CN101732704A - 兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的制法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种制备兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的方法，该方法包括以下步骤：首先将兔病毒性出血症毒株CD_85-2毒株接种于家兔，无菌采集24-96小时内死亡家兔的心、肝、脾、肺或肾，并剔除其上的结缔组织；再将其捣碎、过滤后配成乳剂，并对该乳剂进行灭活；将兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17菌株进行复活，再将复活后的菌株进行增殖培养，将培养得到的含有A型多杀性巴氏杆菌菌株的C_51-17菌液进行灭活；将灭活后的菌液与佐剂进行混合并浓缩，得到含有A型多杀性巴氏杆菌C_51-17的菌液，再将其与灭活乳剂混合，得到所述的二联灭活疫苗。本发明方法获得的二联灭活疫苗具有安全性好、免疫效力高、保存期长的优点。

Description

兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的制法

技术领域

本发明涉及一种制备兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的方法。

背景技术

兔病毒性出血症是1984年首次在我国苏南地区爆发的一种兔的烈性传染病。主要危害青年和成年兔，死亡率高达90％以上，而对2月龄以下的幼年兔不致病。该病的病理变化以全身各实质器官出血为特征，尤其以气管、肺、肝、肾最为明显。该病流行期间，在疫区兔场使用各类抗菌素，磺胺类药物进行治疗，均未能降低发病率和死亡率。目前在疫区采集、分离、鉴定、选育得到了一株免疫原性良好的兔病毒性出血症病毒CD_85-2株，用于灭活疫苗的生产，在四川地区使用有很好的预防效果。

兔巴氏杆菌病是由兔多杀性巴氏杆菌引起的兔的出血性败血症。引起家兔出血性败血症死亡的多杀性巴氏杆菌的血清型是A型，目前全国各厂家生产预防该病的疫苗较多，使用菌株差异很大。由中国兽医药品监察所鉴定、保管、供应的兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17作生产用菌种，实践证明该菌种的免疫原性良好。然而根据现有疫苗的制备方式，将病毒毒株或者菌株灭活后制备而成的疫苗，常常存在生物安全性差、副反应大、产品质量不稳定等问题。目前世界上很多国家已经停止使用灭活疫苗，也禁止从使用灭活疫苗的国家进口畜产品。

随着养兔业规模化、集约化的发展，其他几大阻碍养兔业发展的传染病仍然流行，如巴氏杆菌病、魏氏梭菌病等严重威胁养兔业的健康发展，造成了巨大的经济损失。为了满足养兔业疾病防治的需要，需要研制出针对巴氏杆菌病和兔病毒性出血症均为有效的疫苗。

发明内容

本发明的一目的是提供了一种制备安全性好的兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的方法。

本发明提供了一种制备兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的方法，该方法包括以下步骤：

a.首先将兔病毒出血症毒株CD_85-2接种于家兔，采集接种后24-96小时以内死亡家兔的心、肝、脾、肺或肾，并剔除心、肝、脾、肺或肾上的结缔组织；

b.将剔除结缔组织的死亡家兔的心、肝、脾、肺或肾捣碎、过滤后配成乳剂，并对该乳剂进行灭活；

c.将兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17菌株进行复活，再将复活后的菌株进行增殖培养，将培养得到的含有兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17菌液进行灭活；

d.将步骤c得到的灭活后的菌液与佐剂进行混合，静止，得到含有兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17的菌液；

e.将步骤b得到的灭活乳剂和步骤d得到的含有兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17的菌液混合，得到兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗。

优选地，在所述的步骤d和步骤e之间还包括以下步骤：将所述的含有兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17的菌液进行浓缩，使得该菌液中兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17的浓度为浓缩前的1.5倍。

