KR100436473B1 - 미생물검출장치및방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 시험체 내에서의 미생물의 존재를 검출하는 방법 및 이를 위한 밀폐 가능하고, 살균 가능한 용기(36)에 관한 것으로서, 상기 용기는 지시약 매질을 갖는 액체 배양 배지 및 센서(37)를 포함한다. 기체 불투과성 제거가능한 밀폐부(32)를 갖는 기체 투과성 막(31)은 용기의 벽에 제공된다. 검출하고자 하는 미생물이 혐기성 생물인 경우, 기체 불투과성 밀폐부(32)를 적소에 둔다. 검출하고자 하는 미생물이 호기성인 경우, 기체 불투과성 밀폐부(32)를 떼어내어 용기로 산소를 통과시킨다. 바람직한 실시태양에 있어서, 기체 투과성 막(31)은 용기에 산소를 통과시키며, 용기의 외부로 이산화탄소가 통과되는 것을 적어도 부분적으로 제한한다. 배지내의 기체(CO2, NH2, H2S 등) 생성, 휘발성 산 생성 또는 배지내의 pH 농도의 변화로 생성된 지시약 배지의 변화는 용기의 외부로부터 검출된다.

Description

미생물 검출 장치 및 방법
종래에는 임상 시료 중의 미생물의 존재는 영양분의 존재 하에 시료를 배양하고, 일정 기간 경과후 시험체의 변화 또는 시료 상의 대기에서의 변화로부터 미생물 활성을 검출함으로써 결정된다. 예를 들면, Ahnell et al.의 미국 특허 제4,182,656호에서는 탄소 13이 표지된 발효 가능한 기질을 포함하는 배양 배지가 구비된 용기에 시료를 배치한다. 용기를 시일링시키고, 생물학적 활성에 기여하는 조건으로 시료를 처리한 후, 시료상에서의 기체성 대기내의 탄소 13과 탄소 12의 비를 측정하고, 초기 비와 비교하였다. 미국 특허 제4,152,213호에는 시료상의 대기중의 산소 함량 감소를 용기내의 기체 압력 모니터를 통해 검출함으로써 시일링된 용기 내에서 시료 중의 산소를 소비하는 박테리아의 존재를 결정하는 방법이 기재되어 있다. 미국 특허 제4,073,691호에는 일정 기간 경과 후 시료상에서의 기체 대기의 특성 변화를 측정함으로써 배양 배지를 포함한 시일링된 용기내에서 박테리아를 비롯한 생물학적 활성 제제의 존재를 결정하는 방법이 기재되어 있다. Suppman et al의 1984년 4월 4일자로 발행된 EPO 특허 출원 83108468.6에는 기체 대기 중의 CO2변화의 비-침습성 검출 방법이 개시되어 있다. 상기의 문헌 및 기타의 문헌에 기재된 방법 및 장치는 모두 배양후 기체 대기 내에서의 변화를 측정하기 위해 방사 측정 방법 또는 시일링된 용기의 침습을 필요로 하거나 또는 적외선 광을 통과시키는 특정 물질을 필요로 한다.
시료, 특히 혈액 배양 중의 미생물의 존재를 측정하기 위한 기타의 공지된 방법의 예로는 온도, pH, 혼탁도, 색상, 생물발광 및 임피던스의 미세한 변화를 측정하는 것이 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 박테리아 대사 부산물을 검출하여 미생물의 존재 또는 증식을 결정한다. 미생물의 존재는 계대배양 및/또는 염색에 의해 평가될 수 있다. 이러한 방법에서, 임피던스 측정, 방사 측정 및 적외선 측정만이 임상 시료의 자동처리 가능성을 제공한다. 그리고, 이러한 절차에서 임피던스 및 적외선 측정을 제외하고, 액체 시료 또는 시료 상의 기체 대기와 관련된 측정을 수행하기 위해 용기내에 침입시킬 필요가 있다.
이들 방법은 오염의 가능성 및 결정을 수행하는 매 시간마다 시료상에서 대기의 성분 요소를 변화시키는 가능성을 초래하는 것 이외에, 장시간동안 짧은 시간 간격에 걸쳐서 연속적으로 또는 반복적으로 측정을 수행할 수는 없다. 이는 생물의 증식 속도가 생물 및 초기 시료 중의 생물의 수에 따라 상이하고, 그리하여 대기 또는 액체 시료내의 검출 가능한 변화가 언제 나타나는지를 예상할 수 없는 커다란 단점이 되고 있다. 이와 관련된 문제점으로서, 생물 증식을 액체 시료 중의 pH 변화에 의해 결정되는 경우, 각종 대사 생성물이 시료의 pH에 다양하게 영향을 미치게 된다. 예를 들면, 암모니아의 생성은 pH를 상승시키고, CO2의 생성은 이를 저하시킬 수 있다. 각종 생물의 상이한 증식 속도로 인해서 pH가 어느 한 시점에서 증가하였다가 다른 시점에서 감소하게 되며, 이는 pH를 넓게 이간된 시간 간격을 두고 측정하는 경우 검출되지 않는다. 전혈액 시료 중의 pH 측정에 의해 변화를 검출하는 경우, 특히 pH 결정 수단이 지시 염료인 경우, 기타의 오류원은 염료의 이관이 혈액 세포의 존재에 의해 영향을 받거나 또는 불명료해질 수 있다. 비색계 지시약은 시료의 성질로 인해 야기되는 에러가 염료의 외관에 영향을 미치는 것을 방지할 수 있을 경우에만 효율적으로 사용될 수 있다.
생물학적 활성 제제가 호기성 생물인 경우, 생물학적 활성이 발생할 수 있도록 용기 내의 충분한 산소를 제공하는 시스템을 구비하여야만 한다. 용기에 산소를 제공하는 방법의 하나는 용기의 제조시에 배지를 포함하는 용기내의 대기에 산소를 가하는 것이다. 이 경우, 용기 사용자가 시료를 용기에 가하는 경우, 산소가 이미 용기 내에 존재하게 된다. (그러나, 이 방법이 갖는 문제점은 미리 가해진 산소 및 배지를 포함하는 이러한 용기의 저장 수명이 짧아진다는 점이다.)
미생물이 호기성 생물인 경우, 용기에 산소를 제공하는 기타 방법은 생물 배양시에 용기를 "스파이크" 처리하는 것이다. 흔히, 배양중 산소가 용기에 자유롭게 흐르도록 용기의 스토퍼에 바늘 또는 캐뉼라를 꽂는다. 그러나, 이와 관련된 문제점은 추가의 단계, 용기에 바늘을 꽂는 사용자의 기술 및, 시료의 오염 또는 바늘에 의해 사용자가 찔리는 위험이 수반된다. 또한, 배양 방법이 배지를 더 잘 산소화시키도록 하기 위해 교반을 포함하는 경우, 액체 배지가 바늘을 통해 용기 밖으로 새지 않도록 주위를 기울여야만 한다. 또한, 구멍이 뚫린 용기는 용기 외부로부터 이산화탄소의 통과를 조절할 수가 없다(용기내의 이산화탄소의 변화는 특정 미생물의 존재를 나타내는데 바람직하기 때문이다).
