CN110055190A - 一种腐败梭菌的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种腐败梭菌的培养方法，是将腐败梭菌菌种接种于腐败梭菌培养基中，放置在厌氧培养箱中进行厌氧培养；所述腐败梭菌培养基，由以下重量份的原料制成：脑心浸液肉汤35‑40份、葡萄糖2‑4份、L‑半胱氨酸0.6‑0.8份、水1000份。本发明通过对培养基组成及培养环境条件的构建和优化，最大限度地满足了腐败梭菌快速生长繁殖的需要，能使腐败梭菌生长繁殖加快、培养物细菌密度加大。培养出的高浓度腐败梭菌可用于疫苗的制备，以预防羊快疫等腐败梭菌病。

Description

一种腐败梭菌的培养方法

技术领域

本发明涉及厌氧生物培养技术领域，具体涉及一种腐败梭菌的培养方法。

背景技术

腐败梭菌引起的畜禽疾病不仅发病率高，而且病程短促,死亡率高。该菌常以芽孢体形式散布于自然界中，易被免疫力低的家禽(如鸡)、家畜(羊、鹿等)动物感染，可引起传染性法氏囊病、腺病毒感染、呼肠孤病毒感染及鸡贫血，对于家畜可引起羊快疫等疾病，是严重危害养殖业的重要疾病，给各国畜牧业发展带来巨大经济损失。

在厌氧细菌的培养过程中，培养基的选择和气体环境的配比对于细菌的培养效果至关重要。因此，根据腐败梭菌的在生长代谢中的营养需求和气体环境需求，设计腐败梭菌培养基的营养成分及气体环境的含量和配比是工作的重要内容。

目前，一般市面上所销售的用于腐败梭菌培养的培养基是厌气肉肝汤，但是用其培养腐败梭菌浓度较低，且菌体生长缓慢。而广泛用于梭菌类细菌培养的肉肝胃酶消化汤制作工艺较为复杂，且常因原料问题影响细菌的培养效果。国内很多研究中采用液体石蜡封层，以隔绝氧气，但同时阻碍了腐败梭菌生长过程中与外界的气体交换。因此，在进行腐败梭菌的检验试验时，很多方法无法达到理想的培养效果。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种腐败梭菌的培养方法。本发明通过对培养基组成及培养环境条件的构建和优化，最大限度地满足了腐败梭菌快速生长繁殖的需要，能使腐败梭菌生长繁殖加快、培养物细菌密度加大。培养出的高浓度腐败梭菌可用于疫苗的制备，以预防羊快疫等腐败梭菌病。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种腐败梭菌培养基，由以下重量份的原料制成：

脑心浸液肉汤35-40份、葡萄糖2-4份、L-半胱氨酸0.6-0.8份、水1000份。

优选的，所述腐败梭菌培养基由以下重量份的原料制成：

脑心浸液肉汤38.5份、葡萄糖3份、L-半胱氨酸0.7份、水1000份。

本发明的第二方面，提供上述腐败梭菌培养基的制备方法，包括以下步骤：

将脑心浸液肉汤、葡萄糖和L-半胱氨酸溶于水中，充分溶解后，灭菌，冷却，即得。

优选的，所述灭菌具体为：121℃高压灭菌15min。

优选的，冷却至35-40℃。

本发明的第三方面，提供上述腐败梭菌培养基在如下1)-3)至少一项中的应用：

1)腐败梭菌的快速生长繁殖；

2)腐败梭菌菌种保藏；

3)羊快疫疫苗的制备。

本发明的第四方面，提供一种腐败梭菌的培养方法，包括以下步骤：

将腐败梭菌菌种接种于上述腐败梭菌培养基中，放置在厌氧培养箱中进行厌氧培养。

优选的，所述腐败梭菌菌种接种的体积比为2％。

优选的，所述厌氧培养箱中厌氧环境气体组成体积比为：氮气80％、氢气10％、二氧化碳10％。

优选的，所述厌氧培养条件为：37℃摇床培养12-24h；

更优选的，摇床转速为220摆/min。

本发明的有益效果：

(1)本发明的腐败梭菌培养基是根据腐败梭菌的生理代谢特点设计而成，能使腐败梭菌生长繁殖加快，培养物细菌密度加大，OD₆₀₀达到1.941。是厌气肉肝汤培养基(参考培养基)的2.78倍(OD₆₀₀＝0.698)。