灭活后的菌液进行浓缩，使得A型多杀性巴氏杆菌C_51-17的浓度为浓缩前的1.5倍。

本发明中的兔病毒性出血症病毒CD_85-2是发明人从四川荥经、酉阳、雅安和成都郊区四个疫区采集回数个自然感染毒，从血凝价、特异性、毒力、免疫原性、纯净性方面进行鉴定，筛选出的毒力强、免疫原性好、血凝价高的菌株。所述兔病毒性出血症病毒(拉丁名：Rabbit hemorrhagicdisease virus)CD_85-2，其保藏编号为CGMCC No.2705，该病毒毒株已于2008年10月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101)进行了生物材料保藏。

引起家兔出血性败血症死亡的多杀性巴氏杆菌的血清型是A型，目前全国各厂家生产预防该病的疫苗较多，使用菌株差异很大。所述兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌(拉丁名：Rabbit Pasteurella.multocida capsularserotypes A)C_51-17菌株，其保藏编号为CGMCC No.2704，该菌株已于2008年10月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101)进行了生物材料保藏。所述的兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌的简称为兔多杀巴氏杆菌。

优选地，在所述的步骤d或步骤e之后还包括以下步骤：向步骤d得到的含有兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17的菌液或步骤e得到的混合菌液中添加防腐剂。

该防腐剂优选为硫柳汞。

优选地，兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗中含有0.05-0.07g/头份的捣碎家兔的心、肝、脾、肺或肾和50-10³亿个菌/头份的兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17。在该灭活疫苗中，每头份的量为1ml。因为在该疫苗中对捣碎家兔的心、肝、脾、肺或肾的量有要求，在该疫苗中，只要捣碎家兔的心、肝、脾、肺或肾的量在0.05-0.07g/头份范围内就可以满足要求。同样对于该疫苗中的兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17，只要该菌种的量在50-10³亿个菌/头份就可以满足要求。

优选地，所述的步骤a为：将兔病毒性出血症毒株CD_85-2用生理盐水作10倍稀释，接种体重1.5-2.0kg的家兔，每只皮下注射1ml，无菌采集接种后24-96小时以内死亡时间在1小时内家兔的具有组织病理变化的心、肝、脾、肺或肾。

优选地，无菌采集接种后24-96小时以内死亡时间在1小时内家兔的具有组织病理变化的肝或脾。

优选地，家兔选自2月龄以上的1.5-2.0kg体重的兔病毒出血症抗体为阴性的家兔。本发明中的实验家兔的年龄只要在2月龄以上均可，即使老年的家兔不受影响。

兔病毒性出血症病毒只对2月龄以上家兔易感染，对其他动物不感染，同时难以在细胞培养方面取得突破，因此采用兔病毒性出血症毒株CD_85-2增殖病毒用易感家兔来生产病毒，其标准为来自非疫区的未经免疫的，体重在1.5kg-2.0kg的健康抗体阴性家兔。通过在实验室的试验和中试的规模化生产中，一直采用此要求的家兔生产病毒，生产病毒技术稳定，病毒增殖滴度始终可保持在2¹⁰个菌/ml以上。

优选地，步骤b为将剔除结缔组织的死亡家兔的心、肝、脾、肺或肾用生理盐水捣碎，过滤后配成乳剂，乳剂中捣碎的心、肝、脾、肺或肾与生理盐水重量比为1∶9。

优选地，步骤b加入按乳剂重量计0.4％的甲醛，在30-40℃灭活36-48小时。

更优选地，在37℃灭活36小时，在灭活时每间隔4-6小时搅拌一次。

发明人分别用浓度为0.2％、0.3％、0.4％和0.5％的甲醛溶液，37℃灭活36、48小时，灭活结束后用二只易感家兔作灭活检验。当甲醛浓度为0.2-0.3％时，37℃灭活36或48小时，经灭活检验证明不能将病毒完全灭活；当甲醛浓度为0.4％时，接种家兔无任何不良反应，证明确实灭活；当甲醛浓度为0.5％时，部分家兔有短暂停食现象，表明甲醛过量。因此采用乳剂重量为0.4％的甲醛在37℃灭活36小时。