발명의 요약
본 발명은 기체 투과성 막을 갖는 투명한 멸균 용기내에서 무균 증식 배지를 사용하여 시료를 배양함으로써 혈액 또는 기타 체액과 같은 임상 시료 중의 미생물의 존재를 검출하기 위한 장치 및 방법에 관한 것이다. 미생물의 존재는 용기의 내부면에 부착된 1회용 센서를 사용하여 시험체의 pH 변화는 용기내의 기체(예, CO2) 또는 휘발성 산의 생성을 검출하거나 또는 측정하여 결정된다. 본 발명에 의하면, 비-침습성 수단을 통해 고 농도의 적혈구 세포와 같은 방해 물질의 존재 중에서도 미생물을 검출할 수 있다.
본 발명에서, 용기를 호기성 생물의 배양에 사용하고자 하는 경우, 기체 불투과성 시일이 기체 투과성 막으로부터 제거될 수 있다. 그렇지 않을 경우, 시일이 적소에 잔존하는 경우, 용기를 혐기성 생물의 배양에 사용할 수 있다. 기체 투과성막은 산소가 용기내를 통과할 수 있고, 바람직하게는 높은 양 또는 음의 압력을 견디게 되며, 용기의 외부로 이산화탄소의 통과를 충분한 정도로 제한하고, 용기의 오토클레이브 및 교반 중에도 용기의 외부로 액체 배지가 통과하는 것을 충분히 제한하게 된다.
관련 출원에 대한 참고 문헌
본 출원은 1995년 3월 24일자로 출원된 특허 출원 제08/410,374호의 일부 계속 출원이다. 또한, 이는 본 명세서에 참고로 인용하는 Turner et al.의 미국 특허 제5,217,876호(1993년 6월 8일 발행); Calandra et al.의 미국 특허 제5,094,955호(1992년 3월 10일 발행); Thorpe et al.의 미국 특허 제5,314,855호(1994년 5월 24일 발행); DiGuiseppi et al.의 미국 특허 제5,164,796호(1992년 11월 17일 발행); 및 Turner et al.의 미국 특허 제4,945,060호(1990년 7월 31일 발행)에 관한 것이다.
본 발명은 성장 배지 및 시일링된 용기를 사용하여 시료를 준비하고 용기에 가한 후 용기에 침입되지 않도록 시료의 pH, 기체 생성물(CO2, NH3, H2S 등) 또는 휘발성 산 생성물의 변화를 검출/모니터하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 추가의 잇점으로서, 기체 불투과성 제거가능한 시일(seal)을 갖는 기체 투과성 막이 용기의 벽에 제공된다. 검출하고자 하는 미생물이 혐기성 생물인 경우, 기체 불투과성 시일을 적소에 둔다. 검출하고자 하는 미생물이 호기성 생물인 경우, 용기에 산소가 통과할 수 있도록 기체 불투과성 시일을 제거한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 기체 투과성 막은 용기내의 높은 양 또는 음의 압력을 견디고 및/또는 용기의 외부로 이산화탄소가 통과하는 것을 적어도 부분적으로 제한하면서 용기에 산소가 통과하도록 구성된다. 용기내 (예, 용기내 배지)에서의 기체, 휘발성 산의 및/또는 pH의 농도 차에 따라 변화되는 센서가 구비된다.
도면은 하기와 같이 구성된다.
도 1 - 혈액 배양 장치
도 1은 용기(1), 센서(2), 배지(3), 광원(4), 광검출기(5) 및, 전류 원(6), 전류 전압 변환기(7) 및 저역 통과 필터(8)를 구비한 관련 전자 회로를 갖는 검출기 어셈블리의 기능 부분의 전체적인 외관을 나타낸다.
한 실시태양에서, 각각의 검출기 어셈블리는 광이 관찰되어야 하는 표면상에는 도달하나, 검출기 자체상에는 직접 도달하지 않도록 배치된 접시머리 구멍내의 광다이오드 및 하나 이상의 LED 로 구성된다. 본 실시태양에 있어서의 전자 회로는 검출기로부터의 신호를 조절하는 증폭기 및 필터, 이용가능한 신호를 선택하는 멀티플렉서 및 조명기용 정전류원을 포함한다.
작동시에, 장치 전체는 배양기내의 내부 교반기상에 배치된다. 이에 의해 미생물 증식에 적절한 환경을 제공하며, 실내 광을 광검출기로부터의 배제시킨다.
도 2 - pH 감도
각종의 채색된 병을 사용하여 장치를 주관적으로 테스트하는 것 이외에도, pH 민감 막 병을 사용하여 장치를 테스트하였다. 도 2는 5.8∼8.2 범위내의 pH에서 각종 완충액을 사용하여 센서의 평형을 이룬 후, 7가지의 상이한 검출기의 평균 전압 출력을 나타낸다. 상세히 연구해 보면, 본 시스템은 6.0∼7.5 범위내의 pH상에서 0.1 pH 단위의 변화를 용이하게 식별할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 3 - 미생물 증식에 따른 pH 및 대기의 변화
장치를 사용하여 pH의 변화 및 기체 또는 휘발성 생성물 모두에 의한 미생물의 증식을 검출하였다. 도 3은 박테리아, 이. 콜리의 증식에 의해 생성된 pH 및 CO2의 변화를 나타낸다.
도 4 - 각종 미생물의 검출
거의 모든 생물은 이의 대사 과정에서 기체 또는 휘발성 산을 방출한다. 그래서, 이러한 시스템을 사용하면 매우 광범위한 미생물의 증식을 검출할 수가 있다. 도 4는 이. 콜리, 그램 음성균; 에스. 피오게네스, 그램 양성균; 피. 아에루기노사, 그램 음성 비발효균; 비. 프라질리스, 혐기성균; 및 씨. 알비칸스, 효모의 증식중 발생한 기체(CO2) 및/또는 휘발성 산의 검출을 나타낸다. 이러한 단위는 검정 개시시의 CO2농도를 기준으로 한 배지 중의 상대적인 기체 농도를 나타낸다. 시료 용기 및 배지가 실온(약 20℃)이고, 용기 및 시료는 검정동안 37℃에서 배양하므로, CO2는, 온도가 상승함에 따라 액체 중의 CO2의 용해도가 감소하기 때문에 초기 2~4 시간 동안 액체 시료 및 배지 상의 공간으로 방출된다. 시료의 투입 및 장치로의 배치 이전에 용기 및 배지를 보다 높은 온도로 유지하지 않으면, 일반적으로 최초 2∼4 시간 이내에 최소한의 CO2농도를 통과시키고 나서야 미생물의 존재를 신뢰성있게 측정할 수 있다.
도 5A - 5D
도 5A - 5D는 센서를 내부에 갖는 병 스토퍼의 공동 내부에 배치되어 있는 투과성 막의 한 실시태양을 예시한다.
도 6
도 6은 특정 투과성 막 및 지지 그리드를 갖는 스토퍼의 단면도이다.
