CN115161221B - 一种改善断奶仔猪腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂的制备方法及应用 - Google Patents

一种改善断奶仔猪腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂的制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115161221B
CN115161221B CN202210588803.8A CN202210588803A CN115161221B CN 115161221 B CN115161221 B CN 115161221B CN 202210588803 A CN202210588803 A CN 202210588803A CN 115161221 B CN115161221 B CN 115161221B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
lactobacillus gasseri
selenium
liquid
cfu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210588803.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115161221A (zh
Inventor
张丽
黄金凤
谭荣炳
温程
欧阳海燕
黄金珠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Pucheng Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Pucheng Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Pucheng Biotechnology Co ltd filed Critical Guangzhou Pucheng Biotechnology Co ltd
Priority to CN202210588803.8A priority Critical patent/CN115161221B/zh
Publication of CN115161221A publication Critical patent/CN115161221A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115161221B publication Critical patent/CN115161221B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/30—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for swines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/60—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for weanlings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/04—Sulfur, selenium or tellurium; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/145—Gasseri
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/80—Food processing, e.g. use of renewable energies or variable speed drives in handling, conveying or stacking
    • Y02P60/87—Re-use of by-products of food processing for fodder production

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种改善断奶仔猪腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂的制备方法及应用。是将加氏乳杆菌接种到发酵转化培养基中发酵，发酵温度30‑37℃，发酵5‑9小时后，以变速流加的方式流加已灭菌冷却的亚硒酸钠，维持硒浓度为10‑100μg/ml，控制整个转化发酵过程pH5.0‑6.0，温度28‑35℃，转化发酵时间24‑36小时，由此制得改善仔猪断奶腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂。本发明发现，控制加入无机硒化合物的时间和严格控制pH在5.0‑6.0之间，菌体细胞无机硒转化有机硒的效率最高。

Description