优选地，步骤c将兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17菌株接种于含0.1％裂解血球全血的马丁肉汤中，37℃培养24小时进行复活，再将复活的菌株接种于含0.1％裂解血球全血及4％健康动物血清的改良马丁琼脂平板培养基增殖培养，在36-37℃下，增殖培养18-24小时。

优选地，在步骤d中向增殖得到的含有兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17的菌液中加入其总重量0.15％的甲醛，在30-40℃灭活10-15小时。

更优选在37℃灭活12小时。

经检验合格的A型多杀性巴氏杆菌液，经过大量试验数据证实按总量的0.15％加入甲醛溶液，于37℃灭活12小时，其间搅拌数次。灭活结束后用马丁琼脂作灭活检验，无菌生长，证实该菌已经灭活。

优选地，步骤e中的佐剂为铝盐，灭活后的菌液和铝盐的重量比为5∶1。

优选地，步骤a中的兔病毒性出血症病毒CD_85-2毒株和步骤c中的兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17菌株均为继代3代以内的菌株。

发明人通过对基础菌株的传代研究和鉴定，以及对生产用菌株的鉴定，A型多杀性巴氏杆菌基础种子传代次数7代，生产菌种采用传代7代后继代不超过3代的菌种；兔病毒性出血症CD_85-2基础毒种传代次数为6代，生产毒种采用传代6代后继代不超过3代的菌种，可保证疫苗的免疫效果。

与现有技术不同的是：本发明没有直接采用兔病毒性出血症毒株CD_{8 5-2}制备疫苗，而是首先将其接种于家兔，采集接种后24-96小时以内死亡家兔的心、肝、脾、肺或肾，并剔除心、肝、脾、肺或肾上的结缔组织，将剔除结缔组织的死亡家兔的心、肝、脾、肺或肾捣碎、过滤后配成乳剂，并灭活该乳剂，将灭活的乳剂和培养得到的含有兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17的灭活菌液混合得到本发明的疫苗。相对于直接将兔病毒性出血症毒株CD_85-2和兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17灭活后制成的灭活疫苗，按此方法得到的疫苗的安全性更好，同时也可以保证疫苗的免疫效果。进行本发明采用本发明方法获得的兔病毒性出血症、A型多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗经安全性检验：皮下或肌肉注射接种于1月龄的易感染家兔，与接种生理盐水的家兔对照，免疫注射的家兔精神状态无异常、食欲正常、体温无变化，注射部位无不良反应。同时接种于怀孕健康的母兔进行安全性检测，结果表明免疫后的妊娠母兔，经过观察，妊娠母兔的精神状态无异常、食欲正常、体温无变化，注射部位无不良反应，产仔正常，因此通过本发明方法制备而成的疫苗是安全的。

本发明方法获得的疫苗的免疫效力检验：通过本发明方法制备而成的6批实验室产品分别免疫经抗体检测均为阴性的健康断奶仔兔及成年兔进行免疫，免疫后分别对断奶仔兔及成年兔进行攻毒，其结果表明：疫苗后断奶仔兔，对兔病毒性出血症保护率均为100％，对兔多杀巴氏杆菌有75％的保护率；用该疫苗免疫成年兔，对兔病毒性出血症保护率均为100％；对兔多杀巴氏杆菌有75％以上的保护率。

关于疫苗的免疫期，用实验室制备疫苗在兔场进行免疫期试验，结果表明该疫苗的免疫期：兔病毒性出血症为12个月，兔多杀巴氏杆菌病免疫期5个月。这可满足临床上对家兔的免疫要求。

关于疫苗的保存期，将采用本发明方法制备而成的疫苗存放在2-8℃阴暗处达到12个月及20-25℃条件下存放10天。以1个使用剂量对1.5-2.0kg健康易感家兔进行免疫，进行攻毒保护试验，均得到保护，这充分证实在上述保存条件和保存期内，疫苗质量没有发生改变。