도 7A 및 7B
도 7A는 투과성 막을 위한 지지 그리드 중 하나의 정면도이며, 도 7B는 막 지지의 확대도이다.
도 8A - 8C
도 8A - 8C는 O-링으로 성형된 막을 지지하는 막 지지 그리드의 도면이다.
도 9
도 9는 센서 및 투과성 막을 그 내부에 갖는 본 발명의 배양 병의 단면도이다.
도 10A 및 10B
도 10A는 병 마개의 중앙에서 병 개구를 갖는 배양 병을 예시하며, 도 10B는 병진입 개구가 중앙에서 벗어나 있다.
도 11
도 11은 센서 및 기체 투과성 막 및 불투과성 제거가능한 시일을 내부에 갖는 본 발명의 배양 병을 예시한다.
도 12A - 12C
도 12A - 12C는 배양 병 뚜껑내의 기체 투과성 막의 추가의 실시양태를 예시한다.
도 13 A 및 13B
도 13A 및 13B는 그리드 및 투과성 막이 C-자 형태를 갖는 본 발명의 실시태양을 예시한다.
도 14
도 14는 투과성 막용 배양 병 뚜껑 및 보유 링의 특정 형태의 단면도이다.
도 15A 및 15B
도 15A 및 15B는 투과성 막용 보유 링의 추가의 실시태양의 단면도를 예시한다.
도 16
도 16은 배양 병 전체를 나타낸다.
바람직한 실시태양의 설명
본 발명의 장치는 미생물에 의해 생성된 대사 산물의 증가를 측정하여 혈액 시료 또는 기타 체액과 같은 임상 시료 또는 비임상 시료 중의 미생물의 존재를 검출하기 위한 비침습성 수단을 제공하기 위한 것이다. 시료는 특정 미생물 대사 산물의 생성을 증진시키는 특별히 조제된 배지에 시료를 첨가하고, 이러한 미생물 대사 생성물은 배양 용기의 하부에서 또는 용기의 시일링 수단 내에 배치된 단독 1회용 센서에 의해 검출된다. 센서는 부착 또는 지지 배지로 불리우는 고형 성분 또는 막 및, 그 상부에 또는 이의 내부에서 고정된 지시약 배지를 포함하고 있다. 센서는 지시약 배지를 외부에서 볼 수 있도록, 용기를 시일링시키기 위해 사용한 시일링 수단내에 용기의 내표면에 대하여 동일 평면에 배치되거나, 또는 시일링 수단에 부착시킨다. 세포, 단백질, 기타 고형 또는 기타 불투명 성분 또는 착색된 성분이센서와 용기 표면 사이에 유입되는 것을 방지하도록 용기에 고정시킬 수 있다. 특정 실시태양에 있어서, 센서는 기체 분자를 통과시키나, 이온을 통과시키지 않는 막 또는 고형층에 의해 시료 및 이의 증식 배지로부터 분리된다.
본 발명의 한 실시태양은 투명하거나 또는 투명 섹션을 포함할 수 있는 뚜껑과 같은 시일링 수단을 포함한다. 센서는 투명한 뚜껑 또는 뚜껑의 섹션에 인접 배치될 수 있거나 또는 뚜껑의 일부로서 제조될 수 있다. 용기를 시일링시키기 위해 뚜껑을 사용하는 경우, 투명 시일링 수단을 통해 지시약의 변화를 판독한다. 본 실시태양에서 잇점은 용기를 대규모로 제조하는 가장 경제적인 방법이 될 수 있다는 점이다.
또한, 시일링 수단은 캡슐화된 지시약 마이셀을 함유하는 중합체와 같은 물질로 제조될 수 있다. 물질이 미생물의 대사 산물에 대해 투과성을 지니며, 지시약의 변화를 시일링 수단의 표면상에서 볼 수 있는 한, 용기 또는 시일링 수단 내에서의 투명 섹션은 필요치 않다.
1 ㎖ 당 1개 생물 정도만을 함유하는 혈액과 같은 체액의 시료내의 미생물은 본 발명을 사용하여 검출할 수 있다. 이와 같은 시료는 생물의 개체수가 임계 수치에 도달하여 대사 산물의 증가를 측정할 수 있을 때까지 7일 이하의 배양이 필요할 수 있다. 본 출원인은 특정 유형의 생물에 대해 106CFU/㎖의 농도가 pH 또는 CO2의 측정가능한 변화를 초래한다는 것을 알아냈다. 모든 생물은 107~108CFU/㎖의 농도에서 측정 가능한 결과를 나타낸다.
센서는 다음의 경우에 유용하게 사용된다 :
1) 미생물 대사 산물이 시료에 상의 대기 중에서보다는 배양 병의 액상 중에서 측정되는 경우,
2) 단독 1회용 센서가 병의 내표면 또는 클로저 또는 시일링 수단에 고정되거나 또는, 클로저 또는 시일링 수단의 외부에 통해 고정되기 때문에, 병의 완전성을 손상시키지 않고 병의 투명 벽 또는 시일링 수단의 외부에서 측정을 수행할 수 있는 경우,
3) 육안 검사에 의해 또는 반사율에 의해 측정하는 장치를 사용하여 외부 측정을 수행하는 경우,
4) 시료 중의 불투명 또는 착색된 성분이 변화를 검출하는 센서의 능력 또는 이들 변화의 측정을 방해하지 않는 경우, 및
5) 센서내의 작은 용적중, 즉, 중합체 에멀젼중 또는 막상에서 지시약 분자의 고 농도를 유지하여 색상 변화를 용이하게 검출할 수 있는 경우.
복합 미생물 배지를 구성하는 영양 성분은 미생물에 의해 사용된 대사 경로에 영향을 미친다. 사용 가능한 영양원에 의존하는 비율로 유기 산, 염기 및 각종 기체가 생성된다. 이러한 생성물은 미생물의 종에 따라 달라진다. 액체 배지내에 이러한 산물이 존재하는 것은 이의 pH를 변화시킬 수 있다. 본 발명에 사용된 센서는 환경 내에서의 pH 변화에 응답하는 측정 가능한 변화를 초래하는 pH 민감 지시약을 포함한다. pH 센서가 기체-투과성 이온-불투과성 막에 의해 도포되는 실시태양에 있어서, CO2등의 지시약의 pH에 영향을 미치는 기체의 존재를 측정할 수 있다. 그래서, 액체 배지의 pH 변화 또는 배지 중에 용해된 기체의 측정에 의해 미생물의 증식을 검출할 수 있으며, 이러한 양 지시는 미생물에 의해 생성된 대사 기체성 생성물에 의해 초래된다. 이산화탄소는 대부분의 생물에 의해 생성된 일반적인 대사 산물이며, 그리하여 미생물 증식 검출용에 바람직한 대사 산물이 된다.
