CN110903826B - 一种基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针及其制备方法和在监测细菌孢子发芽过程中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针及其制备方法和在监测细菌孢子发芽过程中的应用，荧光探针由CdS量子点、罗丹明o6G染料及铕离子共同负载在沸石基咪唑酸酯骨架上构成，铕离子起始猝灭了CdS量子点的荧光，在2,6‑吡啶二羧酸存在下，铕离子和2,6‑吡啶二羧酸结合，使CdS量子点的荧光恢复，但罗丹明6G染料的荧光不受影响，从而利用细菌孢子发芽会释放2,6‑吡啶二羧酸的原理，设计比率型荧光监测细菌孢子发芽过程的方法，该方法选择性好、灵敏度高、检测限低及检测范围宽。

Description

一种基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针及其制备方法和在 监测细菌孢子发芽过程中的应用
技术领域
本发明涉及一种生物传感器，尤其涉及一种由CdS量子点、罗丹明°6G染料及铕离子共同负载在沸石基咪唑酸酯骨架上构成的荧光探针，还涉及其制备方法，以及利用细菌孢子发芽过程释放2,6-吡啶二羧酸的原理，从而可以通过基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针检测2,6-吡啶二羧酸以实现荧光法监测细菌孢子发芽过程。属于生物传感技术领域。
背景技术
2,6-吡啶二羧酸是一种食源性标志致病菌休眠体-芽孢萌发时释放出的核内物质，大量存在于细菌芽孢内。芽孢形成过程中在化学成分方面也发生很大变化。生芽孢的细胞大量吸收钙离子并大量合成营养细胞中没有的吡啶二羧酸。传统的热杀菌技术只能将细菌营养体杀灭，而不能将芽孢杀死。芽孢的这种强抗逆性主要依赖于芽孢核心区或其内细胞质高度脱水状态和高密度的吡啶二羧酸钙等核内物质。芽孢的萌发过程中，占芽孢干重约5～10％的2,6-吡啶二羧酸以及与其结合的二价阳离子(主要为Ca2+)从芽孢核内释放，这些物质的释放使芽孢的折光性逐渐消失，随后肽聚糖芽孢皮层水解，相关蛋白酶的活性恢复，萌发结束。因此，对2,6-吡啶二羧酸浓度的精确检测对于判断芽孢萌发情况具有极其重要的意义。
传统的检测2,6-吡啶二羧酸浓度的方法主要有荧光聚合酶链式反应检测法、比色法、高效液相色谱法等，这些方法虽然在单一体系内检测结果可靠，但处理过程繁琐，检测限高，检测范围小，而且对于复杂体系内标志物的检测结果不准确，选择性较差，灵敏度不理想，很容易受到环境干扰。
发明内容
针对现有技术检测2,6-吡啶二羧酸的方法存在的技术问题，本发明的第一个目的是在于提供一种选择性好、灵敏度高、检测限低、检测范围宽的可用于实时荧光监测细菌孢子发芽过程的基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针。
本发明的第二个目的是在于提供一种操作简单、低成本制备所述基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针的方法。
本发明的第三个目的是在于提供一种基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针的应用，该荧光探针在2,6-吡啶二羧酸作用下可以实现荧光恢复，具有选择性好、灵敏度高、检测限低、检测范围宽等优点，从而利用细菌孢子发芽过程释放2,6-吡啶二羧酸的原理，来实现细菌孢子发芽过程的监测。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针，其由CdS量子点、罗丹明°6G染料及铕离子共同负载在沸石基咪唑酸酯骨架上构成。
本发明的基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针在沸石基咪唑酸酯骨架中同时负载了铕离子和CdS量子点，而铕离子能够使得CdS量子点的荧光猝灭，而当环境中存在2,6-吡啶二羧酸时，铕离子能够和2,6-吡啶二羧酸配位结合，从而使得铕离子与CdS量子点的作用变弱，最终使CdS量子点的荧光恢复，而罗丹明6G染料作为一种参比荧光，其荧光不受铕离子影响，从而设计了一种比率型荧光探针，可以用于环境中2,6-吡啶二羧酸的检测，而细菌孢子发芽过程会释放2,6-吡啶二羧酸，因此通过基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针可以设计用于监测细菌孢子发芽过程的方法。
优选的方案，所述沸石基咪唑酸酯骨架粒径大小为200～300纳米，且沸石基咪唑酸酯骨架内部含有1～3纳米的孔道，所述CdS量子点粒径为4～8nm，负载在沸石基咪唑酸酯骨架表面，而罗丹明6G染料及铕离子主要负载在沸石基咪唑酸酯骨架内部孔道中。
优选的方案，所述基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针呈菱形十二面体形貌。
优选的方案，所述基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针在460nm激发下，在549nm与655nm处有两个荧光发射峰。在2,6-吡啶二羧酸(DPA)存在情况下，所述基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针在549nm处的荧光强度基本保持不变，但在655nm处的荧光强度逐渐增强。
本发明的基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针中的罗丹明6G染料的荧光不受DPA影响，作为内参比荧光用以实现比率型荧光检测DPA，从而避免环境等因素对荧光探针荧光强度的影响。