关于疫苗的最小免疫剂量，发明人在研制过程中进行了疫苗对家兔的最小免疫剂量的测定，同时设相应非免疫兔作为对照。免疫后14、21天分别进行攻毒保护试验，结果证实该疫苗最小免疫剂量为0.5ml。考虑临床注射的方便及生产成本、免疫效果保证，将该疫苗使用剂量定为1ml。

附图说明

本发明提供的兔病毒性出血症病毒(拉丁名：Rabbit hemorrhagicdisease virus)CD_85-2，其保藏编号为CGMCC No.2705，该病毒毒株已于2008年10月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101)进行了生物材料保藏。

所述兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌(拉丁名：Rabbit Pasteurella.multocida capsular serotypes A)C_51-17菌株，其保藏编号为CGMCC No.2704，该菌株已于2008年10月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101)进行了生物材料保藏。

图1表示制备本发明的兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的流程图。

具体实施方式

实施例1

兔病毒出血症CD_85-2毒株的传代培养

将保藏后的兔病毒性出血症毒株CD_85-2用生理盐水作10倍稀释，接种于二月龄的，来自非疫区的未经免疫的，体重在1.5kg的健康抗体阴性家兔。每只皮下注射1ml，在该家兔中的病毒滴度可保持在2¹⁰个菌/ml以上。无菌采集接种后24-96小时内死亡的体重1.5kg的家兔，无菌采集死亡时间不超过1小时的家兔且具有组织病理变化的心、肝、肺、脾或肾，并剔除其上的结缔组织，本例中选肝作为毒种。

采用传3代的毒株CD_85-2接种，将剔除结缔组织的死亡兔的心、肝、肺、脾或肾，优选肝加生理盐水捣碎、过滤配制成捣碎的内脏器官与生理盐水的体积比为1∶9的组织乳剂，再分别加入浓度为0.2％、0.3％、0.4％和0.5％的甲醛溶液进行灭活，灭活条件为：37℃灭活36小时，间隔4-6小时搅拌一次，灭活结束后用二只易感家兔作灭活检验。当甲醛浓度为0.2-0.3％时，37℃灭活36、48小时，经灭活检验证明不能将病毒完全灭活；当甲醛浓度为0.4％时，接种家兔无任何不良反应，证明确实灭活；当甲醛浓度为0.5％时，部分家兔有短暂停食现象，表明甲醛过量。所以选择的灭活条件为：用浓度为0.4％的甲醛进行灭活，灭活温度为37℃，持续的灭活时间36小时，并且在灭活时每隔4小时搅拌一次，得到灭活的乳剂。

将保藏的兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17菌株接种于含0.1％裂解血球全血的马丁肉汤中，37℃培养24小时进行复活，再将复活的菌株接种于含0.1％裂解血球全血及4％健康动物血清的改良马丁琼脂平板培养基增殖培养，在36℃下，增殖培养18小时。本实施例中的含0.1％的裂解血球全血的马丁肉汤购自于青岛生命科学院青岛高科园海博生物技术公司，商品名为改良马丁液体培养基。含0.1％的裂解血球全血及4％健康动物血清的改良马丁琼脂平板培养基由本单位自行配制，其配方如下：改良马丁肉汤1000ml，5g蛋白胨，10g琼脂。

向增殖培养得到的含有兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17菌液中加入其总重量0.15％的甲醛，在37℃灭活12小时。灭活结束后用马丁琼脂作灭活检验，无菌生长，确认已灭活，将灭活后的菌液5体积份加入灭菌铝盐1体积份，静止静置2-3日，去除上清液，使其进行浓缩，浓缩后菌液中的兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌的浓度为浓缩前兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌浓度的1.5倍，即为制疫苗用菌液抗原。再向该菌液抗原中加入相对于兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌菌液体积比为1∶1的CD_85-2的灭活乳剂，按菌液和乳剂总重量的0.01％加入硫柳汞，充分搅拌均匀，制成兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病二联灭活疫苗。经检验，该疫苗中含有0.05g/头份的捣碎家兔的内脏和50亿个菌/头份的兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17。

