、機能するために宿主システムの破壊を必要とせず、最小の修飾によって他の細菌種において使用され得る。合成分解システムは、グラム陰性菌（例えば、大腸菌）およびグラム陽性菌（例えば、L.ラクティス）の両方において使用され得る。例えば、大腸菌のゲノムに組み込まれ得る、そのようなプロテアーゼのコドン最適化バージョンも、本明細書に提供される。そのような組み込まれたプロテアーゼは、タンパク質標的のはるかに強力で急速な誘導可能な分解を提供し、産業的または商業的な環境において使用するために本明細書において企図される。ゲノムに組み込まれたプロテアーゼは、プラスミドを維持するための抗生物質またはその他の選択機序を必要としないという付加的な利点を有し、従って、産業的または商業的な使用のために理想的である。
本明細書に提供される一つの局面は、未修飾のメソプラズマ・フローラム分解タグと比較して変更された分解動態を含む、メソプラズマ・フローラム分解タグに由来する修飾型タンパク質分解タグを含む組成物に関する。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面の一つの態様において、メソプラズマ・フローラム分解タグはmf-ssrA（SEQ ID NO:27）である。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、修飾型タンパク質分解タグは、マイコプラズマ科のメンバー（例えば、マイコプラスマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（genitalium）、マイコプラズマ・プルモニス（pulmonis）、マイコプラズマ・シノビエ（synoviae）、マイコプラズマ・ペネトランス（penetrans）、マイコプラズマ・ファーメンタンス（fermentans）等）に由来するmf-Lonプロテアーゼまたはその相同体によって分解される。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、修飾型タンパク質分解タグは、未修飾の分解タグより増加した、mf-Lonまたはその相同体による分解に対する特異性を有する。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、修飾型タンパク質分解タグは、未修飾の分解タグより減少した、内因性細菌プロテアーゼによる分解に対する感受性を有する。ある種の態様において、内因性細菌プロテアーゼは、グラム陽性菌またはグラム陰性菌に由来する。一つの態様において、内因性細菌プロテアーゼは大腸菌プロテアーゼである。もう一つの態様において、内因性細菌プロテアーゼはL.ラクティスプロテアーゼである。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面の一つの態様において、修飾型タンパク質分解タグは、未修飾の分解タグより増加した、内因性細菌プロテアーゼによる分解に対する感受性を有する。ある種の態様において、内因性細菌プロテアーゼは、グラム陽性菌またはグラム陰性菌に由来する。一つの態様において、内因性細菌プロテアーゼは、大腸菌プロテアーゼまたはL.ラクティスプロテアーゼである。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、修飾型タンパク質分解タグは、未修飾の分解タグより減少した、mf-Lonプロテアーゼによる分解に対する特異性を有する。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面の一つの態様において、修飾型タンパク質分解タグは、未修飾の分解タグより増加した、mf-Lonプロテアーゼまたはその相同体による分解に対する特異性を有する。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、修飾型タンパク質分解タグは、ClpXPまたは細菌Lonプロテアーゼ（例えば、大腸菌もしくはL.ラクティスのLonプロテアーゼ）によって分解されない。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、修飾型タンパク質分解タグは、未修飾の分解タグと比較して、アミノ酸残基24〜27に変異を含む。あるいは、修飾型タンパク質分解タグは、アミノ酸残基1〜13のうちの1個以上に変異を含む。もう一つの態様において、修飾型タンパク質分解タグは、タンパク質分解タグのアミノ酸13〜15（例えば、mf-ssrA（SEQ ID NO:27）のアミノ酸13〜15）のうちの1個以上に変異を含む。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、変異は、未修飾の分解タグに存在しない1個以上のアルギニン残基および／またはグルタミン残基を含む。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、修飾型タンパク質分解タグは、表7、表8の配列、またはSEQ ID NO:1〜26より選択される。
本明細書に提供されるもう一つの局面は、（a）メソプラズマ・フローラム分解タグに由来し、かつ未修飾のメソプラズマ・フローラム分解タグと比較して変更された分解動態を含む、標的タンパク質と融合された修飾型タンパク質分解タグ、および（b）システムが発現される細菌細胞によって構成的に発現されない、修飾型タンパク質分解タグを分解することができるプロテアーゼを含み、（a）の修飾型分解タグ融合タンパク質および（b）のプロテアーゼの導入が、細菌細胞における標的タンパク質の調整可能な発現を可能にする、細胞における標的タンパク質の調整可能な発現のためのシステムに関する。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面の一つの態様において、プロテアーゼは、mf-Lonまたはそのバリアントもしくは相同体を含む。
本明細書に提供されるもう一つの局面は、（a）標的タンパク質と融合されたタンパク質分解タグ、および（b）タグ化タンパク質を分解することができる外因性のメソプラズマLonプロテアーゼを含む、細菌細胞における標的タンパク質の調整可能な発現のためのシステムに関する。タンパク質分解タグは、少なくとも10アミノ酸長であり、調整可能な分解速度を提供するため、各々、1個以上のアミノ酸置換を任意で有していてもよいアミノ酸配列PTFおよび／またはアミノ酸配列YAFAを含む。例えば、配列PTFは、SEQ ID NO:1に従って番号付けられたアミノ酸10〜20内に位置してよく、いくつかの態様において、タグのアミノ酸12〜18内に位置する。配列PTFは、分解タグのおよそアミノ酸13〜15に位置してもよい。あるいは、配列は、分解速度を変更する1個、2個、または3個のアミノ酸置換を含有していてもよい。配列PTFを置換し、低下した分解速度を提供する例示的な配列は、RAI、APN、PDS、QPT、AQP、PSP、ERA、PDG、FKL、およびWLGである。これらの配列も、各々、同様に、付加的な分解速度を提供する1個または2個のアミノ酸置換を有し得る。これらまたはその他の態様において、配列YAFAは、分解タグのアミノ酸18〜30内に位置し（分解タグは、いくつかの態様において、50アミノ酸未満または30アミノ酸未満であり得る）、いくつかの態様において、配列YAFAは、（SEQ ID NO:1に従って番号付けられた）アミノ酸24〜27のようなアミノ酸22〜28内に位置する。配列YAFAは、タグ化タンパク質の分解速度を変更するために1個以上のアミノ酸置換を含んでいてもよく、いくつかの態様において、1個以上の置換は、より高い分解速度をもたらす。YAFAと置換される例示的な配列は、SEQ ID NO:2〜17として本明細書に記載され、そのような配列は、分解速度を増加させるためにさらに修飾され得る。YAFAを置換する配列のいくつかの非限定的な例には、RLQL、YLSQ、RRRV、HAQP、RARQ、およびICRLが含まれる。いくつかの態様において、配列YAFAに対する修飾は、1個以上の酸性または塩基性の残基を含む。タグの残りの部分（例えば、SEQ ID NO:1に従って番号付けられたアミノ酸1〜12および16〜23）は、分解速度を調整するためにそれほど重要ではないが、いくつかの態様において、所望の分解速度を可能にする1個以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入と共に、SEQ ID NO:1に示される配列を有する。細菌細胞（例えば、グラム陰性菌（大腸菌）またはグラム陽性菌（L.ラクティス））において共発現されるメソプラズマLonプロテアーゼは、SEQ ID NO:28との少なくとも70％の同一性、またはその他の態様において、SEQ ID NO:28との少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも98％の同一性を有し得る。
Figure 0006430481
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面の一つの態様において、細菌細胞へ導入された場合に、修飾型pdtによってタグ化された標的タンパク質の初期発現レベルは、修飾型分解タグと融合されていない場合の標的タンパク質の初期発現レベルと比較して増加する。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、システムは、（b）のプロテアーゼと融合された第2の分解タグをさらに含む。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、第2の分解タグは、細胞によって構成的に発現されるプロテアーゼによって分解される。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、第2の分解タグは、野生型分解タグと比較して変更された分解特性を有するよう修飾される。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、システムは遺伝子トグルスイッチをさらに含む。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、遺伝子トグルスイッチは相互転写抑制に基づく。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、標的タンパク質は、細胞壁生合成、細胞分裂、代謝（例えば、五炭糖もしくは六炭糖の代謝、クレブス回路、もしくは好気性呼吸）、および／または走化性運動に関与する。
本明細書に記載されたもう一つの局面は、（a）メソプラズマ・フローラム分解タグに由来し、かつ未修飾のメソプラズマ・フローラム分解タグと比較して変更された分解動態を含む、標的タンパク質と融合された修飾型タンパク質分解タグ、および（b）細菌細胞によって構成的に発現されない、修飾型タンパク質分解タグを分解することができるプロテアーゼを発現する細菌細胞を含む細菌スクリーニングアッセイ法に関する。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面の一つの態様において、標的タンパク質の初期発現レベルは、単独の標的タンパク質、または未修飾のタンパク質分解タグと融合された場合の標的タンパク質の初期発現レベルと比較して増加する。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、細菌細胞は、グラム陽性菌細胞またはグラム陰性菌細胞である。本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面の一つの態様において、グラム陽性菌細胞はL.ラクティス細胞である。本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、グラム陰性菌細胞は大腸菌細胞である。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、アッセイは、（b）のプロテアーゼと融合された第2の分解タグをさらに含む。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、第2の分解タグは、細胞によって構成的に発現されるプロテアーゼによって分解される。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、第2の分解タグは、野生型分解タグと比較して変更された分解特性を有するよう修飾される。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、アッセイは遺伝子トグルスイッチをさらに含む。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、遺伝子トグルスイッチは相互転写抑制に基づく。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、標的タンパク質は、細胞壁生合成、細胞分裂、代謝（例えば、五炭糖もしくは六炭糖の代謝、クレブス回路、もしくは好気性呼吸）、および／または走化性運動に関与する。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、標的タンパク質は候補薬物標的である。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、標的タンパク質は候補抗生物質標的である。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、アッセイはアウトプット産物をさらに含む。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、アウトプット産物は、レポーター分子、酵素、または選択マーカーを含む。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、レポーター分子は、蛍光、色、または発光の測定可能なシグナルを含む。
もう一つの局面において、（a）（i）未修飾の分解タグと比較して変更されたプロテアーゼによる分解動態を含む、標的タンパク質と融合された第1の修飾型タンパク質分解タグ、（ii）細菌細胞によって構成的に発現されない、（a）の修飾型タンパク質分解タグを分解することができるプロテアーゼを、細菌細胞において発現させる工程、（b）アウトプット産物を測定する工程を含む、細菌細胞における候補抗生物質標的の同定に関する方法も、本明細書に提供される。本法において、陽性アウトプット産物の減少が、標的タンパク質が候補抗生物質標的であることを示すか、または陰性アウトプット産物の増加が、標的タンパク質が候補抗生物質標的であることを示す。
本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のある種の態様において、細菌細胞はグラム陽性菌細胞またはグラム陰性菌細胞である。本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面の一つの態様において、グラム陽性菌細胞はL.ラクティス細胞である。本明細書に記載されたこの局面および全ての他の局面のもう一つの態様において、グラム陰性菌細胞は大腸菌細胞である。
もう一つの局面において、（a）メソプラズマ・フローラム分解タグに由来し、かつ未修飾のメソプラズマ・フローラム分解タグと比較して変更された分解動態を含む修飾型タンパク質分解タグおよびマルチクローニング部位をコードするベクターを含み、（b）修飾型タンパク質分解タグを分解することができるプロテアーゼをコードするベクターを任意で含み、かつ（c）（b）のプロテアーゼを発現しない細胞における使用についての説明を含むキットも、本明細書に提供される。
本明細書に提供されるもう一つの局面は、本明細書に記載されるプロテアーゼを使用して、複数の細胞経路の協調的な制御を可能にすることができる、複数の内因性タンパク質を同時にタグ化するため、pdtまたは修飾型pdtを使用する方法に関する。
[本発明1001]
未修飾のメソプラズマ・フローラム（Mesoplasma florum）分解タグと比較して変更された分解動態を含む、メソプラズマ・フローラム分解タグ由来の修飾型タンパク質分解タグを含む組成物。
[本発明1002]
メソプラズマ・フローラム分解タグがmf-ssrAである、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
修飾型タンパク質分解タグがmf-Lonプロテアーゼによって分解される、本発明1001の組成物。
[本発明1004]
修飾型タンパク質分解タグが、未修飾の分解タグより増加したmf-Lonによる分解に対する特異性を有する、本発明1003の組成物。
[本発明1005]
修飾型タンパク質分解タグが、ClpXP、大腸菌（E.coli）Lonプロテアーゼ、またはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）プロテアーゼによって分解されない、本発明1001の組成物。
[本発明1006]
修飾型タンパク質分解タグが、未修飾の分解タグと比較して、アミノ酸残基24〜27に変異を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1007]
変異が、未修飾の分解タグに存在しない1個以上のアルギニン残基および／またはグルタミン残基を含む、本発明1005の組成物。
[本発明1008]
修飾型タンパク質分解タグが表7または表8に記載の配列から選択される、本発明1006の組成物。
[本発明1009]
（a）メソプラズマ・フローラム分解タグに由来し、かつ未修飾のメソプラズマ・フローラム分解タグと比較して変更された分解動態を含む、標的タンパク質と融合された修飾型タンパク質分解タグ、および
（b）システムが発現される細菌細胞によって構成的に発現されない、修飾型タンパク質分解タグを分解することができるプロテアーゼ
を含む、細胞における標的タンパク質の調整可能な発現のためのシステムであって、
（a）の修飾型分解タグ融合タンパク質および（b）のプロテアーゼの導入が、細菌細胞における標的タンパク質の調整可能な発現を可能にする、システム。
[本発明1010]
細菌細胞へ導入された場合に、標的タンパク質の初期発現レベルが、修飾型分解タグと融合されていない場合の標的タンパク質の初期発現レベルと比較して増加する、本発明1009のシステム。
[本発明1011]
（b）のプロテアーゼと融合された第2の分解タグをさらに含む、本発明1009のシステム。
[本発明1012]
第2の分解タグが、細胞によって構成的に発現されるプロテアーゼによって分解される、本発明1011のシステム。
[本発明1013]
第2の分解タグが、野生型分解タグと比較して変更された分解特性を有するよう修飾される、本発明1011のシステム。
[本発明1014]
遺伝子トグルスイッチをさらに含む、本発明1009のシステム。
[本発明1015]
遺伝子トグルスイッチが相互転写抑制に基づく、本発明1013のシステム。
[本発明1016]
標的タンパク質が、細胞壁生合成、細胞分裂、および／または走化性運動に関与している、本発明1008のシステム。
[本発明1017]
（a）メソプラズマ・フローラム分解タグに由来し、かつ未修飾のメソプラズマ・フローラム分解タグと比較して変更された分解動態を含む、標的タンパク質と融合された修飾型タンパク質分解タグ、および
（b）細菌細胞によって構成的に発現されない、修飾型タンパク質分解タグを分解することができるプロテアーゼ
を発現する細菌細胞を含む、細菌スクリーニングアッセイ法。
[本発明1018]
標的タンパク質の初期発現レベルが、単独の標的タンパク質または未修飾のタンパク質分解タグと融合された場合の標的タンパク質の初期発現レベルより高い、本発明1017のアッセイ法。
[本発明1019]
（b）のプロテアーゼと融合された第2の分解タグをさらに含む、本発明1017のアッセイ法。
[本発明1020]
第2の分解タグが、細胞によって構成的に発現されるプロテアーゼによって分解される、本発明1019のアッセイ法。
[本発明1021]
第2の分解タグが、野生型の分解タグと比較して変更された分解特性を有するよう修飾される、本発明1019のアッセイ法。
[本発明1022]
遺伝子トグルスイッチをさらに含む、本発明1017のアッセイ法。
[本発明1023]
遺伝子トグルスイッチが相互転写抑制に基づく、本発明1017のアッセイ法。
[本発明1024]
標的タンパク質が、細胞壁生合成、細胞分裂、および／または走化性運動に関与している、本発明1017のアッセイ法。
[本発明1025]
標的タンパク質が候補薬物標的である、本発明1017のアッセイ法。
[本発明1026]
標的タンパク質が候補抗生物質標的である、本発明1025のアッセイ法。
[本発明1027]
アウトプット産物をさらに含む、本発明1017のアッセイ法。
[本発明1028]
アウトプット産物が、レポーター分子、酵素、または選択マーカーを含む、本発明1027のアッセイ法。
[本発明1029]
レポーター分子が、蛍光、色、または発光の測定可能なシグナルを含む、本発明1028のアッセイ法。
[本発明1030]
（a）細菌細胞において、
（i）未修飾の分解タグと比較して変更されたプロテアーゼによる分解動態を含む、標的タンパク質と融合された第1の修飾型タンパク質分解タグ、
（ii）細菌細胞によって構成的に発現されない、（a）の修飾型タンパク質分解タグを分解することができるプロテアーゼ
を発現させる工程、
（b）アウトプット産物を測定する工程
を含む、細菌細胞において候補抗生物質標的を同定する方法であって、
陽性アウトプット産物の減少が、標的タンパク質が候補抗生物質標的であることを示すか、または陰性アウトプット産物の増加が、標的タンパク質が候補抗生物質標的であることを示す、方法。
[本発明1031]
（a）細菌細胞において、
（i）未修飾の分解タグと比較して変更された同族プロテアーゼによる分解動態を含む、標的タンパク質と融合された第1の修飾型タンパク質分解タグ、
（ii）細菌細胞によって構成的に発現されない、（a）の修飾型タンパク質分解タグを分解することができる同族プロテアーゼ
を発現させる工程、
（b）工程（a）の細胞を候補物質と接触させる工程、および
（c）工程（a）の標的タンパク質の量を反映するアウトプット産物を測定する工程
を含む、方法であって、
アウトプット産物の減少が、候補物質が細胞におけるタンパク質分解の速度またはレベルを増加させることを示す、方法。
[本発明1032]
（a）メソプラズマ・フローラム分解タグに由来し、かつ未修飾のメソプラズマ・フローラム分解タグと比較して変更された分解動態を含む修飾型タンパク質分解タグとマルチクローニング部位とをコードするベクター、および
（b）任意で、修飾型タンパク質分解タグを分解することができるプロテアーゼをコードするベクター、および
（c）（b）のプロテアーゼを発現しない細胞における使用についての説明
を含む、キット。
[本発明1033]
細菌細胞が、グラム陽性菌細胞またはグラム陰性菌細胞である、本発明1009、1017、1030、または1031の方法。
[本発明1034]
グラム陽性菌細胞がラクトコッカス・ラクティス細胞である、本発明1033の方法。
[本発明1035]
グラム陽性菌細胞が大腸菌細胞である、本発明1033の方法。
図1A〜1Cは、タンパク質分解タグ特徴決定を示す図である。（図1A）アンヒドロテトラサイクリン（aTc）によるmf-lonの誘導によって、プロテアーゼが、構成的に発現されたGFPをpdt依存的に分解することが可能になる、調整可能なタンパク質分解システムの概略図。mf-Lon（文字）または内因性大腸菌プロテアーゼ（数字）による変更された認識を有するpdt同定タグ（pdt-identified tags）の2つの領域の標的変異誘発。（図1B）構成的なPlacIqプロモーターから発現されたGFP-pdtは、対数期から静止期への増殖の移行の際に、増加した分解を示した。GFP蛍光および光学濃度（600nm）を、フローサイトメトリーおよびマイクロプレートリーダによって測定した。（図1C）内因性大腸菌プロテアーゼによる変更された分解を示すpdt数字バリアントのパネル。中央対数増殖中の細胞のaTc誘導の10時間後に蛍光を測定した。蛍光単位は、非タグ化GFPを100に設定した自由単位であり、エラーバーは、3生物学的反復の平均値±標準偏差（SD）を表す。 図2A〜2Dは、pdtバリアントおよびmf-Lonの分解動態を示す図である。（図2A〜2B）50ng/ml aTcによるmf-Lon誘導後のGFP分解のフローサイトメトリー測定。データは各pdtバリアントについての非誘導対照に対する百分率としての≧10,000個の細胞の幾何平均蛍光を示し、エラーバーは、3生物学的反復の平均値±標準偏差（SD）を表す。（図2A）PDT数字バリアントは、ほぼ同一のmf-Lonによって媒介される分解動態を維持する。（図2B）PDT文字バリアントは、変更されたmf-Lonによって媒介される分解速度を示す。（図2C）ハイブリッドpdtバリアントのパネル。示されたGFP-pdt融合物を発現する株を、aTc誘導の10時間後にプレート蛍光測定によって測定した。対数スケールの蛍光単位は、非タグ化GFPを100に設定した自由単位である。（図2D）mf-Lonの転写制御および翻訳後制御を使用したGFP-pdt#5分解の制御。大腸菌ssrAタグバリアント（ec-LAA、ec-AAV、ec-ASV）のmf-Lonとの融合は、ある範囲の転写誘導レベルにおいてmf-Lon活性の制御を提供する。mf-Lonプロテアーゼ活性の不活化（S692A）は、GFP分解を阻止する。データは、GFP-pdt#5を分解標的として使用して、aTc誘導の10時間後に収集された。 図3A〜3Cは、合成トグルスイッチのプロテアーゼによって駆動される制御を示す図である。（図3A）TetRおよびLacIによる相互転写抑制が双安定回路を形成する合成トグルスイッチの概略図。GFPおよびmCherryは、それぞれLacI+トグル状態およびTetR+トグル状態についての蛍光レポーターとして機能する。LacIへのpdtタグの付加は、mCherry+状態へのプロテアーゼによって駆動されるスイッチを可能にする。（図3B）フローサイトメトリー散乱光プロットは、誘導可能プロモーターPBADからのmf-Lon発現の0時間後、4時間後、および8時間後のGFPおよびmCherryの蛍光を示す。LacI-pdt#5の分解は、8時間目までに、GFP+状態からmCherry+状態へトグルの切り替えを引き起こすが、非タグ化トグルはGFP+状態のままである。マゼンタ線は、GFP+状態およびmCherry+状態を定義するために使用されたゲートパラメーターを示し：左下四半分に含まれる細胞は、GFPおよびmCherryの両方について陰性であると見なされる。（図3C）mf-Lon誘導後のmCherry+状態にある細胞の百分率。フローサイトメトリーによって収集されたデータは、（b）に示されるパラメーターを使用して測定され、エラーバーは、3生物学的反復の平均値±標準偏差（SD）を表す。非誘導株がmCherry+へシフトしなかったことを示すデータについては、図7を参照すること。 図4A〜4Dは、内因性細菌システムの調整可能な制御を証明する。（図4A）DatsenkoおよびWanner23から改作された、pdtバリアントのゲノム挿入のためのリコンビニアリング（recombineering）法の概略図。所望のpdtバリアントを含有している形質転換されたPCR産物のRedリコンビナーゼによって支援された挿入の後、周囲のFRT部位を使用して、付随的なカナマイシンカセットのFlpリコンビナーゼによって媒介される切除を行う。得られた挿入は、pdtバリアントおよび残存するFRT部位を含む83bpの痕跡を含有している。（図4B）MurAのプロテアーゼによって駆動される枯渇の後の株の増殖。初期対数期増殖中のプロテアーゼ誘導（矢印）は、光学濃度（600nm）によって測定されるように、およそ3時間後にmurA-pdt#1を含有している細胞の溶解を引き起こした。弱められたバリアントpdt#1Aおよびpdt#1Bを含有している細胞は、遅延した応答を示す。エラーバーは、6生物学的反復の平均値±標準偏差（SD）を表す。非誘導細胞の野生型の増殖を示すデータについては、図9Aを参照すること。（図4C）FtsZの枯渇の後の細菌のDIC顕微鏡像。ftsZ-pdt#10を含む細菌はフィラメントを形成し、非タグ化野生型細菌は正常な長さを維持する。構成的なGFP発現を示す蛍光顕微鏡写真オーバーレイは、視覚的補助として機能する。（図4D）誘導可能なCheZ分解を示す走化性運動プレート上のディスク拡散アッセイ。中心ディスクへ250ng aTcを添加した後、細胞を走化性プレートへ穿刺し、30°で18時間後に画像化した。 内因性大腸菌プロテアーゼによるGFP-pdt分解を示す図である。示されたプロテアーゼ遺伝子にインフレーム欠失を含有している大腸菌株におけるGFPおよびGFP-pdtのレベルのヒストグラム。GFPおよびGFP-pdtを、PlacIqプロモーターから構成的に発現させ、蛍光をフローサイトメトリーによって測定した。エラーバーは、3生物学的反復の平均値±標準偏差（SD）を表す。 集団レベルの分解動態を示す図である。GFP-pdt#5を構成的に発現する細胞を、mf-Lonを発現するよう誘導し（50ng/ml aTc）、誘導後の示された時点で、10,000個の細胞のGFP蛍光をフローサイトメトリーによって測定した。ヒストグラムプロットは、経時的な細胞集団におけるモノモードのシフトを示す。GFP発現プラスミドを含有していない細胞の対照プロット（GFPなし）は、mf-Lon発現がGFP蛍光をほぼ基線レベルにまで低下させることを示す。aTcによって誘導されなかった細胞の8時間目の対照プロット（aTcなし）は、蛍光シフトがaTc誘導に依存性であることを証明している。 プロテアーゼによって誘導可能なトグルスイッチが双安定であることを示す図である。示されたlacI-pdt融合物を含むトグルスイッチを含有している細胞を、aTcまたはIPTGによって、それぞれGFP+状態またはmCherry+状態へ切り替えた。次いで、細胞を非誘導培地へ移動させ、図3Bに示されるパラメーターを使用して、トグルスイッチ状態について経時的にモニタリングした。全ての株が、初期の状態に安定したままであり、不規則に状態を切り替えることはなかった。エラーバーは、3生物学的反復の平均値±標準偏差（SD）を表す。 示されたtetR-pdt融合物を含むトグルスイッチを含有している細胞が、IPTGによってmCherry+状態へ切り替えられ、非誘導培地においては安定化されることを示す図である。0時間目に、mf-Lonの発現を1mMアラビノースによって誘導し、細胞を、図3Bに示されるパラメーターに従って、GFPおよびmCherryの発現についてフローサイトメトリーによってモニタリングした。tetR-pdt#10融合物を含有している細胞の大多数が、mf-Lon誘導の6時間以内にGFP+状態へ切り替わったが、未修飾のトグルスイッチを含有している細胞（タグなし）は切り替わらなかった。tetR-pdt#10融合物を含有しているが誘導されない細胞（アラビノースなし）またはmf-Lon発現プラスミドを含有していない細胞も、切り替わらず、このことから、mf-Lonによって媒介されるTetR-pdt#10の分解の特異性が証明された。エラーバーは、3生物学的反復の平均値±標準偏差（SD）を表す。 図9A〜9Cは、内因性タンパク質分解制御を示す図である。（図9A）mf-Lon誘導の非存在下でのmurA-pdt株の増殖。示されたpdtバリアントを含有している株は、光学濃度（600nm）によって測定されるような、野生型株とほぼ同一の増殖速度を示す。データは、図4Bに示された実験データと同時に収集された。（図9B）mf-Lon誘導の非存在下でのftsZ-pdt#10株の増殖速度は、野生型細胞とほぼ同一であった。（図9C）対照走化性プレート上のディスク拡散アッセイは、aTcが中心ディスクへ添加されない場合、cheZ-pdt#10株が正常な走化性挙動を示すことを示す。これは、図4CにおけるcheZ-pdt#10株の走化性欠損が、特異的にmf-LonのaTc誘導によるものであったことのさらなる証拠を提供する。中心ディスクへ5μlの水を添加した後、走化性プレートへ細胞を穿刺し、30℃で18時間後に画像化した。 mf-Lonの不活化変異を示す。