CO2센서 및 pH 센서는 pH 지시약으로서 유용한 분자종 및 부착/지지 배지로서 유용한 공통의 성분을 공유한다. pH 지시약은 지지 배지에 공유 또는 비공유 부착될 있다. 또한, 지시약은 경화 이전에 중합체 매트릭스내에서 유화되는 것과 같은 중합체 매트릭스내에서 캡슐화될 수 있다. pH 센서로서 실시하기 위해, 지시약을 액체 배지와 접촉시켜야만 한다. CO2센서는 지시약 막을 시료 및 증식 배지로부터 완전 분리하는 반투과성 물질인 제3 성분을 포함한다. 반투과성 층은 별도의 막이 될 수 있으며, 또한 시료 및 성장 배지에 인접하는 경화된 중합체는 일체형 반투과성 막을 형성할 수 있다. 이러한 센서는 적절한 투명 용기 또는 투명 시일링 수단의 내부에 적절한 접착제에 의해 적절한 고정될 수 있다. 이러한 센서는 또한 시일링 수단의 일체를 이루거나, 또는 그 현장에서 경화된 중합체 매트릭스내에서 유화되는 지시약로서 시일링 수단에 고정될 수 있거나 또는 용기내에 고정될 수 있다. 이러한 센서는 또한 미생물의 대사 산물 또는, 시료를 포함하는 증식 배지를 센서에 접촉시키는 방법이 제공되는 한, 용기의 외부에 배치될 수 있다.
각종의 상이한 형광 pH 지시약 및 가시 pH 지시약은 pH 센서 또는 CO2센서내에서의 활성 분자종으로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 지시약의 선택에 관한 유일한 제한은 지시약이 기존의 전면 형광 또는 반사 기법에 의해 용이하게 검출할 수 있는 허용가능한 동적 pH 범위 및 파장 변화를 갖는 요건이 된다.
본 발명에 의해 배지내의 pH 변화를 검출하는 센서는 약 5.0∼약 8.0 범위 내의 pH에서 형광 강도 또는 가시 색상의 변화를 나타내는 것이 바람직하다.
CO2센서에 대한 지시약은 CO2농도 변화를 검출하기 위해, 바람직하게는 약 pH 13∼5, 가장 바람직하게는 약 pH 13∼약 9의 형광 강도 또는 가시 색상의 변화를 제공하여야만 한다.
특정 pH 지시약 분자만이 지지 배지에 공유 또는 비공유 결합되고 이의 pH 지시 특성을 보유할 수 있다. 크산텐기, 페놀프탈레인기 및 페놀설폰프탈레인기에 속하는 지시약이 유용하다. 이들의 예로는 플루오레세인, 쿠마린, 페놀프탈레인, 티몰프탈레인, 브로모티몰 블루, 티몰 블루, 크실레놀 블루 및 α-나프톨 벤제인 등이 있다.
부착/지지 배지는 유기 반응을 이용하여 pH 지시약을 이에 공유 부착시킬 수 있는 셀룰로즈 등의 물질이 될 수 있다. 양 또는 음의
Figure pct00001
전위를 갖는 나일론막 등, 이온성 지지 물질을 사용하면, pH 지시약의 비-공유 부착을 수행할 수 있다. 사용 가능한 기타의 이온성 지지 물질은 양 또는 음으로 하전된 이온 수지, 예를 들면, 디에틸아미노 에틸(DEAS) 수지 또는 DEAE 셀룰로스가 사용될 수 있다. 지시약 막을 미생물 성장 배지에 직접 접촉시키는 경우, 단백질을 사용하여 지지 물질을 사건처리할 필요가 있다.
pH 지시약 센서는 미생물 성장 배지의 pH 환경으로 인한 pH 변화를 직접 검출한다. 그러나, 이들 센서는 실리콘, 라텍스, 테플론 또는 기체를 선택적으로 확산시키거나 이온을 통과시키는 능력을 특징으로 하는 각종 플라스틱 등, 선택적 반투과성 성분 또는 막으로 이들 센서를 도포하여 액체 증식 배지내에서 기체(예, 이산화탄소, 암모니아)에 선택적으로 반응하도록 제조할 수 있다. 중합체 매트릭스내에서 캡슐화된 지시약을 포함하는 센서의 경우, 매트릭스를 형성하는 중합체는 기체는 통과시키지만 이온은 통과시키지 않는 반투과성 차단물로서 작용할 수 있다.
한 실시태양에 있어서, CO2센서는 4가지 성분으로 구성된다. 제1 성분은 pH 6∼10 범위내에서 반응하는 가시 또는 형광 pH 지시약이다. 이러한 기준을 충족하는 지시약의 예로는 브로모티몰 블루, 티몰 블루, 크실레놀 블루, 페놀프탈레인, 쿠마린 및 형광 등이 있다. 제2 성분은 선택한 pH 지시약에 의해 CO2를 검출하기 위해 최적의 pH 환경을 유지하는 수산화나트륨 또는 등가 염기가 있다. 제3 성분은 경화되지 않은 중합체내에서 유화된 지시약 용액의 액적을 생성할 수 있는 글리세롤 또는 등가의 유화제이다. 제4 성분은 지시약에 대해 적절한 환경을 유지하는 실리콘과 같은 경화되지 않은 중합체이다. 기체에 대해서는 투과성을 갖지만 이온은 투과성이 없고, 또한 살균 처리시에 이러한 특성이 변화되지 않는 한, 그 자체의 화학적 또는 물리적 특성 또는 이의 경화 요건으로부터 지시약의 화학적 활성에 영향을 미치지 않는 어떠한 중합체도 사용할 수 있다. 또한, 충분한 기타 실리콘 중합체는 고온, 촉매 활성 또는 자외선 경화에 의해 경화되는 것들이다. 이러한 4가지 성분으로부터 에멀젼을 제조하며, 중합체를 경화시키고, pH 지시약의 액적 주위에 액체 미생물 성장 배지로부터의 CO2및 기타 기체를 선택적으로 확산시키고, 그리하여 지시약의 측정 가능한 변화를 초래하는 반투과성 매트릭스를 형성한다. 센서는 몰드 등에서 별도로 제조되고, 경화시키며, 이어서 실리콘 접착제와 같은 적절한 접착제로 배양 병에 부착시킨다. 또한 센서를 병의 하부상에 형성시키고, 그 현장에서 경화되는 것이 바람직하다. 센서를 포함하는 병을 경화시킨 후, 예를 들면 오토클레이브에 의해서 이를 살균시킨다. 증식 배지는 오토클레이브 이전에 병에 투입할 수 있거나, 또는 상기 방법에 의해 살균될 수 있다.
호기성 미생물의 배양은 배양 병내의 산소 공급을 필요로 한다. 현재 자동, 반자동 및 수동 배양 병은 통기 장치(예, 통기 스파이크 또는 바늘)의 삽입 및 제거, 뚜껑의 풀림 및/또는 교환 또는 병으로부터 기체를 기계적으로 제거 및 병으로 다시 기체를 가하는 것과 같은 방법으로 일시적으로 통기될 수 있다. 특정의 비교반수동 시스템은 테스트 기간중 적소에 있는 통기 장치를 사용한다.