一种改善断奶仔猪腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂的制备方法及 应用
技术领域：
本发明属于家畜饲养领域，具体涉及一种改善断奶仔猪腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂的制备方法及应用。
背景技术：
断奶仔猪腹泻是猪场常见的问题之一，因仔猪在早期断奶时期因自身消化系统和免疫功能尚未成熟，会导致仔猪出现腹泻，一般腹泻率在20％～30％左右，病死率达10％～15％，发病仔猪生长迟缓，形成僵猪，甚至死亡，给养猪生产带来了巨大的经济损失。现仔猪断奶腹泻多添加抗生素、高剂量微量元素等进行治疗，在降低腹泻的同时，也带来了畜产品抗生素残留、肠道微生态失调以及病原菌耐药性增加等问题，并严重的污染了养殖环境，对人类健康构成了严重的威胁。因此，降低断奶仔猪的腹泻，提高断奶仔猪的免疫力及营养物质消化率，寻找环保有效的抗生素替代品对生猪绿色养殖、健康发展，具有重要作用。
硒是人体和动物所必需的微量元素，具有参与机体免疫调节、预防癌症、抑制病原菌等重要的生理学功能，也是哺乳动物体内许多酶活性中心的必需组分，如谷胱甘肽过氧化物酶、脱碘酶等，具有保护细胞免受过度氧化损伤的作用。加氏乳杆菌在生长过程中会产生乳酸菌素、乳酸、过氧化氢、胞外多糖、氨基酸等代谢产物，这些代谢产物具有增强免疫力、杀菌抑菌、维持肠道菌群平衡等功效。本发明以加氏乳杆菌为载体通过菌体发酵过程的消化吸收代谢，制备一种改善断奶仔猪腹泻的富硒加氏乳杆菌，可有效降低断奶仔猪的腹泻率，提高断奶仔猪的免疫力及营养物质消化率，降低断奶仔猪病死率，提高生猪养殖的生产成绩，降低养殖成本。目前未见有关改善断奶仔猪腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂的制备方法相关专利。
发明内容：
本发明的目的是提供一种能有效的提高有机硒转化效率的改善断奶仔猪腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂的制备方法及应用。
本发明的提高有机硒转化效率的改善断奶仔猪腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂的制备方法，其是将加氏乳杆菌接种到发酵转化培养基中发酵，发酵温度30-37℃，发酵5-9小时后，以变速流加的方式流加已灭菌冷却的亚硒酸钠，维持硒浓度为10-100μg/ml，控制整个转化发酵过程pH 5.0-6.0，温度28-35℃，转化发酵时间24-36小时，由此制得改善仔猪断奶腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂。
经富硒含量和加氏乳杆菌活菌数检测，菌液有机硒含量8-90μg/mL，转化率80％以上，加氏乳杆菌活菌数6.0×108cfu/mL～3.0×109cfu/mL。
优选，所述的发酵转化培养基是每升含有氯化钠：10-20g、糖蜜10-30g、大豆蛋白胨5-10g、酵母抽提物1-5g、亚硒酸钠3-8mg、碳酸钙10-30g，pH 6.8。
优选，所述的发酵是在发酵罐中发酵，发酵罐的装液量是60-70％体积。
优选，所述的加氏乳杆菌是以一级种子液的形式按照体积比3-8％的比例接种到发酵转化培养基中，所述的一级种子液是浓度为：5.0×108cfu/mL～2.0×109cfu/mL的菌液，进一步优选是9.2×108cfu/mL～1.6×109cfu/mL的菌液。
优选，所述的一级种子液是通过以下方法制备的：
将液体菌种以3-6％的接种量转接到含有一级发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量为70-80％，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间为16-24小时，制成一级种子液；
所述的一级发酵培养基每升含有蛋白胨10g、葡萄糖3g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温80 1mL、碳酸钙10g，pH6.8。
所述的液体菌种是5.0×108cfu/mL～2.0×109cfu/mL的加氏乳杆菌菌液，进一步优选是6.2×108cfu/mL～9.8×108cfu/mL的加氏乳杆菌菌液。
优选，所述的液体菌种是通过以下方法制备的：
将加氏乳杆菌CGMCC 1.3224，划线接种到改良的MRS琼脂试管斜面，37±1℃培养18-28小时；然后转接到改良的MRS液体培养基中，37±1℃静置培养18h-30h，获得液体菌种；
所述的改良的MRS液体培养基每升含有蛋白胨10g、葡萄糖3g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温80 1mL、碳酸钙10g，pH6.8，所述的改良的MRS琼脂是在改良的MRS液体培养基上加入20g/L的琼脂。
本发明的第二个目的是提供上述富硒加氏乳杆菌菌剂在改善断奶仔猪腹泻的制剂中的应用。