按以上工艺我们生产了六批实验室制品和六批临床试验用疫苗共150万头份，合格率100％，证实该工艺是完善和可行的。

实施例2

将保藏后的兔病毒性出血症毒株CD_85-2用生理盐水作10倍稀释，接种于5年龄的，来自非疫区的未经免疫的，体重在2.0kg的健康抗体阴性家兔。每只皮下注射1ml，在该家兔中的病毒滴度可保持在2¹⁰以上。无菌采集接种后24-96小时内死亡的体重2.0kg的家兔，无菌采集死亡时间不超过1小时的家兔且具有组织病理变化的心、肝、肺、脾或肾，并剔除其上的结缔组织，本例中选脾作为毒种。

采用传3代的毒株CD_85-2接种，将剔除结缔组织的死亡兔的心、肝、肺、脾或肾，选脾加生理盐水捣碎、过滤配制成捣碎的内脏器官与生理盐水的体积比为1∶9的组织乳剂，再分别加入浓度为0.2％、0.3％、0.4％和0.5％的甲醛溶液进行灭活，灭活条件为：37℃灭活36小时，间隔4-6小时搅拌一次，灭活结束后用二只易感家兔作灭活检验。当甲醛浓度为0.2-0.3％时，37℃灭活36、48小时，经灭活检验证明不能将病毒完全灭活；当甲醛浓度为0.4％时，接种家兔无任何不良反应，证明确实灭活；当甲醛浓度为0.5％时，部分家兔有短暂停食现象，表明甲醛过量。所以选择的灭活条件为：用浓度为0.4％的甲醛进行灭活，灭活温度为37℃，持续的灭活时间36小时，并且在灭活时每隔6小时搅拌一次，得到灭活的乳剂。

将保藏的兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17菌株接种于含0.1％裂解血球全血的马丁肉汤中，37℃培养24小时进行复活，再将复活的菌株接种于含0.1％裂解血球全血及4％健康动物血清的改良马丁琼脂平板培养基增殖培养，在36℃下，增殖培养18小时。本实施例中的含0.1％的裂解血球全血的马丁肉汤购自于青岛生命科学院青岛高科园海博生物技术公司的商品名为改良马丁液体培养基。含0.1％的裂解血球全血及4％健康动物血清的改良马丁琼脂平板培养基自行配制，其配方如下：改良马丁肉汤1000ml，5g蛋白胨，10g琼脂。

向增殖培养得到的兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17菌液中加入其总重量0.15％的甲醛，在37℃灭活12小时。灭活结束后用马丁琼脂作灭活检验，无菌生长，确认已灭活，将灭活后的菌液5体积份加入灭菌铝盐1体积份，静止静置2-3日，去除上清液，使其进行浓缩，浓缩后菌液中的兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌的浓度为浓缩前的1.5倍，即为制疫苗用菌液抗原。再向该菌液抗原中加入其重量的0.02％的硫柳汞，再向该菌液抗原中加入相对于A型多杀性巴氏杆菌菌液体积比为1∶1的CD_85-2的灭活乳剂，充分搅拌均匀，制成兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病二联灭活疫苗。经检验，该疫苗中含有0.05g/头份的捣碎家兔的心、肝、脾、肺或肾和50亿个菌/头份的兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17。

按以上工艺我们生产了六批实验室制品和六批临床试验用疫苗共150万头份，合格率100％，证实该工艺是完善和可行的。

实施例3

疫苗的安全性检验

将按照实施例1方法或得到的疫苗皮下或肌肉单剂量1ml接种1月龄健康易感家兔进行安全性试验：将试制的疫苗皮下或肌肉接种1月龄健康易感家兔各4只，1ml/只，另外向4只家兔同时注射1ml/只的灭菌生理盐水的非免疫对照，测定体温，观察10日。结果免疫注射后，精神状态无异常，食欲正常，体温无明显变化，注射部位无炎症等不良反应。