그러나, 본 발명에서, 배양 병으로 주위 대기를 통과시키면서 배지 및 시료를 병 밖으로 누출시키는 것을 방지하는 선택적인 소수성 차단물이 제공된다. 본 발명의 투과성 차단물은 오염물, 예컨대, 오염 생물이 병으로 유입되는 것을 방지할 뿐 아니라, 이산화탄소를 병으로부터 통과시키는 것을 억제하는 것이 바람직하다. 투과성 막/소수성 차단물에 대한 바람직한 물질의 예로는 실리콘, 폴리프로필렌, 불소화 에틸렌 프로필렌, 저 밀도 폴리에틸렌, Porex, 폴리테트라플루오로에틸렌 및 폴리메틸펜텐 막 및 선택적 차단물과 같은 물질이 있다(폴리메틸펜텐은 무시할 수 있는 정도의 CO2투과성 및 높은 O2투과성 즉, 270(cc-m)/초-㎠-cmHg×10-10을 갖는다). 또한 산소에 대한 충분한 투과성을 지니는 경우, 바람직하게는 막이 병의 외부로 이산화탄소가 통과되는 것을 억제하고, 물질이 오토클레이브 가능하고, 가압하에 누출이 방지되는 경우 기타 투과성 막은 사용 가능하다. 하기에 기재된 바와 같이, 충분한 강도가 없는 물질은 투과성 막과 일체성을 갖는 지지 구조를 형성하거나 또는 투과성 막이 지지 수단상에 또는 지지 수단사이에 배치되어 강화될 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서는 투과성 막을 지지 물질에 고정시키기 위한 접착제가 사용될 수 있다. Elmer Stix-All과 같은 접착제를 사용하면 Porex 플러그를 스토퍼내에서 확실히 시일링시킬 수 있다. Adcare 접착제는 용접 시일링을 실시하기에는 충분치 않으나, 기체에 대해 투과성을 지니며, 막을 샌드위치 형 구조로 Porex 플러그에 접착시키는데 사용될 수 있다.
배양용 병을 사용하기 전에 배양 병내로 산소가 통과되는 것을 방지하기 위해서 기체 투과성 막을 덮는 시일이 제공된다. 불투과성 시일은 병의 제조, 기체 발생, 오토클레이브 및 저장 동안 투과성 막을 덮고 용접 시일링시킨다. 시일은 배지병의 배양 중에 기체 교환을 가능케 하기 위해,(미생물이 호기성인 경우) 병 접종시에 제거할 수 있다. 투과성 막은 그 내부에 배치될 수 있는 물질에 따라 달라질 수 있을지라도, 플라스틱 코팅된 알루미늄이 일반적으로 적절하다.
추가로, 기체 투과성 막에 대해서, 막을 통한 기체가 막을 통해 이동하는 동안 배지가 주위 생물에 의해 오염되는 것을 방지하기 위해 0.2 미크론 또는 그 이하의 공극 크기가 바람직하다. 기체 투과성 막을 적소에 고정시키는 지지 시스템이 필요하거나, 또는 내압 및 진공 효과에 대한 오토클레이브로 인해서 필요할 경우, 동일하거나 또는 별개의 지지 구조가 기체 투과성 막을 지지시켜야만 한다. 내부 폴리프로필렌 지지 그리드를 포함하는 PTFE는 기체 투과성 막으로서 사용하기에 특히 유용하다.
본 발명의 한 실시태양은 도 5A∼5D에 예시되어 있다. 도 5A에 예시된 바와 같은 스토퍼(10)에는 도 5B에 예시된 바와 같은 내부 공동(12)이 구비되어 있다. 필터(14)는 스토퍼의 공동 내에 배치되며, 기체 불투과성 제거 가능한 시일(16)는 필터(14)에 이웃하게 배치된다(도 5C 참조). 도 5D에 도시된 바와 같이, 제거가능한 불투과성 시일링(16)이 제거되는 경우, 스토퍼(10)는 기체 투과성 막(14)을 경유하여 기체에 대해 투과성을 갖는다. 기체 투과성 막(14)은 예를 들면 Porex 필터가 될 수 있다.
도 6에 예시된 바와 같이, 본 발명의 스토퍼의 여러 가지 실시태양에서는 그사이에 갖는 상체 투과성 막(22)을 갖는 두개의 지지물(20,21)의 상부에 기체 불투과성 시일(16)가 제공된다. 도 7A 및 도 7B에서 더 잘 알 수 있는 바와 같이, 상부 지지물(20) 및 하부 지지물(21)내에 지지 그리드(25)가 모두에 구비된다. 두개의 지지물(20,21)이 함께 맞물릴 경우, 기체 투과성 막(22)은 이들 사이에서 강하게유지될 수 있다. 도 8A∼8C에서 알 수 있는 바와 같이 기체 투과성 막에 대한 지지물의 기타의 실시태양으로서, 지지물(20) 및 지지물(21)사이에 유지된 막(28)은 액체를 배양 병의 외부로 통과시키는 막의 불투과성을 향상시키도록 "O-링" 시일(29)를 사용하여 성형시킨다. 물론, 지지물 및 이들 사이의 막은 스토퍼내에 구비되며, 마찬가지로 스토퍼도 본 발명의 센서를 포함하는 배양 병내에 구비된다.
본 발명의 기타의 실시태양에 있어서, 기체 투과성 막이 스토퍼내에 제공되지 않지만, 배양 병의 상부에 스토퍼에 이웃하게 구비된다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 기체 투과성 막(31)은 호일 시일(32)와 같은 기체 불투과성 제거 가능한 시일 아래에 구비된다. 20 mm 스토퍼와 같은 스토퍼(23) 뿐 아니라, 금속 시일(34) 및 플립(flip) 덮개(35)가 구비된다. 병(36)은 상기에 논의된 바와 같이 이의 하부에 배치된 센서(37) 및 막(38)이 구비된 플라스틱 병이 될 수 있다. 도 10A에서 알 수 있는 바와 같이, 12 mm 스토퍼 등의 스토퍼(33)는 병(36)상의 플라스틱 뚜껑(30)의 중앙 부위에 배치된다. 또한, 도 10B에서 알 수 있는 바와 같이, 스토퍼는 뚜껑에서 중심으로부터 벗어난 위치에 구비될 수 있다.
도 11에 예시된 바와 같이, 막(31)의 상부에는 호일 시일(32)가 배치되어 있다. 시일(32)는 플라스틱 코팅된 알루미늄이 될 수 있다. 물론 이러한 물질이 충분한 불투과성 및 배양시에 병으로부터의 제거 용이성을 갖는 한, 제거 가능한 시일을 위한 기타의 소재를 고려할 수 있다. 도 11에서 알 수 있는 바와 같이, 시일의 잡기 및 제거가 용이하도록, 병에 부착되지 않은 탭(39)이 시일(32)의 일부로서 구비된다.
도 12A∼12C에 예시한 바와 같은 본 발명의 부가의 실시태양에 있어서, 그리드(40)는 병 뚜껑 자체 중에 형성된다. 한 실시태양에 있어서, 다수의 구멍(41)이 병 뚜껑 중에 형성된다. 도 12B 및 12C에서 알 수 있는 바와 같이, Porex 층(43)은 기체 투과성 막(45)에 인접하게 배치될 수 있으며, 지지링(42)에 의해 적소에 지지될 수 있다. 이러한 어셈블리는 도 12B에서 알 수 있는 바와 같이 병 뚜껑의 그리드(40) 아래에 배치된다.