murA-pdt#1ゲノム挿入を有する細胞のサブセットは、溶解せず、mf-Lon誘導後に継続的な増殖を示したため、6回の独立の実験から個々の生存細胞を単離し、mf-Lon発現プラスミドを、新しい大腸菌株においてGFP-pdt#5を誘導可能に分解する能力についてアッセイした。6つのケース（exp1〜exp6）全てにおいて、mf-Lon発現プラスミドは、タンパク質分解活性をほぼ全て失い、非誘導レベルのおよそ1％にGFPを低下させた親mf-Lonプラスミド（wt）とは対照的に、 GFP-pdt#5定常状態レベルが高いままであることを可能にした。これは、生存細胞が、murA-pdt#1融合物の変異ではなくmf-Lonプラスミドの変異を通して、溶解を回避したことを示す。エラーバーは、3生物学的反復の平均値±標準偏差（SD）を表す。 図11A〜11Dは、タンパク質分解タグの特徴決定を示す図である。図11Aは、変更された定常状態レベルを示すpdt数字バリアントのパネルを示す。対数増殖中の細胞のATc誘導の6時間後に蛍光を測定した。実験対照として、pdt#3バリアントを、mf-Lon発現カセットを含有していない株において試験した（#3対照）。蛍光単位は、非タグ化GFPを100に設定した自由単位である。図11B〜Cは、50ng/ml ATcによるmf-Lon誘導後のGFP分解のフローサイトメトリー測定を示す。データは、各pdtバリアントについての、非誘導対照に対する百分率としての、少なくとも5,000個の細胞の幾何平均蛍光を示す。図11Bは、pdt数字バリアントが、類似したmf-Lonによって媒介される分解動態を維持することを示す。図11Cは、pdt文字バリアントが、変更されたmf-Lonによって媒介される分解速度を示すことを示す。図11Dは、ハイブリッドpdtバリアントのパネルを示す。示されたGFP-pdt融合物を発現する株を、ATc誘導の6時間後にフローサイトメトリーによって測定した。蛍光単位は、非タグ化GFPを100に設定した自由単位である。全ての図のエラーバーは、3生物学的反復の標準偏差を示す。 図12A〜12Dはpdtシステムの特徴決定を示す図である。図12Aは、mCherryおよびGFPのpdtによって媒介される分解の比較分析を示す。pdt文字バリアントをGFPおよびmCherryと融合させた。mf-Lon誘導（50ng/ml Atc、6時間）後に残存していた蛍光（％）が示される。蛍光データはフローサイトメトリーによって収集された。示されたpdtバリアントは、蛍光（％）が増加する順にリストされたpdt#3、#3A、#3B、#3C、#3D、#3Eである。最良適合直線はy＝1.09×-0.01であり、R2値は0.99である。図12Bは、mf-Lonによって媒介されるpdt分解の転写ベースおよび翻訳後ベースの制御を示す。誘導可能な転写は、ある範囲のATc誘導レベルにおいてGFP-pdt#3のmf-Lonによって媒介される分解の制御を提供する。大腸菌ssrAタグバリアントec-AAVおよびec-ASVのmf-Lonとの融合は、GFP分解プロファイルをシフトさせ、mf-Lonプロテアーゼ活性の不活化（S692A）は、GFP分解を阻止する。データは、GFP-pdt#3を分解標的として使用して、ATc誘導の6時間後に収集された。図12Cは、L.ラクティスにおけるmCherryのpdt依存性の分解を示す。L.ラクティスにおけるナイシンによって誘導されたmf-Lon発現は、pdt依存性のmCherry分解を引き起こす。データは、非誘導細胞の蛍光に対するパーセントとしての幾何平均蛍光を示す。ナイシン誘導は3ng/mlであった。図12Dは、大腸菌およびL.ラクティスにおけるpdt文字バリアントの比較分析を示す。pdt文字バリアントをmCherryと融合させた。mf-Lon誘導（6時間の誘導、大腸菌：50ng/ml ATcおよびL.ラクティス：3ng/mlナイシン）後に残存している蛍光（％）が示される。蛍光データはフローサイトメトリーによって収集された。示されたpdtバリアントは、蛍光（％）が増加する順にリストされたpdt#3、#3A、#3B、#3C、#3D、#3Eである。最良適合直線は、y＝1.79×+0.11であり、R2値は0.92である。全ての図について、エラーバーは、3生物学的反復の標準偏差を示す。 図13A〜13Eは、内因性細菌システムの調整可能な制御を示す図である。図13Aは、MurAのプロテアーゼによって駆動される枯渇の後の株の増殖を示す。光学濃度（OD600）によって測定されるように、初期対数期増殖中のプロテアーゼ誘導（矢印）は、murA-pdt#1を含有している細胞を1時間以内に溶解させる。弱められたpdt文字バリアントを含有している細胞は、遅延した応答を示す。エラーバーは、6生物学的反復の標準偏差を示す。図13Bは、3時間のATc誘導の後の細胞のDIC蛍光オーバーレイ画像を示す。ftsZ-pdt#5を含有している細胞は、フィラメントを形成するが、非タグ化野生型細菌は正常な長さを維持する。構成的なGFP発現を示す蛍光顕微鏡写真オーバーレイは、視覚的補助として機能する。図13Cは、走化性運動プレート上のディスク拡散アッセイが、pdt依存性のCheZ分解による走化性運動の喪失を示すことを示す。中心ディスクへ250ng ATcを添加した後、走化性プレートへ細胞を穿刺した。図13Dは、murA-pdt#1Dを含有している細胞が、4ng/ml ATcによる同時誘導によって、ホスホマイシンに対する増加した感受性を示すことを示す（誘導）。ATcおよびホスホマイシンによる処理の6時間後にOD600測定値を得た。ホスホマイシンへ曝されていない細胞（未処置）のOD600に対するパーセントとして提示される。図13Eは、RecAのpdt依存性の分解が、recA欠失株（ΔrecA）の既知の過敏と一致する、キノロンシステムノルフロキサシンに対する過敏を引き起こすことを示すデータを示す。示された場合、細胞を、50ng/ml ATcによって2時間誘導した後、ノルフロキサシン（25ng/ml）によって2時間処理した。生存をコロニー形成単位（CFU）によって測定した。ノルフロキサシン処理の直前に測定されたCFUに対するパーセントとして提示される。 図14A〜14Bは、内因性大腸菌プロテアーゼによるGFP-pdt分解を示す図である。図14Aは、示された大腸菌プロテアーゼ遺伝子のインフレーム欠失を含有している大腸菌株におけるGFPおよびGFP-pdtのレベルを示す。GFP、GFP-pdt、およびGFP-pdt#3を、PlacIqプロモーターから構成的に発現させ、蛍光をフローサイトメトリーによって測定した。対数期および静止期の細胞の光学濃度は、それぞれ、およそ0.3および1.6であった。蛍光単位は、対数期条件および静止期条件の両方について、非タグ化GFPを100に設定した自由単位である。エラーバーは、3生物学的反復の標準偏差を示す。 集団レベルの分解動態を示す。GFP-pdt#3を構成的に発現する対数期増殖中の細胞を、mf-Lonを発現するよう誘導し（50ng/ml ATc）、誘導後の示された時点で、フローサイトメトリーによってGFP蛍光を測定した。ヒストグラムプロットは、経時的な細胞集団におけるモノモードのシフトを示す。 図16A〜16Bは、pdt数字バリアントの比較を示す図である。pdt数字バリアントを、示されるようにGFPおよびmCherryと融合させた。蛍光をmf-Lon誘導なしにフローサイトメトリーによって測定した。非タグ化タンパク質標的の蛍光に対するパーセントとして提示される。図16Aは、大腸菌におけるmCherryとGFPとの間のpdt数字バリアントの相関を示す。mCherry蛍光（％）が増加する順にリストされたpdtバリアントは、pdt、pdt#2、pdt#3、pdt#5である。単回帰直線はy＝1.26×-0.07であり、R2値は0.95である。図16Bは、L.ラクティスと大腸菌との間のpdt数字バリアントの相関を示す。大腸菌における蛍光（％）が増加する順にリストされたpdt数字バリアントは、pdt#1、pdt、pdt#2、pdt#3、pdt#5である。単回帰直線は、y＝0.60×+0.17であり、R2値は0.61である。両方の図面においてエラーバーは、3生物学的反復の標準偏差を示す。 mf-Lon誘導の非存在下でのmurA-pdt細胞の増殖を示す図である。示されたpdtバリアントを含有しており、示されたようにmf-Lonを含む細胞もしくは含まない細胞、またはATcで誘導された細胞もしくは誘導されなかった細胞の増殖速度は、光学濃度（600nm）によって測定されるように、野生型細胞と識別不能である。ftsZ-pdt#5を含有している大腸菌の増殖速度は、mf-Lon誘導の非存在下で、野生型細胞と識別不能であった。 MurA過敏アッセイについての増殖曲線を示す図である。示されるように、ATcおよびホスホマイシンを同時に添加した後の細胞増殖。murA-pdt#1Dを含有している細胞について、ATcおよびホスホマイシンへの曝露は、ATcのみまたはホスホマイシンのみへの曝露より大きい増殖欠陥を引き起こす。図13Dについてのデータは、ATcおよびホスホマイシンによる誘導の4時間後に得られた。 GFP回復を示す図である。GFP-pdt#3融合を含有している細胞を、mf-Lonによって媒介されるGFP分解を引き起こすため、ATc（50ng/ml）によって6時間誘導し、次いで、ATcなしの培地へ移動させ、30分毎に6時間測定した。蛍光はフローサイトメトリーによって測定された。ATcに曝されていない細胞の蛍光に対するパーセントとして提示される。GFP-pdt#3レベルの完全な回復が、ATc除去の4.5時間以内に起こる。
詳細な説明
転写および翻訳の調節を通したタンパク質生合成の外因性の制御は、十分に確立されているが1-5、細菌システムにおけるタンパク質分解の頑強で調整可能な制御は、それほど開発されていない。本明細書に記載されるように、宿主細胞分解システムに頼らず、広範囲の細菌（例えば、グラム陽性菌およびグラム陰性菌）において機能することができる合成分解構成要素およびシステムが開発された。具体的には、本明細書に記載されるように、合成分解構成要素およびシステムが作製され、大腸菌およびL.ラクティスにおける機能性を証明するため、グラム陽性菌メソプラズマ・フローラムのtmRNA構成要素が使用された。GurおよびSauer15による以前の研究は、M.フローラムssrAタグ（mf-ssrA）が、内因性Lonプロテアーゼ（mf-Lon）によって分解されるが、ClpXPまたは大腸菌Lon相同体によっては分解されないことを見出した。さらに、mf-Lonは、ec-ssrAを認識または分解せず、直交の機能性を有するプロテアーゼおよび同族分解タグを提供する。
変更された分解動態を有する「タンパク質分解タグ（pdt）」と本明細書において呼ばれるバリアントを遺伝子工学によって作製する（engineer）ために、27アミノ酸mf-ssrAタグのサイズおよび複雑さを利用する、mf-ssrAおよびmf-Lonが組み入れられた、細菌（例えば、大腸菌およびL.ラクティス）における誘導可能なタンパク質分解のための蛍光ベースのアッセイプラットフォームが作製された。mf-Lonまたは内因性細菌プロテアーゼのいずれかによる認識に影響を与える変異のため、分解タグの別個の領域を標的とし、得られたタグバリアントを、付着したタンパク質の初期レベルおよび誘導可能な分解速度の両方の予測可能な独立した制御を有するハイブリッドタグを作製するため、組み合わせた。システムをさらにバリデートするため、遺伝子トグルスイッチのプロテアーゼベースの切り替えを可能にするため、ハイブリッドタグを合成遺伝子システムへ組み入れ、次いで、既存の調節構造を破壊することなく、内因性細菌過程を制御するため、ゲノムタグ挿入を使用した。従って、これらの簡便で調整可能なタンパク質分解構成要素およびシステムは、現在の細菌分解システムに対するいくつかの利点を提供し、生物学者および技術者にとって利用可能な調節機序のレパートリーを拡張する。
定義
本明細書において使用されるように、「タンパク質分解タグ（protein degradation tag）（pdt）」という用語は、標的タンパク質と融合された場合、細菌細胞における同族プロテアーゼによる分解のためにタンパク質をマークする小さいアミノ酸配列をさす。pdtおよび同族プロテアーゼの対の例には、大腸菌ssrA（ec-ssrA）／大腸菌Lon（ec-Lon）およびメソプラズマ・フローラムssrA（mf-ssrA）／メソプラズマ・フローラムLon（mf-Lon）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において使用されるように、「修飾型タンパク質分解タグ」という用語は、未修飾の分解タグと比較して変更された発現および／または分解動態を有するよう修飾された分解タグをさす。
本明細書において使用されるように、「標的タンパク質」という用語は、細胞において発現されることが望まれる任意のタンパク質をさす。いくつかの態様において、「標的タンパク質」は、「候補薬物標的」（例えば、候補抗生物質標的）である。そのような候補薬物標的は、細胞過程、例えば、細菌細胞壁生合成、細胞分裂、および運動に対する発現レベルの効果を決定するため、所望の発現レベルおよび／または分解速度を達成するため、修飾型pdtと融合された標的タンパク質を細胞において発現させることによって同定され得る。候補薬物標的は、薬物の存在下でも、発現レベルおよび分解速度について試験され得る。
本明細書において使用されるように、「変更された分解動態」という用語は、未修飾のpdtおよび標的タンパク質の認識または分解の速度と比較された、修飾型pdtおよび標的タンパク質の同族プロテアーゼによる認識または分解の速度の増加または減少をさす。例えば、修飾型pdtは、未修飾のカウンターパートと比較して増加した速度で、同族プロテアーゼによって分解され得る。あるいは、いくつかの態様において、修飾型pdtは、それが由来する未修飾の分解タグより減少した、即ち、遅い速度で、同族プロテアーゼによって分解される。さらに、修飾型pdtは、細胞における標的タンパク質の初期発現レベルを修飾するためにも使用され得、それは「変更された発現」または「変更された初期発現レベル」と本明細書において呼ばれる。そのような修飾型pdtは、未修飾のpdtカウンターパートと融合された同一のタンパク質と比較して、標的タンパク質の初期発現レベルを増加させるかまたは減少させるために使用され得ることが、本明細書において企図される。
「増加させる」または「増強する」または「活性化する」という用語は、全て、一般に、統計的に有意な量の増加を意味するために本明細書において使用される。しかしながら、不確かさの回避のため、「増加した」、「増加」または「増強する」または「活性化する」という用語は、未修飾のpdt融合タンパク質の発現レベルまたは分解速度と比較した、少なくとも約5％または少なくとも10％の、修飾型pdt融合タンパク質の標的タンパク質の発現量または分解速度の増加、例えば、未修飾のpdt融合タンパク質を含む分解システムと比較した、少なくとも約20％もしくは少なくとも約30％もしくは少なくとも約40％もしくは少なくとも約50％もしくは少なくとも約60％もしくは少なくとも約70％もしくは少なくとも約80％もしくは少なくとも約90％もしくは100％までの増加、または10〜100％の増加、または少なくとも約2倍もしくは少なくとも約3倍もしくは少なくとも約4倍もしくは少なくとも約5倍もしくは少なくとも約10倍の増加、または2〜10倍もしくはそれ以上の増加を意味する。
反対に、「減少」、「減少した」、または「低下した」という用語は、全て、一般に、未修飾のpdt融合タンパク質の発現レベルまたは分解速度と比較した、統計的に有意な量、例えば、少なくとも約5％または少なくとも10％の、修飾型pdtを含むpdt融合タンパク質の発現レベルまたは分解速度の減少、例えば、未修飾のpdt融合タンパク質を含む分解システムと比較した、少なくとも約20％もしくは少なくとも約30％もしくは少なくとも約40％もしくは少なくとも約50％もしくは少なくとも約60％もしく少なくとも約70％もしくは少なくとも約80％もしくは少なくとも約90％もしくは100％までの減少、または10〜100％の減少、または少なくとも約2倍もしくは少なくとも約3倍もしくは少なくとも約4倍もしくは少なくとも約5倍もしくは少なくとも約10倍の減少、または2〜10倍もしくはそれ以上の減少を意味するために本明細書において使用される。
「統計的に有意な」または「有意に」という用語は、統計的有意性をさし、一般に、他の値と比較した2標準偏差（2SD）を意味する。その用語は、差が存在することの統計的証拠をさす。その決定は、しばしば、p値を使用してなされる。
本明細書において使用されるように、「同族プロテアーゼ」または「ペアのプロテアーゼ」という用語は、本明細書において使用されるように、修飾型pdtを認識し、それによって、修飾型pdtと融合された標的タンパク質を分解することができるプロテアーゼをさす。いくつかの態様において、同族プロテアーゼは、システムの使用が設計される細胞において構成的に発現されないことが好ましい。これは、（メソプラズマ・フローラムまたはマイコプラズマ科の他のメンバーのような）高度に分岐した細菌に由来する同族プロテアーゼ／pdt対を使用し、高度に分岐した細菌に由来する修飾型pdtによってタグ化されたタンパク質を認識または分解する能力を有するプロテアーゼを構成的に発現しない細胞（例えば、大腸菌のようなグラム陰性菌、L.ラクティスのようなグラム陽性菌、または真核生物）において、それらを発現させることによって、一部分、達成され得る。マイコプラズマ科（例えば、マイコプラスマ・ニューモニエ、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・プルモニス、マイコプラズマ・シノビエ、マイコプラズマ・ペネトランス、マイコプラズマ・ファーメンタンス等）に由来するssrAタグおよび／または同族プロテアーゼの使用も、本明細書において企図される。
本明細書において使用されるように、「構成的に発現される」または「構成的に発現された」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、本明細書に記載された方法およびシステムが利用される細胞にネイティブであり、かつ細胞におけるタンパク質分解活性（例えば、タンパク質の認識および分解）（例えば、基底タンパク質分解活性）を含むプロテアーゼをさす。例えば、大腸菌細胞において、ec-Lonは構成的に発現されると見なされるが、mf-Lonはそうでない。mf-Lonは、大腸菌細胞において「外因的に発現される」と見なされる。
本明細書において使用されるように、「調整可能な発現」という用語は、本明細書に記載されたシステムの、細胞における標的タンパク質の発現のレベルを制御する能力をさす。これは、例えば、標的タンパク質と融合された場合に、特別な発現特徴、例えば、（i）単独の標的タンパク質もしくは未修飾のpdtと融合された標的タンパク質の発現と比較した、標的タンパク質の初期発現レベルの増加もしくは減少、または（ii）単独の標的タンパク質もしくは未修飾のpdtと融合された標的タンパク質の同族プロテアーゼによる分解の速度と比較した、同族プロテアーゼによる分解の速度の増加もしくは減少を付与する修飾型タンパク質分解タグを選択することによって達成され得る。あるいは、同族プロテアーゼの発現レベルは、例えば、（i）細胞へ導入される同族プロテアーゼをコードする核酸構築物の量を修飾するか、（ii）核酸構築物によってコードされた誘導可能プロモーターもしくは生物学的回路を使用して、同族プロテアーゼの発現を制御するか、または（iii）システムが発現される細胞において構成的に発現されるプロテアーゼによって所望の速度で認識され分解される同族プロテアーゼに分解タグ（もしくは修飾型分解タグ）を融合させることによって、所望の発現（例えば、mRNAもしくはタンパク質）のレベルまたは活性レベルへ調整され得る。
本明細書において使用されるように、「分解することができる」という用語は、本明細書に記載されるpdtまたは修飾型pdtによってタグ化されたタンパク質を少なくとも部分的に認識し分解することができるプロテアーゼをさす。従って、「分解することができる」とは、pdtまたは修飾型pdtによってタグ化されたタンパク質が、プロテアーゼの非存在下でのpdtまたは修飾型pdtによってタグ化されたタンパク質と比較して、少なくとも10％、分解されることを意味することができ；好ましくは、pdt/タンパク質融合物または修飾型pdt/タンパク質融合物は、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、または100％分解される（即ち、pdtまたは修飾型pdtによってタグ化されたタンパク質のmRNAまたはタンパク質のレベルは、例えば、FACS、ELISA、蛍光顕微鏡法等を使用した標準的な検出レベルより低い）。さらに、「分解することができる」という用語は、本明細書において、発現レベルのみによるのではなく、pdtまたは修飾型pdtによってタグ化されたタンパク質の分解速度をさすことが企図される。例えば、分解が、低下した速度で起こる場合であっても、例えば、修飾型pdt融合タンパク質の分解速度が、未修飾のpdt融合タンパク質またはpdtタグの非存在下で発現された標的タンパク質の分解速度と比較して、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれ以上、低下する場合であっても、プロテアーゼは、タグ化タンパク質を「分解することができる」。さらに、当業者は、タグ化タンパク質の分解速度が、非タグ化カウンターパートと比較して、例えば、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、またはそれ以上、増加し得ることも認識するであろう。本明細書に記載されるpdtまたは修飾型pdtを分解することができる例示的なプロテアーゼには、mf-Lon、またはそのバリアントもしくは相同体（例えば、マイコプラズマ科の他のメンバーに由来するLonプロテアーゼ）が含まれるが、これらに限定されない。
「核酸構築物」という用語は、本明細書において使用されるように、組換え法によって少なくとも部分的に作製された核酸をさす。「DNA構築物」という用語は、デオキシリボヌクレオチドからなるポリヌクレオチド構築物をさす。構築物は一本鎖または二本鎖であり得る。構築物は環状または直鎖状であり得る。当業者は、DNA構築物を入手し生成する多様な方式に精通している。構築物は、例えば、Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(NY)；Silhavy et al.(1984)Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(NY)；Ausubel et al.(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc and Wiley Interscience；Gelvin et al.(Eds)(1990)Plant Molecular Biology Manual；Kluwer Academic Publisher,Dordrecht,The Netherlandsに記載されているような、慣習的な組換えおよびクローニングの技術によって調製され得る。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」、「遺伝子産物」、「発現産物」、および「タンパク質」という用語は、連続するアミノ酸残基のポリマーまたはオリゴマーをさすために本明細書において交換可能に使用される。
「機能的な連結」または「機能的に連結された」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、例えば、調節要素の各々が、連結された核酸配列の発現を可能にするか、修飾するか、容易にするか、または他の方法で影響を与えるため、その意図された機能を果たすことができるような方式で、調節要素（例えば、プロモーター）が、発現される核酸配列、および、適宜（例えば、ターミネーターのような）さらなる調節要素と、連続的に配置されることを意味するものとして理解される。発現は、センスRNAまたはアンチセンスRNAに対する核酸配列の配置に依って起こり得る。この目的のため、化学的な意味での直接の連結は、必ずしも必要とされない。例えば、エンハンサー配列のような遺伝子制御配列は、遠位から、または、実際、他のDNA分子から、標的配列に対する機能を果たす場合もある。いくつかの態様において、配置は、2種の配列が相互に共有結合で連結されるよう、組換え発現される核酸配列が、プロモーターとして作用する配列の後に位置するものである。プロモーター配列と組換え発現される核酸配列との間の距離は、任意の距離であり得、いくつかの態様において、200塩基対未満、具体的には、100塩基対未満、50塩基対未満である。いくつかの態様において、転写される核酸配列は、転写開始が、本発明のキメラRNAの所望の開始と同一であるような方式で、プロモーターの後に位置する。機能的な連結、および発現構築物は、（例えば、Maniatis T,Fritsch EF and Sambrook J(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(NY)；Silhavy et al.(1984)Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(NY)；Ausubel et al.(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc and Wiley Interscience；Gelvin et al.(Eds)(1990)Plant Molecular Biology Manual；Kluwer Academic Publisher,Dordrecht,The Netherlandsに）記載されているような、慣習的な組換えおよびクローニングの技術によって生成され得る。しかしながら、2種の配列の間にさらなる配列が位置していてもよい。配列の挿入は、融合タンパク質の発現をもたらすか、またはリボソーム結合部位として機能する場合もある。いくつかの態様において、プロモーターおよび発現される核酸配列の連結からなる発現構築物は、ベクターに組み込まれた形態で存在し、例えば、形質転換によって植物ゲノムへ挿入されてもよい。
「プロモーター」、「プロモーター要素」、または「プロモーター配列」という用語は、等価であり、本明細書において使用されるように、関心対象のヌクレオチド配列に機能可能に連結された場合に関心対象のヌクレオチド配列のmRNAへの転写を制御することができるDNA配列をさす。プロモーターは、必ずではないが、典型的には、それがmRNAへの転写を制御する関心対象のヌクレオチド配列の5'（即ち、上流）（例えば、構造遺伝子の転写開始部位の近位）に位置し、転写の開始のためのRNAポリメラーゼおよびその他の転写因子による特異的な結合のための部位を提供する。ポリヌクレオチド配列は、外来種に起因する場合、または同一種に起因するが、最初の形態から修飾されている場合、生物または第2のポリヌクレオチド配列に対して「異種」である。例えば、異種コード配列に機能的に連結されたプロモーターとは、プロモーターが由来したものと異なる種に由来するコード配列、または同一種に由来する場合、プロモーターに天然に関連していないコード配列（例えば、遺伝子的に操作されたコード配列または異なる生態型もしくは変種に由来する対立遺伝子）をさす。適当なプロモーターは、発現が起こるべき宿主細胞の遺伝子または宿主細胞にとっての病原体に由来し得る（例えば、組織プロモーターまたはウイルスのような病原体）。
プロモーターが、本明細書において定義される「誘導可能プロモーター」である場合、転写の速度は、誘導剤または誘導因子に応答して修飾される。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場合、転写の速度は誘導因子によって調節されない。プロモーターに関して使用された場合、「構成的な」という用語は、プロモーターが、刺激（例えば、熱ショック、化学物質、剤、光等）の非存在下で、機能的に連結された核酸配列の転写を指図することができることを意味する。典型的には、構成的プロモーターは、実質的に任意の細胞および任意の組織において核酸配列の発現を指図することができる。対照的に、本明細書において言及される「調節可能な」または「誘導可能な」プロモーターという用語は、刺激（例えば、熱ショック、化学物質、光、剤等）の存在下で、刺激の非存在下での機能的に連結された核酸配列の転写のレベルとは異なるレベルで、機能的に連結された核酸配列の転写を指図することができるものである。
プロモーターは、特異的な組織型においてのみ会合したコード領域を転写する活性を有するよう、組織特異的または組織優先的に調節されてもよい。「組織特異的な」という用語は、プロモーターに適用される場合、異なる組織型（例えば、腎臓）には同一の関心対象のヌクレオチド配列の発現が相対的に存在しないよう、特異的な組織型（例えば、肝臓）において関心対象のヌクレオチド配列の選択的な発現を指図することができるプロモーターをさす。プロモーターの組織特異性は、例えば、レポーター構築物を生成するためにレポーター遺伝子をプロモーター配列に機能的に連結し、レポーター構築物が得られたトランスジェニック動物の全ての組織へ組み込まれるよう、生物、例えば、動物モデルのゲノムへレポーター構築物を導入し、トランスジェニック動物の異なる組織においてレポーター遺伝子の発現を検出する（例えば、mRNA、タンパク質、またはレポーター遺伝子によってコードされたタンパク質の活性を検出する）ことによって評価され得る。他の組織におけるレポーター遺伝子の発現のレベルと比べた、1種以上の組織におけるレポーター遺伝子のより大きい発現レベルの検出は、より大きい発現レベルが検出される組織にプロモーターが特異的であることを示す。「細胞型特異的」という用語は、プロモーターに適用される場合、同一組織内の異なる細胞型には同一の関心対象のヌクレオチド配列の発現が相対的に存在しないよう、特異的な細胞型において関心対象のヌクレオチド配列の選択的な発現を指図することができるプロモーターをさす。「細胞型特異的」という用語も、プロモーターに適用される場合、単一組織内のある領域において関心対象のヌクレオチド配列の選択的な発現を促進することができるプロモーターを意味する。プロモーターの細胞型特異性は、当技術分野において周知の方法、例えば、GUS活性染色または免疫組織化学的染色を使用して査定され得る。「ミニマルプロモーター」という用語は、本明細書において使用されるように、機能的なプロモーターも維持しながらプロモーター要素を含む最小の核酸配列をさす。ミニマルプロモーターには、誘導可能、構成的、または組織特異的なプロモーターが含まれ得る。
「発現」という用語は、本明細書において使用されるように、遺伝子産物の生合成、好ましくは、細胞におけるヌクレオチド配列、例えば、内因性遺伝子または異種遺伝子の転写および／または翻訳をさす。例えば、異種核酸配列のケースにおいて、発現は、異種核酸配列のmRNAへの転写を含み、任意で、その後のmRNAの1種以上のポリペプチドへの翻訳を含む。発現とは、RNA分子の生合成もさすが、必ずしもポリペプチド配列への翻訳を必要としない。「発現構築物」および「核酸構築物」という用語は、本明細書において使用されるように、同義語であり、適切な宿主細胞（例えば、原核細胞、真核細胞、または哺乳動物細胞）において異種標的遺伝子配列のような特定のヌクレオチド配列の発現を指図することができる核酸配列をさす。所望の異種標的遺伝子の翻訳が必要とされる場合、それは典型的にはヌクレオチド配列の適切な翻訳のために必要とされる配列も含む。コード領域は、関心対象のタンパク質をコードしてもよいが、関心対象の機能性RNA、例えば、アンチセンスRNA、dsRNA、または非翻訳RNAを、センスまたはアンチセンスの方向にコードしてもよい。本明細書に開示される核酸構築物は、キメラであってもよく、即ち、その構成要素のうちの少なくとも1個が、他の構成要素のうちの少なくとも1個に対して異種であってもよい。