(2)采用本发明的腐败梭菌培养基对腐败梭菌进行培养，其培养速度快，能够缩短培养时间。与采用厌气肉肝汤培养基相比，培养时间可缩短30h以上。

(3)本发明的腐败梭菌培养基可用于腐败梭菌菌种保藏、保存和疫苗的制备，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1：不同培养环境细菌增菌效果比较；图中，混合气体组中培养环境的气体组成为：80％氮气、10％氢气、10％二氧化碳；对照组为采用石蜡封层，完全隔绝气体。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，目前对于腐败梭菌的培养主要采用的是厌气肉肝汤培养基，但存在腐败梭菌生长繁殖缓慢、培养时间长、培养物浓度低的问题。基于此，本发明的目的是提供一种能够快速繁殖腐败梭菌的培养方法，以满足腐败梭菌菌种保藏和疫苗制备的需要。

我们知道，细菌培养的培养效率起决定性作用的是培养基以及培养条件。为了获得高浓度的腐败梭菌培养物，必须构建一种适合腐败梭菌营养需求的、快速生长繁殖的培养基；构建一个适应厌氧的腐败梭菌快速生长、繁殖的环境条件。因此，本发明根据腐败梭菌在生长、繁殖和代谢过程中的营养需求，设计腐败梭菌培养基中各种营养物的成分、含量及其配比，并优化繁殖的环境条件。

经试验优选，本发明设计的最优的腐败梭菌培养基的原料组成为：

脑心浸液肉汤38.5份、葡萄糖3份、L-半胱氨酸0.7份、水1000份。

腐败梭菌为厌氧菌，厌氧条件较高。不同于普通的厌氧培养基，本发明所设计的腐败梭菌培养基，其使用脑心浸液肉汤为基础培养基，其中的蛋白胨、脱水小牛脑浸粉和脱水牛心浸粉等成分可以为腐败梭菌生长提供碳源、氮源等营养物质；葡萄糖提供能源；L-半胱氨酸作为一种较强的还原剂，能够消耗溶解在培养基中的氧；三者缺一不可。本发明通过对“脑心浸液肉汤”、“葡萄糖”和“L-半胱氨酸”这三种原料的用量进行优化，使其能够完全满足腐败梭菌的培养需求。

本发明的腐败梭菌培养基各原料组成是一个有机的整体，各原料之间具有协同促进作用，其不仅能够满足腐败梭菌的生理生长需求，而且有利于对培养结果进行判定和测定。在此培养基的基础上无需再添加其他成分。实验证明在此基础上再添加血红素、牛肉粒等其他成分，对促进腐败梭菌生长作用不大，且容易对培养结果的判断和测定造成干扰。

腐败梭菌虽为厌氧菌，但其生长仍需要一定浓度的其他气体，因此，在所设计的腐败梭菌培养基的基础上，本发明进一步的对繁殖的环境条件进行了优化。传统的腐败梭菌培养方法是采用液体石蜡封层的方法，以隔绝氧气，形成厌氧环境。但同时也阻碍了腐败梭菌在生长过程中与外界的气体交换，因此培养效果不佳。

为解决这一问题，本发明将氮气、氢气和二氧化碳按体积比为80％：10％：10％组成厌氧的气体环境，并将腐败梭菌在此厌氧环境中进行培养。为考察培养效果，本发明进行了对比试验：

试验分为两组，即混合气体组和对照组，采用上述相同的腐败梭菌培养基，腐败梭菌菌种均按体积比2％进行接种。

混合气体组是将接种后的培养基放置于由按体积比80％氮气、10％氢气、10％二氧化碳组成的气体环境的厌氧培养箱中37℃进行厌氧振荡培养；对照组是在培养基表面以灭菌后的液体石蜡封层，使之隔绝一切气体，置于37℃厌氧培养。

每隔一定时间测定培养液中的OD600值，结果见图1。结果表明，腐败梭菌在本发明气体组成的厌氧环境条件下，生长快、繁殖力强。培养24h后，达到最高密度OD₆₀₀＝1.941。而传统培养方法(□线)是OD₆₀₀＝1.548。

本发明还尝试了多种气体环境和比例，结果发现，只有在体积比80％氮气、10％氢气、10％二氧化碳组成的气体环境下更有利于腐败梭菌生长。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例和对比例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：腐败梭菌的培养

(1)配制适用于腐败梭菌培养的培养基：

将脑心浸液肉汤38.5g、葡萄糖3g、L-半胱氨酸0.7g加入到1L水中；充分溶解后，于121℃高压灭菌15min，冷却至40℃左右，配制得到腐败梭菌培养基(pH约为7)。