그리드는 다수의 구멍(41)이 중앙의 스토퍼(33) 주위에서 C-자형이 되는 도 13A 및 13B에 예시된 그리드(47)와 같은 것이 될 수 있다. 이러한 방법으로, 그리드의 하부에 배치된 기체 투과성 막(48)의 표면적은 증가될 수 있다.
본 발명의 배양 병은 각종 방법으로 제조할 수 있다. 바람직한 실시태양에 있어서, 배양 병 및 배양 병 뚜껑을 별도로 제조한 후, 이어서 병에 뚜껑을 풀칠로 접착시키는 것과 같이 하여 이들을 접착시킨다. 병 상부와 병을 접착시키는 기타의 방법은 병 상부와 병을 서로 회전시키고, 발생한 마찰이 플라스틱을 용해시키고, 이를 재응결시켜 이에 의해 상부와 병이 용접되는 스핀 용접이 있다.
도 14에서 알 수 있는 바와 같이, 병 뚜껑(59)에는 각각이 서로 상이한 외경을 갖는 외부면(50, 51 및 52)이 구비된다. 면(52)은 병의 외부 원주 면과 동일 평면이 되도록 하는 치수를 갖는다. 최소 외경을 갖는 면(50)은 병내에서 정확하게 맞춰져서 표면(50)에 의해 형성된 병의 내경 및 외경이 실질적으로 동일하게 된다. 표면(51)은 병의 내경보다 큰 외경을 갖는다. 이와 같이, 스핀 용접 중, 병의 내경보다 더 큰 직경을 갖는 표면(51)은 병 뚜껑이 회전하고 병내에서 가압될 때 더 높은 마찰을 생성한다. 이와 같이 하여, 병 뚜껑과 병은 서로 단단히 접착된다. 도 14에 도시된 바와 같이, 막(58)은 지지 링 및 막 둘레의 유체 흐름에 대한 불투과성이 개선되도록 위한 돌출부(56)를 갖는 지지 고리(54)에 의해 적소에 유지된다.
병 뚜껑을 병에 접착시키는 기타의 방법에는 초음파 용접이 있다. 기체 투과성 막을 적소에 지지하기 위한 지지 고리는 초음파 용접에 의해서도 접착될 수 있다. 도 15A 및 15B에서 알 수 있는 바와 같이, 단면이 도시된 지지 고리(54)에는 환형 피이크(60)가 구비된다. 초음파 에너지가 피이크(60)의 바로 아래의 지점(65)에 가해지는 경우, 지지 고리(54)는 적소에서 용접될 수 있다. 도 15B에서 알 수 있는 바와 같이, 병의 교반 중에 액체가 지지 고리내에 포획될 가능성을 적게 하기 위하여 경사진 내부면(66)을 구비할 수 있다.
도 16에 예시된 바와 같이, 센서(37)는 배양 병의 하부에 배치되며, 막(58)은 지지 고리(54)에 의해 적소에 지지된다. 또한, 표면(51)의 용융으로 인해 병과 뚜껑의 스핀 용접 중에 발생되는 여분의 용융 플라스틱용 환형 함몰부(70)가 도시되어 있다(도 14를 참조). 환형 함몰부(70)로 인해서, 용융 플라스틱은 병 뚜껑 또는 병의 외부면으로 흐르지 않게 된다.
본 발명의 한 실시양태에서의 센서의 이산화탄소 또는 pH에 대한 반응성으로 인해서, 기체 투과성 막은 (병으로부터 배출되는) 이산화탄소보다도 (병으로 유입되는) 산소에 대한 투과성이 높은 것이 바람직하다. 이산화탄소에 대해 적어도 부분적으로 불투과성을 갖는 막에 의하면, 센서의 감도가 더 크게 된다. 단, 이산화탄소보다 산소에 대한 투과성이 높은 막은 본 발명에서는 필요치 않다. 초기에는병으로부터 이산화탄소의 자유 유동이 가능할 뿐 아니라, (예를 들면 미생물의 존재를 나타내도록 하기 위해) 이의 내부에 센서를 변경시켜 병내에 이산화탄소를 필요로 하는 배양병은 사용할 수 없는 것으로 판단되었으나, 놀랍게도, 센서는 병 내부에서 이산화탄소가 "가라앉는" 일종의 형태로서 작용하여, 기체 투과성 막이 병의 일부가 되는 경우에도, 센서가 미생물의 존재를 적절하게 표시한다는 것을 알았다.
혈액 기체 변화에 의한 투과성 (표 1)
병을 준비하고, 100% 질소로 채웠다. 표본 병에서 열 시일링을 제거하여 개방시키고, 실온에서 1 시간동안 회전 교반기 상에서 교반시켰다. 이러한 시간 주기의 종반에, 혈액 기체 장치 상에서 pO2를 측정하고, 판독치를 투과성 막을 포함하지 않는 대조용 병 및 20∼30 mmHg의 소정의 pO2(100% 질소로 충전된 병을 표시하는 사전 테스트로 측정함)와 비교하였다. 대조 기준치와 비교한 이들 병의 pO2의 증가는 이들 물질의 산소에 대한 1 시간 이내의 투과성을 표시한다.
오토클레이브성(표 1)
선택한 테스트 물질을 121℃, 15 psi에서 12 분 동안 고속 배기로 오토클레이브 처리하였다. 그후, 각 물질을 용해 또는 변형 등의 시각적 변화에 대해 조사하였다.
압력 허용 범위(표 1)
스토퍼는 상기한 바와 같이 테스트 물질로 열 시일링 없이 준비하고, 그후물을 포함하는 병에 크림프 시일링시켰다. 60 cc의 주사기에 16 g의 바늘을 끼우고, 플런저를 50 cc 표시까지 잡아당기고, 스토퍼에 바늘을 삽입하였다. 이어서, 상기 물질을 통해 누출이 발생할 때까지 플런저에 압력을 가하였다. 누출이 발생하는 시점에서, 플런저 위치에서 50으로부터 빼서 필요한 압력양을 결정하였다.
Figure pct00002
증식 실시에 의한 투과성(표 2)
표본 병을 접종하였다. 병을 상기 기재된 바와 같이 준비하였다. 이어서 표본 병에 표준 성장 실시 프로토콜을 이용하여 테스트 물질당 2개의 병으로 하여 씨. 알비칸스(C. albicans), 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 엠. 루테우스(M. luteus)를 접종하였다. 음성 대조병은 질소 중에 5%의 이산화탄소 대기로 준비하였다. 이러한 병을 일시적으로 통기시키지 않고, 투과성 막을 구비하지 않는다. 양성 대조병은 통기를 하거나 또는 표준 호기성 성체 병인 것을 제외하고, 동일한 방법으로 준비하였다. 접종 병을 BTA중에서 3 일 동안 방치하고, 그후 판독치를 그래프로 나타냈다. 각 그래프의 비교에 의하면, 엠. 루테우스가 가장 양호하며, 증식을 억제하지 않는 속도에서 병중에 산소 투과를 나타내는 것으로 판명되었다. 또한, 이는 이산화탄소 생성량이 낮은 미생물이기 때문에, 이산화탄소 확산의 영향을 관찰할 수가 있다.