常规发酵加氏乳杆菌其发酵液的pH随发酵时间菌体产酸量增加，发酵液的pH值降低，当活菌数达到生长对数稳定和衰退期，菌液的pH值在4.2-4.8之间。发酵加氏乳杆菌最佳生长pH值是6.8左右。而本发明发现，控制加入无机硒化合物的时间和严格控制pH在5.0-6.0之间，菌体细胞无机硒转化有机硒的效率最高。流加液体亚硒酸钠的开始时间和严格控制加氏乳杆菌将无机硒转化有机硒过程的pH是本发明菌剂的关键点。本发明中所写转化发酵参数(流加开始时间、转化pH控制、温度和发酵时间)所得富硒加氏乳杆菌的有机硒的转化率比直接在发酵液中添加亚硒酸钠提高了75％以上。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、该工艺制备方法简单，所用发酵培养基原料安全易得。
2、采样微生物发酵吸收代谢生物技术，制备富含有机硒硒加氏乳杆菌，可提高断奶仔猪对硒的利用率，减少无机硒因利用率不高排除体外造成环境污染。同时富含有机硒硒加氏乳杆菌可效降低断奶仔猪的腹泻率，增强断奶仔猪的免疫力，提高其营养物质消化率，降低断奶仔猪病死率，提高生猪养殖的生产成绩，降低养殖成本。
3、本发明的改善断奶仔猪腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂可替代断奶仔猪腹泻中抗生素或药物的使用，降本增效，绿色健康，减少断奶仔猪机体和养殖环境的抗生素及药物残留。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1菌种活化
首先制菌种，无菌开启冻干保藏菌种加氏乳杆菌(来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号：CGMCC 1.3224)，划线接种到改良的MRS琼脂试管斜面，37±1℃培养18小时；然后转接到改良的MRS液体培养基中，37±1℃静置培养18小时，形成种子液，其浓度为6.2×108cfu/mL。
2培养发酵
2.1一级种子液制备
三角瓶中的种子液以体积比3％的接种量转接到含有一级发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量为70％，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间为16小时，制成一级种子液，其浓度为9.2×108cfu/mL。
2.2培养发酵无机硒转化有机硒
将一级种子液以体积比3％的接种量转接到改良的含亚硒酸钠液态发酵转化培养基中进行发酵，发酵罐装液量为60％，发酵温度30℃，发酵5小时(pH≤5.0)后，以变速流加的方式流加已灭菌冷却的亚硒酸钠(亚硒酸钠添加量为：发酵液中维持硒浓度为10μg/mL)。用6mol/LNaOH调节pH，控制整个转化发酵过程pH 5.0，温度28℃，转化发酵时间24小时，由此制得改善仔猪断奶腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂。经富硒含量和加氏乳杆菌活菌数检测，菌液有机硒含量8.62μg/mL，转化率86.2％，加氏乳杆菌活菌数1.2×109cfu/mL。
3培养基
3.1所述的改良的MRS培养基，一级发酵培养基均为：在1L的体系里面：将蛋白胨10g、葡萄糖3g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温80 1mL、碳酸钙10g、加水至1000mL，pH6.8；115℃灭菌30min。固体培养基是加入琼脂，琼脂含量是20g/L。
3.2所述的改良的含亚硒酸钠液态发酵转化培养基为：在1L的体系里面：将氯化钠：10g、糖蜜10g、大豆蛋白胨5g、酵母抽提物1g、亚硒酸钠3mg、碳酸钙10g，pH 6.8，加水至1000mL，115℃灭菌30min。
4上述所制得的改善仔猪断奶腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂为试验组Ⅰ，下表中试验组Ⅱ和Ⅲ制备方法同试验组I，只是发酵条件不同，具体如表1所示，各实验组发酵期间流加相同含量的亚硒酸钠，试验组Ⅱ转化过程控制pH6.8为发酵培养基初始pH值，而试验组Ⅲ则不控制pH值，使其自然发酵。各组获得的富硒加氏乳杆菌菌剂的试验结果如下：
表1
结果显示，本发明所制得的富硒加氏乳杆菌菌剂试验组Ⅰ有机硒转化率比试验组Ⅱ和Ⅲ分别提高了46.85％和78.10％，有机硒转化率与加氏乳杆菌的活菌数无直接相关性。
5通过将上述改善仔猪断奶腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂按如下试验设计进行，试验组Ⅰ和Ⅲ添加的菌剂活菌数一致，试验Ⅱ和Ⅲ添加的总硒含量一致，养殖试验分组如下：
表2
组别 试验设计 添加物质 菌剂活菌数 添加硒含量
Ctr0 基础饲料 未添加 0
Ⅰ 基础饲料+加氏乳杆菌 加氏乳杆菌 1.2×109cfu/mL
Ⅱ 基础饲料+亚硒酸钠 亚硒酸钠 0 25μg/kg
Ⅲ 基础饲料+本发明富硒加氏乳杆菌 本发明富硒加氏乳杆菌 1.2×109cfu/mL 25μg/kg
将上述制备的加氏乳杆菌及本发明制备的富硒加氏乳杆菌均匀喷涂在断奶仔猪基础饲料上饲喂断奶仔猪，亚硒酸钠按表中含量添加上基础饲料中制成饲喂断难仔猪，各组实验条件一致。