本发明还提供了一种基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针的制备方法，该方法是将CdS量子点、铕离子溶液及丹明6G染料与2-甲基咪唑搅拌反应，再在反应体系中缓慢加入锌盐后，进一步反应，反应混合物经过静置处理、过滤分离，即得。
优选的方案，CdS量子点、铕离子溶液及丹明6G染料与2-甲基咪唑搅拌反应5～15分钟，在反应体系中缓慢加入锌盐，进一步反应5～15分钟，反应混合物经过静置处理18～28h。
优选的方案，CdS量子点、铕离子及丹明6G染料的质量比为1～3:1～10:1×10-4～10×10-4。
优选的方案，2-甲基咪唑与锌盐的摩尔比例为5～10:500～1000。
本发明还提供了一种基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针的应用，其应用于监测细菌孢子发芽过程。
优选的方案，通过检测细菌孢子发芽过程中释放的2,6-吡啶二羧酸含量来监测细菌孢子发芽过程。
本发明还提供了一种基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针的应用，包括以下步骤：
1)将荧光探针与分别一系列不同浓度的标准2,6-吡啶二羧酸溶液反应后，采用荧光法进行测定，得到一系列荧光光谱图，以各荧光光谱图中549nm与655nm处荧光强度的比值为纵坐标，标准2,6-吡啶二羧酸浓度为横坐标，绘制标准曲线；
2)将荧光探针加入到待测细菌孢子溶液中，并加入促进剂促使细菌孢子发芽，细菌孢子过程中释放的2,6-吡啶二羧酸与荧光探针反应，采用荧光法进行测定，得到荧光光谱图，根据荧光光谱图中549nm与655nm处荧光强度的比值及标准曲线，计算出待测细菌孢子溶液中2,6-吡啶二羧酸浓度，利用细菌孢子发芽过程中释放2,6-吡啶二羧酸的关系，实现细菌孢子发芽过程监测。
优选的方案，所述促进剂为十二烷胺。十二烷胺主要是用于加速细菌孢子发芽。
本发明的CdS量子点通过以下方法制备得到：将0.22～0.25g CdCl2、1.00～1.30gNa2S2O3和20mL NH3·H2O(3.0mol/L)混合在反应釜中，在180℃下反应24小时。待反应釜自然冷却后，将反应产物离心，分离，干燥及得到CdS量子点。
本发明的基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针的制备方法：将制备的CdS量子点(1mg/mL，2mL),50μmol铕离子及40μL丹明6G染料(1×10-2mg.mL-1)与0.52g 2-甲基咪唑(溶解于2mL水中)混合，在搅拌下反应10分钟。然后将Zn(NO3)2·6H2O(0.5mol)慢慢加入混合溶液中并继续反应10分钟。最后将溶液在30℃静置24小时，分离得到同时负载CdS量子点，罗丹明6G染料及铕离子的基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针。
相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：
本发明的基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针对2,6-吡啶二羧酸的检测选择性好、灵敏度高、检测限低、检测范围宽。
本发明的基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针的制备过程操作简单、低成本，有利于扩大生产和应用。
本发明的基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针在2,6-吡啶二羧酸作用下可以实现荧光恢复，具有选择性好、灵敏度高、检测限低、检测范围宽等优点，从而利用细菌孢子发芽过程释放2,6-吡啶二羧酸的原理，来实现细菌孢子发芽过程的监测。
附图说明
【图1】为本发明的基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针的制备及用于监测细菌孢子发芽过程，显示了基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针的合成过程及监测细菌孢子发芽原理。
【图2】为实施例1未修饰荧光物质沸石基咪唑酸酯骨架及修饰了荧光物质的沸石基咪唑酸酯骨架的形貌图，表面修饰荧光物质后并未明显改变沸石基咪唑酸酯骨架结构。
【图3】为实施例1基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针检测不同浓度DPA的荧光谱图，探针对DPA的线性相应曲线及探针选择性，表明探针对DPA检测具有较好的线性范围及较好的选择性。
【图4】为基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针实时监测枯草芽孢杆菌孢子发芽过程。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1
本发明一种基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针应用的一个实例，将该荧光探针用于检测细菌孢子发芽过程中DPA的释放，改荧光探针合成原理示意图如图1所示。
1)将0.22g CdCl2、1.00g Na2S2O3和20mL NH3.H2O(3.0mol/L)混合在反应釜中，在180℃下反应24小时。待反应釜自然冷却后，将反应产物离心，分离，干燥及得到CdS量子点。
2)将制备的CdS量子点(1mg/mL，2mL)，50μmol铕离子及40μL丹明6G染料(1×10- 2mg.mL-1)与0.52g 2-甲基咪唑(溶解于2mL水中)混合，在搅拌下反应10分钟。然后将Zn(NO3)2·6H2O(0.5mol)慢慢加入混合溶液中并继续反应10分钟。最后将溶液在30℃静置24小时，分离得到同时负载CdS量子点，罗丹明6G染料及铕离子的基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针。