Figure pct00003
열 시일링 투과성(표 3)
중공 펀치를 이용하여, 표준 Tompkins 스토퍼에 구멍을 뚫었다. 테스트 열 시일링 물질을 구멍을 덮도록 시일링시켰다. 병에 40 ㎖의 배지를 채우고, 열 시일링시킨 스토퍼로 덮고, 100% 질소를 충전시킨 후, 12 분 동안 121℃에서 15 psi에서 오토클레이브 처리하였다. 최소 24 시간 동안 평형화시킨 후, 표본 병의 pO2를NOVA STAT 3 상에서 표준 프로토콜을 사용하여 측정하였다. 나머지 병을 실온에서 일정 시간동안 방치하여 열 밀봉이 산소를 병에 누출시키는지에 대해 측정하였다. 코어 처리된 스토퍼를 포함하지 않은 대조용의 병의 초기 pO2대 지지 시간 후의 최종 pO2를 비교하고, 이 물질이 산소에 대해 투과성이 있는지를 측정하였다.
Figure pct00004
각종의 방법을 사용하여 본 발명의 배양 병을 제조하는데 사용할 수 있을지라도, 기체 투과성 막 재료를 열 시일링에 의해 병의 뚜껑에 부착시키는 방법이 있다, 그후, 투과성 물질을 덮도록 병의 외부에서 제거 가능한 시일을 부착시킨다. 뚜껑을 병의 적소에 용접시킨다. 별도의 포트에서, 센서를 가하고, 열 경화시킨다. 이어서, 배지를 병에 가하고, 병의 상부공간을 배기시키고, 적절한 혼합 기체로 대체하였다. 잔류 감압을 가할 수 있다. 스토퍼를 적소에 시일로 고정시키고, 그후, 처리된 병을 오토클레이브 처리하였다,
오토클레이브동안, 병의 내압은 15 psi를 초과할 수 있다. 이와 같이 하여, 본 발명의 한 실시태양에 있어서, 기체 투과성 막 구조물는, 기체 불투과성 제거 가능한 시일과 마찬가지로 5∼30 psi을 넘는 압력에 견디도록 구조하다. 기체 투과성막 구조물 및 제거가능한 시일링은 15 psi 이상의 압력을 견딜 수 있는 것이 바람직하다. 그리고, 생물의 증식에 의한 압력은 25 psi 이하에 달하기 때문에, 기체 투과성 막 구조물 및 제거 가능한 시일링은 각각 15∼25 psi의 압력을 견딜 수 있도록 구조되며, 한 바람직한 실시태양에 있어서, 막과 시일링은 25 psi 또는 이를 넘는 압력을 견디도록 구조된다. 오토클레이브 후, 병을 냉각시키고, 포장 및 운송을 위해 라벨을 붙일 수 있다.
병을 이용하는 한 방법으로서, 진공용기 어댑터에 고정시킨 튜브형 소재를 구비한 나비형 바늘을 이용하여 혈액 시료를 환자에게서 채취한다. 스토퍼가 달린 포트의 상부의 오염을 제거하고, 어댑터를 포트에 끼운다. 그후, 병은 적량의 시료를 배출한다. 일단 접종시킨 후, 병을 식별하고, 배양을 위해 준비해 둔다. 병을 호기성 배양에 대해 사용하고자 하는 경우, 제거 가능한 시일을 제거하여, 기체 투과성 막을 노출시키고, 이에 의해 산소가 병에 자유로이 통과하도록 한다. 병을 오가논 테크니카의 BacT/Alert 장치와 같은 자동 배양 장치 중에 병을 배치한다. 병은 35∼37℃의 온도에서 배양시킨다.
각종의 배양 방법에 있어서, 배양 중의 배양 병을 교반시키는 것이 바람직하다. 본 발명의 배양 병은 기체 투과성 막이 배양 병으로의 산소를 자유롭게 통과시키지만, 동시에 병으로부터의 유체의 유출은 제한하므로, 배양중 교반시키는 것이특히 바람직하다. 사실상, 본 발명은 격렬한 교반 뿐 아니라, 배양물을 직립 위치와 역전 위치 사이에서 교반하는 것이 바람직함을 알 수 있다. 종래의 스파이크 처리된 병은 누출될 수 있으며, 이와 같은 방법으로 교반시키거나 또는 요동시킬 수가 없다.
본 발명의 원리, 바람직한 실시태양 및 작동 유형은 전술한 명세서에 기재되어 있다. 그러나, 본 명세서에서 보호하고자 하는 발명은 개시된 특정 형태로 제한되는 것이 아닌데, 이는 특정 개시된 형태가 제한의 목적이 아니라, 예시의 목적으로 간주되기 때문이다. 다양한 변형예 및 수정예는 본 발명의 정신 및 범주에서 벗어남이 없이 당업자에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 센서 및 투과성 막 모두는 개시된 것 이외에 배양 병의 다른 부분에 의해서도 제공될 수 있다. 예를 들면, 투과성 막은 병의 측면 벽에 배치될 수도 있거나 또는 센서는 병의 뚜껑 내부에 배치될 수도 있다. 또한, 다수개의 센서 또는 막이 구비될 수도 있다. 게다가, 지지 그리드의 배열과 투과성 막의 크기 및 형상도 또한 본 발명의 범주내에 포함된다. 물론, 투과성 및 불투과성 제거가능한 시일의 기타의 물질도 본 발명의 범주내에 포함된다.

Claims (41)

  1. 미생물이 존재하는가 또는 존재하지 않는가에 대해 분석하고자 하는 시료를 수용하기 위한 용기,
    미생물의 증식을 지지하기 위한 용기내의 성장 배지,
    미생물의 증식으로 인해 용기내의 기체 성분의 농도 변화에 대해 반응하여 시료 중에 미생물이 존재하는가 또는 존재하지 않는가를 표시할 수 있는 상기 성장 배지와 별도로 용기 중에 있는 센서, 및
    장치의 사용 중 기체를 통과시키기 위한 용기벽 내의 기체 투과성 막을 포함하는, 미생물 검출 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기체 성분은 시료 중의 미생물의 대사 산물인 것인 장치.
  3. 제2항에 있어서, 상기 센서는 시료 중의 미생물의 기체 대사 산물로 인한 pH의 변화에 반응하는 것인 장치.
  4. 제2항에 있어서, 상기 대사 산물은 이산화탄소이며, 상기 센서는 이산화탄소의 증가에 대해 반응하는 것인 장치.
  5. 제1항에 있어서, 상기 센서는 용기 부분의 내부면에 고정되어 있으며, 상기 용기 부분은 거의 투명한 것인 장치.