(2)培养：

将现有腐败梭菌菌种(OD₆₀₀＝0.298)以体积比为2％(即每100ml培养基中接种2ml腐败梭菌菌种)接种于步骤(1)配制的培养基中，并置于体积百分比80％氮气、10％氢气、10％二氧化碳的厌氧培养箱中37℃进行厌氧摇床振荡培养(摇床转速为220摆/min)24h。

对比例1：

配制厌气肉肝汤培养基作为对照：厌气肉肝汤培养基粉末溶解于1L水中，于121℃高压灭菌15min。冷却至40℃左右，将现有腐败梭菌菌种(OD₆₀₀＝0.298)以体积比为2％接种于上述培养基中，并置于体积百分比80％氮气、10％氢气、10％二氧化碳厌氧培养箱中37℃进行厌氧振荡培养24h。

对比例2：

(1)配制培养基：

将脑心浸液肉汤38.5g、L-半胱氨酸0.7g加入到1L水中；充分溶解后，于121℃高压灭菌15min，冷却至40℃左右，配制得到培养基。

(2)培养：

将现有腐败梭菌菌种(OD₆₀₀＝0.298)以体积比为2％(即每100ml培养基中接种2ml腐败梭菌菌种)接种于步骤(1)配制的培养基中，并置于体积百分比80％氮气、10％氢气、10％二氧化碳的厌氧培养箱中37℃进行厌氧摇床振荡培养(摇床转速为220摆/min)24h。

对比例3：

(1)配制培养基：

将脑心浸液肉汤38.5g、葡萄糖3g、维生素C 0.7g加入到1L水中；充分溶解后，于121℃高压灭菌15min，冷却至40℃左右，配制得到培养基。

(2)培养：

将现有腐败梭菌菌种(OD₆₀₀＝0.298)以体积比为2％(即每100ml培养基中接种2ml腐败梭菌菌种)接种于步骤(1)配制的培养基中，并置于体积百分比80％氮气、10％氢气、10％二氧化碳的厌氧培养箱中37℃进行厌氧摇床振荡培养(摇床转速为220摆/min)24h。

在厌氧培养24h后，测得本发明实施例1的培养基中已达到OD₆₀₀＝1.941；而对比例1的厌气肉肝汤培养基中OD₆₀₀＝0.698；对比例2的培养基中OD₆₀₀＝0.982；对比例3的培养基中OD₆₀₀＝1.150。

结果表明，本发明的培养基可以使腐败梭菌生长繁殖加快，培养物细菌密度加大。

实施例2：

配制适用于腐败梭菌培养的培养基，在1L水中的含量为：脑心浸液肉汤38.5g；葡萄糖3g；L-半胱氨酸0.7g。充分溶解后，于121℃高压灭菌15min。冷却至40℃左右，将现有腐败梭菌菌种(OD₆₀₀＝0.298)以体积比2％的比例接种于上述培养基中，并置于由按体积比80％氮气、10％氢气、10％二氧化碳气体环境的厌氧培养箱中37℃厌氧振荡培养24h。培养物与灭菌后的甘油以1:1的体积比充分混合，置于-80℃中保存30天。

结果发现，于-80℃保存30天后菌种不发生凝固现象，并且使用本发明方法复苏该菌种，培养物OD₆₀₀可达1.9。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种腐败梭菌培养基，其特征在于，由以下重量份的原料制成：

脑心浸液肉汤35-40份、葡萄糖2-4份、L-半胱氨酸0.6-0.8份、水1000份。

2.根据权利要求1所述的腐败梭菌培养基，其特征在于，由以下重量份的原料制成：

脑心浸液肉汤38.5份、葡萄糖3份、L-半胱氨酸0.7份、水1000份。

3.权利要求1或2所述的腐败梭菌培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将脑心浸液肉汤、葡萄糖和L-半胱氨酸溶于水中，充分溶解后，灭菌，冷却，即得。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌具体为：121℃高压灭菌15min。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，冷却至35-40℃。

6.权利要求1或2所述的腐败梭菌培养基在如下1)-3)至少一项中的应用：

1)腐败梭菌的快速生长繁殖；

2)腐败梭菌菌种保藏；

3)羊快疫疫苗的制备。

7.一种腐败梭菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

将腐败梭菌菌种接种于权利要求1或2所述的腐败梭菌培养基中，放置在厌氧培养箱中进行厌氧培养。

8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述腐败梭菌菌种接种的体积比为2％。

9.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述厌氧培养箱中厌氧环境气体组成体积比为：氮气80％、氢气10％、二氧化碳10％。

10.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述厌氧培养条件为：37℃摇床培养12-24h；

优选的，摇床转速为220摆/min。