本明細書において使用されるように、「を含む（comprising）」という用語は、提示された明確な要素に加えて、他の要素が存在してもよいことを意味する。「を含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。従って、「を含む」という用語は「主に含むが、単独である必要はない」を意味する。さらに、「を含む（comprise）」および「を含む（comprises）」のような「を含む（comprising）」という単語の変形は、相応して同一の意味を有する。「から本質的になる」という用語は「少なくとも1を主に含むが、単独である必要はない」を意味し、従って、「任意の組み合わせの1以上の選択」を意味するものとする。換言すると、「から本質的になる」という用語は、本発明の新規の特徴に実質的に影響を与えることなく、要素を追加するか、削除するか、または置換することが可能であることを意味する。これは、記載された方法内の工程ならびにその中の組成物および構成要素に等しく当てはまる。他の態様において、本明細書に記載された発明、組成物、方法、およびそれぞれの構成要素は、構成要素、組成物、または方法に必須の要素とは見なされない要素を除外するものとする（「からなる」）。例えば、リコンビナーゼをコードする配列およびリコンビナーゼ認識配列を含む生物学的コンバータスイッチは、リコンビナーゼおよびより大きい配列のリコンビナーゼ認識配列の両方を包含する。さらなる例として、要素AおよびBを含む組成物は、A、B、およびCからなる組成物も包含する。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」には、前後関係によって明白にそうでないことが示されない限り、複数の対象物が含まれる。従って、例えば、「その方法（the method）」との言及には、本明細書に記載されかつ／または本開示を参照することによって当業者に明白になるであろう型の1種以上の方法および／または工程が含まれる。
以上の詳細な説明および以下の例は、例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでないことが、理解される。当業者に明白であろう、開示された態様に対する様々な変化および修飾が、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく行われ得る。さらに、同定された特許、特許出願、刊行物、およびウェブサイトは、全て、例えば、本発明に関して使用され得るそのような刊行物に記載された方法論を記載し開示する目的のため、参照によって明白に本明細書に組み入れられる。これらの刊行物は、本願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供される。先行発明のため、またはその他の何らかの理由のため、本発明者らがそのような開示に先行している資格を有しないことの承認として解釈されるべきものは存在しない。これらの書類の日付に関する陳述または内容に関する表記は、全て、本出願人にとって入手可能な情報に基づいており、これらの書類の日付または内容の正確さに関しての承認を構成しない。
タンパク質分解タグバリアント
本明細書において定義されるように、「分解タグ」または「タンパク質分解タグ」とは、タンパク質が、例えば、プロテアーゼまたは細胞分解機序によるより速い分解を受けるよう、その配列から発現されるタンパク質を修飾する、核酸配列の末端への遺伝子付加である。従って、そのようなタンパク質分解タグは、分解のためにタンパク質を「マークし」、それによって、タンパク質の半減期を減少させる。
分解タグの有用な局面のうちの一つは、時間感受性の様式で遺伝子活性を検出し調節する能力である。典型的には、タンパク質分解タグは、細胞内でプロテアーゼのようなタンパク質分解酵素の使用を通して作動する。分解タグは、例えば、タンパク質のC末端において約11アミノ酸の配列をコードすることができ、その配列は、切断された（「短縮された」）mRNA上にリボソームが固着した場合、大腸菌において正常に生成される。正常な終結コドンなしでは、リボソームは欠陥mRNAから脱離することができない。ssrA（「スモールステーブル（small stable）RNA A」）またはtmRNA（「トランスファーメッセンジャーRNA」）として公知の特別の型のRNAは、終止コドンの前に分解タグを付加することによって、リボソームを救済する。これは、リボソームが自由になり、機能し続けることを可能にする。タグ化された不完全タンパク質は、プロテアーゼClpXPまたはClpAPによって分解され得る。ssRA/tmRNAタグをコードするアミノ酸の数の最初の発見は、11であったが、そのシステムの最後の3アミノ酸の変異の効力が試験されている。従って、タグAAV、ASV、LVA、およびLAAは、3アミノ酸のみによって分類される。
標的タンパク質の誘導可能な分解のためのタンパク質分解タグの使用は、内因性の構成的な活性型プロテアーゼが細菌細胞に存在することによって限定される。研究者らは、細菌における付着したタンパク質の分解速度を修飾するため、大腸菌ssrA（ec-ssrA）分解タグを修飾することによって、この限界を克服することを目標としてきた。本明細書に記載されるタンパク質分解タグは、高度に分岐したグラム陽性菌メソプラズマ・フローラムの分解タグ、特に、mf-ssrAから修飾されるが、マイコプラズマ科の他のメンバーに由来するssrAタグも本明細書において企図される（例えば、マイコプラスマ・ニューモニエ、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・プルモニス、マイコプラズマ・シノビエ、マイコプラズマ・ペネトランス、またはマイコプラズマ・ファーメンタンス等に由来するssrAタグ）。他の細菌からのM.フローラムの遺伝学的分岐は、本明細書に記載された分解システムが、広範囲のグラム陰性菌およびグラム陽性菌ならびに真核生物において機能することを可能にする。M.フローラムに由来する分解タグは、その内因性Lonプロテアーゼ（mf-Lon）によってのみ認識され、分解され、ClpXPまたは大腸菌もしくはL.ラクティスのLon相同体によっては認識または分解されない。従って、mf-ssrAに由来するタンパク質分解タグが、本明細書に提供される。いくつかの態様において、タンパク質分解タグ（pdt）は、標的タンパク質の変更された初期タンパク質レベルおよび／または変更されたプロテアーゼによって誘導される分解動態を含む、変更された特徴を含む。
本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、タンパク質分解タグは、修飾型mf-ssrAタグである。分解タグのサイズは、タグの別個の領域の標的変異誘発が、内因性プロテアーゼ、および本明細書に記載されたシステムにおいて使用される同族プロテアーゼmf-Lon（またはそのバリアントもしくは相同体）による認識の独立した制御を有するタグを生成することを可能にする。内因性プロテアーゼまたは分解のためタグを特異的に標的とするプロテアーゼによる認識に影響を与えるため、例えば、タグ内の他のアミノ酸の標的変異、欠失、または付加によって、他の変異をmf-ssrAタグへ導入してもよい。もう一つの態様において、タンパク質分解タグは、他のマイコプラズマ種に由来する修飾型ssrAタグを含む。
未修飾のmf-ssrAタグは、以下の配列：
Figure 0006430481
を含む。
本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、pdtタグは、表7（SEQ ID NO:1〜26）または表8のペプチドをコードする配列からなる群より選択される配列を含む。本発明者らは、mf-Lonによる認識を完全に消失させるmf-ssrAの最初の13アミノ酸の欠失を見出したが、この領域内の個々のアミノ酸の変更は、mf-Lon分解に対する感受性を変化させる。本発明者らは、アミノ酸13〜15の変動が、mf-Lonに対する特異性を変動させ得ることも示した。従って、一つの態様において、本明細書に記載される修飾型pdtの生成のため、アミノ酸13〜15の変異が企図される。mf-Lonまたはそのバリアントもしくは相同体の認識が完全に消失しないのであれば、アミノ酸1〜13内の変異を修飾型pdtを生成するために使用することができる。本発明者らは、mf-ssrAのアミノ酸25〜27にバリアントを有するタグは、mf-Lonに対する感受性は比較的不変であるが、内因性大腸菌プロテアーゼに対する減少した感受性を有するよう修飾されるため、mf-Lonに対する増加した特異性を示すことを見出した。本発明者らは、mf-ssrAのアミノ酸13〜15におけるバリアントが、mf-Lonに対する減少した感受性および特異性を示すことも見出した。これらの領域の各々における変異は、本明細書に記載される修飾型pdtの生成において使用するために企図される。
微生物シュードモナス（Pseudomonas）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、および／またはアシネトバクター（Acinetobacter）について本明細書に記載されるシステムと共に使用するための、大腸菌ssrAタグ配列（例えば、ANDENYALAA）の使用も、本明細書において企図される。下記の配列は、タグ配列を含有している対応するtmRNA遺伝子のヌクレオチド配列である。それらは、可能性のあるペプチドコード領域を明らかにするため、3種の順方向リーディングフレーム全てにおいて翻訳される。下線付きの領域は、各配列内の大腸菌ssrAタグ配列を示す。
大腸菌ssrAタグ配列：ANDENYALAA
>914794-915261_1 アシネトバクター種ADP1染色体、完全ゲノム
Figure 0006430481
>914794-915261_2 アシネトバクター種ADP1染色体、完全ゲノム
Figure 0006430481
>914794-915261_3 アシネトバクター種ADP1染色体、完全ゲノム
Figure 0006430481
>837441-837907_1 スタフィロコッカス・アウレウス（aureus）亜種アウレウスMSSA476染色体、完全ゲノム
Figure 0006430481
>837441-837907_2 スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウスMSSA476染色体、完全ゲノム
Figure 0006430481
>837441-837907_3 スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウスMSSA476染色体、完全ゲノム
Figure 0006430481
>c901924-901466_1 シュードモナス・アエルギノサ（aeruginosa）PAO1染色体、完全ゲノム
Figure 0006430481
>c901924-901466_2 シュードモナス・アエルギノサPAO1染色体、完全ゲノム
Figure 0006430481
>c901924-901466_3 シュードモナス・アエルギノサPAO1染色体、完全ゲノム
Figure 0006430481
他の有用なpdtタグ配列は、例えば、本明細書中の実施例セクションに記載されるような蛍光ベースのインビボ試験プラットフォームを使用して開発され得る。
修飾型pdtは、mf-ssrAの相同体またはバリアント（例えば、マイコプラズマ科の他のメンバーに由来するssrAタグ）を使用して生成され得ることが、本明細書においてさらに企図される。同様に、本明細書に記載されるpdtまたは修飾型pdtを分解することができるプロテアーゼは、マイコプラズマ科のメンバーから入手されてもよいし、またはマイコプラズマ科のメンバーに由来するプロテアーゼ（例えば、他のマイコプラズマ科メンバーに由来する修飾型Lonプロテアーゼ）に由来してもよいことも、本明細書において企図される。
さらに、当業者は、1種以上のpdtまたは修飾型pdtを複数の内因性タンパク質へ付着させ、それによって、本明細書に記載されるように、1種以上の同族プロテアーゼを活性化することによって、複数の細胞経路の協調的な制御を可能にし得ることが、本明細書において企図される。
標的タンパク質およびpdt配列を含む融合タンパク質の発現のための、pdt配列およびマルチクローニング部位をコードするベクターも、本明細書に提供される。そのような融合タンパク質の発現のためのベクター構築物は、一般に、標的細胞における構築物の発現を確実にするため、調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサー等を必要とするであろう。ベクターおよび構築物についてのこれらおよびその他の詳細は、下記の「構成要素部分」というタイトルのセクションにおいてさらに詳細に記載される。
いくつかの態様において、プロテアーゼをコードする核酸配列は、コドン最適化されている。核酸配列のコドン最適化の方法は、当業者に公知である。例えば、核酸配列の特定のコドンが、増強された発現レベルをもたらす特定の宿主にとって好ましいコドンへ変化した、組換えポリペプチドバリアントをコードするよう、核酸配列を修飾することができる（例えば、Haas et al.,Curr.Biol.6:315,1996；Yang et al.,Nucleic Acids Res.24:4592,1996を参照すること）。コドン最適化の他の方法には、翻訳開始領域の修飾、mRNA構造要素の変更、および異なるコドンバイアスの使用が含まれるが、これらに限定されない。
ある種の態様において、プロテアーゼは、細菌、例えば、大腸菌またはL.ラクティスのゲノムへ組み込まれる。核酸配列を細菌ゲノムへ組み込む方法は、当業者に公知である。ゲノム組み込みは、細菌における修飾型プロテアーゼの発現を可能にし、従って、細菌の培養物中にプラスミドを維持するための抗生物質またはその他の選択機序を使用した選択を必要としない。従って、ゲノム組み込みは、タンパク質標的のより強力なかつ／またはより迅速な誘導可能な分解を与え、それによって、標的タンパク質の分解を制御するためのさらなるオプションを当業者に与えるという付加的な利点を有する。修飾型プロテアーゼをコードする核酸配列のゲノム組み込みは、厄介なプラスミド選択工程の必要のない、タンパク質標的の制御された分解が望まれる、産業的または商業的な状態において特に有用である。
分解モジュールおよびシステム
本明細書に記載された分解システムは、高度にモジュール式であり、機能するために小さいペプチドタグおよび単一のプロテアーゼのみを必要とする。他の分解システムと異なり、本明細書に記載されたシステムは、標的タンパク質の初期タンパク質レベルおよび誘導可能な分解速度の両方の予測可能な独立した制御を可能にする。さらに、この分解システムは、システムが機能することを可能にするために宿主の遺伝子または経路の破壊を必要とせず、最小の修飾によって、他の細菌（例えば、グラム陰性菌およびグラム陽性菌）ならびに真核生物へトランスファー可能である。独特の分解タグおよび同族プロテアーゼの使用は、誘導可能な標的タンパク質分解を可能にする。さらに、複数の独特の分解タグ（2種以上の異なるタグ）およびそれらの同族プロテアーゼの使用は、複数のタグ化タンパク質（例えば、2種、3種、4種、またはそれ以上）の誘導可能な標的とされたタンパク質分解を可能にし、それによって、当業者が協調的に制御された様式で複数の細胞経路を制御することを可能にする。
システムは、医薬またはその他の化合物の作製のための代謝工学のような細胞経路の制御または回避を必要とする任意の過程において有用である内因性細胞過程を制御するために使用され得る。
本明細書に記載された分解システムは、バイオファブリケーションおよびバイオセンサーの設計のような領域において使用するための多様な合成回路を制御するために使用され得る。それは、細胞の移動を制御するために使用され得、従って、治療用のタンパク質または化合物のその後の発現または放出のため、体内の特定のニッチへの細胞の改変された（engineered）ターゲティングを可能にする。他の例には、分解システムが、細胞質の抗原内容物を放出するため、細胞溶解を誘導することができる、ワクチン送達システムにおける使用が含まれる。
本明細書に記載された分解システムは、強力なタンパク質特異的な低分子阻害剤を同定する高価で労働集約的な過程を開始する前に、（このケースにおいては分解による）標的タンパク質阻害に関連した表現型を同定する簡便な方法を、製薬会社に提供する。従って、一つの態様において、本明細書に記載された分解システムは、薬物開発（例えば、抗生物質開発）のための細菌標的を同定するためのスクリーニングアッセイにおいてまたはスクリーニングプラットフォームとして使用される。
一つの態様において、本明細書に記載されたシステムは、標的タンパク質と融合された修飾型mf-ssrA分解タグ、および修飾型分解タグを認識し分解する同族プロテアーゼ、またはそれらのベクターを含む。もう一つの態様において、本明細書に記載されたシステムは、他のマイコプラズマまたは近縁種に由来するssrAタグおよび／もしくは同族プロテアーゼまたはそれらのベクターを含む。
本明細書に記載された合成分解システムおよびタンパク質分解タグを使用して、細胞過程の状態（例えば、代謝状態、アポトーシス、壊死、増殖等）または細胞内の標的タンパク質のレベルを示すために使用され得る多様な生物学的アウトプットも、本明細書に提供される。これらの生物学的アウトプットまたは「アウトプット産物」とは、本明細書において定義されるように、本明細書に記載されるシステムの具体的な状態のマーカーとして使用され得る産物をさす。アウトプット配列には、本明細書に記載されたシステムを使用して、細菌細胞における分解システムの発現によって、または誘導可能な分解の開始によって、細胞の状態を追跡するかまたはマークするために使用される、標的タンパク質または検出可能タンパク質についてのタンパク質またはRNA分子が含まれ得る。そのようなアウトプット産物は、細胞の様々な状態を識別するために使用され得る。例えば、細胞における分解システムの発現および／または誘導によって、標的タンパク質のアウトプット遺伝子産物は、例えば、外部環境における化学物質の変化に応答して、または薬物曝露（例えば、抗生物質）に応答して、多様な細胞経路において検出可能な変化を引き起こし得る。
本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、アウトプット産物は「レポーター」である。本明細書において定義されるように、「レポーター」とは、遺伝子発現を測定するために使用され得るタンパク質をさす。レポーターは、一般に、蛍光、色、または発光のような測定可能なシグナルを生成する。レポータータンパク質コード配列は、細胞または生物におけるその存在が容易に観察されるタンパク質をコードする。例えば、蛍光タンパク質は、特定の波長の光によって励起された場合、細胞に蛍光を発しさせ、ルシフェラーゼは、光を生じる反応を細胞に触媒させ、βガラクトシダーゼのような酵素は、基質を有色産物へ変換する。いくつかの態様において、レポーターは、細胞における標的タンパク質分解の速度または程度を定量化するために使用される。いくつかの態様において、細胞内または生物内のタンパク質の位置を同定するため、レポーターを他のタンパク質コード配列にインフレームで融合させることができる。
特定のレポーター、および望まれている特徴決定データの種類に依って、レポーターを測定するかまたは定量化するいくつかの異なる方式が存在する。いくつかの態様において、顕微鏡法は、特に、単細胞レベルで、レポーター活性に関する空間的および時間的な情報を入手するための有用な技術であり得る。他の態様において、フローサイトメーターは、大きい細胞集団におけるレポーター活性の分布を測定するために使用され得る。いくつかの態様において、プレートリーダは、経時的に多くの異なる試料の集団平均測定値を得るために使用され得る。他の態様において、フローサイトメーターのために設計されたマルチプレートリーダー、および顕微鏡法とフローサイトメトリー装置との組み合わせのような、そのような様々な機能を組み合わせる器機が使用されてもよい。
蛍光タンパク質は、本明細書に記載されたモジュールまたは生物学的回路走化性コンバータのアウトプットを視覚化するかまたは定量化するための便利な方式である。蛍光は、光の適切な波長によって蛍光タンパク質を励起させるために装備された顕微鏡、プレートリーダ、またはフローサイトメーターを使用して、容易に定量化され得る。いくつかの異なる蛍光タンパク質が利用可能であるため、複数の遺伝子発現測定を平行して行うことができる。蛍光タンパク質の非限定的な例は、表1に提供される。
（表１）蛍光タンパク質レポーターの例
Figure 0006430481
Figure 0006430481
発光はプレートリーダまたは発光カウンターを使用して容易に定量化され得る。細胞はルシフェラーゼの非存在下ではバックグラウンド発光をほとんど乃至全く有しない傾向があるため、ルシフェラーゼは、例えば、低レベルの遺伝子発現を測定する本明細書に記載された様々な態様のため、アウトプット産物として使用され得る。ルシフェラーゼの非限定的な例は、表2に提供される。
（表２）ルシフェラーゼの例
Figure 0006430481
他の態様において、有色基質を生成する酵素は、プレートリーダを含む、吸光度測定値を得ることができる分光光度計またはその他の装置を使用して、定量化され得る。ルシフェラーゼと同様に、βガラクトシダーゼのような酵素は、低いシグナルを増幅する傾向があるため、低レベルの遺伝子発現を測定するために使用され得る。そのような酵素の非限定的な例は、表3に提供される。
（表３）有色基質を生成する酵素の例
Figure 0006430481
本明細書に記載された異なる局面において使用するための他のレポーターアウトプット産物には、フルオレセインA結合（BBa_K157004）が含まれる。
本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、標的タンパク質は、それ自体、転写の活性化因子または抑制因子であり、アウトプット産物配列によるその産生が、細胞の状態のさらなる変化をもたらし、その後のまたは付加的なモジュールまたは生物学的回路走化性コンバータへ付加的なインプットシグナルを提供することができる。転写調節因子は、同族プロモーターからの転写を活性化するかまたは抑制する。転写活性化因子は、典型的には、転写プロモーターの近くに結合し、転写を直接開始するためにRNAポリメラーゼをリクルートする。抑制因子は、転写プロモーターに結合し、RNAポリメラーゼによる転写開始を立体的に妨害する。他の転写調節因子は、結合する場所および細胞条件に依って、活性化因子または抑制因子のいずれかとして機能する。アウトプット産物としての転写調節因子の非限定的な例は、表4に提供される。
（表４）転写調節因子の例
Figure 0006430481
Figure 0006430481
Figure 0006430481
本明細書に記載された様々な局面の他の態様において、選択マーカーをコードする遺伝子が、アウトプット産物配列として使用される。「選択マーカー」とは、本明細書において定義されるように、細胞のような生物学的単位に選択的な有利または不利を付与するタンパク質コード配列をさす。例えば、原核生物選択マーカーの一般的な型は、特定の抗生物質に対する耐性を付与するものである。従って、選択マーカーを保持する細胞は、抗生物質の存在にも関わらず培地中で増殖することができる。例えば、プラスミドのコピーを失った細胞は、抗生物質が補足された培地においてすぐに死滅するかまたは増殖し得ないため、大部分のプラスミドは、細胞の複製および分裂の間にプラスミドが維持されることを確実にするため、抗生物質選択マーカーを含有している。しばしば陽性選択マーカーと呼ばれる、選択マーカーの第二の一般的な型は、細胞にとって毒性のものである。陽性選択マーカーは、クローニングベクターによって形質転換された細胞に対して選択し、インサートを含有しているプラスミドによって形質転換された細胞のみを確保するため、クローニングにおいて頻繁に使用される。選択マーカーアウトプット産物の非限定的な例は、表5に提供される。
（表５）
Figure 0006430481
アウトプット産物配列は、本明細書に記載された合成分解システムとの種々の関係において使用するための酵素をコードすることができる。いくつかの態様において、酵素アウトプットは、特定のインプットに対する応答として使用され得る。例えば、エフェクター剤（例えば、抗生物質）への曝露による、または曝露によらない、標的タンパク質の発現、または反対に、標的タンパク質の誘導可能な分解は、アウトプット遺伝子産物である、毒素を分解するかまたは他の方法で破壊することができる酵素をコードするモジュール構成要素を「オンにする」ことができる。
本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、アウトプット産物配列は、基質の産物への変換を触媒する「生合成酵素」をコードする。例えば、そのような生合成酵素は、特異的なシグナルに応答して、有用な化学物質および材料を生成するかまたは分解する経路を構築するため、モジュールと共にまたはモジュール内で、共に組み合わせられ得る。酵素のこれらの組み合わせは、天然または合成の生合成経路を再構成することができる。これらの酵素は、特殊化学物質、生物燃料、およびバイオレメディエーションにおける適用を有する。
例えば、N-アシルホモセリンラクトン（AHLまたはN-AHL）は、細菌クオラムセンシングに関与するシグナリング分子のクラスである。「クオラムセンシング」とは、集団密度に基づく群ベースの挙動の協調を可能にする細菌間のコミュニケーションの方法をさす。合成生物学において、クオラムセンシングシステムに由来する遺伝子部分は、細菌叢においてパターンを作製し、同調した細胞挙動を達成するために使用されている。AHLは、細胞膜を横切って拡散することができ、ある範囲のpH値において増殖培地中で安定している。AHLはLuxRのような転写活性化因子に結合し、同族プロモーターからの転写を刺激することができる。いくつかの類似したクオラムセンシングシステムが、種々の細菌種に存在する；従って、本明細書に記載されたモジュールおよびタンパク質分解システムのために使用され得る、種々のAHL分子を合成するかまたは分解するいくつかの公知の酵素が存在する。
（表６）AHLの例
Figure 0006430481
合成細胞分解システムとしてまたは合成細胞分解システム内で使用される、本明細書に記載されたタンパク質分解タグ、ならびにプロモーター、転写活性化因子、転写抑制因子、リコンビナーゼ、およびアウトプット産物を含む種々の核酸およびタンパク質構成要素を含む、遺伝子トグルスイッチのような生物学的モジュールも、本明細書に提供される。種々の構成要素およびモジュールを操作し組み合わせる能力は、本明細書に記載された分解システムのインプット応答およびアウトプット応答の柔軟性を提供する。
本明細書中の実施例において証明されるように、本明細書に記載されたタンパク質分解タグは、遺伝子トグルスイッチへ組み入れられ、合成回路におけるプロテアーゼベースの切り替えを可能にすることができる。従って、いくつかの局面において、本明細書に記載された1種以上のタンパク質分解タグを含む遺伝子トグルスイッチが、本明細書に提供される。「遺伝子トグルスイッチ」とは、本明細書において定義されるように、相互に阻害性のネットワークに配置された2種の抑制可能プロモーターから構築され得る、合成のアドレス可能な細胞メモリユニットまたはモジュールをさす。遺伝子トグルスイッチは、頑強な双安定の挙動を示す。「頑丈な双安定の挙動」とは、トグルスイッチが広範囲のパラメータ値において双安定性を示すこと、そして2種の状態が遺伝子発現に固有の変動に対して寛容であること、即ち、遺伝子トグルスイッチがランダムに状態をフリップしないことを意味する。例えば、T.S.Gardner et al.,Nature(2000)403:339-342に記載されるように、最小の条件のセットが満たされる限り、遺伝子トグルスイッチの双安定性は、プロモーターおよび抑制因子の任意のセットによって可能である。
遺伝子トグルスイッチの双安定性は、本明細書に記載されるように、少なくとも2種の抑制因子配列の相互に阻害性の配置から発生する。各抑制因子配列の産物、即ち、抑制因子は、転写レベル、翻訳レベル、またはその組み合わせにおいて、他の抑制因子配列によってコードされた産物の発現を阻害することができる。従って、転写活性化剤のような適切なインプットまたは誘導剤の非存在下では、第1の抑制因子が発現され第2の抑制因子配列の発現を阻害する第1の状態、および第2の抑制因子が発現され第1の抑制因子配列の発現を阻害する第2の状態という2種の安定な状態が可能である。例えば、いくつかの局面において、抑制因子は、転写レベルで作用し、それによって、第1のプロモーター配列が、第2のプロモーター配列に特異的な抑制因子をコードする第1の抑制因子配列の発現を駆動する。第2のプロモーター配列は、第2のプロモーター配列に特異的な抑制因子をコードする第2の抑制因子配列の発現を駆動する。そのような局面において、2種の状態（即ち、第1または第2の抑制因子の発現）の切り替えは、現在不活性のプロモーターに抑制因子が結合するのを防止する剤のような外因性または内因性のインプット剤の存在によって媒介される。そのような態様において、剤は、最初に活性型であったプロモーターを安定的に抑制するまで、反対の抑制因子が最大に転写されることを可能にする。本明細書に記載された局面の他の態様において、遺伝子トグルスイッチにおける抑制因子は、翻訳レベルにおいて作用することができ、それによって、第1の抑制因子が、第2の抑制因子の翻訳を阻害するかもしくは防止するかまたは第2の抑制因子mRNAの分解を引き起こす阻害性RNA分子のような産物をコードする。本明細書に記載された局面の他の態様において、遺伝子トグルスイッチにおける異なる抑制因子は、異なる抑制の機序、即ち、転写的抑制、翻訳的抑制、またはそれらの組み合わせを使用することができる。
本明細書に記載されたこの局面および全てのそのような局面の一つの態様において、遺伝子トグルスイッチは、各プロモーターが他方のプロモーターによって転写された抑制因子によって阻害され得るよう、異なる抑制因子をコードする2種の配列の発現を駆動する2種の異なる抑制可能プロモーター配列を含む。そのような態様において、遺伝子トグルスイッチは、第2の抑制可能プロモーター配列に特異的な抑制因子をコードする第2の抑制因子配列（R2）の転写を駆動する第1の抑制可能プロモーター配列（rP1）、および第1の抑制可能プロモーター配列に特異的な抑制因子をコードする第1の抑制因子配列（R1）の転写を駆動する第2の抑制可能プロモーター配列（rP2）を含む。
いくつかの態様において、遺伝子トグルスイッチは、大腸菌に由来するプラスミドのようなプラスミドにおいて実装される。いくつかの態様において、遺伝子トグルスイッチのプロモーターおよび抑制因子の核酸配列は、単一のプラスミドに含有されているかまたは存在する。他の態様において、遺伝子トグルスイッチのプロモーターおよび抑制因子の核酸配列は、複数のプラスミドに含有されているかまたは存在する。
本明細書に記載されたこの局面および全てのそのような局面の一つの態様において、遺伝子トグルスイッチは、温度感受性λ抑制因子（cIts）の発現を駆動するPtrc-2プロモーター、およびLac抑制因子の発現を駆動するPLs1conプロモーターを含む。そのような態様において、遺伝子トグルは、イソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）のパルスおよび熱パルスによって状態を切り替えられる。例えば、IPTGのパルスは、IPTGがLac抑制因子がPtrc-2プロモーターに結合するのを防止するため、Ptrc-2プロモーターによって駆動されたcItsの発現を可能にする。cItsの発現は、PLs1conプロモーターに結合しそれを抑制することによって、Ptrc-2プロモーターからの転写の状態を維持し、従って、Lac抑制因子発現およびPtrc-2プロモーターの阻害を防止する。対照的に、熱パルスは、cIts抑制因子を阻害し、従って、cItsがPLs1conプロモーターに結合することを防止し、Lac抑制因子の発現を可能にする。Lac抑制因子の発現は、Ptrc-2プロモーターに結合しそれを抑制することによって、PLs1conプロモーターからの転写の状態をさらに維持し、従って、cIts抑制因子発現およびPLs1conプロモーターの阻害を防止する。