经21d养殖试验，结果显示：与Ctr0相比(对照组的腹泻率：21.25％，病死率是14.1％，血清谷胱甘肽过氧化物酶含量157.33U/Ml,丙二醛含量5.29μmol/L)，试验组Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ断奶仔猪的腹泻率分别比对照组降低了20.73％、10.37％和49.28％，病死率分别比Ctr0降低了27.09％、17.73％和39.79％，血清谷胱甘肽过氧化物酶含量分别比Ctr0提高了29.24％、13.14％和51.91％，血清丙二醛含量分别比Ctr0降低了23.25％、12.85％和52.55％。结果表明：添加本发明的富硒加氏乳杆菌菌剂可降低断奶仔猪的腹泻率，提高断奶仔猪的成活率，增强断奶仔猪的抗氧化能力，且本发明制剂其效果优于普通发酵的加氏乳杆菌及化合物硒。
实施例2
1菌种活化
首先制菌种，无菌开启冻干保藏菌种加氏乳杆菌(来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号：CGMCC 1.3224)，划线接种到改良的MRS琼脂试管斜面，37±1℃培养23小时；然后转接到改良的MRS液体培养基中，37±1℃静置培养24h，形成种子液，其浓度为6.9×108cfu/mL。
2培养发酵
2.1一级种子液制备
三角瓶中的种子液以体积比5％的接种量转接到含有一级发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量为75％，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间为20小时，制成一级种子液，其浓度为1.6×109cfu/mL。
2.2培养发酵无机硒转化有机硒
将一级种子液以体积比5％的接种量转接到改良的含亚硒酸钠液态发酵转化培养基中进行发酵，发酵罐装液量为65％，发酵温度34℃，发酵7小时(pH≤5.0)后，以变速流加的方式流加已灭菌冷却的亚硒酸钠(亚硒酸钠添加量为：发酵液中维持硒浓度为55μg/mL)。用6mol/LNaOH调节pH，控制整个转化发酵过程pH 5.5，温度32℃，转化发酵时间30小时，由此制得改善仔猪断奶腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂，经富硒含量和加氏乳杆菌活菌数检测，菌液有机硒含量49.12μg/mL，转化率89.3％，加氏乳杆菌活菌数1.6×109cfu/mL。
3培养基
3.1所述的改良的MRS培养基，一级发酵培养基均为：在1L的体系里面：将蛋白胨10g、葡萄糖3g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温80 1mL、碳酸钙10g，加水至1000mL，pH6.8；115℃灭菌30min。固体培养基的话，加入20g/L的琼脂。
3.2所述的改良的含亚硒酸钠液态发酵转化培养基为：在1L的体系里面：将氯化钠：15g、糖蜜15g、大豆蛋白胨7.5g、酵母抽提物3g、亚硒酸钠5mg、碳酸钙20g，pH 6.8加水至1000ml，115℃灭菌30min。
4上述所制得的改善仔猪断奶腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂为试验组Ⅰ，下表中试验组Ⅱ和Ⅲ制备方法同试验组I，只是发酵条件不同，具体如表3所示，各实验组发酵期间流加相同含量的亚硒酸钠，试验组Ⅱ转化过程控制pH6.8为发酵培养基初始pH值，而试验组Ⅲ则不控制pH值，使其自然发酵。各组获得的富硒加氏乳杆菌菌剂的试验结果如下：
表3
结果显示，本发明所制得的富硒加氏乳杆菌菌剂试验组Ⅰ有机硒转化率比试验组Ⅱ和Ⅲ分别提高了55.57％和85.65％，有机硒转化率与加氏乳杆菌的活菌数无直接相关性。
5通过将上述菌剂按如下试验设计进行，试验组Ⅰ和Ⅲ添加的菌剂活菌数一致，试验Ⅱ和Ⅲ添加的总硒含量一致，养殖试验分组如下：
表4
组别 试验设计 添加物质 菌剂活菌数 添加硒含量
Ctr0 基础饲料 未添加 0
Ⅰ 基础饲料+加氏乳杆菌 加氏乳杆菌 1.6×109cfu/mL
Ⅱ 基础饲料+亚硒酸钠 亚硒酸钠 0 50μg/kg
Ⅲ 基础饲料+本发明富硒加氏乳杆菌 本发明富硒加氏乳杆菌 1.6×109cfu/mL 50μg/kg
将上述制备的加氏乳杆菌及本发明制备的富硒加氏乳杆菌均匀喷涂在断奶仔猪基础饲料上饲喂断奶仔猪，亚硒酸钠按表中含量添加上基础饲料中制成饲喂断难仔猪，各组实验条件一致。
经21d养殖试验，结果显示：与Ctr0相比(对照组的腹泻率22.33％，病死率是13.8％，血清超氧化物歧化酶含量96.17μmol/L,溶菌酶含量4.91μmol/L)，试验组Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ断奶仔猪的腹泻率分别比对照组降低了18.10％、8.02％和43.70％，病死率分别比Ctr0降低了21.55％、14.92％和34.25％，血清超氧化物歧化酶含量分别比Ctr0提高了23.01％、9.91％和57.02％，血清溶菌酶含量分别比Ctr0提高了20.21％、9.39％和54.90％。结果表明：添加本发明的富硒加氏乳杆菌菌剂可降低断奶仔猪的腹泻率，提高断奶仔猪的成活率，增强断奶仔猪的免疫力，且本发明制剂其效果优于普通发酵的加氏乳杆菌及化合物硒。