3)荧光探针(200L)与不同浓度的标准2,6-吡啶二羧酸(100L，5，10，20，50，80，100，150μM)混合进行特异性反应，构建检测2,6吡啶二羧酸的比率型荧光传感器；
4)采用荧光法进行测定，得到不同浓度的标准2,6-吡啶二羧酸荧光光谱图；以各荧光光谱图中549nm与655nm处荧光强度的比值为纵坐标，标准2,6-吡啶二羧酸浓度为横坐标绘制标准曲线。
5)实际样品的测量(其原理示意图如图1所示)：取能够产生芽孢的细菌之一——枯草芽孢杆菌在营养培基上划线培养到第三代，33℃恒温培养一周后，收集芽孢到离心管中，在4℃离心10min，转速为5000r/min；用冷的无菌水洗涤芽孢三次，将其重新分散在无菌水中，置于4℃保存；将2mM十二胺加入到芽孢悬浮液中，在90℃加热30min，立刻冷却，离心并保留上清液；然后在芽孢分泌物中加入荧光探针，在荧光倒置显微镜下实时观察荧光探针荧光强度随时间变化情况。
从图1中可以看出，基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针制备过程比较简单。当沸石基咪唑酸酯骨架上只负载有CdS量子点时，探针只有一个荧光发射峰，但当CdS量子点，罗丹明6G染料及铕离子同时负载在沸石基咪唑酸酯骨架上时，CdS量子点的荧光被猝灭，探针也只有罗丹明6G染料的荧光发射峰。然而在DPA存在下，CdS量子点的荧光恢复，探针出现两个荧光峰。
从图2中可以看出，沸石基咪唑酸酯骨架上负载了荧光物质后，沸石基咪唑酸酯骨架的结构并不明显变化，同时负载在沸石基咪唑酸酯骨架上的CdS量子点清晰可见。
从图3中可以看出，基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针对DPA具有良好的相应性能，探针在549nm处的荧光强度基本不变，但探针在655nm处的荧光强度随DPA浓度增大而增强。探针对DPA检测线性范围为0.1至150μM，检测下限为67nM。同时探针对DPA检测具有较好的选择性。
从图4中可以看出，探针可以实时监测枯草芽孢杆菌发芽释放DPA过程，随时间变化，探针发射的红色荧光强度逐渐增强，表明枯草芽孢杆菌释放了DPA。

Claims (9)

1.一种基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针，其特征在于：由CdS量子点、罗丹明6G染料及铕离子共同负载在沸石基咪唑酸酯骨架上构成；所述沸石基咪唑酸酯骨架粒径大小为200～300纳米，且沸石基咪唑酸酯骨架内部含有1～3纳米的孔道，所述CdS量子点粒径为4～8nm，负载在沸石基咪唑酸酯骨架表面，而罗丹明6G染料及铕离子主要负载在沸石基咪唑酸酯骨架内部孔道中。
2.权利要求1所述的一种基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针的制备方法，其特征在于：将CdS量子点、铕离子溶液及罗丹明6G染料与2-甲基咪唑搅拌反应，再在反应体系中缓慢加入锌盐后，进一步反应，反应混合物经过静置处理、过滤分离，即得。
3.根据权利要求2所述的一种基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针的制备方法，其特征在于：CdS量子点、铕离子溶液及罗丹明6G染料与2-甲基咪唑搅拌反应5～15分钟，在反应体系中缓慢加入锌盐，进一步反应5～15分钟，反应混合物经过静置处理18～28h。
4.根据权利要求3所述的一种基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针的制备方法，其特征在于：CdS量子点、铕离子及罗丹明6G染料的质量比为1～3:1～10:1×10-4～10×10-4。
5.根据权利要求3所述的一种基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针的制备方法，其特征在于：2-甲基咪唑与锌盐的摩尔比例5～10:500～1000。
6.权利要求1所述的一种基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针的应用，其特征在于：应用于监测细菌孢子发芽过程。
7.根据权利要求6所述的一种基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针的应用，其特征在于：通过检测细菌孢子发芽过程中释放的2,6-吡啶二羧酸含量来监测细菌孢子发芽过程。
8.根据权利要求6或7所述的一种基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针的应用，其特征在于：包括以下步骤：
1)将荧光探针与分别一系列不同浓度的标准2,6-吡啶二羧酸溶液反应后，采用荧光法进行测定，得到一系列荧光光谱图，以各荧光光谱图中549nm与655nm处荧光强度的比值为纵坐标，标准2,6-吡啶二羧酸浓度为横坐标，绘制标准曲线；
2)将荧光探针加入到待测细菌孢子溶液中，并加入促进剂促使细菌孢子发芽，细菌孢子过程中释放的2,6-吡啶二羧酸与荧光探针反应，采用荧光法进行测定，得到荧光光谱图，根据荧光光谱图中549nm与655nm处荧光强度的比值及标准曲线，计算出待测细菌孢子溶液中2,6-吡啶二羧酸浓度，利用细菌孢子发芽过程中释放2,6-吡啶二羧酸的关系，实现细菌孢子发芽过程监测。
9.根据权利要求8所述的一种基于沸石基咪唑酸酯骨架的荧光探针的应用，其特征在于：所述促进剂为十二烷胺。
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