  6. 제1항에 있어서, 상기 기체 투과성 막은 용기 중의 시료를 포함하기 위한 소수성 차단물인 것인 장치.
  7. 제6항에 있어서, 상기 기체 투과성 막은 5∼30 psi 압력을 견디도록 구조된 것인 장치.
  8. 제7항에 있어서, 상기 기체투과성 막은 15 psi 또는 이보다 높은 압력을 견디도록 구조된 것인 장치.
  9. 제8항에 있어서, 상기 기체투과성 막은 25 psi 또는 이보다 높은 압력을 견디도록 구조된 것인 장치.
  10. 제1항에 있어서, 상기 기체 투과성 막은 실리콘, 폴리프로필렌, 아크릴 공중합체, 플루오르화 에틸렌 프로필렌, 저 밀도 폴리에틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌 및 폴리메틸펜텐에서 선택되는 1종 이상의 물질로 형성된 것인 장치.
  11. 제7항에 있어서, 상기 기체 투과성 막을 덮는 시일링 기체 불투과성의 제거가능한 시일을 추가로 포함하는 것인 장치.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제거 가능한 시일이 플라스틱 코팅된 알루미늄으로 이루어진 것인 장치.
  13. 제12항에 있어서, 상기 기체 투과성 막은 공극 크기가 0.001 내지 0.2 미크론 인 장치.
  14. 제8항에 있어서, 보강 수단이, 가압시 기체 투과성 막에 대한 지지물을 제공하기 위해 기체 투과성 막내에 또는 막에 인접하게 구비되는 것인 장치.
  15. 제12항에 있어서, 보강 수단이, 가압시에 기체 투과성 막에 대한 지지물을 제공하기 위해 기체 투과성 막내에 또는 막에 인접하게 구비되는 것인 장치.
  16. 제15항에 있어서, 상기 기체 투과성 막은 폴리테트라플루오로에틸렌으로 이루어지며, 상기 보강 수단은 상기 기체 투과성 막내에서의 폴리프로필렌 지지물 그리드인 것인 장치.
  17. 제16항에 있어서, 상기 보강 수단은 기체 투과성 막의 양면상에 배치된 2개의 지지물 그리드를 포함하는 것인 장치.
  18. 제15항에 있어서, 상기 기체 투과성 막의 주변에 인접하게 배치된 O-링을 추가로 포함하는 것인 장치.
  19. 제12항에 있어서, 상기 용기는 병이며, 상기 기체 투과성 막 및 불투과성 시일은 상기 병에 끼우기 위한 병 뚜껑내에 배치되는 것인 장치.
  20. 제16항에 있어서, 상기 용기는 병이며, 상기 기체 투과성 막 및 불투과성 시일은 상기 병에 끼우기 위한 병 뚜껑내에 배치되며, 상기 보강 수단은 병 뚜껑의 내부에 배치된 상기 기체 투과성 막의 위치와 인접한 위치에 다수의 개구를 포함하는 것인 장치.
  21. 제20항에 있어서, 상기 기체 투과성 막 및, 병 뚜껑의 개구의 배열이 C 자형인 것인 장치.
  22. 제21항에 있어서, 상기 센서는 상기 병 뚜껑의 내부에 배치되는 것인 장치.
  23. 제21항에 있어서, 상기 센서는 상기 병의 하부의 내부에 배치되는 것인 장치.
  24. 제1항에 있어서, 상기 기체 투과성 막은 이산화탄소보다 산소에 대한 기체 투과성이 높은 것인 장치.
  25. 제24항에 있어서, 상기 기체 투과성 막은 플리메틸펜텐으로 이루어지는 것인 장치.
  26. 제1항에 있어서, 장치내에서 미생물의 증식을 보조하기 위한 유체 배지를 추가로 포함하는 것인 장치.
  27. 제26항에 있어서, 상기 기체 투과성 막에 인접 배치된 제거가능한 기체 불투과성 시일을 추가로 포함하는 것인 장치.
  28. 제27항에 있어서, 상기 용기내에 불활성 기체를 추가로 포함하는 것인 장치.
  29. 제28항에 있어서, 상기 기체는 질소 및/또는 CO2인 것인 장치.
  30. 테스트하고자 하는 시료를 제27항의 장치에 가하는 단계;
    소정의 온도에서 장치를 배양시키는 단계;
    배양 중 상기 장치를 교반시키는 단계(이때 장치의 상기 기체 투과성 막은유체 배지 및 시료가 장치의 외부로 통과되는 것을 제한하고, 또 동시에 장치로 산소의 유입을 허용한다);
    상기 장치내의 센서에서 임의의 변화를 검출하여 장치내의 미생물 존재여부를 결정하는 단계를 포함하는, 시료 중의 미생물 존재여부를 분석하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 장치내의 유체 배지 및 시료가 기체 투과성 막으로부터 누출되지 않으면서, 이를 세정할 수 있는 정도로 장치를 교반시키는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 미생물이 테스트하고자 하는 시료 중에 존재하는 경우, 상기 미생물은 증식을 위해 상기 유체 배지를 이용하고, 상기 미생물이 증식함으로써 상기 장치내의 압력을 형성하는 기체의 대사 산물을 생성하며, 상기 기체 투과성 막은 상기 장치내에서 형성된 압력을 견디도록 구조된 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 기체 투과성 막은 5∼30 psi의 압력을 견딜 수 있는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 기체 투과성 막은 15 psi 이상의 압력을 견딜 수 있는 것인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 기체 투과성 막은 25 psi 이상의 압력을 견딜 수 있는 것인 방법.
  36. 제32항에 있어서, 상기 교반 동안, 수직 위치 및 역전 위치 사이로 전후로 상기 장치를 흔드는 것인 방법.
  37. 제31항에 있어서, 상기 테스트하고자 하는 시료는 혈액 시료, 무균 체액 시료 또는 음식물 시료인 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 미생물은 씨. 알비칸스(C. albicans), 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 또는 엠. 루테우스(M. luteus)인 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 미생물인 미코박테리아인 것인 방법.
  40. 제31항에 있어서, 배양 단계 및 교반 단계 동안, 상기 기체 투과성 막을 통해 상기 장치내로 유입될 수 있는 산소가 상기 기체 투과성 막을 통해 상기 장치로부터 배출될 수 있는 이산화탄소 보다 많은 것인 방법.
  41. 제28항의 장치를 준비하는 단계;
    상기 장치로부터 기체 불투과성 시일을 제거하는 단계;
    테스트하고자 하는 시료를 상기 장치에 가하는 단계;
    시료을 포함한 장치를 소정의 온도에서 배양시키는 단계;
    적어도 배양 중에 장치를 교반하는 단계(이때 장치 중의 상기 기체 투과성막은 유체 배지 및 시료가 장치의 외부로 유출되는 것을 제한하고, 또 동시에 장치내로 산소가 유입되게 한다);
    상기 장치내의 센서에서의 임의의 변화를 검출하여 테스트하고자 하는 시료중의 미생물 존재여부를 결정하는 단계를 포함하는, 시료 분석 방법.
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