实施例3
1菌种活化
首先制菌种，无菌开启冻干保藏菌种加氏乳杆菌(来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号：CGMCC 1.3224)，划线接种到改良的MRS琼脂试管斜面，37±1℃培养28小时；然后转接到改良的MRS液体培养基中，37±1℃静置培养30小时，形成种子液，其浓度为9.8×108cfu/mL。
2培养发酵
2.1一级种子液制备
三角瓶中的种子液以体积比6％的接种量转接到含有一级发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量为80％，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间为24小时，制成一级种子液，其浓度为1.1×109cfu/mL。
2.2培养发酵无机硒转化有机硒
将一级种子液以体积比8％的接种量转接到改良的含亚硒酸钠液态发酵转化培养基中进行发酵，发酵罐装液量为70％，发酵温度37℃，发酵9小时(pH≤5.0)后，以变速流加的方式流加已灭菌冷却的亚硒酸钠(亚硒酸钠添加量为：发酵液中维持硒浓度为100μg/mL)，流加开始时间接种发酵后9小时。用6mol/LNaOH调节pH，控制整个转化发酵过程pH6.0，温度35℃，转化发酵时间36小时，由此制得改善仔猪断奶腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂，经富硒含量和加氏乳杆菌活菌数检测，菌液有机硒含量88.9μg/mL，转化率88.9％，加氏乳杆菌活菌数9.7×108cfu/mL。
3培养基
3.1所述的改良的MRS培养基，一级发酵培养基均为：在1L的体系里面：蛋白胨10g、葡萄糖3g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温80 1mL、碳酸钙10g，加水至1000mL，pH6.8；115℃灭菌30min。固体培养基的话，加入20g/L的琼脂。
3.2所述的改良的含亚硒酸钠液态发酵转化培养基为：在1L的体系里面：将氯化钠20g、糖蜜30g、大豆蛋白胨10g、酵母抽提物5g、亚硒酸钠8mg、碳酸钙30g，pH 6.8加水至1000ml，115℃灭菌30min。
4上述所制得的改善仔猪断奶腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂为试验组Ⅰ，下表中试验组Ⅱ和Ⅲ制备方法同试验组I，只是发酵条件不同，具体如表5所示，各实验组发酵期间流加相同含量的亚硒酸钠，试验组Ⅱ转化过程控制pH6.8为发酵培养基初始pH值，而试验组Ⅲ则不控制pH值，使其自然发酵。各组获得的富硒加氏乳杆菌菌剂的试验结果如下：
表5
结果显示，本发明所制得的富硒加氏乳杆菌菌剂试验组Ⅰ有机硒转化率比试验组Ⅱ和Ⅲ分别提高了45.95％和90.04％，有机硒转化率与加氏乳杆菌的活菌数无直接相关性。
通过将上述菌剂按如下试验设计进行，试验组Ⅰ和Ⅲ添加的菌剂活菌数一致，试验Ⅱ和Ⅲ添加的总硒含量一致，养殖试验分组如下：
表6
组别 试验设计 添加物质 菌剂活菌数 添加硒含量
Ctr0 基础饲料 未添加 0
Ⅰ 基础饲料+加氏乳杆菌 加氏乳杆菌 9.7×108cfu/mL
Ⅱ 基础饲料+亚硒酸钠 亚硒酸钠 0 100μg/kg
Ⅲ 基础饲料+本发明富硒加氏乳杆菌 本发明富硒加氏乳杆菌 9.7×108cfu/mL 100μg/kg
将上述制备的加氏乳杆菌及本发明制备的富硒加氏乳杆菌均匀喷涂在断奶仔猪基础饲料上饲喂断奶仔猪，亚硒酸钠按表中含量添加上基础饲料中制成饲喂断难仔猪，各组实验条件一致。
经21d养殖试验，结果显示：与Ctr0相比(对照组腹泻率24.45％，病死率12.9％，日增重16.88％，血清IgM含量1.08g/L,血清IgG含量6.07g/L,血清SigA0.11μg/L)，试验组Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ断奶仔猪的腹泻率分别比对照组降低了19.64％、12.08％和51.93％，病死率率分别比Ctr0降低了23.76％、15.47％和43.09％，日增重分别比对照组提高了23.46％、14.93％和58.83％，血清IgM含量分别比Ctr0提高了13.89％、7.41％和44.48％，血清IgG含量分别比Ctr0提高了26.50％、12.33％和65.17％，血清SIgA含量分别比Ctr0提高了18.18％、9.09％和45.45％。结果表明：添加本发明的富硒加氏乳杆菌菌剂可降低断奶仔猪的腹泻率，提高断奶仔猪的成活率和日增重，增强断奶仔猪对疾病的抵抗能力，且本发明制剂其效果优于普通发酵的加氏乳杆菌及化合物硒。

Claims (8)