皮下或肌肉单剂量1ml重复接种1月龄健康易感家兔的安全性试验：将试制的疫苗皮下或肌肉接种1月龄健康易感家兔各4只，1ml/只，7天后重复接种一次，另设4只家兔同时注射并重复注射1ml/只灭菌生理盐水的非免疫对照，测定体温，观察10日。结果免疫注射后，精神状态无异常，食欲正常，体温无明显变化，注射部位无炎症等不良反应。

皮下或肌肉超剂量4ml接种1月龄健康易感家兔的安全性试验：将试制的疫苗皮下或肌肉接种1月龄健康易感家兔各4只，4ml/只，另设4只家兔同时注射4ml/只灭菌生理盐水的非免疫对照，测定体温，观察10日。结果免疫注射后，精神状态无异常，食欲正常，体温无明显变化，注射部位无炎症等不良反应。

皮下或肌肉两倍剂量2ml接种怀孕健康易感妊娠10-15天母兔的安全性试验：将试制的疫苗皮下或肌肉接种妊娠10-15天健康易感家兔各4只，2ml/只，另设4只同时并重复注射1ml/只灭菌生理盐水的非免疫对照，测定体温，观察产仔情况等。结果免疫注射后，精神状态无异常，食欲正常，体温无明显变化，注射部位无炎症等不良反应，产仔情况正常。

以上试验结果表明该疫苗是安全的。

实施例4

疫苗效力的检验

6批实验室产品(0201001、0202002、0202003、0202004、0202005、0202006)分别免疫经抗体检测均为阴性的健康断奶仔兔及成年兔各4只/组，1ml/只，免疫后14、21天，将条件相同的对照兔和断奶仔兔及成年兔一起分别进行攻毒，其结果：0201001-0202006批疫苗分别免疫断奶仔兔，对兔病毒性出血症保护率均为100％，对照死亡率为15/16；兔巴氏杆菌保护率分别为3/4、3/4、3/4、3/4即约有75％的保护率，对照保护率为0％。0201001-0202006批疫苗分别免疫成年兔，对兔病毒性出血症保护率均为100％，对照死亡14/16；兔巴氏杆菌保护率分别为4/4、3/4、3/4、3/4即有75％以上的保护率，对照保护率为0％。

由此我们确定该疫苗成品检验中对兔病毒性出血症攻毒免疫保护4/4，对兔多杀性巴氏杆菌病攻毒免疫保护3/4，因此本发明方法制备而成的疫苗对兔病毒性出血症和兔多杀性巴氏杆菌病均有保护效力。

实施例5

疫苗免疫期

用实验室生产的6批疫苗(0201001、0202002、0202003、0202004、0202005、0202006)在定点自繁兔场进行免疫期试验，每批疫苗分5组，每组各接种10只1.5-2.0kg易感家兔和1月龄断奶仔兔，每只皮下注射1个使用剂量，各组分两部分，同时设立5只非免疫兔作为空白对照。经免疫120日、180日、240日、300日、360日后，作攻毒保护试验，其结果兔病毒性出血症免疫保护一直为100％，兔巴氏杆菌病150天免疫保护仍有75％的保护率。

因此规定该疫苗的免疫期：兔病毒性出血症为12个月，兔巴氏杆菌病免疫期5个月。这可满足临床上对家兔的免疫要求。

实施例6

疫苗保存期试验

将四批实验室制品存放在2-8℃阴暗处9个月、12个月、15个月、18个月及20-25℃条件下存放10天。以1个使用剂量对1.5-2.0kg健康易感家兔进行免疫，分别在免疫后14、21天分别进行攻毒保护试验，均得到保护，充分证实在上述保存条件和保存期内，疫苗质量没有发生改变。因此该疫苗在2-8℃的保存条件下，保存期为可以达到12个月。