本明細書に記載されたこの局面および全てのそのような局面のもう一つの態様において、遺伝子トグルスイッチは、Tet抑制因子（Tet）の発現を駆動するPtrc-2プロモーター、およびLac抑制因子の発現を駆動するPLtetO-1プロモーターを含む。そのような態様において、遺伝子トグルスイッチは、IPTGのパルスまたはアンヒドロテトラサイクリン（aTc）のパルスによって状態を切り替えられる。例えば、IPTGはLac抑制因子がPtrc-2プロモーターに結合するのを防止するため、IPTGのパルスは、Ptrc-2プロモーターによって駆動されるTetの発現を可能にする。Tetの発現は、PLtetO-1プロモーターに結合しそれを抑制することによってPtrc-2プロモーターからの転写の状態を維持し、従って、Lac抑制因子発現およびPtrc-2プロモーターの阻害を防止する。対照的に、アンヒドロテトラサイクリンのパルスは、Tet抑制因子を阻害し、従って、TetがPLtetO-1プロモーターに結合することを防止し、Lac抑制因子の発現を可能にする。Lac抑制因子の発現は、Ptrc-2プロモーターに結合しそれを抑制することによってPLtetO-1プロモーターからの転写の状態をさらに維持し、従って、Tet抑制因子発現およびPLtetO-1プロモーターの阻害を防止する。
本明細書に記載された遺伝子トグルスイッチおよびタンパク質分解システムにおいて使用するため、例えば、T.S.Gardner et al.,Nature(2000)403:339-342に記載されるような、条件の最小のセットを満たす限り、プロモーターおよび抑制因子の任意のセットを使用することが可能である。本発明のいくつかの態様において、遺伝子トグルスイッチにおいて有用なプロモーターは、プロモーターというタイトルのセクションにおいて提示される。
タグを発現しているタンパク質の分解を増強するため、本明細書に記載された遺伝子トグルスイッチおよびタンパク質分解システムにおいて使用するための分解タグ配列も提供される（例えば、本明細書に記載されるmf-Lonプロテアーゼまたはそのバリアントもしくは相同体）。本明細書に記載された遺伝子トグルスイッチおよびタンパク質分解システムによってコードされたタンパク質に分解タグを付加する能力は、モジュールの調節および制御の付加的な層を提供する。本明細書に記載された遺伝子トグルスイッチおよびタンパク質分解システムにおいて使用するためのそのような分解タグ配列の非限定的な例は、表7、表8、またはSEQ ID NO:1〜26に提供される。従って、本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、遺伝子トグルスイッチはタンパク質分解タグ配列を含む。
いくつかの態様において、リボソーム結合部位（RBS）のための配列を付加するかまたは修飾することによって、本明細書に記載された遺伝子トグルスイッチにおいて使用するための転写抑制因子のタンパク質合成の速度を修飾することもできる。いくつかの態様において、RBSは、プロモーター配列の下流、そのプロモーターから転写される転写抑制因子をコードする配列の上流に置かれる。
いくつかの態様において、遺伝子トグルスイッチは、その発現が遺伝子トグルスイッチの状態を反映するかまたは示す、タンパク質またはRNA分子のようなアウトプット産物をコードするアウトプット産物配列（OP）をさらに含むことができる。そのような態様において、遺伝子トグルスイッチは、第2の抑制可能プロモーター配列に特異的な抑制因子をコードする第2の抑制因子配列（R2）の転写を駆動する第1の抑制可能プロモーター配列（rP1）、ならびに第1の抑制可能プロモーター配列に特異的な抑制因子をコードする第1の抑制因子配列（R1）の転写およびアウトプット配列（OP）の転写を駆動する第2の抑制可能プロモーター配列（rP2）を含む。即ち、遺伝子トグルスイッチは、rP1-R2およびrP2-R1-OPを含む。そのような態様において、第2の抑制可能プロモーターが活性型であり、第1の抑制因子およびアウトプット配列を転写している場合、トグルスイッチは「オン」状態にあると見なされる。そのような態様において、アウトプット産物の発現を、二進法においてデジタルアウトプット00000001として考慮することができる。本明細書に記載された様々な局面のいくつかの態様において、トグルスイッチのその組み合わせのデジタルアウトプットが、「オン」状態である遺伝子トグルスイッチの数に依存するよう、特定の遺伝子トグルスイッチの状態を表す異なるアウトプット産物を各々有する複数の遺伝子トグルスイッチが組み合わせられる。
本明細書において使用されるように、「デジタルアウトプット」とは、二進フォーマットで表され得るアウトプットをさす。二進記数法または2進記数法は、2つの記号0および1を使用して数値を表す。より具体的には、通常の2進法は、2を底とした位取り記数法である。ロジックゲートを使用したデジタル電子回路網における実装のため、二進法は、全ての現代のコンピューターによって内部に使用されている。「ビット」とは、本明細書において定義されるように、二進数字である。本発明のモジュールの組み合わせ、例えば、遺伝子トグルスイッチによって表される数値は、「オン」状態である場合に各モジュールに割り当てられる値に依存する。例えば、3個の遺伝子トグルスイッチの組み合わせが使用される本明細書に記載された態様において、遺伝子トグルスイッチが1個も「オン」でない場合、デジタルアウトプットは00000000として表される。1個の遺伝子トグルスイッチが「オン」である、即ち、アウトプット産物を転写している場合、状態は00000001である。2個の遺伝子トグルスイッチが「オン」である場合、状態は00000010である。3個の遺伝子トグルスイッチが全て「オン」である場合、状態は00000011である。「バイト」は、8ビットのコレクションを表す。従って、1バイトは、8ビットのコレクションとして定義されるため、0〜255、即ち、00000000〜11111111の範囲の256の値または状態を表すことができる。
本明細書に記載されるような任意のアウトプット産物を利用することができる。いくつかの態様において、トグルスイッチにおいて、アウトプット産物の発現が2種のプロモーターのうちの一方によってのみ駆動される場合、アウトプット産物はレポータータンパク質またはレポーターRNA分子をコードすることができる。いくつかの態様において、レポータータンパク質は蛍光レポータータンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質である。いくつかの態様において、複数の遺伝子トグルスイッチが組み合わせられる場合、各アウトプット配列は異なるアウトプット産物をコードする。例えば、3個の遺伝子トグルスイッチの組み合わせが組み合わせられる場合、アウトプット産物配列は、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、および赤色蛍光タンパク質をコードすることができるため、3種の蛍光タンパク質全ての発現は、スイッチのその組み合わせのため、00000011のデジタルアウトプットを表す。本明細書に記載されたモジュールのアウトプット産物の検出は、検出されているアウトプット産物の性質に基づき、顕微鏡およびフローサイトメーターのような蛍光検出器、発光検出器、定量的PCR、ウエスタンブロット分析等を含むが、これらに限定されない、当業者に公知の任意の方法を使用して実施され得る。
他の態様において、遺伝子トグルスイッチの各プロモーターは、あるアウトプット産物の発現があるデジタルアウトプットを表し、反対のプロモーターによって駆動されるアウトプット産物の発現が他のデジタルアウトプットを表すよう、アウトプット産物の発現を駆動することができる。即ち、単一の遺伝子トグルスイッチの「オン」および「オフ」の状態は、当業者もしくは使用者によって自由に割り当てられてもよいし、または遺伝子トグルスイッチが構成要素である回路の設計に基づいていてもよい、異なるアウトプット産物の発現によって表される。そのような態様において、どのアウトプット産物発現が、どの状態、即ち、「オン」または「オフ」に相当するかの表記は、当業者によって決定され得る。
本明細書に記載された分解システムにおいて使用するための遺伝子トグルスイッチの範囲および感受性をさらに増強し拡張するため、転写抑制因子のような複数の相互に機能性の抑制因子を含む遺伝子トグルスイッチのライブラリーを作製することが、有用である。従って本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、転写抑制因子および活性化因子のライブラリーを、転写の活性化ドメインおよび抑制ドメインと融合された改変ジンクフィンガータンパク質を使用して、最小のクロスオーバーを有する独特のプロモーターに対してターゲティングすることができる。
そのようなライブラリーを作製するためには、改変ジンクフィンガータンパク質に結合することが既知の配列部位を含有している独特のプロモーターを合成することができる。これらの部位は、各々が少なくとも3 DNA塩基対長である、3個の配列から構成される。各3塩基対配列は、1個のジンクフィンガードメインに結合する。従って、いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子は、各々、全部で9塩基対のDNAの領域を標的とするために3個のジンクフィンガードメインを含有している。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、1である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、2である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、3である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、4である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、5である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、6である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、7である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、8である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、9である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、10である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、11である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、12である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、13である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、14である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、15である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、15である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、17である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、18である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、19である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、20である。いくつかの態様において、完全な改変ジンクフィンガー転写因子において使用されるジンクフィンガードメインの数は、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも100、またはそれ以上である。
影付きの3塩基対配列のために作製されたジンクフィンガープールの代表的な例は、以下：
Figure 0006430481
に示される（ML Maeder et al.,Molecular Cell 2008:31,294-301）。そのようなプールを使用して、合成プロモーターを標的とすることができる、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、またはそれ以上のジンクフィンガーを含有している完全な改変ジンクフィンガータンパク質を選択することができる。
いくつかの態様において、改変ジンクフィンガータンパク質は、例えば、VP16、VP64、p65、Gal4、RNAポリメラーゼのαサブユニット、野生型CRP（アミノ酸残基1〜209）、CRP D1（残基1〜180）、CRP D2（残基137〜190）、CRP D3（残基137〜180）、およびCRP D4（残基151〜168）のための転写活性化ドメインと融合させられる。他の態様において、改変ジンクフィンガータンパク質は、転写抑制因子ドメイン、例えば、SKD、KRAB（Margolin et al.,1994）、SNAG、Kid、Ume6、CRP、SID（Ayer et al.,1996）と融合させられる。従って、改変ジンクフィンガータンパク質は、改変ジンクフィンガータンパク質を適切な転写活性化因子ドメインまたは転写抑制因子ドメインと融合させることによって、本明細書に記載された様々な態様の必要条件に依って、転写活性化因子または転写抑制因子として使用され得る。融合のためジンクフィンガータンパク質および転写活性化ドメインを改変する方法の非限定的な例は、例えば、Kwang-Hee B.et al,Nature Biotechnology 2003:21,p.275-280；R-J Kwon et al.,Biotechnology Letters (2006)28:9-15；P.Blancafort et al.,PNAS,2005,102:33,p.11716-11721；J.T.Stege et al.,The Plant Journal (2002)32,1077-1086；J.Y.Lee et al.,Nucleic Acids Research,2008,36:16；K-S Park et al.,Nature Biotechnology,2003,21:10,p.1208-1214；R.R.Beerli et al.,PNAS,2000,97:4,p.1495-1500；P.Blancafort et al.,Nature Biotechnology 2003:21,p.269-274；D-k Lee,et al.,Genome Res.,2003,13:2708-2716に記述されている。そのような融合改変ジンクフィンガータンパク質の相互機能性は、プロモーター活性がどのような影響を受けるかを決定するため、異なる改変ジンクフィンガー転写因子のコンビナトリアルな付加によって査定され得る。
改変ジンクフィンガーベースの転写因子の協調性を増強するため、いくつかの態様において、改変ジンクフィンガーベースの転写因子を、ロイシンジッパードメインのような二量体化ドメインを使用して、二量体化するためにさらに改変することができる。いくつかの態様において、DNAの骨格および／または塩基と接触することが既知のアミノ酸の部位特異的変異誘発によって、単量体の改変ジンクフィンガータンパク質の親和性を増加させるかまたは減少させることができる。そのような親和性修飾を達成する方法の非限定的な例は、例えば、J.L.Pomerantz,et al.,Biochemistry,1998,37:4,p.965-970およびS.A.Wolfe et al.,Structure,2000,8:7,p.739-750に記述されている。
本明細書に記載された遺伝子トグルスイッチおよびその他のモジュールにおいて使用するため、相互に抑制する転写因子を同定し、双安定性について試験するために、改変ジンクフィンガーベースの転写抑制因子のペアの組み合わせを実施することができる。いくつかの態様において、1種ずつ転写抑制因子を過剰発現させることによって、遺伝子トグルスイッチをフリップする能力を査定することができる。そのような遺伝子トグルスイッチにおける抑制因子間の切り替えの閾値は、例えば、結合効率および抑制効率に影響を与えるため、トグルスイッチのプロモーターを変化させることによって、モジュレートされ得る。
本明細書に記載された分解システムと組み合わせて使用される、プロモーター、転写活性化因子、転写抑制因子、リコンビナーゼ、およびアウトプット産物のような種々の核酸構成要素およびタンパク質構成要素を含む、シングルインベルターゼメモリモジュールのような生物学的モジュールも、本明細書に提供される。種々の構成要素およびモジュールを操作し組み合わせる能力は、本明細書に記載された誘導可能分解システムのインプット応答およびアウトプット応答の柔軟性を提供する。
いくつかの局面において、本明細書に記載された誘導可能分解システムと共に使用するための生物学的モジュールとして「シングルインベルターゼメモリモジュール」が提供される。「シングルインベルターゼメモリモジュール（SIMM）」とは、本明細書において定義されるように、2個の反対方向の同族リコンビナーゼ認識部位の間のDNAを反転させることができるCreおよびflpeのようなリコンビナーゼを使用するメモリの安定的な切り替え可能なビットをさす。本明細書に記載された方法および組成物に関連したSIMMの独特の特色および利点は、同族認識部位とは独立にリコンビナーゼを発現させることによって引き起こされ得る、「漏れやすさ」および反転状態と非反転状態との混合物の両方を欠くそのようなSIMMを設計する能力である。従って、本明細書に記載された生物学的回路走化性コンバータにおけるSIMMの使用は、メモリの維持を可能にし、同族認識部位間のリコンビナーゼを発現させることによって別個の状態を制御し維持する能力を提供する。
最低でも、SIMMは、同族リコンビナーゼ認識部位間に位置するリコンビナーゼ配列を含む核酸ベースのモジュールである。即ち、RRSfor-RC-RRSrev（RRSforは順方向リコンビナーゼ認識部位であり、RCはRRSforおよびRRSrevを認識するリコンビナーゼをコードするリコンビナーゼ配列であり；RRSrevは逆方向リコンビナーゼ認識部位である）。上流プロモーターの活性化の後のリコンビナーゼ発現によって、リコンビナーゼは、同族認識部位間の核酸、即ち、リコンビナーゼ核酸配列の一回の反転またはRRSfor-RCinv-RRSrevを引き起こす。上流プロモーターからのさらなる転写は、センスRNAではなくリコンビナーゼ遺伝子のアンチセンスRNAを与え、従って、さらなるリコンビナーゼタンパク質は産生されない。従って、反転イベントは、分離し、安定しており、反転状態と非反転状態との混合物をもたらさない。SIMMの発現を駆動する上流プロモーターは、上流SIMM内のプロモーター配列、もう一つのモジュール構成要素、同一SIMMの構成要素であってもよいし、または単離されたプロモーター配列であってもよい。
いくつかの局面において、SIMMは上流プロモーター配列をさらに含む。即ち、P-RRSfor-RC-RRSrev（Pはプロモーター配列である）。他の局面において、SIMMは、同族リコンビナーゼ認識部位間に位置するリコンビナーゼ配列を含み、リコンビナーゼ配列の上流に反転した誘導可能プロモーター配列をさらに含む。即ち、RRSfor-iPinv-RC-RRSrev（RRSforは順方向リコンビナーゼ認識部位であり、iPinvは反転したプロモーター配列であり、RCはリコンビナーゼ配列であり、RRSrevは逆方向リコンビナーゼ認識部位である）。上流プロモーターの活性化の後のリコンビナーゼ発現によって、リコンビナーゼは、それ自体をコードする核酸配列、即ち、リコンビナーゼ核酸配列を含む、同族認識部位間のDNAの一回の反転を引き起こす。上流プロモーターからのさらなる転写は、センスRNAではなくリコンビナーゼ遺伝子のアンチセンスRNAを与え、従って、さらなるリコンビナーゼタンパク質は産生されない。さらに、反転したプロモーターは、下流モジュールの構成要素、例えば、もう一つのSIMMの転写を駆動するために適切な方向になる。本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、プロモーターは構成的プロモーターである。本明細書に記載された局面の他の態様において、プロモーターは誘導可能プロモーターである。いくつかの態様において、誘導可能プロモーターは抑制可能プロモーターである。いくつかの態様において、誘導可能プロモーターは活性化剤によって活性化される。
本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、SIMMは、一方向のリコンビナーゼのみならず、メモリをコードするためのリコンビナーゼも使用することができる。いくつかの態様において、リコンビナーゼは同族リコンビナーゼ認識配列間にコードされる。他の態様において、リコンビナーゼは同族リコンビナーゼ認識配列の外側にコードされる。リコンビナーゼが同族リコンビナーゼ認識配列の外側にコードされる態様において、SIMMは、例えば、リコンビナーゼ発現をもたらすインプットが、リコンビナーゼ認識配列の間で一定の反転をもたらし、アウトプットのパルスを生成するために使用されるような、波形ジェネレーターとして使用され得る。そのようなアウトプットは、本明細書に記載されたアウトプット産物のいずれかであり得る。いくつかの態様において、アウトプットは蛍光タンパク質である。
SIMMは、例えば、タンパク質合成のためのmRNA配列の翻訳を増強するため、リコンビナーゼの下流のさらなる転写を防止するため、またはリコンビナーゼ配列が発現された後のリコンビナーゼmRNA配列もしくはタンパク質配列の分解を増強するために付加される、分解タグ配列、リボソーム結合配列、翻訳ターミネーター配列、およびアンチセンス配列を含むが、これらに限定されない、1種以上の構成要素をさらに含むことができる。そのような付加的な「部分」または構成要素は、SIMMのような生物学的モジュールの忠実度および正確さを増強することによって、例えば、生物学的モジュールの数および組み合わせの増加を可能にし、本明細書に記載された生物学的回路走化性コンバータの能力を改善する。
従って、いくつかの態様において、タグを発現しているタンパク質の分解を増強するため、本明細書に記載されたSIMMおよび分解システムにおいて使用するための、タンパク質分解タグ配列も提供される（例えば、本明細書に記載されるmf-Lonプロテアーゼ）。本明細書に記載されたSIMMおよびシステムによってコードされたタンパク質に1種以上の分解タグを付加する能力は、モジュールの調節および制御の付加的な層を提供する。そのような分解タグ配列の非限定的な例は、SEQ ID NO:1〜26に提供される。従って、本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、SIMMは、リコンビナーゼ配列の下流にタンパク質分解タグ配列をさらに含む。即ち、SIMMは、RRSfor-RC-D-RRSrev（Dは分解タグ配列である）を含む。他の態様において、SIMMは、反転したプロモーター配列および分解タグ配列の両方をそれぞれリコンビナーゼ配列の上流および下流にさらに含む。即ち、SIMMは、RRSfor-iPinv-RC-D-RRSrev（iPinvは反転したプロモーター配列であり、Dは分解タグ配列である）を含む。
本明細書に記載された局面の他の態様において、SIMMは、タンパク質合成のためのmRNA配列の効率的で正確な翻訳を促進するため、1個以上のリボソーム結合部位配列（RBS）をさらに含むことができる。RBSは、本明細書に記載された生物学的コンバータスイッチによってコードされたタンパク質またはその他のアウトプットの合成の効率および速度をモジュレートするために有用な構成要素である。本明細書に記載されたSIMMにおいて使用するためのそのようなRBS配列の非限定的な例。従って、これらの局面のいくつかの態様において、SIMMは、リコンビナーゼ配列の上流にリボソーム結合部位をさらに含む。即ち、SIMMは、RRSfor-RBS-RC-RRSrev（RBSはリボソーム結合部位である）を含む。他の局面において、SIMMは、反転したプロモーター配列およびリボソーム結合部位の両方をリコンビナーゼ配列の上流にさらに含む。即ち、SIMMは、RRSfor-iPinv-RBS-RC-RRSrev（iPinvは反転したプロモーター配列であり、RBSはリボソーム結合部位配列である）を含む。
本明細書に記載された局面の他の態様において、上流プロモーター配列による下流の遺伝子またはモジュールの活性化を防止するため、1個以上のターミネーター配列がSIMMに付加されてもよい。ターミネーター配列は、リコンビナーゼの下流のさらなる転写を防止するため、例えば、SIMMのリコンビナーゼをコードする配列の末端に付加され得る。従って、ターミネーター配列は、様々なモジュールの活性化によって駆動される望まれない転写を防止するため、本明細書に記載された方法および組成物と共に有用である。SIMMにおいて使用するためのそのようなターミネーターの非限定的な例は、本明細書に記載される。従って、これらの局面のいくつかの態様において、SIMMは、リコンビナーゼ配列の下流に転写ターミネーター配列をさらに含む。即ち、RRSfor-RC-T-RRSrev（Tはターミネーター配列である）。他の態様において、SIMMは、反転したプロモーター配列およびターミネーター配列の両方をそれぞれリコンビナーゼ配列の上流および下流にさらに含む。即ち、SIMMは、RRSfor-iPinv-RC-T-RRSrev（iPinvは反転したプロモーター配列であり、Tはターミネーター配列である）を含む。
これらの局面のさらなる態様において、SIMMは、リコンビナーゼ配列の上流にリボソーム結合部位を含み、リコンビナーゼ配列の下流にタンパク質分解タグ配列を含む。即ち、SIMMは、RRSfor-RBS-RC-D-RRSrevを含む。いくつかの態様において、SIMMは、さらに、リコンビナーゼ配列の上流に反転したプロモーター配列およびリボソーム結合部位を含み、リコンビナーゼ配列の下流にタンパク質分解タグ配列を含む。即ち、SIMMは、RRSfor-iPinv-RBS-RC-D-RRSrevを含む。これらの局面のいくつかの態様において、SIMMは、リコンビナーゼ配列の下流にタンパク質分解タグ配列および転写ターミネーター配列の両方を含む。即ち、SIMMは、RRSfor-iPinv-RC-D-T-RRSrevを含む。いくつかの態様において、SIMMは、さらに、リコンビナーゼ配列の上流に反転したプロモーター配列を含み、リコンビナーゼ配列の下流にタンパク質分解タグ配列およびターミネーター配列を含む。即ち、SIMMは、RRSfor-iPinv-RC-D-T-RRSrevを含む。これらの局面のいくつかの態様において、SIMMは、さらに、リコンビナーゼ配列の上流にリボソーム結合部位を含み、リコンビナーゼ配列の下流にターミネーター配列を含む。即ち、SIMMは、RRSfor-iPinv-RBS-RC-T-RRSrevを含む。いくつかの態様において、SIMMは、さらに、リコンビナーゼ配列の上流に反転したプロモーター配列およびリボソーム結合部位を含み、リコンビナーゼ配列の下流にターミネーター配列を含む。即ち、SIMMは、RRSfor-iPinv-RBS-RC-T-RRSrevを含む。
これらの局面のいくつかの具体的な態様において、SIMMは、さらに、リコンビナーゼ配列の上流にリボソーム結合部位を含み、リコンビナーゼ配列の下流にタンパク質分解タグおよび転写ターミネーター配列を含むことができる。即ち、RRSfor-iPinv-RBS-RC-D-T-RRSrev。他のそのような態様において、SIMMは、さらに、リコンビナーゼ配列の上流に反転したプロモーター配列およびリボソーム結合部位を含み、リコンビナーゼ配列の下流にタンパク質分解タグおよび転写ターミネーター配列を含む。即ち、SIMMは、RRSfor-iPinv-RBS-RC-D-T-RRSrevを含む。そのような態様において、RBS、転写ターミネーター配列、および分解タグのSIMMへの付加の組み合わせは、SIMMによってコードされたリコンビナーゼの発現を調節し制御する増強された能力を提供する。
本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、SIMMは、さらに、リコンビナーゼmRNAに特異的であるアンチセンスRNA配列を、リコンビナーゼをコードする配列の下流に、それに対して反転した方向で、含むか、または含むよう設計され得る。即ち、RRSfor-RC-asRNAinv-RRSrev（asRNAinvは反転したアンチセンスRNA配列である）。そのような態様において、例えば、上流プロモーターの活性化に応答して、リコンビナーゼタンパク質の発現によって、リコンビナーゼは、リコンビナーゼ配列が反転方向となり、アンチセンスRNAをコードする配列が順方向となるよう、リコンビナーゼ認識部位が隣接しているSIMM内の配列をフリップする。即ち、RRSfor-asRNA-RCinv-RRSrev。反転イベントは、リコンビナーゼ配列のさらなる転写および翻訳を防止し、リコンビナーゼに特異的なアンチセンスRNAをコードする配列の転写は、残存している転写されたリコンビナーゼmRNA配列の分解を増強する。さらなる態様において、SIMMの正確さおよび忠実度を確実にするため、要素の組み合わせによって、リコンビナーゼの発現が調節されるよう、SIMMは、さらに、リコンビナーゼ配列の上流にリボソーム結合部位を含み、リコンビナーゼ配列下流にタンパク質分解タグもしくは転写ターミネーター配列、またはそれらの組み合わせを含むことができる。即ち、RRSfor-RBS-RC-asRNAinv-D-T-RRSrev。
本明細書に記載されたこれらの局面および全てのそのような局面のいくつかの態様において、逆方向リコンビナーゼ認識部位の下流に反転した方向で付加的なプロモーター配列を置くことによって、リセットすることができるよう、SIMMを設計することができる。即ち、RRSfor-RBS-RC-RRSrev-iPinv（iPinvは反転した誘導可能プロモーター配列である）。プロモーターの活性化によって、リコンビナーゼ配列が反転した方向にある場合、そのようなSIMMの状態は、反転した状態から最初の状態にフリップされる。いくつかの態様において、システム内の全てのSIMMの包括的なリセットを実施するために、単一の誘導因子を使用することができるよう、同一の逆方向誘導可能プロモーターを、SIMMのセット全体において使用することができる。
本明細書に記載されたこれらの局面および全てのそのような局面のいくつかの態様において、SIMMは、順方向リコンビナーゼ認識部位配列、反転したプロモーター配列、リボソーム結合部位配列、リコンビナーゼ遺伝子配列、および逆方向リコンビナーゼ認識部位配列、およびアウトプット産物をコードする配列、即ち、RRSfor-Pinv-RC-RRSrev-OP（RRSforは順方向リコンビナーゼ認識配列であり；Pinvは反転したプロモーター配列であり；RCはRRSforおよびRRSrevに特異的なリコンビナーゼをコードするリコンビナーゼ遺伝子配列であり；RRSrevは逆方向リコンビナーゼ認識配列であり、OPはアウトプット産物配列である）を含む。そのような態様において、リコンビナーゼの発現によって、2個のリコンビナーゼ認識部位の間の配列は反転し、リコンビナーゼ発現の終結をもたらし、反転したプロモーター配列がアウトプット遺伝子配列および下流モジュールの発現を駆動する適切な方向にあることを可能にする。いくつかの態様において、プロモーターは誘導可能プロモーターである。いくつかの態様において、誘導可能プロモーターは、抑制可能プロモーター、または活性化剤によって活性化され得るプロモーターである。そのような態様において、SIMMにさらなる調節能力を追加するため、本明細書に記載されるように、SIMMは、分解タグ、リボソーム結合部位、転写ターミネーター配列、およびアンチセンスRNA配列をさらに含むことができる。