1.一种改善断奶仔猪腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，是将加氏乳杆菌接种到发酵转化培养基中发酵，发酵温度30-37℃，发酵5-9小时后，以变速流加的方式流加已灭菌冷却的亚硒酸钠，维持硒浓度为10-100µg/ml，控制整个转化发酵过程pH5.0-5.5，温度28-35℃，转化发酵时间24-36小时，由此制得改善仔猪断奶腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂；
所述的发酵转化培养基是每升含有氯化钠：10-20g、糖蜜 10-30g、大豆蛋白胨 5-10g、酵母抽提物1-5g、亚硒酸钠3-8mg、碳酸钙 10-30g，pH 6.8。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵是在发酵罐中发酵，发酵罐的装液量是60-70%体积。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的加氏乳杆菌是以一级种子液的形式按照体积比3-8%的比例接种到发酵转化培养基中，所述的一级种子液是浓度为：5.0×108cfu/mL～2.0×109cfu/mL的菌液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的一级种子液是浓度为：9.2×108cfu/mL～1.6×109cfu/mL的菌液。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述的一级种子液是通过以下方法制备的：
将液体菌种以3-6%的接种量转接到含有一级发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量为70-80%，发酵温度37±1℃，密闭静置培养，发酵时间为16-24小时，制成一级种子液；
所述的一级发酵培养基每升含有蛋白胨10g、葡萄糖3g、酵母粉 5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺 2g、磷酸氢二钾 2g、硫酸镁 0.2g、硫酸锰 0.05g、吐温80 1mL、碳酸钙10g，pH6.8；
所述的液体菌种是5.0×108cfu/mL～2.0×109cfu/mL的加氏乳杆菌菌液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的液体菌种是6.2×108cfu/mL～9.8×108cfu/mL的加氏乳杆菌菌液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的液体菌种是通过以下方法制备的：
将加氏乳杆菌CGMCC 1.3224，划线接种到改良的MRS琼脂试管斜面，37±1℃培养18-28小时；然后转接到改良的MRS液体培养基中，37±1℃静置培养18h-30h，获得液体菌种；
所述的改良的MRS液体培养基每升含有蛋白胨10g、葡萄糖3g、酵母粉 5g、牛肉膏10g、乙酸钠 5g、柠檬酸氢二胺 2g、磷酸氢二钾 2g、硫酸镁 0.2g、硫酸锰 0.05g、吐温80 1mL、碳酸钙10g，pH6.8，所述的改良的MRS琼脂是在改良的MRS液体培养基上加入20g/L的琼脂。
8.权利要求1-7任一制备方法制备得到的富硒加氏乳杆菌菌剂在制备改善断奶仔猪腹泻的制剂中的应用。
CN202210588803.8A 2022-05-26 2022-05-26 一种改善断奶仔猪腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂的制备方法及应用 Active CN115161221B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210588803.8A CN115161221B (zh) 2022-05-26 2022-05-26 一种改善断奶仔猪腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂的制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210588803.8A CN115161221B (zh) 2022-05-26 2022-05-26 一种改善断奶仔猪腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂的制备方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115161221A CN115161221A (zh) 2022-10-11
CN115161221B true CN115161221B (zh) 2024-04-02

Family

ID=83483360

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210588803.8A Active CN115161221B (zh) 2022-05-26 2022-05-26 一种改善断奶仔猪腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂的制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115161221B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107028986A (zh) * 2017-03-01 2017-08-11 华中农业大学 防治仔猪腹泻的微生态制剂及其制备方法和应用