实施例7

关于疫苗最小免疫剂量的确定

我们在研制过程中进行了疫苗对家兔的最小免疫剂量的测定，结果证实：采用将疫苗以0.25ml、0.5ml、0.75ml、1ml四种不同剂量组免疫1.5kg左右健康易感家兔，同时设相应非免疫兔作为对照。免疫后14、21天分别进行攻毒保护试验，其结果：0.25ml组兔病毒性出血症免疫保护3/4，兔巴氏杆菌免疫保护为2/4；0.5ml、0.75ml、1ml组兔病毒性出血症免疫保护均为4/4，兔巴氏杆菌病免疫保护为3/4、3/4、3/4。通过试验证实该疫苗最小免疫剂量定为0.5ml。

Claims (10)

1.一种制备兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的方法，该方法包括以下步骤：

a.首先将兔病毒性出血症毒株CD_85-2接种于家兔，采集接种后24-96小时以内死亡家兔的心、肝、脾、肺或肾，并剔除心、肝、脾、肺或肾上的结缔组织；

b.将剔除结缔组织的死亡家兔的心、肝、脾、肺或肾捣碎、过滤后配成乳剂，并对该乳剂进行灭活；

c.将兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17菌株进行复活，再将复活后的菌株进行增殖培养，将培养得到的含有兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17菌液进行灭活；

d.将步骤c得到的灭活后的菌液与佐剂进行混合，静止，得到含有兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17的菌液；

e.将步骤b得到的灭活乳剂和步骤d得到的含有兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17的菌液混合，得到兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，优选地，在所述的步骤d和步骤e之间还包括以下步骤：将所述的含有兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17的菌液进行浓缩，使得该菌液中兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17的浓度为浓缩前的1.5倍。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述的步骤d或步骤e之后还包括以下步骤：向步骤d得到的含有兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17的菌液或步骤e得到的混合菌液中添加防腐剂，该防腐剂优选为硫柳汞。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤e得到的兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗中含有0.05-0.07g/头份的捣碎家兔的心、肝、脾、肺或肾和50-10³亿个菌/头份的兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述的步骤a为：将兔病毒性出血症毒株CD_85-2用生理盐水作10倍稀释，接种体重1.5-2.0kg的家兔，每只皮下注射1ml，无菌采集接种后24-96小时以内死亡时间在1小时内家兔的具有组织病理变化的心、肝、脾、肺或肾，优选地，无菌采集接种后24-96小时以内死亡时间在1小时内的家兔的具有组织病理变化的肝或脾。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中的家兔选自2月龄以上的1.5-2.0kg体重的兔病毒性出血症抗体为阴性的家兔。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中的步骤b为将剔除结缔组织的死亡家兔的心、肝、脾、肺或肾用生理盐水捣碎，过滤后配成乳剂，乳剂中捣碎的心、肝、脾、肺或肾与生理盐水重量比为1∶9。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤b加入按乳剂重量计0.4％的甲醛，在30-40℃灭活36-48小时，优选在37℃灭活36小时并且在灭活时每间隔4-6小时搅拌一次。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中步骤c将兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17菌株接种于含0.1％裂解血球全血的马丁肉汤中，37℃培养24小时进行复活，再将复活的菌株接种于含0.1％裂解血球全血及4％健康动物血清的改良马丁琼脂平板培养基增殖培养，在36-37℃下，增殖培养18-24小时。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在步骤d中向增殖培养得到的含有兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C_51-17的菌液中加入其总重量0.15％的甲醛，在30-40℃灭活10-15小时，优选在37℃灭活12小时。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤e中的佐剂为铝盐，灭活后的菌液和铝盐的体积比比为5∶1。

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