本明細書に記載されたこれらの局面および全てのそのような局面の他の態様において、SIMMは、誘導可能プロモーター配列（iP）、順方向リコンビナーゼ認識部位配列（RRSfor）、構成的プロモーターの反転した配列（Pinv）、リコンビナーゼ遺伝子配列（RC）、逆方向リコンビナーゼ認識部位配列（RRSrev）、およびアウトプット産物配列（OP）、即ち、iP-RRSfor-iPinv-RC-RRSrev-OPを含むことができる。そのような態様において、誘導可能プロモーターの活性化は、リコンビナーゼの発現を駆動し、それが、2個のリコンビナーゼ認識部位の間の配列を反転させ、リコンビナーゼ発現の終結をもたらし、反転した構成的プロモーター配列が、アウトプット産物配列および下流モジュール、例えば、1個以上の付加的なSIMMの発現を駆動するために適切な方向にあることを可能にする。いくつかのそのような態様において、逆方向プロモーターの活性化によって、システムの状態が反転した状態から最初の状態にフリップされるよう、SIMMは、逆方向リコンビナーゼ認識部位配列およびアウトプット産物配列の間に反転した方向で付加的な誘導可能プロモーターをさらに含むことができる。即ち、iP-RRSfor-iPinv-RC-RRSrev-iP2,inv-OP。いくつかのそのような態様において、第1および第2の誘導可能プロモーターは、異なる剤によって誘導される。全てのそのような態様において、SIMMは、SIMMの活性化状態および定常状態をさらに調節するため、分解タグ、リボソーム結合部位、転写ターミネーター配列、およびアンチセンスRNA配列のような1種以上の構成要素をさらに含むことができる。
本明細書に記載されたこれらの局面および全てのそのような局面のいくつかの態様において、本明細書に提供された方法および組成物と共に使用するためのSIMMの利用可能性または機能性を増加させるため、1種以上の付加的な構成要素をSIMMに付加することができる。いくつかの態様において、SIMMは、順方向プロモーター配列、順方向リコンビナーゼ認識配列、リボソーム結合部位配列、リコンビナーゼ遺伝子配列、転写ターミネーター配列、反転したアウトプット産物配列、反転したリボソーム結合部位配列、および逆方向リコンビナーゼ認識部位配列、即ち、Pfor-RRSfor-RBS-RC-T-OPinv-RBSinv-RRSrev（Pforは順方向プロモーター配列であり；RRSforは順方向リコンビナーゼ認識配列であり；RBSはリボソーム結合部位配列であり；RCはRRSforおよびRRSrevを認識するリコンビナーゼをコードするリコンビナーゼ遺伝子配列であり；Tは転写ターミネーター配列であり；OPinvはアウトプットとして使用され得る遺伝子の反転した配列であり；RBSinvは反転したリボソーム結合部位配列であり；RRSrevは逆方向リコンビナーゼ認識配列である）を含む。そのような態様において、順方向プロモーター（Pfor）の活性化によって、リコンビナーゼ遺伝子（RC）が発現され、2個のリコンビナーゼ認識配列（RRSforおよびRRSrev）の間の配列の反転を引き起こし、従って、もはや反転した方向にないアウトプット産物配列の発現を可能にする。いくつかの態様において、アウトプット産物配列は転写の抑制因子または活性化因子をコードする。いくつかの態様において、アウトプット産物配列はレポーター遺伝子をコードする。
本明細書に記載されたこれらの局面および全てのそのような局面の他の態様において、順方向プロモーター配列、順方向リコンビナーゼ認識配列、リボソーム結合部位配列、リコンビナーゼ遺伝子配列、リボソーム結合部位配列、アウトプット産物配列、反転したリボソーム結合部位配列、および逆方向リコンビナーゼ認識部位配列、即ち、Pfor-RRSfor-RBS-RC-RBS-OP-RBSinv-RRSrev（Pforは順方向プロモーターであり；RRSforは順方向リコンビナーゼ認識配列であり；RBSはリボソーム結合部位配列であり；RCはRRSforおよびRRSrevを認識するリコンビナーゼをコードするリコンビナーゼ遺伝子配列であり；OPはタンパク質分子またはRNA分子のようなアウトプット産物の配列であり；RBSinvは反転したリボソーム結合部位配列であり；RRSrevは逆方向リコンビナーゼ認識配列である）を含むSIMMが提供される。そのような態様において、順方向プロモーター配列の活性化は、リコンビナーゼおよびアウトプット産物の両方の発現をもたらし、次いで、リコンビナーゼの活性による配列の反転によって、アウトプット産物の発現は中止される。従って、そのような態様において、SIMMは、アウトプット遺伝子産物の発現の単一パルスを作製する。いくつかの態様において、アウトプット産物配列は、転写抑制因子または転写活性化因子をコードする。他の態様において、アウトプット産物配列は、iRNA分子、アンチセンスRNA分子、またはマイクロRNA分子のようなRNA分子をコードする。本明細書に記載されたSIMMにおいて使用するためのアウトプット産物の他の非限定的な例は、レポータータンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、転写因子、転写抑制因子、または原核細胞および哺乳動物細胞におけるリボスイッチのようなRNA分子、ならびに哺乳動物細胞における短いヘアピンRNA、アンチセンスRNA分子、およびマイクロRNA分子である（F.J.Isaacs,Nat Biotechnol 22,841(2004)）。本明細書に記載されたSIMMにおいて使用するためのアウトプット産物のさらなる非限定的な例は、「アウトプット産物」および「RNA分子構成要素およびアウトプット産物」というタイトルのセクションに提供される。
本明細書に記載されたSIMMにおいて使用するためのリコンビナーゼおよび組換え認識配列は、当業者によって決定されるような、リコンビナーゼまたはリコンビナーゼ認識配列の既知のもの、またはバリアント、即ち、改変されたものから選択され得る。本明細書に記載された様々な局面のいくつかの態様において、リコンビナーゼはCreリコンビナーゼであり、リコンビナーゼ認識部位はLoxP部位またはそのバリアントである。代替的な部位特異的リコンビナーゼには、（1）FRT部位およびそのバリアントを認識するサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の2piプラスミドのFlpリコンビナーゼ（Cox (1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4223）；（2）ファージゲノムのattP部位および宿主染色体のattB部位との間の効率的な組換えを実施するストレプトマイセス（Streptomyces）ファージPHI.C31のインテグラーゼ（Groth et al.,2000 Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:5995）；（3）att部位を認識する（Xisを含むかまたは含まない）バクテリオファージλ（λ-int/attP）のIntリコンビナーゼ（Weisberg et al.In:Lambda II,supra,pp.211-250）；（4）28bp dif部位を認識するリコンビナーゼを共に形成する大腸菌のxerCリコンビナーゼおよびxerDリコンビナーゼ（Leslie and Sherratt(1995)EMBO J.14:1561）；（5）接合トランスポゾンTn916由来のIntタンパク質（Lu and Churchward(1994)EMBO J.13:1541）；（6）TpnIおよびβラクタマーゼトランスポゾン（Levesque (1990)J.Bacteriol.172:3745）；（7）Tn3リゾルバーゼ（Flanagan et al.(1989)J.Mol.Biol.206:295およびStark et al.(1989)Cell 58:779）；（8）枯草菌（Bacillus subtilis）のSpoIVCリコンビナーゼ（Sato et al.J.Bacteriol.172:1092）；（9）Hinリコンビナーゼ（Galsgow et al.(1989)J.Biol.Chem.264:10072）；（10）Cinリコンビナーゼ（Hafter et al.(1988)EMBO J.7:3991）；（11）免疫グロブリンリコンビナーゼ（Malynn et al.Cell(1988)54:453）；ならびに（12）FIMBリコンビナーゼおよびFIMEリコンビナーゼ（Blomfield et al.,1997 Mol.Microbiol.23:705）が含まれるが、これらに限定されない。
SIMM内の反転したプロモーター配列は、リコンビナーゼ活性化およびプロモーターの順方向への反転によって、そのSIMMまたはその他の生物学的モジュールの下流構成要素の転写を駆動するために使用され得る。従って、本明細書に記載されたSIMMにおいて使用するための反転したプロモーター配列は、分解システムの必要条件に依って、構成的プロモーターまたは誘導可能プロモーターであり得る。本明細書に記載されたモジュールおよびシステムにおいて使用するためのそのようなプロモーター配列の非限定的な例は、本明細書に提供される。
いくつかの局面において、受容されたインプットシグナルを特異的な「センサー受容体」または「センサー」の発現へ変換する能力を提供する、生物学的回路走化性コンバータが、本明細書に記載された方法および組成物と組み合わせて使用され得る。そのようなセンサーの発現は、天然または合成（例えば、人工）の細胞のような生物学的システムが、走化性シグナルに応答して移動するかまたは遊走するために必要な分子構成要素を活性化することを可能にする。本明細書に記載された生物学的回路走化性コンバータのモジュール性は、コンバータの柔軟性および拡大が、生物学的回路走化性コンバータが応答することができるインプットシグナルの範囲および感受性を変動させることを可能にし、受容された特定のインプットシグナルに依って、発現されるセンサーの数および組み合わせを増加させる。本明細書に記載された生物学的回路走化性コンバータへのインプットシグナルとして作用し得るそのようなシグナルには、フェロモン、ホルモン、増殖因子、代謝物質等のような生物学的剤を含み得る誘導剤の濃度；化学物質、環境副産物、金属イオン、およびその他のそのような分子もしくは剤の濃度；光レベル；温度；機械的ストレス；または電流および電圧のような電気的シグナルが含まれるが、これらに限定されない。例示的な生物学的回路走化性コンバータは、その内容全体が参照によって組み入れられる米国特許出願US 2013/0034907に見出され得る。
生物学的回路走化性コンバータは、例えば、細胞生物における走化性応答を含む、原核細胞、真核細胞、または合成細胞のような細胞システムにおける複雑な挙動表現型の改変において使用され得る。
細菌細胞
本明細書に記載されたタンパク質分解モジュールおよびシステムは、細菌の任意の種と共に使用するために企図される。いくつかの態様において、細菌細胞は、グラム陰性細胞であり、別の態様において、細菌細胞はグラム陽性細胞である。本明細書に記載される方法および組成物による改変のために有用な細菌細胞の種の非限定的な例には、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ならびにシュードモナス、ストレプトマイセス、およびスタフィロコッカスの様々な種に由来する細胞が含まれるが、これらに限定されない。本発明の生物学的回路走化性コンバータと共に使用するために遺伝学的に改変され得る細菌細胞のその他の例には、エルシニア（Yersinia）菌種、エシェリキア（Escherichia）菌種、アシネトバクター菌種、クレブシエラ（Klebsiella）菌種、ボルデテラ（Bordetella）菌種、ラクトコッカス菌種、ナイセリア（Neisseria）菌種、エロモナス（Aeromonas）菌種、フランシエセラ（Franciesella）菌種、コリネバクテリウム（Corynebacterium）菌種、シトロバクター（Citrobacter）菌種、クラミジア（Chlamydia）菌種、ヘモフィルス（Hemophilus）菌種、ブルセラ（Brucella）菌種、マイコバクテリウム（Mycobacterium）菌種、レジオネラ（Legionella）菌種、ロドコッカス（Rhodococcus）菌種、シュードモナス菌種、ヘリコバクター（Helicobacter）菌種、サルモネラ菌種、スタフィロコッカス菌種、ビブリオ菌種、バチルス菌種、およびエリシペロスリクス（Erysipelothrix）菌種に由来する細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、細菌細胞は大腸菌細胞である。他の態様において、細菌細胞はラクトコッカス・ラクティス細胞である。本明細書に記載された合成分解システムによって形質転換されるかまたはトランスフェクトされることができる細胞の生物の他の例には：スタフィロコッカス・アウレウス、枯草菌、酪酸菌（Clostridium butyricum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）、ラクトコッカス・ラクティス、ロイコノストック（Leuconostoc）ラクティス、ストレプトマイセス、アクチノバチルス・アクチノビセタムコミタンス（Actinobacillus actinobycetemcomitans）、バクテロイデス（Bacteroides）、ラン藻（cyanobacteria）、大腸菌、ヘリコバクター・ピロリ（pylori）、セルノモナス・ルミナチウム（Selnomonas ruminatium）、ソンネ菌（Shigella sonnei）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、マイコプラズマ・ミコイデス（mycoides）、またはトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、バチルス・チューリンゲンシス（thuringiensis）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（lugdunensis）、ロイコノストック・オエノス（Leuconostoc oenos）、コリネバクテリウム・キセロシス（xerosis）、ラクトバチルス・プランタルム（plantarum）、フェカリス菌（Streptococcus faecalis）、バチルス・コアギュランス（coagulans）、バチルス・セレタス（ceretus）、バチルス・ポピレ（popillae）、シネコシスティス（Synechocystis）株PCC6803、バチルス・リクファシエンス（liquefaciens）、パイロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi）、セルノモナス・ノミナンチウム（Selnomonas nominantium）、ラクトバチルス・ヒルガーディ（hilgardii）、ストレプトコッカス・フェルス（ferus）、ラクトバチルス・ペントーサス（pentosus）、バクテロイデス・フラギリス（fragilis）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、表皮ブドウ球菌、ザイモモナス・モビリス、ストレプトマイセス・ファエクロモゲネス（phaechromogenes）、ストレプトマイセス・ガネニス（ghanaenis）、ハロバクテリウム（Halobacterium）株GRB、およびハロバフェラックス（Halobaferax）種株Aa2.2が含まれるが、これらに限定されない。
構成要素部分
プロモーター、ならびにプロモーターの誘導剤、活性化剤、および抑制剤
プロモーターも本明細書に提供され、プロモーター配列は、本明細書に記載される標的タンパク質の初期のまたは誘導可能な分解の制御において使用するためのものである。
「プロモーター」という用語は、本明細書において使用されるように、タンパク質またはRNAをコードする異種標的遺伝子であり得る核酸配列の転写を駆動することによって、もう一つの核酸配列の発現を調節する核酸配列をさす。プロモーターは、構成的、誘導可能、抑制可能、組織特異的、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。プロモーターは、核酸配列の残りの部分の転写の開始および速度が制御される核酸配列の制御領域である。プロモーターは、RNAポリメラーゼおよびその他の転写因子のような調節タンパク質および分子が結合することができる遺伝要素も含有することができる。
プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動するかまたは転写を駆動すると言われ得る。「機能的に連結された」、「機能可能に位置付けられた」、「機能可能に連結された」、「制御下」、および「転写制御下」という語句は、プロモーターが、その配列の転写開始および／または発現を制御するため、それが調節する核酸配列に対して正確な機能的な位置および／または方向にあることを示す。「反転したプロモーター」とは、本明細書において使用されるように、コード鎖であったものが非コード鎖となったか、その逆のような、核酸配列が逆方向にあるプロモーターをさす。反転したプロモーター配列は、モジュールまたはスイッチの状態を調節するため、本発明の様々な態様において使用され得る。さらに、本発明の様々な態様において、プロモーターは、プロモーターの下流の核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性の調節配列をさす「エンハンサー」と共に使用され得る。エンハンサーは、プロモーターおよび／またはコードされた核酸の前または後の任意の機能的な位置に位置し得る。
プロモーターは、所定の遺伝子または配列のコードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する5'非コード配列を単離することによって入手され得るような、遺伝子または配列に天然に関連したものであり得る。そのようなプロモーターは「内因性」と呼ばれ得る。同様に、いくつかの態様において、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する核酸配列に天然に関連したものであり得る。
あるいは、機能的に連結されているコードされた核酸配列に天然環境において通常関連していないプロモーターをさす「組換えプロモーター」または「異種プロモーター」の制御下に、コード核酸セグメントを位置付けることによって、ある種の利点が獲得される。組換えまたは異種のエンハンサーとは、天然環境において所定の核酸配列に通常関連していないエンハンサーをさす。そのようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー；他の原核細胞、ウイルス細胞、または真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー；ならびに「天然に存在」しない、即ち、当技術分野において公知である遺伝子工学の方法を通して、異なる転写調節領域の異なる要素および／または発現を変更する変異を含み得る、合成のプロモーターまたはエンハンサーが含まれ得る。本明細書に開示された生物学的コンバータスイッチおよびモジュールに関して、プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列の合成的な作製に加えて、PCRを含む組換えクローニングおよび／または核酸増幅のテクノロジーを使用して、プロモーター配列を作製することができる（例えば、参照によって各々本明細書に組み入れられる米国特許第4,683,202号、米国特許第5,928,906号を参照のこと）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体等のような非核細胞小器官における配列の転写および／または発現を指図する制御配列も、同様に利用し得ることが企図される。
誘導可能プロモーター
本明細書に記載されるように、「誘導可能プロモーター」とは、誘導因子または誘導剤の存在下にある場合、それらによって影響を受けた場合、またはそれらと接触した場合、転写活性を開始するかまたは増強することを特徴とするものである。「誘導因子」または「誘導剤」とは、本明細書において定義されるように、誘導可能プロモーターから転写活性を誘導する活性を有するよう投与される、内因性の、または通常外因性の、化合物またはタンパク質であり得る。いくつかの態様において、誘導因子または誘導剤、即ち、化学物質、化合物、またはタンパク質は、それ自体、核酸配列の転写または発現の結果であり得（即ち、誘導因子はもう一つの構成要素またはモジュールによって発現された転写抑制因子タンパク質であり得）、その核酸配列は、それ自体、誘導可能プロモーターの制御下にあり得る。いくつかの態様において、誘導可能プロモーターは、抑制因子のようなある種の剤の非存在下で誘導される。誘導可能プロモーターの例には、テトラサイクリン、メタロチオネイン、エクジソン、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；およびマウス乳癌ウイルス末端反復配列（MMTV-LTR））、ならびにその他のステロイド応答プロモーター、ラパマイシン応答プロモーター等が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載された生物学的回路走化性コンバータ、システム、および方法において有用な誘導可能プロモーターは、原核宿主生物および真核宿主生物の両方において機能することができる。本明細書に記載された異なる局面のいくつかの態様において、他の生物に由来する誘導可能プロモーター、および原核生物宿主または真核生物宿主において機能するよう設計された合成プロモーターが使用されてもよいが、哺乳動物誘導可能プロモーターが含まれる。本明細書に記載された誘導可能プロモーターの一つの重要な機能的特徴は、環境誘導因子のような外部から適用された誘導因子への曝露による最終的な誘導可能性である。例示的な環境誘導因子には、熱への曝露（即ち、熱パルスまたは一定の熱曝露）、様々なステロイド化合物、（Cu2+およびZn2+を含む）二価カチオン、ガラクトース、テトラサイクリン、IPTG（イソプロピル-β-Dチオガラクトシド）、ならびにその他の天然に存在するかまたは合成の誘導剤および無償性誘導物質が含まれる。
本明細書に記載される合成分解システムと共に使用するためのプロモーターは、一部分、2種の機序のいずれかによる原核生物プロモーターまたは真核生物プロモーターの誘導可能性を包含する。これらの局面のいくつかの態様において、本明細書に記載されたシステムは、環境誘導因子に頼る転写活性化因子に依存性であり得る適当な誘導可能プロモーターを含む。他の態様において、誘導可能プロモーターは、転写抑制因子によって抑制され得、転写抑制因子は、それ自体、もう一つのプロモーターによって駆動された配列の産物のような環境誘導因子によって不活化される。従って、他に特記されない限り、誘導可能プロモーターは、転写活性化因子を正に活性化する誘導剤によって誘導されるもの、または転写抑制因子を負に調節する誘導剤によって抑制解除されるものであり得る。本明細書に記載された様々な局面のそのような態様において、活性化誘導剤と抑制誘導剤とを識別することが必要とされる場合、明示的な区別がなされるであろう。
本明細書に開示された生物学的回路走化性コンバータおよび使用法において有用な誘導可能プロモーターには、環境誘導剤の作用による誘導を受ける潜在型の転写活性化因子の作用によって制御されるものが含まれる。いくつかの非限定的な例には、酵母ACE1転写活性化因子による銅依存性の活性化を受ける酵母遺伝子CUP1、CRS5、およびSOD1の銅によって誘導可能なプロモーターが含まれる（例えば、Strain and Culotta,1996；Hottiger et al.,1994；Lapinskas et al.,1993；およびGralla et al.,1991を参照すること）。あるいは、ACE1転写活性化因子（Lapinskas et al.,1993）と無関係に作動する（細胞質カタラーゼTをコードする）酵母遺伝子CTT1の銅によって誘導可能なプロモーターが利用され得る。これらの遺伝子の効率的な誘導のために必要とされる銅濃度は、適当に低いため、酵母細胞およびショウジョウバエ細胞を含む大部分の細胞システムによって許容され得る。あるいは、以下のものを含む、その他の天然に存在する誘導可能プロモーターが、本発明において使用され得る：ステロイドによって誘導可能な遺伝子プロモーター（例えば、Oligino et al.(1998)Gene Ther.5:491-6を参照すること）；酵母に由来するガラクトースによって誘導可能なプロモーター（例えば、Johnston(1987)Microbiol Rev 51:458-76；Ruzzi et al.(1987)Mol Cell Biol 7:991-7を参照すること）；および様々な熱ショック遺伝子プロモーター。多くの真核生物転写活性化因子が、広範囲の真核生物宿主細胞において機能することが示されているため、例えば、酵母において同定された誘導可能プロモーターの多くも、哺乳動物宿主細胞において使用するために同様に適応し得る。例えば、GAL4結合部位を含有している哺乳動物プロモーターを誘導するGAL4-エストロゲン受容体融合タンパク質に基づく、哺乳動物細胞のための独特の合成転写誘導システムが開発されている（Braselmann et al.(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90:1657-61）。特異的な誘導因子に依存性の転写活性化因子に対して応答性のこれらおよびその他の誘導可能プロモーターは、本明細書に記載された生物学的回路走化性コンバータと共に使用するために適当である。
本明細書に記載された生物学的回路走化性コンバータ、使用法、およびシステムにおいて有用な誘導可能プロモーターには、環境的な外部剤またはもう一つの遺伝子の産物の作用による不活化を受ける「転写抑制因子」によって抑制されるものも含まれる。本明細書に記載された生物学的スイッチコンバータの所定のモジュールまたは構成要素において他の型のプロモーターを識別することが必要とされる場合、そのような誘導可能プロモーターは「抑制可能プロモーター」とも名付けられ得る。例には、適切な抑制因子結合オペレーター配列を組み入れるために改変された真核生物プロモーターを転写的に抑制することができる原核生物抑制因子分子が含まれる。本明細書に記載されたモジュールおよび方法において使用するための好ましい抑制因子は、生理学的に良性の剤による不活化に感受性である。従って、lac抑制因子タンパク質が、lacOオペレーター配列を含有するよう改変されたプロモーター配列の発現を制御するために使用される場合、IPTGによる宿主細胞の処理は、lacOオペレーター配列を含有している改変されたプロモーターからのlac抑制因子の解離を引き起こし、転写が起こることを可能にするであろう。同様に、tet抑制因子が、tetOオペレーター配列を含有するよう改変されたプロモーター配列の発現を制御するために使用される場合、テトラサイクリンによる宿主細胞の処理は、改変されたプロモーターからのtet抑制因子の解離を引き起こし、改変されたプロモーターの下流配列の転写が起こることを可能にするであろう。
本明細書に記載される方法およびシステムと共に有用な誘導可能プロモーターは、pHの変化、温度、放射線、浸透圧、塩勾配、細胞表面結合、および1種以上の外的または内的な誘導剤の濃度のような1種以上の生理学的条件によって誘導され得る。外的な誘導因子または誘導剤には、アミノ酸およびアミノ酸類似体、糖および多糖、核酸、タンパク質転写の活性化因子および抑制因子、サイトカイン、毒素、石油ベースの化合物、金属含有化合物、塩、イオン、酵素基質アナログ、ホルモン、ならびにそれらの組み合わせが含まれ得る。具体的な態様において、誘導可能プロモーターは、化学物質の濃度の変化、金属、温度、放射線、栄養素、またはpHの変化のような、環境条件の変化に応答して活性化されるかまたは抑制される。従って、本明細書に記載される方法およびシステムにおいて有用な誘導可能プロモーターは、ファージによって誘導可能なプロモーター、栄養素によって誘導可能なプロモーター、温度によって誘導可能なプロモーター、放射線によって誘導可能なプロモーター、金属によって誘導可能なプロモーター、ホルモンによって誘導可能なプロモーター、ステロイドによって誘導可能なプロモーター、ならびに／またはそれらのハイブリッドおよび組み合わせであり得る。
ある種の態様において、遺伝子発現がUVまたはX線のような電離放射線への曝露によって細胞において局所的に誘導される場合、電離放射線によって誘導可能なプロモーターを使用することができる。放射線によって誘導可能なプロモーターには、fosプロモーター、c-junプロモーター、またはEgr-1プロモーターの少なくとも1個のCArGドメインの非限定的な例が含まれる。誘導可能プロモーターのさらなる非限定的な例には、エストロゲン遺伝子プロモーター等のような、シトクロムP450遺伝子、誘導可能熱ショックタンパク質遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、ホルモンによって誘導可能な遺伝子のような遺伝子に由来するプロモーターが含まれる。さらなる態様において、本明細書に記載された方法およびシステムにおいて有用な誘導可能プロモーターは、Zn2+メタロチオネインプロモーター、メタロチオネイン1プロモーター、ヒトメタロチオネインIIAプロモーター、lacプロモーター、lacOプロモーター、マウス乳癌ウイルス初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、トリオースデヒドロゲナーゼプロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、サルウイルス40初期プロモーター、またはレトロウイルス脊髄増殖性肉腫ウイルスプロモーターであり得る。誘導可能プロモーターの例には、哺乳動物プロバシンプロモーター、ラクトアルブミンプロモーター、GRP78プロモーター、または細菌のテトラサイクリンによって誘導可能なプロモーターも含まれる。他の例には、ホルボールエステル、アデノウイルスE1A要素、インターフェロン、および血清によって誘導可能なプロモーターが含まれる。
インビボ使用のため、本明細書に記載された分解タグおよびシステムと組み合わせて有用な誘導可能プロモーターには、明確な動物組織に一般的に見られるもののような、生物学的に適合性の剤に対して応答性のものが含まれ得る。一例は、腫瘍壊死因子によって誘導可能であるヒトPAI-1プロモーターである。さらなる適当な例には、様々な毒素およびその他の剤によって誘導可能なシトクロムP450遺伝子プロモーター；様々なストレスによって誘導可能な熱ショックタンパク質遺伝子；エストロゲン遺伝子プロモーターのようなホルモンによって誘導可能な遺伝子等が含まれる。
本明細書に記載される誘導因子または抑制因子の投与または除去は、機能的に連結された異種標的遺伝子の転写の「オン」状態と「オフ」状態との間のスイッチをもたらす。従って、本明細書において定義されるように、核酸配列に機能的に連結されたプロモーターの「オン」状態とは、プロモーターが機能的に連結された核酸配列の転写を活発に駆動している、即ち、連結された核酸配列が発現される状態をさす。いくつかの低分子リガンドは、組織培養細胞および／またはトランスジェニック動物モデルのいずれかにおいて、調節された遺伝子発現を媒介することが示されている。これらには、FK1012およびラパマイシン免疫抑制薬（Spencer et al.,1993；Magari et al.,1997）、プロゲステロンアンタゴニストミフェプリストン（RU486）（Wang,1994；Wang et al.,1997）、テトラサイクリンシステム抗生物質誘導体（Gossen and Bujard,1992；Gossen et al.,1995；Kistner et al.,1996）、ならびに昆虫ステロイドホルモンエクジソン（No et al.,1996）が含まれる。これらの参照は、全て、参照によって本明細書に組み入れられる。さらなる例として、Yaoは、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第6,444,871号において、tet抑制因子タンパク質が哺乳動物細胞における転写をモジュレートすることが公知のポリペプチドと融合されているシステムである、テトラサイクリン耐性（tet）オペロンに関連した原核生物要素を開示している。次いで、融合タンパク質は、tetオペレーター配列の位置付けによって特異的な部位に差し向けられる。例えば、tet抑制因子は、トランス活性化因子（VP16）と融合させられ、選択された遺伝子のプロモーターから上流に位置付けられたtetオペレーター配列にターゲティングされた（Gussen et al.,1992；Kim et al.,1995；Hennighausen et al.,1995）。融合タンパク質のtet抑制因子部分は、オペレーターに結合して、それによって、転写の誘導が望まれる特異的な部位にVP16活性化因子をターゲティングする。別のアプローチは、tet抑制因子をKRAB抑制因子ドメインと融合させ、遺伝子の数百塩基対上流に置かれたオペレーターにこのタンパク質をターゲティングすることであった。このシステムを使用して、キメラタンパク質は、CMVによって調節される遺伝子発現の10〜15倍の抑制を生じることができるが、tet抑制因子単独ではそれができないことが見出された（Deuschle et al.,1995）。
本明細書に開示されるモジュールおよび生物学的回路走化性コンバータにおいて有用な抑制可能プロモーターの一例は、3種の異なるアプローチによって遺伝子発現を調節するために使用されている大腸菌のLac抑制因子（lacR）／オペレーター／誘導因子システムである：（1）プロモーター部位における適切に置かれたlacオペレーターによる転写開始の防止（Hu and Davidson,1987；Brown et al.,1987；Figge et al.,1988；Fuerst et al.,1989；Deuschle et al.,1989）；（2）LacR/オペレーター複合体による伸長の間の転写中のRNAポリメラーゼIIの阻止（Deuschle et al.(1990)）；および（3）LacRと単純ヘルペスウイルス（HSV）ビリオンタンパク質16（VP16）の活性化ドメインとの間の融合物に対して応答性のプロモーターの活性化（Labow et al.,1990；Baim et al.,1991）。Lacシステムの一つのバージョンにおいて、lacオペレーターに連結された配列の発現は、LacR-VP16融合タンパク質によって構成的に活性化され、イソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）の存在下でオフにされる（Labow et al.(1990)（前記引用））。システムのもう一つのバージョンにおいて、細胞の温度を増加させることによって増強され得る、IPTGの存在下でlacオペレーターに結合するlacR-VP16バリアントが使用される（Baim et al.(1991)（前記引用））。従って、本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、Lacシステムの構成要素が利用される。例えば、lacオペレーター（LacO）は、組織特異的プロモーターに機能的に連結され得、異種標的遺伝子、およびTetRのようなもう一つの抑制因子タンパク質の転写および発現を制御する。従って、異種標的遺伝子の発現は、システムにおけるLac抑制因子の発現または存在と比較して、逆に調節される。
やはり真核細胞において機能することが見出され、遺伝子発現を調節するために使用されている大腸菌のテトラサイクリン（Tc）耐性システムの構成要素も、本明細書に記載された様々な局面において使用され得る。例えば、テトラサイクリンの非存在下でtetオペレーター（tetO）配列に結合し、遺伝子転写を抑制するTet抑制因子（TetR）が、tetオペレーター配列を含有しているプロモーターからの転写を抑制するために十分に高い濃度で、植物細胞において発現させられた（Gatz,C.et al.(1992)Plant J.2:397-404）。本明細書に記載されたいくつかの態様において、Tet抑制因子システムが同様に利用される。
VP16トランス活性化因子と融合された熱ショック応答調節因子rheAを有する融合タンパク質の形態で低温によって誘導可能なトランス活性化因子を含む例示的なTIGRシステム（Weber et al,.2003a）のような、温度または熱によって誘導可能な遺伝子調節システムも、本明細書に記載された分解タグ、システム、および方法と共に使用され得る。この融合サーモセンサーに応答性のプロモーターには、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターの最小バージョンのような、ミニマルプロモーターに機能的に連結されたrheO要素が含まれる。37℃の許容温度において、低温によって誘導可能なトランス活性化因子は、例示的なrheO-CMVminプロモーターをトランス活性化して、標的遺伝子の発現を可能にする。41℃において、低温によって誘導可能なトランス活性化因子は、もはやrheOプロモーターをトランス活性化しない。熱ショック遺伝子（例えば、hsp20-30、hsp27、hsp40、hsp60、hsp70、およびhsp90）の熱応答要素を含むが、これらに限定されない、そのような熱によって誘導可能であるかまたは熱によって調節されるプロモーターは、本明細書に記載されたモジュール、生物学的回路走化性コンバータ、および方法に従って使用され得る。Easton et al.(2000)Cell Stress Chaperones 5(4):276-290；Csermely et al.(1998)Pharmacol Ther 79(2):129-1 68；Ohtsuka & Hata(2000)lnt J Hyperthermia 16(3):231-245；ならびにそれらに引用された参照を参照すること。熱ショックタンパク質および熱応答プロモーター要素との配列類似性が、他の機能に関して最初に特徴決定された遺伝子においても認識されており、熱誘導可能性を付与するDNA配列は、開示された遺伝子治療ベクターにおいて使用するために適当である。例えば、グルコース応答遺伝子（例えば、grp94、grp78、モルタリン（mortalin）/grp75）（Merrick et al.(1997)Cancer Lett 119(2):185-1 90；Kiang et al.(1998)FASEB J 12(14):1571-16-579）、カルレティキュリン（Szewczenko-Pawlikowski et al.(1997)MoI Cell Biochem 177(1-2):145-1 52）；クラスタリン（Viard et al.(1999)J Invest Dermatol 112(3):290-296；Michel et al.(1997)Biochem J 328(Ptl):45-50；Clark & Griswold (1997)J Androl 18(3):257-263）、組織適合性クラスI遺伝子（HLA-G）（Ibrahim et al.(2000)Cell Stress Chaperones 5(3):207-218）、およびアミロイド前駆タンパク質のクニッツプロテアーゼアイソフォーム（Shepherd et al.(2000)Neuroscience 99(2):31 7-325）の発現は、熱に応答してアップレギュレートされる。クラスタリンのケースにおいては、熱誘導可能性のために十分な14塩基対要素が解明されている（Michel et al.(1997)Biochem J 328(Pt1):45-50）。同様に、カルレティキュリンプロモーター領域の10塩基対要素および14塩基対要素を含む2種の配列単位は、熱誘導性を付与することが示されている（Szewczenko-Pawlikowski et al.(1997)MoI Cell Biochem 177(1-2):145-1 52）。
本明細書に記載された局面の様々な態様において有用なその他の誘導可能プロモーターには、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、およびロキシスロマイシンのようなマクロライドシステム抗生物質に応答性の抑制可能（Eoff）システムおよび誘導可能（Eon）システムを有している大腸菌に由来するエリスロマイシン耐性レギュロンが含まれる（Weber et al.,2002）。Eoffシステムは、エリスロマイシン依存性のトランス活性化因子を利用し、マクロライドシステム抗生物質の提供がトランスジーン発現を抑制する。Eonシステムにおいては、オペレーターへの抑制因子の結合が、トランスジーン発現の抑制をもたらす。そこでは、マクロライドの存在下で、遺伝子発現が誘導される。
Fussenegger et al.(2000)は、（例えば、プリスチナマイシン、ヴァージニアマイシン、およびシナシッドのような）ストレプトグラミン型抗生物質に応答性である、ストレプトマイセス・セリカラー（coelicolor）のストレプトグラミン耐性オペロンによってコードされたPip（プリスチナマイシンによって誘導されるタンパク質）抑制因子を使用した抑制可能システムおよび誘導可能システムを記載している。Pip DNA結合ドメインは、例えば、VP16トランス活性化ドメインまたはKRABサイレンシングドメインと融合させられる。例えば、プリスチナマイシンの存在または欠如は、そこに記載されるように、それぞれの様式で、PipONシステムおよびPipOFFシステムを調節する。
本明細書に記載されたモジュールおよび生物学的回路走化性コンバータのために有用なプロモーター発現システムのもう一つの例は、（標的レギュロンの抑制解除をもたらすオペレーター部位への抑制因子の結合を防止する拡散可能シグナル分子を有する特定の原核生物分子コミュニケーションシステムをさす）クオラムセンシングシステムを利用する。例えば、Weberら（2003b）は、融合タンパク質が結合するそれぞれのオペレーターを有するキメラプロモーターを調節するトランス活性化ドメインと共にストレプトマイセス・セリカラーのクオラムセンシング受容体を含む融合タンパク質を利用する。その発現は、SCB1およびMP133のような非毒性ブチロラクトンによって微調整される。
いくつかの態様において、相互に機能的に適合性の多重調節された多重遺伝子発現システムが、本明細書に記載された局面において利用され得る（例えば、Kramer et al.(2003)を参照すること）。例えば、Weber et al.(2002)において、マクロライド応答エリスロマイシン耐性レギュロンシステムが、ストレプトグラミン（PIP）によって調節される発現システムおよびテトラサイクリンによって調節される発現システムと共に使用されている。
非熱刺激に応答性のその他のプロモーターも使用され得る。例えば、モルタリンプロモーターは、低線量の電離放射線によって誘導され（Sadekova(1997)lnt J Radiat Biol 72(6):653-660）、hsp27プロモーターは、17-βエストラジオールおよびエストロゲン受容体アゴニストによって活性化され（Porter et al.(2001)J MoI Endocrinol 26(1):31-42）、HLA-Gプロモーターは、アルセナイトによって誘導され、hspプロモーターは、光線力学的治療によって活性化され得る（Luna et al.(2000)Cancer Res 60(6):1637-1 644）。適当なプロモーターは、組織特異的活性化のような因子を組み入れることができる。例えば、hsp70は、ストレスを受けた神経芽細胞腫細胞において転写的に損なわれ（Drujan & De Maio (1999)12(6):443-448）、モルタリンプロモーターは、ヒト脳腫瘍においてアップレギュレートされる（Takano et al.(1997)Exp Cell Res 237(1):38-45）。本発明の方法において利用されるプロモーターは、例えば、モルタリン（Takano et al.(1997)Exp Cell Res 237(1):38-45）、hsp27およびカルレティキュリン（Szewczenko-Pawlikowski et al.(1997)MoI Cell Biochem 177(1-2):145-1 52；Yu et al.(2000)Electrophoresis 2 1(14):3058-3068）、grp94およびgrp78（Gazitet al.(1999)Breast Cancer Res Treat 54(2):135-146）、ならびにhsp27、hsp70、hsp73、およびhsp90（Cardillo et al.(2000)Anticancer Res 20(6B):4579-4583；Strik et al.(2000)Anticancer Res 20(6B):4457-4552）について記載されたように、腫瘍細胞において選択的なアップレギュレーションを示し得る。
本明細書に記載されるように、遺伝子トグルスイッチのような本明細書に記載されたシステムのモジュール構成要素のプロモーターは、機能的に連結されたリコンビナーゼ、抑制因子、またはアウトプット産物の発現を駆動し、従って、リコンビナーゼ、抑制因子、またはアウトプット産物の発現および結果的な活性を調節することができる。本明細書に記載された様々な局面のいくつかの態様において、プロモーター配列は、遺伝子ネットワークの活性化、または栄養素、毒素、代謝物質への曝露、または環境曝露のような、生理学的なイベントおよび刺激を計数しインプットするため、細胞分解システムに添加される。
本明細書に記載された様々な局面のいくつかの態様において、利用されるプロモーター配列は、1種以上の化学的誘導因子を使用して、分解システムの1種以上の構成要素の発現の制御を可能にする誘導可能プロモーターである。
修飾型pdtに対する抗体
いくつかの態様において、本明細書に記載される修飾型pdtまたは同族プロテアーゼに対する抗体試薬を使用しかつ／または生成することが望ましい。一つの態様において、抗体試薬は、本明細書に記載されるタンパク質分解タグの未修飾領域に対するものである。そのような抗体試薬は、例えば、ウエスタンブロットのようなイムノブロッティング技術を使用して、タグ化タンパク質の定量化を可能にするために企図される。本明細書に記載されるpdt、修飾型pdt、またはそれらのバリアントもしくは相同体に対する抗体試薬は、免疫組織化学または免疫蛍光によってタグ化タンパク質の細胞位置を決定するために使用され得る。
本明細書において使用されるように、「抗体試薬」という用語は、少なくとも1個の免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、所定の抗原（例えば、本明細書に記載される修飾型または未修飾のタンパク質分解タグ）に特異的に結合するタンパク質をさす。例えば、抗体は、重（H）鎖可変領域（本明細書においてVHと略記される）および軽（L）鎖可変領域（本明細書においてVLと略記される）を含み得る。もう一つの例において、抗体は、2個の重（H）鎖可変領域および2個の軽（L）鎖可変領域を含む。「抗体試薬」という用語には、完全抗体のみならず、抗体の抗原結合断片（例えば、単鎖抗体、Fab断片およびsFab断片、F(ab')2、Fd断片、Fv断片、scFv、ならびにドメイン抗体（dAb）断片（de Wildt et al.,Eur J.Immunol.1996;26(3):629-39）が包含される。抗体は、IgA、IgG、IgE、IgD、IgM（ならびにそれらのサブタイプ）の構造的特色を有し得る。抗体は、霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類）抗体および霊長類化抗体を含む、任意の起源に由来するものであり得る。VH領域およびVL領域は、「フレームワーク領域」（「FR」）と名付けられたより保存されている領域が散在する、「相補性決定領域」（「CDR」）と呼ばれる超可変性の領域へさらに細分され得る。フレームワーク領域およびCDRの範囲は、正確に定義されている（Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242およびChothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917を参照すること；カバットの定義が本明細書において使用される）。VHおよびVLは、各々、典型的には、以下の順にアミノ末端からカルボキシ末端に配置された3個のCDRおよび4個のFRから構成される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗体の1個以上の領域は、ヒトまたは事実上ヒトであり得る。例えば、可変領域のうちの1個以上が、ヒトまたは事実上ヒトであり得る。例えば、CDRのうちの1個以上が、ヒト、例えば、HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2、およびLC CDR3であり得る。フレームワーク領域のうちの1個以上が、ヒト、例えば、HCまたはLCのFR1、FR2、FR3、およびFR4であり得る。例えば、免疫グロブリンの可変ドメイン、定常領域、定常ドメイン（CH1、CH2、CH3、CL1）、または完全抗体の少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％が、ヒトまたは事実上ヒトであり得る。完全ヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンの重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックなマウスを免疫感作することによっても調製され得る。これらのマウス（例えば、XENOMOUSE（商標）（Abgenix）、HUMAB-MOUSE（商標）（Medarex/GenPharm））の免疫感作の後、標準的なハイブリドーマテクノロジーに従ってモノクローナル抗体を調製することができる。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、従って、ヒトへ投与された場合にヒト抗マウス抗体（HAMA）応答を誘発しないであろう。「抗原結合断片」という用語は、関心対象の標的に特異的に結合する能力を保持する、全長抗体の1個以上の断片をさすため、本明細書において使用される。全長抗体の「抗原結合断片」という用語に包含される結合断片の例には、（i）VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン、およびCH1ドメインからなる1価の断片、Fab断片；（ii）ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結された2個のFab断片を含む2価の断片、F(ab')2断片；（iii）VHドメインおよびCH1ドメインからなるFd断片；（iv）抗体の単一アームのVLドメインまたはVHドメインからなるFv断片、（v）VHドメインまたはVLドメインからなるdAb断片（Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546）；ならびに（vi）特異的な抗原結合機能性を保持する単離された相補性決定領域（CDR）が含まれる。さらに、Fv断片の2個のドメインVLおよびVHは、別々の遺伝子によってコードされるが、単鎖Fv（scFv）として公知の1価の分子が形成されるよう、VL領域およびVH領域が対となった単一タンパク質鎖としてそれらを作成することを可能にする合成リンカーによって、組換え法を使用して、それらを接合することができる。例えば、米国特許第5,260,203号、第4,946,778号、および第4,881,175号；Bird et al.(1988)Science 242:423-426；ならびにHuston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883を参照すること。抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を含む任意の適切な技術を使用して入手され得る。「単一特異性抗体」という用語は、特定の標的、例えば、エピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す抗体をさす。この用語には、本明細書において使用されるように、抗体が生成された方法に関係なく、単一分子組成の抗体またはそれらの断片の調製物をさす「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」が含まれる。タンパク質分析のために使用される抗体試薬は、とりわけ、AbCam（Cambridge,MA）、New England Biolabs（Ipswich,MA）、Santa Cruz Biotechnologies（Santa Cruz,CA）、およびCell Signaling（Danvers,MA）を含む商業的な供給元を通して広く入手可能である。当業者に公知の方法によって、ポリペプチドまたはポリペプチドの一部に対して、抗体および抗体試薬を作製することもできる。抗体は、遺伝子産物またはそれらの断片（例えば、PSAまたはPSMA）による免疫感作によって、ウサギまたはマウスのような動物において容易に作製される。免疫感作されたマウスは、ハイブリドーマの製造のためのB細胞の起源を提供するために特に有用であり、ハイブリドーマが、大量のモノクローナル抗体を産生するよう培養される。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が、本明細書に記載された方法において使用され得るが、条件が特定のタンパク質に対する増加した特異性を必要とする場合には、モノクローナル抗体が使用されることが好ましい。ファージディスプレイも、本明細書に記載された方法およびアッセイのために有用な抗体試薬を同定するために特に有効であり得る。簡単に説明すると、従来の手法を使用して、4〜約80アミノ酸残基のインサートをディスプレイするファージライブラリーを（例えば、m13、fd、λファージを使用して）調製する。インサートは、例えば、完全に縮重したアレイまたはバイアスアレイを表すことができる。次いで、pdtまたは修飾型pdtの所望の領域に結合するインサートを保持するファージを選択することができる。pdt分子または修飾型pdt分子に結合するファージの再選択の数サイクルを通して、この過程を繰り返すことができる。繰り返しは、特定の配列を保持しているファージの濃縮をもたらす。発現されたポリペプチドの配列を同定するため、DNA配列分析を実施することができる。pdt分子または修飾型pdt分子に結合する配列の最小直鎖部分を決定することができる。最小直鎖部分の一部または全部＋その上流または下流の1個以上の付加的な縮重残基を含有しているインサートを含有しているバイアスライブラリーを使用して、手法を繰り返すことができる。
タンパク質またはその断片の画像化のため、特定の診断標識剤に抗体をカップリングすることができる。標識には、例えば、蛍光標識または発色標識、ならびに抗体-GFP融合物、または当技術分野において既知のその他の蛍光タンパク質（例えば、高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）、レニラ・レニフォルミス（Renilla reniformis）緑色蛍光タンパク質、GFPmut2、GFPuv4、高感度黄色蛍光タンパク質（EYFP）、高感度シアン蛍光タンパク質（ECFP）、高感度青色蛍光タンパク質（EBFP）、ディスコソマ由来のシトリン（citrine）および赤色蛍光タンパク質（dsRED））との抗体融合物のような抗体融合タンパク質が含まれる。多様な蛍光標識が、Molecular Probes（Eugene,Oreg.）およびその他の多くの製造業者から入手可能であり、かつ／またはそれらから入手可能なHandbook of Fluorescent Probes and Research Products 8.sup.th Ed.(2001)に広範囲に記載されている。他の態様において、抗体試薬は、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、分泌胎盤アルカリホスファターゼ、βラクタマーゼ、ヒト成長ホルモン、およびその他の分泌酵素レポーターを含むが、これらに限定されない、その存在または活性のいずれかによって容易に検出可能な分子と融合させられる。pdtまたは修飾型pdtによってタグ化されたタンパク質は、免疫組織化学、ウエスタンブロット分析、即ち、イムノブロッティング、ELISA、免疫沈降、ラテラルフローイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ等を含むが、これらに限定されない、当業者に周知の技術を使用して、検出または単離され得る。
一つの態様において、抗体試薬は、本明細書に記載される修飾型pdt上のエピトープを認識する。もう一つの態様において、抗体試薬は、SEQ ID NO:1〜26の配列を含むエピトープを認識する。もう一つの態様において、抗体試薬は、修飾型pdtの未修飾の領域内のエピトープを認識する。もう一つの態様において、抗体試薬は、アミノ酸1〜13、13〜15、または25〜27を含むエピトープを認識する。
スクリーニングアッセイ
本明細書に記載されたタンパク質分解組成物、モジュール、およびシステムは、細胞壁生合成、細胞分裂、および／または走化性運動のような細胞過程を変更するための剤についてスクリーニングするために有用である。一つの態様において、スクリーニングアッセイは、候補薬物標的を同定するために使用される。もう一つの態様において、スクリーニングアッセイは、標的タンパク質の分解に対する効果について候補物質（例えば、候補抗生物質）を試験するために使用される。
薬物スクリーニング研究のためのそのようなアッセイは、高度に分岐した細菌の種（例えば、メソプラズマ・フローラム）に由来する修飾型タンパク質分解タグおよび同族プロテアーゼを使用するため、既存のアッセイより有利である。例えば、本明細書に記載された方法、アッセイ、システム、およびキットは、標的タンパク質のタンパク質分解を変更することができる剤を同定しかつ／または試験するために使用され得る。
従って、以下の工程を含む、生物学的活性について試験化合物をスクリーニングする方法が、本明細書に提供される：（a）（i）未修飾の分解タグと比較して変更された同族プロテアーゼによる分解動態を含む、標的タンパク質と融合された第1の修飾型タンパク質分解タグ、および（ii）細菌細胞によって構成的に発現されない、（a）の修飾型タンパク質分解タグを分解することができる同族プロテアーゼを、細菌細胞において発現させる工程、（b）工程（a）の細胞を候補物質と接触させる工程、ならびに（c）工程（a）の標的タンパク質の量を反映するアウトプット産物を測定する工程。ここで、アウトプット産物の減少は、候補物質が細胞におけるタンパク質分解の速度またはレベルを増加させることを示す。細胞に対する効果は、レポーター分子の使用によって直接または間接的に観察可能なものであり得る。
本明細書において使用されるように、「生物学的活性」または「生理活性」という用語は、生物学的試料に影響を与える試験化合物の能力をさす。生物学的活性には、非限定的に、生物学的アッセイにおける刺激応答、阻害応答、調節応答、毒性応答、または致死応答の誘発が含まれ得る。例えば、生物学的活性とは、化合物の、酵素の効果をモジュレートする能力、受容体を阻止する能力、受容体を刺激する能力、1種以上の遺伝子の発現レベルをモジュレートする能力、細胞増殖をモジュレートする能力、細胞分裂をモジュレートする能力、細胞代謝をモジュレートする能力、分化をモジュレートする能力、細胞形態学をモジュレートする能力、細胞壁生合成をモジュレートする能力、走化性運動をモジュレートする能力、またはそれらの組み合わせをさすことができる。いくつかの場合において、生物学的活性とは、生物学的試料において毒性効果を生じる試験化合物の能力をさし得る。
本明細書において使用されるように、「試験化合物」または「候補物質」という用語は、細胞に対して効果を及ぼす能力についてスクリーニングされる剤（例えば、化合物）または剤のコレクションをさす。試験化合物には、化合物、化合物の混合物、例えば、多糖、小さい有機もしくは無機の分子（例えば、2000ダルトン未満、1000ダルトン未満、1500ダルトン未満、1000ダルトン未満、もしくは500ダルトン未満の分子量を有する分子）、生物学的高分子、例えば、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似物、ならびにそれらの類似物および誘導体、ペプチド模倣体、核酸、核酸の類似物および誘導体、細菌、植物、真菌、もしくは動物の細胞もしくは組織のような生物学的材料から作成された抽出物、天然に存在する組成物、または合成組成物を含む、多様な異なる化合物が含まれ得る。
多数の低分子ライブラリーが、当技術分野において公知であり、市販されている。これらの低分子ライブラリーは、本明細書に記載されたスクリーニング法を使用してスクリーニングされ得る。ケミカルライブラリーまたは化合物ライブラリーは、特定の効果について候補物質をスクリーニングするため、本明細書に記載された方法と共に使用され得る、保存された化学物質のコレクションである。ケミカルライブラリーは、各化合物の化学構造、純度、量、および生理化学的特徴に関する情報を含む。化合物ライブラリーは、例えば、とりわけ、Enzo Life Sciences（商標）、Aurora Fine Chemicals（商標）、Exclusive Chemistry Ltd.（商標）、ChemDiv、ChemBridge（商標）、TimTec Inc.（商標）、AsisChem（商標）、およびPrinceton Biomolecular Research（商標）から市販されている。
非限定的に、化合物は、適切な期間にわたり対照と比べて細胞に対して効果を及ぼすことができる濃度で試験され得る。いくつかの態様において、化合物は、約0.01nM〜約100mM、約0.1nM〜約500μM、約0.1μM〜約20μM、約0.1μM〜約10μM、または約0.1μM〜約5μMの範囲の濃度で試験される。
化合物スクリーニングアッセイは、ハイスループットスクリーニングにおいて使用され得る。ハイスループットスクリーニングは、化合物のライブラリーが所定の活性について試験される過程である。ハイスループットスクリーニングは、多数の化合物を迅速に平行してスクリーニングしようとするものである。例えば、マイクロタイタープレートおよび自動アッセイ装置を使用して、実験室は1日に100,000ものアッセイを平行して実施することができる。
本明細書に記載された化合物スクリーニングアッセイは、細胞またはレポーター機能の複数の測定（例えば、複数のパラメーターの測定および／またはアッセイ中の複数の点での1種以上のパラメーターの測定）を含むことができる。複数の測定は、試験化合物とのインキュベーション時間にわたり生物学的活性を追跡することを可能にし得る。一つの態様において、レポーター機能は、異なるインキュベーション時間における試験化合物の効果のモニタリングを可能にするため、複数の時間で測定される。
スクリーニングアッセイの後、同定された試験化合物が意図された使用のための望ましい特性を有しているか否かをさらに同定するため、後続のアッセイを行うことができる。例えば、スクリーニングアッセイの後、生物学的利用能、毒性、または薬物動態のいずれかの測定からなる群より選択されるが、これらの方法に限定されない、第2のアッセイを行うことができる。
キット
本明細書に記載されたテクノロジーのもう一つの局面は、標的タンパク質の分解を増強するかもしくは防止するためのキット、候補物質をスクリーニングするためのキット、ならびに／またはメソプラズマ・フローラムに由来する修飾型pdtおよび同族プロテアーゼもしくはそれらの相同体もしくはバリアントを含むシステムのためのキットに関する。本明細書に記載されたキットのうちの1種以上に含まれ得るキット構成要素が、本明細書に記載される。一つの態様において、本明細書に記載されたキットは、メソプラズマ・フローラムに由来し、未修飾のメソプラズマ・フローラムタンパク質分解タグと比較して変更された同族プロテアーゼによる分解動態を含む修飾型タンパク質分解タグ、およびマルチクローニング部位をコードする核酸構築物を含む。もう一つの態様において、キットは、システムが利用される細胞において構成的に発現されるプロテアーゼによる分解に感受性であって、任意で、未修飾のカウンターパートと比較して変更された分解動態を有するよう修飾されている第2の分解タグに任意で融合されている、同族プロテアーゼを含む核酸構築物をさらに含む。
一つの態様において、本明細書に記載されたキットは、キット内に提供される同族プロテアーゼを構成的に発現しない細菌細胞、例えば、大腸菌細胞を含むことができる。一つの態様において、1種以上の培地または培地成分がキット内に提供される。
いくつかの態様において、本明細書に記載された構成要素は、単独で提供されてもよいし、またはキットとして任意の組み合わせで提供されてもよい。さらに、キットは、任意で、情報材料を含む。
いくつかの態様において、キット内の化合物は、いくつかの態様において、キットの他の構成要素を実質的に含まない、気密容器または密封容器において提供され得る。例えば、培地成分は、複数の容器で供給され得、例えば、予定されたスクリーニング反応の数、例えば、1、2、3、またはそれ以上のための十分な試薬を有する容器で供給され得る。本明細書に記載される構成要素のうちの1種以上は、任意の形態、例えば、液体、乾燥物、または凍結乾燥物の形態で提供され得る。本明細書に記載された化合物は、実質的に純粋でありかつ／または無菌であることが好ましい。本明細書に記載された1種以上の構成要素が液状溶液で提供される場合、液状溶液は、好ましくは、水溶液であり、無菌の水溶液が好ましい。本明細書に記載された化合物が乾燥物の形態として提供される場合、再生は、一般に、適当な溶媒の添加による。溶媒、例えば、無菌の水または緩衝液が、任意で、キット内に提供され得る。
情報材料は、本明細書に記載された方法および／または本明細書に記載された方法のための本明細書に記載された化合物の使用に関する、説明的な、教育的な、マーケティングのための、またはその他の材料であり得る。キットの情報材料は、その形態に関して限定されない。一つの態様において、情報材料は、ベクター、マルチクローニング部位、プロモーター等に関する情報を含むことができる。一つの態様において、情報材料はスクリーニングアッセイを使用する方法に関する。
本明細書に記載された化合物に加えて、キットの組成物は、溶媒もしくは緩衝液、安定剤、保存剤、および／または、例えば、本明細書に記載される修飾型pdtタグ、システム、もしくはスクリーニングアッセイを使用するための付加的な剤のような他の構成要素を含むことができる。
キットは、修飾型タンパク質分解タグおよび／または同族プロテアーゼ等の検出のための構成要素を含むことができる。さらに、キットは、タグもしくは同族プロテアーゼに結合する1種以上の抗体、またはRT-PCR反応もしくはPCR反応、例えば、半定量的もしくは定量的なRT-PCR反応もしくはPCR反応のためのプライマーを含むことができる。そのような構成要素は、細胞における各構成要素の発現またはタンパク質分解の程度もしくは速度を査定するために使用され得る。検出試薬が抗体である場合、それは、乾燥調製物、例えば、凍結乾燥物として供給されてもよいし、または溶液で供給されてもよい。抗体またはその他の検出試薬は、検出において使用するための標識、例えば、放射線学的標識、蛍光標識（例えば、GFP）、または比色定量標識に連結され得る。検出試薬がプライマーである場合、それは、乾燥調製物、例えば、凍結乾燥物として供給されてもよいし、または溶液で供給されてもよい。
キットは、典型的には、その様々な要素が、1個のパッケージ、例えば、ファイバーベースの、例えば、ボール紙、またはポリマー、例えば、スタイロフォームボックスに含まれて、提供されるであろう。包材は、内部と外部との間の温度差を維持するために構成され得、例えば、予め選ばれた時間、予め選ばれた温度に試薬を維持するための遮蔽特性を提供することができる。
タンパク質分解タグ特徴決定
本明細書に記載されるように、大腸菌におけるmf-Lonによって媒介されるタンパク質分解を特徴決定するため、GFP蛍光を使用し、大腸菌ssrAタグとの混同を最小化するため、mf-ssrAタグを「pdt」（タンパク質分解タグ）と改名した（図1A）。初期対数増殖中に、C末端pdt融合を保持するGFP（GFP-pdt）の構成的な発現は、非タグ化GFPに類似した蛍光をもたらしたが、GFP-pdtレベルは、後期対数期および静止期には著しく低く、このことから、pdtが1種以上の内因性大腸菌プロテアーゼによって認識され分解されることが示された（図1B）。
従って、mf-Lon分解に対して完全に感受性のまま、内因性分解に対して増加した耐性を有するpdtバリアントを生成することが求められた。ΔclpA変異体株における高いGFP-pdt蛍光（図5）、およびpdtとec-ssrA16上のClpA結合部位との間の弱い配列相同性から、pdt残基24〜27を変異誘発のための標的とした（図1A、「数字」）。高い初期タンパク質レベルおよびmf-Lon発現後の強力な分解の両方を示す、数字によって表示されたGFP-pdtバリアントを単離するため、プレート蛍光測定によって、GFP-pdtクローンの2000メンバーライブラリーをスクリーニングした（図1Cおよび表7）。
非タグ化GFPレベルは、mf-Lon発現によって概して影響されないままであったが、GFP-pdtは、その低い初期レベルからの21倍の低下を示し、このことから、pdtによって媒介されるmf-Lon分解の特異性が確認された。スクリーニングにおいて同定されたpdtバリアントは、親pdtタグより23倍も高い初期GFPレベルの範囲を示し、mf-Lon誘導後にGFPの60倍もの低下を示した。これらのpdtバリアントの配列分析は、大多数が変異誘発領域に複数のアルギニン残基およびグルタミン残基を含有し、負の電荷を有する残基を含有しているものはないことを示した（表7）。これらの設計基準を使用して、mf-Lonによって効率的に分解される、高い定常状態GFPレベルを有する付加的なpdtバリアントを遺伝子工学によって作製した（表7）。
mf-Lonによって媒介されるGFP-pdt分解をさらに特徴決定するため、フローサイトメトリーを使用し、pdtバリアントが、野生型pdtに類似した時間的分解動態を示し、GFPレベルを7時間目までにおよそ20〜50倍低下させることを見出した（図2A）。重要なことに、GFP分解は、mf-Lonまたはpdtタグのいずれかの非存在下では起こらず、蛍光集団分布の緊密なモノモードのシフトは、実験集団内の全ての細胞において分解が起こったことを示した（図6）。
次に、本発明者らは、mf-Lon認識を変更するが、内因性大腸菌プロテアーゼによる認識は変更しない直交のpdtバリアントを同定しようと努力した（図1A、「文字」）。その基底レベルが非タグ化GFPに類似していたため、GFP-pdt#5を親タグとして使用し、次いで、三つの理由のため、pdt残基13〜15を修飾のための標的とした：マイコプラスマ・ニューモニエにおける相同領域がLonによって媒介される分解にとって必須であり17、その領域は既知のClpA結合部位、ClpX結合部位、またはSspB結合部位との相同性を示さず16、残基が一次スクリーニングにおいて標的とされたものから物理的に離れている。初期GFPレベルを維持し、ある範囲のmf-Lon依存性の分解速度を示したpdtバリアントを同定し、文字によって表示した（図2Bおよび表7）。
初期タンパク質レベルおよび誘導される分解速度の両方の予測可能な制御を有するハイブリッドタグを作製するため、これらの文字バリアントを他の数字バリアントと組み合わせることが可能であるか否かを決定するため、ハイブリッドpdtバリアントのパネルを作製し、蛍光をmf-Lon誘導の存在下および非存在下で測定した。図2Cに見られるように、ハイブリッドpdtバリアントは予想通りに機能し、使用された数字バリアントおよび文字バリアントに従って両方の分解パラメーターを独立に制御した。
調整可能なプロテアーゼ発現
pdtバリアントの分解速度は、配列および発現レベルのみならず、mf-Lonの発現および分解速度にも依存性である。mf-Lonプロテアーゼレベルの代理測定値としてGFP-pdt#5を使用して、転写制御および翻訳後制御の機序を使用してmf-Lonを特徴決定した。強力なec-ssrAタグec-LAAのmf-Lonとの融合は、完全な転写誘導の下ですら、検出可能レベル未満にmf-Lonタンパク質レベルを低下させたが（図2D）、弱められたec-AAVタグの融合は、最大発現時に、mf-Lonが初期レベルの38％へGFP-pdt#5を分解することを可能にした。顕著に、最も弱いec-ssrAバリアントec-ASVは、最大のGFP-pdt#5分解を誘導するために必要とされるaTc濃度の低下によって証拠付けられるように、実際、mf-Lonタンパク質レベルを野生型レベルより高く増加させた。mf-Lonプロテアーゼドメインの保存された活性部位（S692A）18への不活化変異の導入は、GFP-pdt#5に対する活性を完全に消失させ、このことから、mf-Lon発現後に観察されたGFP蛍光の低下が、mf-Lonによって媒介されるGFP分解によるものであり、AAA+アンフォールダーゼドメイン19によるアンフォールディングのみによるものではないことが証明された。
合成トグルスイッチのプロテアーゼによって駆動される制御
本明細書に記載された分解システムを合成回路において試験するため、pdtバリアントを、相互転写抑制に基づく遺伝子トグルスイッチ20へ組み入れた。図3Aに示されるように、LacIおよびTetRは、LacIまたはTetRのいずれかが優位を占め、それ自体の発現をさらに可能にするために他方の転写を抑制する、双安定回路を形成する。抑制因子も、蛍光レポーターGFPおよびmCherryの発現を制御し、トグルスイッチ状態の簡便な同定を可能にする。回路におけるプロテアーゼベースの切り替えを可能にするため、pdt#5をLacIと融合させ、アラビノースによって誘導可能なPBADプロモーター21からのmf-Lon発現の後のトグルのスイッチ速度および双安定性を測定するため、フローサイトメトリーを使用した。図3Bは、LacI-pdt#5を含有している回路は、mf-Lon誘導後8時間以内にLacI+/GFP+状態からTetR+/mCherry+状態へ切り替わったが、非タグ化回路は不変であったことを示す。さらに、GFP分解データから予測されるように、LacI-pdt#5のハイブリッドタグpdt#5Aおよびpdt#5Bへの置換は、同一の誘導条件の下で遅延した切り替えを引き起こした（図3C）。重要なことに、これらのLacI-pdt回路は、mf-Lon誘導の非存在下では双安定のままであった（図7）。最後に、pdtタグをLacIではなくTetRと融合させることによって、プロテアーゼによって媒介される切り替えが反対方向に起こることが可能となった（図8）。
内因性細菌システムの調整可能な制御
合成生物学の主要な目標は、内因性細菌システムを制御するツールを開発することであり22、従って、本発明者らは、天然の転写調節および翻訳調節の下にあるままのネイティブ遺伝子を制御するため、この分解システムを使用することが可能であるか否かを決定しようと努力した。図4Aに示されるように、修飾されたリコンビニアリング法23,24を、大腸菌ゲノムへpdtタグを挿入するために使用した。細胞壁生合成、細胞分裂、および走化性運動は、十分に特徴決定されており、これらの破壊は容易に観察可能な表現型を引き起こすため、これらの細胞過程に関与している標的遺伝子を選択した。
その枯渇が光学濃度の低下によって測定可能な細胞溶解を引き起こす、ペプチドグリカン生合成に関与している必須酵素MurA25を、まず標的とした。図4Bは、murA-pdt#1ゲノム融合が、mf-Lon誘導の3時間以内に細胞溶解を引き起こし、ハイブリッドバリアントpdt#1Aおよびpdt#1Bが、GFP分解アッセイおよびトグルスイッチアッセイにおいてpdt#5Aおよびpdt#5Bについて見られたものに密接に類似している、遅延した表現型応答を引き起こしたことを示している（例えば、図2Bおよび図3Cを参照すること）。重要なことに、MurA-pdt融合物を含有している細胞は、mf-Lon誘導の非存在下で野生型細菌と同一の増殖速度を示し、このことは、pdtバリアントがMurA機能に干渉しないことを証明している（図9A）。murA-pdt#5細胞のサブセットはmf-Lon誘導にも関わらず増殖し、6回の独立した実験からの単離物は、全て、mf-Lon発現プラスミドに不活化変異を含有していた（図10）。
ゲノム複製後の細胞中隔形成に必要な環構造を形成するチューブリン相同体FtsZ26を、次に、標的とした。図4Cに見られるように、mf-Lon発現は、3時間以内に、ftsZ-pdt#10細胞において明瞭なフィラメント形成を引き起こしたが、野生型細胞においては引き起こさなかった。pdt#10融合は、非誘導条件の下ではFtsZ機能に対して鑑別可能な効果を及ぼさず（0時間画像）、その増殖速度は野生型細胞と同一であった（図9B）。
最後に、本発明者らは、その破壊が定方向の鞭毛運動を防止する走化性シグナリングシステムのメンバーCheZ27を標的とした。運動寒天上のディスク拡散アッセイにおいて、cheZ-pdt#10を含有している細菌は、中心ディスクから発せられるaTc勾配への曝露によって、mf-Lonを発現するにつれ、走化性運動を失った（図4D）。非タグ化細菌（野生型）およびmf-Lonを発現しない細菌（対照）は、アッセイにおいて正常な運動を維持し、このことから、aTcによって誘導されるCheZ-pdt#10のmf-Lon分解の特異性が確認された。
本明細書に記載された合成分解システムは、簡便であり、モジュール式であり、付着したタンパク質の初期レベルおよび誘導可能な分解速度の両方の制御を可能にする、単一のプロテアーゼ遺伝子および小さいペプチドタグを含む。本明細書に記載された同定されたpdtバリアントは、内因性の安定性の20倍の範囲およびmf-Lon誘導後の定常状態タンパク質レベルの60倍もの低下を提供する。mf-Lon発現分析から推論された大腸菌におけるmf-Lonの相対的な不安定性は、この研究において使用されたものを超えて、mf-Lonの発現および安定性を増加させることによって、pdt融合物の分解速度および最終定常状態レベルの両方が容易に改善される可能性があることを示している（図2D）。pdt変異誘発スクリーニングは、飽和しておらず、従って、mf-Lon依存性の分解速度の拡大された範囲を有する付加的なpdtバリアントが存在する可能性が高い。さらに、pdtのN末端の13アミノ酸は、mf-Lonによるインビトロ分解のためには不要であり15、従って、いくつかの態様において、mf-Lon認識を損なうことなく、付着したタンパク質の機能に干渉するタグを短縮することが可能である。
この分解システムは、タンパク質レベル制御が、複雑な回路設計を補助するための付加的な調節機序を提供する、合成生物学における重要な進歩を表す28-32。転写ベースのトグルスイッチについて本明細書において証明されるように、既存の合成回路網は、最初の調節フレームワークを完全なままにしながら、翻訳後制御を可能にするため、このシステムによって容易に修飾され得る。Huangら33による最近の研究も、トグルスイッチを作製するためにmf-Lonによって媒介される分解を使用し、合成システムにおけるプロテアーゼによって駆動される制御の利用可能性をさらに証明している。本明細書に記載されたシステムは、代謝工学における制御機序として34-36、または複数の合成回路を統合するツールとして37,38、使用され得る。
本明細書に記載された分解システムは、mf-Lon発現を制御する転写調節に依存しているが、mf-Lonの3ドメイン構造19,39、ならびに低分子および光によって誘導されるドメイン相互作用システム40-42の開発は、いくつかの局面および態様において、mf-Lon活性の翻訳後制御を使用することが可能であることを示す。例えば、ラパマイシンによって誘導されるClpXPによるタンパク質分解を可能にするため、類似したアプローチが、Davisら11によって最近とられた。
いくつかの局面において、本明細書に記載されたテクノロジーは、内因性遺伝子システムの研究および制御において使用され得る。一工程ゲノム挿入は、ほぼ全ての大腸菌遺伝子へpdt融合物をターゲティングする、単純で頑強な方法を提供する。本研究において、3種の別個の細胞経路の遺伝子が標的とされ、各ケースにおいて、挿入されたpdtバリアントは、mf-Lon発現の非存在下では機能に影響を与えることなく、標的とされたシステムの特異的な制御を提供した。既存の転写調節ネットワークを再編成することなく、内因性のシステムの制御を行うこの能力は、多様な合成生物学および生物工学の適用において使用され得る。
いくつかの局面において、本明細書に記載されたpdtバリアントは、その細胞機能および標的抗生物質開発のための可能性が主要な研究分野である、必須遺伝子の研究において使用され得る。必須遺伝子分析のための従来の方法は、転写または翻訳の破壊を使用し、次いで、標的タンパク質を枯渇させるために内因性プロテアーゼに頼っているが、これは、各タンパク質に独特の分解動態に依る受動的な過程である21,43,44。対照的に、本明細書に記載されたpdtバリアントおよびそれらのシステムは、MurAおよびFtsZについて示されるように、特異的かつ能動的に必須タンパク質を分解のための標的とする。スメグマ菌（M.smegmatis）において開発された類似したシステム45と同様に、いくつかの局面および態様において、本明細書に記載されたpdtバリアントは、標的抗生物質開発のための魅力的な表現型である分解によって誘導される細胞死に対して最も感受性の必須遺伝子を同定するためのスクリーニングプラットフォームとして機能し得る。mf-Lon活性の翻訳後制御は、誘導とタンパク質枯渇との間の時間を最小化するため、そのような局面および態様において、特に有用であり得る。同定されたタンパク質標的について、本明細書に記載されたpdtバリアントおよびそれらのシステムは、定常状態タンパク質レベルの正確な制御を可能にし、標的タンパク質が化学的な阻害に類似したレベルへ誘導可能に分解されることを可能にする。インビボでタンパク質機能を阻止するために必要とされる阻害レベルについての知識は、化学生物学設計を補助することができる。本明細書に記載されたpdtバリアントおよびそれらのシステムは、強力なタンパク質特異的な低分子阻害剤を同定する高価で労働集約的な過程を開始する前に、このケースにおいては、分解を通して、標的タンパク質阻害に関連した表現型を同定するための簡便な方法も、化学生物学者に提供する。
本明細書に記載されたpdtバリアントおよびそれらのシステムは、M.フローラムを含む高度に分岐したマイコプラズマ属以外の他の細菌にトランスファー可能である。pdtタグおよびその他のマイコプラズマssrAタグは、他の配列決定された細菌におけるssrAタグとの類似点をほとんど保持しておらず15、マイコプラズマが、標的ssrA分解のためにLonを使用することが既知の唯一の生物であり、このことは、pdtおよびmf-Lonの両方が、他のグラム陰性菌およびグラム陽性菌において直交のままであろうということを示している。いくつかの態様において、付加的なpdt数字バリアントを、これらの生物における内因性プロテアーゼによる分解を制御するため、使用することができる。本明細書に記載されたpdtバリアントおよびそれらのシステムは、いくつかの態様において、細菌AAA+プロテアーゼがssrAによって指図されるタンパク質分解活性を保持することが示されている9、S.セレビシエのような真核生物にトランスファーされ得る。
（表７）タンパク質分解タグの同定および特徴決定（出現順にSEQ ID NO:1〜26）
Figure 0006430481
＊数字の前のSは、pdtが順方向に遺伝子工学によって作製されたことを示す（合成）。
＊＊aaは、アミノ酸を示す。完全pdtタグアミノ酸配列は以下の通りである：
Figure 0006430481
（標的領域は下線付き）。
＊＊＊このpdtバリアントにおいてはアミノ酸23〜27が変異させられた。
方法
株構築。Keioコレクションに由来するlacI::kanのMG1655（ATCC番号47076）へのP1ファージ形質導入を通して、MG1655ΔlacIΔaraBADを作製し、Redリコンビナーゼによって媒介される一工程相同組換えを、以前に記載された方法に従って、araBADのインフレーム欠失を作製するために使用した。各ケースにおいて、kanrカセットを除去するため、Flpリコンビナーゼを使用した。DH5αλpirをクローニングのために使用した。Keioコレクションに由来する対応する変異のMG1655proへのP1ファージ形質導入によって、インフレームプロテアーゼ欠失を構築した後、上に詳述されたようなkanrカセット除去を行った。
プラスミド。GFP-pdtバリアントを、KpnIおよびHindIIIの制限部位を使用して、pZE21-MCSへクローニングし、構成的なPlacIqプロモーターをXhoI部位およびKpnI部位を使用して挿入した。KpnI部位およびHindIII部位を、mf-lonの内部HindIII部位の除去の後、pZA11-MCSへmf-lonをクローニングするために使用した。トグルスイッチ実験のため、このプラスミドのPLtetOプロモーターを、XhoI部位およびKpnI部位を使用して、PBADと交換した。pECTを生成するため、kanrカセットおよび周囲のFRT部位を、pKD131からPCR増幅し、MluIおよびXhoIを使用して、pWM915へクローニングした。PDTタグバリアントを、XhoIおよびSacIIを使用して、pECTへクローニングし、挿入されたpdtタグに従って命名した（例えば、pECT5Aはpdt#5Aを含有している）。プラスミドpECA102、pBAD24-Flpを作成するため、KpnIを使用して、FlpリコンビナーゼをpBAD24へクローニングし、その後、構成的に発現されたsacカセットを、MluIおよびSalIによる部分消化ならびにライゲーションを使用して、pWM91からpBAD24-Flpへクローニングした。トグルスイッチ実験のため、lacI-pdt融合物を、BsrGIおよびSacIIを使用して、pKDL071-RBS8へクローニングした。プラスミドは、配列決定によって確証された。それはGenBankに寄託される。
PDTバリアントのゲノム挿入。相同性を有する付加的な42塩基5'伸張を含有しているプライマーP1およびP2を使用して、同族pECTプラスミドからPDTバリアントを増幅した。
Figure 0006430481
株、プラスミド、および試薬。本明細書に記載されるように、MG1655ΔlacIΔaraBADが調製され使用された合成トグル実験を除き、全てのケースにおいて、以前に発表された1,46大腸菌K-12誘導体株MG1655Pro（F-,λ-,Spr,lacI,tetR）を野生型株として使用した。他に特記されない限り、30°でルリアブロス（LB）において振とうしながら細菌を増殖させ、50ng/ml aTcによってmf-Lon発現を誘導した。適宜、抗生物質カルベニシリン（100ug/ml）およびカナマイシン（30ug/ml）を培地へ添加した。プラスミドおよび株変異は全て配列決定によって確証された。プラスミドマップはGenBankに寄託される。
GFP分解プラットフォーム。GFPバリアントGFPmut3b47を、全てのGFP発現のために使用した。ColE1開始点およびカナマイシン耐性カセットを含有している高コピープラスミドにおいて、構成的なPlacIqプロモーター48から、GFP-pdtバリアントを発現させた。PLtetOプロモーターを、P15A開始点およびアンピシリン耐性カセットを含有している中コピープラスミドにおいてmf-Lonを発現させるために使用した。
フローサイトメトリー。以下の電圧設定でFACSARIAII（BD BIOSCIENCES）フローサイトメーターを使用して、GFP発現を測定した：FCS、340；SCS、270；FITC（GFPのため）、520；mCherry、615。少なくとも10,000個の細胞を各測定のために収集し、FloJoをデータ分析のために使用した。
プレート蛍光測定および光学濃度。蛍光および光学濃度の測定は、515nmでの放射フィルタカットオフで、それぞれ488nmおよび520nmの励起波長および放射波長を使用して、SPECTRAMAX M5マイクロプレートリーダ（MOLECULAR DEVICES）によって行われた。光学濃度は600nmで測定された（OD600）。全ての測定が、96穴透明底プレートにおいて200μlで行われた。
PDT変異誘発スクリーニング。ランダムヌクレオチドを含有しているポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマーを、示されたpdtコドンを変異誘発するために使用した。gfpと融合された、変異誘発タグを含有しているプラスミドを、mf-Lon発現プラスミドと共にMG1655Proへ形質転換した。形質転換体を96穴プレートへ選取し、中央対数期まで増殖させ、50ng/ml aTcを含む培地および含まない培地で1:20希釈し、10時間の増殖の後にプレートリーダによって測定した。所望のGFP分解動態を示した株を、フローサイトメトリーによってさらに特徴決定した。
合成トグルスイッチ。親トグルスイッチとして機能したトグルスイッチプラスミドpKDL071-RBS8は、使用された最少培地条件においてトグル双安定性を増強する変更されたtetRリボソーム結合部位（RBS）を含有するよう、pKDL071のPCR変異誘発によって生成された。lacI-pdtのバリアントをPCRによって生成し、pKDL071-RBS8へクローニングした。GFP分解プラットフォームにおいて使用されたmf-Lon発現プラスミドを、アラビノースによって誘導される発現を可能にするため、PLtetOプロモーターをPBADプロモーターに交換することによって、トグルスイッチと共に使用するために修飾した。トグルスイッチおよびmf-Lon発現プラスミドを含有している細胞を、0.2％グリセロールおよび0.05％カザミノ酸を含有しているM9最少培地において37°で96穴丸底プレートにおいて200μlで増殖させ、実験の間中、対数増殖が維持されるよう注意した。それぞれGFP+状態またはmCherry+状態へ細胞を誘導するため、30ng/ml aTcまたは500μMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）のいずれかによって、細胞を6時間増殖させた。細胞を非誘導培地で1:1000希釈し、さらに12時間増殖させた。mf-Lonを誘導するため、細胞を、1mMアラビノースと共に、またはアラビノースなしで、37°で振とうしながら増殖させ、次いで、同一の誘導条件を含有している培地へ4時間毎に継代した（およそ1:10希釈）。各時点で、40μlをPBS中1％パラホルムアルデヒドによって固定し、5日まで4°で保存した。トグルスイッチ回路を含有していない細胞を、図3Bに示されるGFP状態およびmCherry状態を定義するために使用した。
pdtバリアントのゲノム挿入。図4Aに示されるpdtバリアントカセットのPCR増幅のための鋳型として機能するよう、プラスミドpECTを作製した。本発明者らは、pECTを生成するため、カナマイシン耐性カセットおよび周囲のFRT部位をpKD1349からpWM9150へクローニングし、それを、上流FRT部位に隣接してクローニングされたpdtタグバリアントに従ってさらに命名した（例えば、pECT-5Aはpdt#5Aを含有している）。ゲノム組み込みのためのPCR産物を生成するため、それぞれ標的遺伝子のC末端および直近の3'非翻訳領域（UTR）との相同性を有する付加的な42塩基5'伸張を含有しているプライマーP1およびP2を使用して、同族pECTプラスミドからPDTバリアントを増幅した。PCR産物を、発表された方法_ENREF_2323を使用して、pKD46を含有しているコンピテントMG1655Pro細胞へ電気穿孔し、成功したゲノムpdt挿入を、カナマイシンによる選択後、PCRによって確証した。kanrカセットを除去するため、FlpリコンビナーゼをpECA102のPBADプロモーターから発現させ、その後、プラスミドを、10％ショ糖を含有しているLB寒天プレートでの選択によってキュアリングした。プライマーおよびプラスミド構築の詳細な説明は、本明細書中に見出される。
MurAによって誘導される溶解の増殖条件。SPECTRAMAX M5プレートリーダにおいて振とうしながら30°で蓋付き96穴丸底プレートにおいて200μl LBで株を増殖させた。OD600測定値を15分毎に得、培地のみのウェルを使用して標準化した。プレートの周辺のウェルには水を充填し、細菌増殖のために使用しなかった。
FtsZ顕微鏡法。100倍の対物レンズを使用したNikon ECLIPSE TI顕微鏡およびNIS-Elements Advanced Research 3.2ソフトウェアによって操作されたCOLDSNAP HQ2 CCDカメラ（Photometrics）によって、微分干渉顕微鏡（DIC）および蛍光顕微鏡の画像を得た。ftsZ-pdtフィラメント形成の画像のため、液体培養物中の中央対数増殖中の細胞を、50ng/ml aTcによって誘導し、30°で3時間増殖させ、PBSおよび0.75％低温溶解アガロース（Boston Bioproducts）を含有している300μlパッドに置き、直ちに画像化した。
走化性運動プレート。中央対数増殖中の細胞を、1％トリプトン（tryptone）、0.5％NaCl、および0.3％寒天を含有している軟寒天プレートへ穿刺した。5μlの水に溶解したATcを、プレートの中心の無菌6mmディスクに添加した後、直ちに細菌を接種した。プレートを30°で18時間インキュベートした後、GEL LOGIC 6000 PRO（Carestream）によって画像化した。
参照
Figure 0006430481
Figure 0006430481
Figure 0006430481
Figure 0006430481
実施例2：細菌システムの翻訳後制御のためのプラットフォーム
概要。細菌におけるタンパク質分解の調整可能な制御は、合成遺伝子回路を開発し、天然細胞システムを調査するために利用可能な遺伝子ツールセットを拡張することができる。本発明において、本発明者らは、大腸菌における標的タンパク質の調整可能な制御を提供する合成分解システムを作製するため、メソプラズマ・フローラムtmRNAシステムの構成要素を使用する。本発明者らは、付着したタンパク質の定常状態レベルおよび誘導可能な分解速度の両方の独立した制御を有する分解タグバリアントを同定し、合成回路開発、ならびにペプチドグリカン生合成、細胞分裂、および走化性運動を含むコア細菌過程の外因性の制御におけるそれらの使用を証明する。本発明者らは、抗生物質に対する標的特異的過敏を誘導し、それによって、標的特異的阻害剤のスクリーニングアッセイの基礎として機能するシステムの能力を証明する。さらに、システムは、細菌における広い機能性を示し、グラム陽性菌であるラクトコッカス・ラクティスにおいて強力な標的分解を示す。合成分解システムは、簡便であり、モジュール式であり、小さいペプチドタグおよび単一のプロテアーゼ遺伝子のみを必要とし、宿主システムの破壊を必要とせず、最小の修飾によって多様な細菌へトランスファーされ得る。
転写および翻訳の調節によるタンパク質生合成の外因性の制御は、十分に確立されているが1-7、細菌におけるタンパク質分解の頑強で調整可能な制御は困難であった。制御されたタンパク質分解は、その発現を制御する転写調節および翻訳調節を破壊することなく、遺伝子機能を調査する能力を生物学者に提供することができ、より複雑な合成遺伝子回路を開発するための付加的な調節ツールを生物工学者に提供することができる。細菌における標的タンパク質分解は、一部分、急速分解のための内因性のClpXPプロテアーゼおよびClpAPプロテアーゼにタンパク質を差し向けるため、小さいペプチドssrAを使用するtmRNAシステムを通して起こる8。大腸菌ssrAタグ（ec-ssrA）のバリアントが、細菌9において、そして最近では真核生物10において、付着したタンパク質の分解速度を修飾するために一般に使用されているが、これらのタグは、分解の誘導可能な制御を提供しない。最近の誘導可能な真核生物システムは、細菌には存在しない分解機構に頼っており11-13、Davisら14によって開発されたもののような細菌システムは、しばしば、内因性tmRNAシステムの破壊を必要とし、他の生物へ簡単にはトランスファーされない。
本発明において、本発明者らは、宿主分解システムに頼らず、広範囲の細菌において機能することができるグラム陽性M.フローラムtmRNAシステムに基づく合成分解システムを提示する。GurおよびSauer15は、M.フローラムssrAタグ（mf-ssrA）が、内因性Lonプロテアーゼ（mf-Lon）によって分解され、大腸菌LonまたはClpXPによっては分解されないこと、mf-Lonが、ec-ssrAを認識または分解せず、大腸菌における直交の機能性を有するプロテアーゼおよび同族分解タグを提供することを示した。
上述のように、本発明者らは、大腸菌ssrAタグとの混同を最小化するため、mf-ssrAタグを「pdt」（タンパク質分解タグ）と改名し、大腸菌における誘導可能なタンパク質分解のためのGFPベースの試験プラットフォームへそれを組み入れた（図1a）。最初に、mf-Lon発現の非存在下での定常状態GFPレベルを変更するpdtバリアントを遺伝子工学によって作製するため、本発明者らは、その領域のec-ssrA ClpA結合部位との部分的な相同性16、およびclpA、clpX、およびclpPが欠失している株における変更されたGFP-pdt安定性のため、pdt残基24〜27を変異誘発のための標的とすることにした（図1B、14A、および14B）。図11Aに見られるように、本発明者らは、GFP定常状態レベルを変更し、mf-Lon発現後に野生型GFP分解速度をほぼ維持する、数字によって表示された数種のpdtバリアントを同定した。重要なことに、非タグ化GFPは、mf-Lon発現によって概して影響されないままであったが、野生型GFP-pdt融合物は、その初期レベルの3％にまで低下し、このことから、LacZ分解についてGurおよびSauerによって見られた15pdtによって媒介されるmf-Lon分解の特異性が確認された。同定されたpdt数字バリアントの配列分析は、大多数が変異誘発領域に複数のアルギニン残基およびグルタミン残基を含有しており、mf-Lon認識を破壊することが公知の15負の電荷を有する残基を含有しているものはないことを示した（表3）。
本発明者らは、mf-Lonによって媒介されるGFP-pdt分解をさらに特徴決定するためにフローサイトメトリーを使用し、pdt数字バリアントが野生型pdtに類似した時間的な分解動態を示し、4時間以内に初期レベルの1〜5％にGFPレベルを低下させることを見出した（図11B）。GFP分解は、mf-Lonまたはpdtタグのいずれかの非存在下では起こらず、蛍光集団分布の緊密なモノモードのシフトは、実験集団内の全ての細胞において分解が起こったことを示した（図15）。
本発明者らは、次に、mf-Lon依存性の分解を変更するが、内因性大腸菌プロテアーゼによる認識は変更しない（文字によって表示された）pdtバリアントを同定しようと努力した。本発明者らは、親タグとしてGFP-pdt#3を使用し、pdt残基13〜15を変異誘発のための標的とした。それは、その領域が、マイコプラスマ・ニューモニエにおけるLonによって媒介される分解にとって必須であり17、既知のClpA結合部位、ClpX結合部位、またはSspB結合部位との相同性を有していない16ためであった。定常状態GFPレベルを維持し、ある範囲のmf-Lon依存性の分解速度を示したpdtバリアントが、図11Cに示される。
定常状態タンパク質レベルおよび誘導される分解速度の両方の予測可能な制御を有するハイブリッドタグを作製するため、これらの文字バリアントを他の数字バリアントと組み合わせることが可能であるか否かを決定するため、本発明者らは、ハイブリッドpdtバリアントのパネルを作製し、mf-Lon誘導の存在下および非存在下でGFP蛍光を測定した。数字バリアントpdt#2およびpdt#5と組み合わせられた場合、文字バリアントは、pdt#3を使用して最初に同定された分解速度の同一の順位を示した（図11D）。mf-Lon誘導の非存在下で、ハイブリッドpdtバリアントも、使用された数字バリアントによって指示されたレベルに概して一致した定常状態レベルを示したが、いくつかのハイブリッドタグ組み合わせにおいては有意な変動が存在し、大腸菌プロテアーゼによる文字バリアント領域の部分的な認識が示された。
大腸菌における他のタンパク質標的のpdtによって媒介される分解を予測するため、このGFP-pdt特徴決定を使用することができるか否かを決定するため、本発明者らは、構造的に無関係な蛍光タンパク質mCherryにpdtバリアントを置き、mf-Lon誘導後の分解を測定した。図12Aに見られるように、文字バリアントは、GFP分解と強く相関するmCherry分解動態を生じ、0.99のR2値を有する単回帰を示した。回帰直線の傾き（1.09）およびそのy切片（-0.01）は、GFPおよびmCherryのmf-Lonによって媒介される分解が、試験された全てのpdt文字バリアントについて類似した速度で起こったことを示す。pdt数字バリアントも、0.95の線形回帰R2値で、mCherryおよびGFPについての強力な相関を示した（図16A）。
この標的分解システムが他の細菌において機能するか否かを決定するため、本発明者らは、グラム陰性菌である大腸菌からシステム統発生的に遠い産業上重要なグラム陽性菌ラクトコッカス・ラクティスへ、誘導可能なプロテアーゼおよびpdtバリアントをトランスファーした。本発明者らは、L.ラクティスにおける発現のためにmf-lonをコドン最適化し、遺伝子をナイシンによって誘導可能なプロモーターPnisA18の制御下に置いた。図12Cに見られるように、L.ラクティスにおける誘導可能なmf-Lon発現は、mCherryの効率的なpdtによって媒介される分解をもたらし、L.ラクティスにおけるpdt文字バリアントの相対的な分解の強さは、大腸菌における対応する強さとよく相関した（R2＝0.92）（図12D）。大腸菌特異的なプロテアーゼによる認識の変更のために選ばれたpdt数字バリアントについては、予想された通り、L.ラクティスにおけるmCherry定常状態レベルに対する効果は、大腸菌との弱い相関しか示さなかった（図16B）。
標的タンパク質分解は、標的タンパク質およびpdtバリアントのみならず、mf-Lon発現レベルにも依存性であり、標的タンパク質レベルを制御するための付加的な機序を提供する。図12Bに示されるように、PLtetOプロモーターのアンヒドロテトラサイクリン（ATc）誘導に基づくmf-Lonの転写制御は、標的GFP-pdt#3分解によって定義されるような十分に定義された範囲のmf-Lon発現レベルを提供した。mf-Lonの翻訳後制御を可能にするため、本発明者らは、ec-ssrAタグのバリアントをmf-Lonと融合させ、GFP-pdt#3分解に対する効果を測定した。ec-AAVバリアントは、誘導可能なmf-Lonタンパク質レベルの有意なシフトを引き起こし、試験されたATcレベルの範囲の全体にわたり低下したGFP-pdt#3分解をもたらしたが、より弱いec-ASVバリアントは、mf-Lonタンパク質レベルに対して小さい効果しか及ぼさなかった。mf-Lonタンパク質分解ドメインの保存された活性部位（S692A）19における不活化変異は、mf-Lonによって媒介されるGFP-pdt#3分解を完全に阻止した。
改変された遺伝子回路を制御するためのこのシステムの使用を証明するため、本発明者らは、転写ベースのトグルスイッチ20の翻訳後制御を提供するためにpdt融合物を使用した。LacIおよびTetRは、相互抑制に基づく双安定回路を形成し、GFPおよびmCherryの同時調節は、トグルスイッチ状態の簡便な蛍光ベースの同定を可能にする。本発明者らは、トグル回路内のLacIのC末端にpdt#3を融合させ、第2のプラスミドからのmf-Lon発現を駆動するため、アラビノースによって誘導可能なPBADプロモーター1を使用した。フローサイトメトリーは、LacI-pdt#3を含有している回路が、mf-Lon誘導の8時間以内にLacI+/GFP+状態からTetR+/mCherry+状態へ切り替わり、非タグ化回路は不変であったことを示す。さらに、ハイブリッドタグpdt#3Aおよびpdt#3BによるLacI-pdt#3の置換は、回路スイッチ速度の時間的な制御を提供し、pdtのTetRとの融合は、mf-Lonが反対方向にトグルを切り替えることを可能にした（図8および示されないデータ）。重要なことに、LacI-pdt回路は、mf-Lon誘導の非存在下で転写ベースの双安定性を維持し、このことから、既存の調節ネットワークを完全なままにしておくシステムの能力が証明された（図7および示されないデータ）。
微生物バイオテクノロジーにおける主要な目標は、内因性細菌システムを制御し操作するツールを開発することであるため21、本発明者らは、次に、本明細書に記載されたシステムによる制御のためにネイティブの大腸菌経路を標的としようとした。細胞壁生合成、細胞分裂、および走化性運動は、十分に特徴決定されており、容易に観察可能な表現型を生成するため、本発明者らは、これらの過程に関与している遺伝子を標的とすることにした。図4Aに示されるように、本発明者らは、大腸菌ゲノムへpdtタグを挿入するための修飾されたリコンビニアリング法を開発し22,23、その枯渇が光学濃度の低下によって測定可能な細胞溶解を引き起こすペプチドグリカン生合成に関与している必須酵素MurA24を標的とすることから開始した。murA-pdt#1のゲノム融合は、mf-Lon誘導の45分後に観察可能な細胞溶解を引き起こし（図13A）、ハイブリッドバリアントpdt#1Aおよびpdt#1Bの遅延した表現型応答は、トグルスイッチアッセイおよびGFP分解アッセイにおいて文字バリアントについて見られた時間的な遅延に密接に類似していた（図12Dを参照すること）。重要なことに、murA-pdt融合物を含有している細胞は、mf-Lon誘導の非存在下で、野生型細胞と同一の増殖速度を示し、このことは、pdtバリアントがMurAの機能または調節に干渉しないことを証明している（図17A）。
本発明者らは、次に、ゲノム複製後の細胞中隔形成のために必要な環構造を形成するチューブリン相同体FtsZ25を標的とした。図13Bに見られるように、mf-Lon誘導は、ATc誘導の3時間以内にftsZ-pdt#5細胞において明瞭なフィラメント形成を引き起こしたが、野生型細胞においては引き起こさなかった。pdt#5融合は、非誘導条件下ではFtsZ機能に対して鑑別可能な効果を及ぼさず（0時間画像）、増殖速度は野生型細胞と同一であった（図9Bおよび示されないデータ）。次いで、本発明者らは、その破壊が定方向の鞭毛運動を防止する走化性シグナリングシステムのメンバーCheZ26を標的とした。運動寒天上のディスク拡散アッセイにおいて、中心ディスクからのATc勾配によるmf-Lon誘導は、cheZ-pdt#5を含有している細菌に走化性運動を失わせた（図13C）。cheZ-pdt#5融合物を含有していないかまたはmf-Lonを発現していない細菌は、正常な走化性運動を維持し、このことから、ATcによって誘導されるCheZ-pdt#5のmf-Lon分解の特異性が確認された。
最後に、本発明者らは、関心対象のタンパク質の制御された分解が、標的特異的な阻害を示す化合物に対する過敏を誘導するために使用される、標的特異的な抗生物質スクリーニングプラットフォームを開発しようと努力した。本発明者らは、ホスホマイシンの既知の標的であるMurA27へ焦点を戻し、小さいmurA-pdt#1D依存性の増殖欠陥を生じるmf-Lon誘導条件を同定するため、弱いハイブリッドタグpdt#1Dおよびある範囲のATc濃度を使用した（4ng/ml ATc、図18を参照すること）。これらの条件の下で、MurAレベルは、細胞生存可能性を保持するのに必要な最小閾値にまで低下するため、MurA機能を阻害する化合物28に対して大腸菌が特に脆弱になる。図13Dに見られるように、murA-pdt#1Dを含有している細胞は、ホスホマイシンに対する感受性の10倍の増加を示した。この証明の延長として、本発明者らは、DNA傷害修復タンパク質RecAも誘導可能な分解のための標的とし、mf-Lon誘導によって、recA-pdt#3を含有している細胞は、DNA傷害を引き起こすことが既知のキノロンシステム抗生物質ノルフロキサシン29に対して一過性に過敏になった（図13E）。本明細書において提示された合成分解システムは、簡便であり、モジュール式であり、付着したタンパク質の定常状態レベルおよび誘導可能な分解速度の両方の制御を提供する、単一のプロテアーゼ遺伝子および小さいペプチドタグを含む。この分解システムは、タンパク質レベル制御が、複雑な回路設計30-34を補助するための付加的な調節機序を提供するであろう、合成生物学における重要な進歩を表す。転写ベースのトグルスイッチについて本明細書において証明されるように、既存の合成回路網は、最初の調節フレームワークを完全なままにしながら、翻訳後制御を可能にするため、このシステムによって容易に修飾され得、複数の合成回路を統合するためのシステムの使用が、簡単に想起され得る35,36。
Huangら37による最近の研究も、トグルスイッチを作製するためにmf-Lonによって媒介される分解を使用し、合成システムにおけるプロテアーゼによって駆動される制御の利用可能性をさらに証明している。このテクノロジーの有望な適用は、内因性細菌システムの制御にあるであろう。一工程ゲノム挿入は、ほぼ全ての大腸菌遺伝子へpdt融合物をターゲティングする単純で効率的な方法を提供し、既存の調節ネットワークを破壊することなく、内因性システムを制御する能力は、代謝工学において特に有用であることが判明し得る38-40。さらなる使用は、細胞機能および標的抗生物質開発のための可能性が研究の主要な分野である、必須遺伝子の研究において見出され得る。スメグマ菌において開発されたシステム41と類似して、本明細書に記載された分解システムは、抗生物質開発のための魅力的な表現型である、分解によって誘導される細胞死に対して最も感受性の必須遺伝子を同定するために使用され得る。タンパク質標的が同定された後は、標的特異的な阻害剤についてスクリーニングするための標的特異的な過敏アッセイを開発するため、システムを使用することができる。最後に、L.ラクティスについて本明細書に示されたように、このシステムは他の細菌へ容易にトランスファー可能である。付加的なpdt数字バリアントが、これらの生物における内因性プロテアーゼによる分解を制御するために必要であり得、本明細書における使用のために企図される。
方法
株および試薬。本明細書に記載されるようにして調製されたMG1655ΔlacIΔaraBADを使用した合成トグル実験を除き、全てのケースにおいて、以前に発表された大腸菌K-12誘導体株MG1655Pro（F-,λ-,Spr,lacI,tetR）2,42を、野生型株として使用した。他に示されない限り、大腸菌を振とうしながら30℃でルリアブロス（LB）において増殖させ、mf-Lon発現を50ng/ml ATcによって誘導した。L.ラクティス株NZ900018を、全てのL.ラクティス実験のために使用し、0.5％グルコースを含有しているM17ブロスにおいて増殖させた。適宜、抗生物質カルベニシリン（100ug/ml）、カナマイシン（30ug/ml）、およびエリスロマイシン（10ug/ml）を、培地へ添加した。全てのプラスミドおよび株の変異を配列決定によって確証した。プラスミドマップはGenBankに寄託される。
大腸菌ベースの分解プラットフォーム。mf-lon遺伝子を、大腸菌発現のためにコドン最適化し、PLtetOプロモーターの制御下に置き、近位ゲノムプロモーターからの望まれないmf-Lon発現を阻止するための5'および3'の転写ターミネーターと共にlacZ遺伝子座へ組み込んだ。GFPバリアントGFPmut3bを、全てのGFP発現のために使用し、GFP-pdtバリアントおよびmCherry-pdtバリアントを、ColE1開始点およびカナマイシン耐性カセットkanRを含有している高コピープラスミド上の構成的なPlacIqプロモーターから発現させた。
L.ラクティスベースの分解プラットフォーム。プラスミドpGPSARE5を、L.ラクティスにおけるmf-LonおよびmCherryの発現を可能にするため、作製した。プラスミドpZE11-MCS2に基づき、それは、大腸菌におけるクローニングを可能にするColE1複製開始点およびampRアンピシリン耐性カセット、ならびにL.ラクティスにおける複製および選択を可能にするAMβ1複製開始点およびermRエリスロマイシンカセットを含有している。mf-lonは、3ng/mlナイシンによって誘導可能なPnisAプロモーターから発現され、mcherryは構成的なL.ラクティスP32プロモーターから発現される。
フローサイトメトリー。GFPおよびmCherryの分解動態についてのデータは、High Throughput Samplar（BD Biosciences）が装備されたLSRFortessaセルアナライザーを使用して収集され、合成トグルスイッチについてのデータは、FACSAriaIIフローサイトメーター（BD Biosciences）を使用して収集された。各測定のため、細胞を1％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定し、最長5日間、4℃で保持し、次いで、分析のためにPBSで1:10希釈した。少なくとも5,000個の細胞を各測定のために収集し、FloJo（Treestar）をデータ分析のために使用した。
プレート蛍光測定および光学濃度。蛍光および光学濃度の測定は、515nmでの放射フィルタカットオフにより、それぞれ488nmおよび520nmの励起波長および放射波長を使用して、SpectraMax M5マイクロプレートリーダ（Molecular Devices）によって行われた。光学濃度は、600nmで測定された（OD600）。全ての測定が、96穴平底プレートにおいて200μlで行われた。
PDT変異誘発スクリーニング。示されたpdtコドンにランダムヌクレオチドを含有しているプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、pdt変異体ライブラリーを作製した。GFP-pdt変異体を含有している株を、96穴プレートへ個々に選取し、対数期増殖中にプレート蛍光測定によって測定した。ATcによる誘導の後に所望のGFP分解動態を示した株を、フローサイトメトリーによってさらに特徴決定した。
合成トグルスイッチ。pKDL07143に基づくプラスミドpKDL071R8を、使用された最少培地条件におけるトグル双安定性を増強するため、弱められたtetRリボソーム結合部位（RBS）を含有するよう変更した。このプラスミドは、全てのLacI-pdtトグルスイッチ実験のための親株として機能した。オーバーラッピングPCRによってpdtバリアントをlacIと融合させ、SacIIおよびBsrGIを使用して、pKDL071R8へクローニングした。アラビノースによって誘導可能なPBADプロモーターを、第2のプラスミドからmf-Lonを発現させるために使用した。トグルスイッチおよびmf-Lon発現プラスミドを含有している細胞を、0.2％グリセロールおよび0.05％カザミノ酸を含有しているM9最少培地において37℃で96穴丸底プレートにおいて200μlで増殖させ、実験の間中、対数増殖が維持されるよう注意した。細胞をGFP+状態またはmCherry+状態へ誘導するため、それぞれ30ng/ml ATcまたは500μMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）のいずれかと共に細胞を6時間増殖させた。細胞を非誘導培地で1：1000希釈し、さらに12時間増殖させた。mf-Lonを誘導するため、細胞を1mMアラビノースと共に振とうしながら37℃で増殖させ、同一の誘導条件を含有している培地へ4時間毎に継代した（およそ1:10希釈）。各時点で、細胞をPBS中1％パラホルムアルデヒドで固定し、最長5日間、4°で保存した。トグルスイッチプラスミドを含有していない細胞を、GFP-/mCherry-状態を定義するために使用した。
pdtバリアントのゲノム挿入。pECTプラスミドを、図4aに示されるpdtバリアントカセットのPCR増幅のための鋳型として機能するよう作製した。pKD1344に由来するkanRカセットおよび周囲のFRT部位を、pWM9145へクローニングして、pECTを生成し、それを上流FRT部位に隣接してクローニングされたpdtタグバリアントに従ってさらに命名した（例えば、pECT-Aはpdt#3Aを含有している）。ゲノム組み込みのためのPCR産物を生成するため、PDTバリアントを、それぞれ標的遺伝子のC末端および直近の3'非翻訳領域との相同性を有する付加的な42塩基5'伸張を含有しているプライマーを使用して、pECTプラスミドから増幅した。PCR産物を、発表された方法22を使用して、pKD46を含有している大腸菌へ形質転換し、成功したゲノムpdt挿入をPCRによって確証した。PBADプロモーターから発現されたFlpリコンビナーゼを含有しているプラスミドpECA102を、kanRカセットを除去するために使用し、その後、pECA102を8％ショ糖による選択によってキュアリングした。
MurAによって誘導される溶解の増殖条件。SPECTRAMAX（商標）M5プレートリーダにおいて、振とうしながら、30℃で、蓋付き96穴平底プレートにおいて200μl LBで株を増殖させた。OD600測定値を15分毎に得、培地のみのウェルを使用して標準化した。プレートの周辺のウェルには水を充填し、細菌増殖のために使用しなかった。
FtsZ顕微鏡法。100倍の対物レンズを使用したNikon ECLIPSE TI顕微鏡およびNIS-Elements Advanced Research 3.2ソフトウェアによって操作されたCOLDSNAP HQ2 CCDカメラ（Photometrics）によって、微分干渉顕微鏡（DIC）および蛍光顕微鏡の画像を得た。液体培養物中の対数増殖中の細胞を、ATcによって誘導し、30℃で3時間増殖させ、PBSおよび0.75％低温溶解アガロース（Boston Bioproducts）を含有している300μlパッドに置き、直ちに画像化した。
走化性運動プレート。対数増殖中の細胞を、1％トリプトン（tryptone）、0.5％NaCl、および0.3％寒天を含有している軟寒天プレートへ穿刺した。10μlの水に溶解したATcを、プレートの中心の無菌6mmディスクに添加した後、直ちに細菌を接種した。プレートを30℃で18時間インキュベートした後、Gel Logic 6000 Pro（Carestream）によって画像化した。
過敏アッセイ。96穴平底プレートにおいて、対数増殖中の細胞へ、ノルフロキサシンおよびATcを、示された濃度で同時に添加し、培地のみのウェルを吸光度対照として、6時間後にOD600を測定した。標的RecA分解のため、対数増殖中の細胞を2時間50ng/ml ATcによって誘導し、示された場合、その後に2時間25ng/mlノルフロキサシンによって処理した。次いで、細胞を、PBSで段階希釈し、選択なしのLBプレートにスポットし、30℃での一晩のインキュベーションの後、可視のコロニー形成単位（CFU）を計数した。
回帰分析。単回帰モデルは、最良適合直線および決定係数（R2）を決定するため、最小二乗アプローチを使用した。
参照
Figure 0006430481
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Figure 0006430481
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補足的な方法および参照
株構築。全ての実験のための親株は、大腸菌MG1655（ATCC番号47076）およびL.ラクティスNZ90001である。MG1655ΔlacIΔaraBADを、Keioコレクション2からのlacI::kanRのMG1655へのP1ファージ形質導入を通して作製し、Redリコンビナーゼによって媒介される相同組換えを、記載された方法3に従って、araBADのインフレーム欠失を作製するために使用した。pECA102（4時間10mMアラビノース）において発現されたFlpリコンビナーゼを、各ケースにおいて、kanRカセットを除去するために使用した。DH5αλpir4をクローニングのために使用した。内因性大腸菌プロテアーゼ欠失を、Keioコレクションからの対応する変異のMG1655pro5へのP1ファージ形質導入によって構築した後、上に詳述されるようなkanRカセット除去を行った。mf-Lon発現カセットを構築するため、本発明者らは、大腸菌における発現のためにmf-lonをコドン最適化し、高発現6を可能にするための強力なRBSを順方向に遺伝子工学によって作製した。遺伝子およびRBSを、EcoRIおよびHindIIIを使用して、pZE11へクローニングした。本発明者らは、このプラスミドにおいてPLtetOプロモーターの5'に転写ターミネーターを付加するためオーバーラッピングPCRを使用し、次いで、5'ターミネーター、PLtetOプロモーター、mf-lon遺伝子、および3'ターミネーターを含むこの発現カセットを、1kbのlacZターゲティング領域を含むpWM917の誘導体pWM91-lacZへクローニングした。得られたプラスミドpECL275を、Sm10λpirからコンジュゲーションによってMG1655proへ導入し、単一の組込み体をカルベニシリンプレートにおいて選択し、8時間リッチ培地において増殖させ、次いで、プラスミド切除について選択するため、1％トリプトン、0.5％酵母抽出物、8％ショ糖、および1.5％寒天を含有しているプレートにおいて選択した。得られたコロニーを、mf-Lon発現カセットについてPCRによってスクリーニングした。ec-AAV融合およびec-ASV融合ならびにS692A点変異を含有しているMf-Lonバリアントを、同様に構築した。プラスミドpECL275はGenBankに寄託される。
プラスミド構築。pdtバリアントを、PCRによって、GFPmut3b8およびmCherryと融合させ、KpnI制限部位およびHindIII制限部位を使用してpZE21-MCS9へクローニングした。構成的なPlacIqプロモーター10を、XhoIおよびKpnIを使用して挿入した。合成トグルスイッチ実験のため、KpnI部位およびHindIII部位を使用して、mf-lonをpZA11-MCSへクローニングし、その後、XhoI部位およびKpnI部位を使用して、PBADプロモーターをクローニングした。ゲノムpdt挿入を生成するために使用されたpECTプラスミドをクローニングするため、kanRカセットおよび周囲のFRT部位を、pKD132からPCR増幅し、MluIおよびXhoIを使用してpWM917へクローニングした。pdtタグバリアントを、XhoIおよびSacIIを使用して、pECTへクローニングし、挿入されたpdtタグに従って命名した（例えば、pECT5Aはpdt#5Aを含有している）。pECA102を生成するため、KpnIを使用して、FlpリコンビナーゼをpBAD2411へクローニングし、その後、構成的に発現されたsacBカセットをpWM917から増幅し、MluIおよびSalIによる部分消化ならびにライゲーションを使用してプラスミドへクローニングした。トグルスイッチ実験のため、lacI-pdt融合物をオーバーラッピングPCRによって生成し、BsrGIおよびSacIIを使用して、pKDL071R8へクローニングした。TetR-pdt融合物をNheIおよびSacIを使用してpKDL071R9へクローニングした。プラスミドを、配列決定によって確証した。それはGenBankに寄託される。
ラクトコッカス・ラクティスプラスミドおよびクローニング。プラスミドpGPSARE5を、L.ラクティスにおけるmf-LonおよびmCherryの発現を可能にするために作製した。プラスミドpZE11-MCS9に基づき、それは、大腸菌におけるクローニングを可能にするColE1複製開始点およびampRアンピシリン耐性カセットを含有しており、L.ラクティスにおける複製および選択を可能にするAMβ1複製開始点およびpVE552312由来のermRエリスロマイシン耐性カセットを含有している。pGPSARE5において、mCherryは構成的なP32プロモーター13から発現され、mf-Lonは、3ng/mlナイシンによって誘導可能プロモーターPnisA 1から発現される。pGPSARE5、およびmCherry-pdtバリアントを含有しているバージョンを、確立されているプロトコル14に従って、L.ラクティスへ形質転換した。
pdtバリアントのゲノム挿入。それぞれ標的遺伝子のC末端および直近の3'UTRとの相同性を有する付加的な42塩基5'伸張を含有しているプライマーP1およびP2を使用して、pECTプラスミドからpdtバリアントを増幅した。内因性遺伝子の終止コドンがP1 5'伸張に含まれていてはならないことに注意すること。基本のP1プライマーおよびP2プライマーの配列、ならびにmurA、ftsZ、cheZ、およびrecAを標的とするために使用された全長プライマーは、以下：
Figure 0006430481
にリストされる。
Figure 0006430481
Figure 0006430481
（表８）pdtの同定およびGFP分解についての特徴決定
Figure 0006430481
＊aaはアミノ酸を示す。完全pdtタグアミノ酸配列は、以下の通りである：
Figure 0006430481
（標的領域は下線付き）。
＊＊0ng/ml ATc誘導（0）および50ng/ml ATc誘導（50）についての3生物学的反復の標準偏差（SD）
実施例1におけるpdt配列は、実施例2におけるpdt配列とは異なる番号付けの慣習を使用して、番号付けされていることに注意するべきである。以下の表は、実施例2に記載されたpdt配列と相関させられた実施例1からの対応するpdt配列を示す。
（表９）実施例1および2に記載された配列についての命名一致表
Figure 0006430481

Claims (9)

  1. メソプラズマ・フローラム（Mesoplasma florum）分解タグ由来の修飾型タンパク質分解タグまたはそれをコードするポリヌクレオチド構築物を含む組成物であって、
    該修飾型タンパク質分解タグが、未修飾のメソプラズマ・フローラムssrA分解タグと比較して、より高い速度でメソプラズマ・フローラムLonプロテアーゼにより分解され、
    該修飾型タンパク質分解タグが、ClpXp、大腸菌（E.coli）Lonプロテアーゼ、またはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）プロテアーゼによって分解されず、かつ、
    該修飾型タンパク質分解タグが、配列番号：1のアミノ酸24〜27に対応するアミノ酸残基の1つまたは複数の置換を含み、
    該1つまたは複数の置換が、未修飾の分解タグに存在しない1個以上のアルギニン残基および／またはグルタミン残基を含む、
    組成物。
  2. 修飾型タンパク質分解タグが、未修飾の分解タグより増加したmf-Lonによる分解に対する特異性を有する、請求項1記載の組成物。
  3. メソプラズマ・フローラム（Mesoplasma florum）分解タグ由来の修飾型タンパク質分解タグまたはそれをコードするポリヌクレオチド構築物を含む組成物であって、
    該修飾型タンパク質分解タグが、未修飾のメソプラズマ・フローラムssrA分解タグと比較して、より高い速度でメソプラズマ・フローラムLonプロテアーゼにより分解され、
    該修飾型タンパク質分解タグが、ClpXp、大腸菌（E.coli）Lonプロテアーゼ、またはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）プロテアーゼによって分解されず、かつ、
    該修飾型タンパク質分解タグが、RLQL（配列番号：30）、ICRL（配列番号：35）、YLSQ（配列番号：31）、YQYR（配列番号：116）、RRRV（配列番号：117）、HISP（配列番号：118）、RICR（配列番号：119）、HAQP（配列番号：120）、RARQ（配列番号：121）、VVRR（配列番号：122）、RAQQ（配列番号：123）、RRQL（配列番号：124）、またはQRQRQ（配列番号：125）から選択される配列番号：1のアミノ酸24〜27に対応するアミノ酸残基の1つまたは複数の置換を含む、
    組成物。
  4. 修飾型分解タグが、標的タンパク質に融合されている、請求項1記載の組成物。
  5. 修飾型分解タグが、細菌細胞内で発現される、請求項4記載の組成物。
  6. 前記細菌細胞が大腸菌（E.coli）である、請求項5記載の組成物。
  7. 前記細菌細胞がラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）である、請求項5記載の組成物。
  8. 前記組成物が、前記修飾型分解タグとの融合タンパク質の形成のために配置されたマルチクローニング部位を含むDNAベクターである、請求項1記載の組成物。
  9. 前記DNAベクターが、細菌細胞内での融合タンパク質の発現のための1つまたは複数の調節要素を含む、請求項8記載の組成物。
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