CN108048363A (zh) * 2018-01-16 2018-05-18 华侨大学 一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法
CN108504602A (zh) * 2018-04-13 2018-09-07 陕西科技大学 一种富硒乳酸菌的制备方法
CN111040973A (zh) * 2019-12-30 2020-04-21 江南大学 一株可高产2种形态有机硒的鼠李糖乳杆菌及其应用
CN112553111A (zh) * 2020-12-18 2021-03-26 苏州微克生活科技有限公司 提高副干酪乳杆菌有机硒富集量的自动补硒方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107028986A (zh) * 2017-03-01 2017-08-11 华中农业大学 防治仔猪腹泻的微生态制剂及其制备方法和应用
CN108048363A (zh) * 2018-01-16 2018-05-18 华侨大学 一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法
CN108504602A (zh) * 2018-04-13 2018-09-07 陕西科技大学 一种富硒乳酸菌的制备方法
CN111040973A (zh) * 2019-12-30 2020-04-21 江南大学 一株可高产2种形态有机硒的鼠李糖乳杆菌及其应用
CN112553111A (zh) * 2020-12-18 2021-03-26 苏州微克生活科技有限公司 提高副干酪乳杆菌有机硒富集量的自动补硒方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
弓剑.动物微量元素硒营养.中国原子能出版社,2020,第180-181页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115161221A (zh) 2022-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101946850B (zh) 一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料及其制备方法和用途
CN103173371B (zh) 酿酒酵母与嗜酸乳杆菌的饲料用复合微生物制剂的生产
CN101974463B (zh) 罗伊氏乳杆菌及其复合活菌制剂
CN106962594B (zh) 一种富硒发酵豆粕、制备方法及应用
CN111733091B (zh) 一种枯草芽孢杆菌用发酵培养基及其制备方法、枯草芽孢杆菌制剂的制备方法
CN103184174B (zh) 培养基中含腐植酸钠饲料用枯草芽孢杆菌生物制剂的生产
CN102409007A (zh) 一种芽孢杆菌微生态制剂及其液固结合发酵制备工艺
CN104371960A (zh) 复合菌剂及所采用的复合微生物的连续发酵法
CN115074290B (zh) 一种联产苯乳酸和γ-氨基丁酸的干酪乳杆菌及其应用
CN111593010B (zh) 一株植物乳杆菌及应用该菌株生产发酵饲料的方法
CN101836688B (zh) 一种不含抗生素的微生物发酵饲料的制备方法
CN114107111B (zh) 一种丁酸梭菌的发酵方法及其微生态制剂和应用
CN111685235A (zh) 一种仔猪用植物乳杆菌发酵液体全价饲料的制备方法
CN113773996A (zh) 一种饲用枯草芽孢杆菌的制备方法及其应用
CN1908155B (zh) 一种微生物活菌组合及其制备方法
CN114304379A (zh) 一种含有复合微生物菌剂的发酵饲料的制备方法
CN108029853B (zh) 发酵菌液、包含其的应用于哺乳母猪的产品及产品的制备方法和应用
CN103756922A (zh) 一种生命结合态有机酵母蛋白硒产品生产方法和应用
CN104232547A (zh) 一种用于羊饲料的微生物菌群添加剂及其制备方法
CN115161221B (zh) 一种改善断奶仔猪腹泻的富硒加氏乳杆菌菌剂的制备方法及应用
CN116396874A (zh) 一种丁酸梭菌的联合发酵方法
CN110870511A (zh) 一种干湿混合浓缩饲料及其制备方法
CN102907575A (zh) 一种生长猪预混料和配合料
CN113234632B (zh) 一种通过发酵控制提高罗伊氏乳杆菌冻干存活率的方法
CN114231434A (zh) 一种用于饲用添加剂的丁酸梭菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant