JP5551933B2 - 組み換え弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ生物体およびワクチン - Google Patents

Description

（関連する出願への相互参照）
本願は、２００６年４月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／７９２，５５３号の米国特許法§１１９（ｅ）のもとでの優先権を主張する非仮出願であって、米国仮特許出願第６０／７９２，５５３号の内容は、本明細書中でその全体が参考として援用される。

（発明の分野）
本発明は、弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ生物体、これを作成および用いる方法、ならびにムテインα毒素およびこれをコードする核酸に関する。

（発明の背景）
嫌気性細菌病原体は、農業に対する重大な経済的負担である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ科の細菌は、特に負担である。なぜならそれらの細菌は家禽、および他の経済的に有用な家畜に重篤な疾患を生じるからである。これらの生物体を制御するための以前の労力は、動物の給餌における衛生的な手段および抗生物質の投与に依存している。

詳細には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（「Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ」）は、土壌中において、有機物質を崩壊させ、そしてヒトおよび動物の腸管内菌叢の一部として見出される嫌気的な細菌である。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの異なる株は、生成される毒素のスペクトルに依存してＡ〜Ｅの生物型として命名される［非特許文献１；非特許文献２］。生物型Ａ株は、種々のタイプの壊疽および腸疾患の病因として特に重要な型である。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによって生じる特に重要な腸疾患は、ヒトおよび家畜の両方において、壊死、敗血症および溶血を生じる腸の壊疽である壊疽性腸炎（当該分野では、「壊死性腸炎（ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）」として公知）である［非特許文献３；非特許文献４］。鳥類、例えば、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）にとって、壊疽性腸炎は重大な問題である。タイプＡまたはタイプＣのいずれかのＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓは、特にブロイラーのニワトリの生産において重要な損害をもたらし得る［非特許文献５］。壊死性腸炎の激増に関連する損害に加えて、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ関連疾患を有する集団中では生産性が損なわれることが報告されている［非特許文献６］。上で注記されるとおり、動物の飼料に入れられる抗菌剤が、最も一般的な制御方法である。しかし、抗菌剤、例えば、抗生物質は費用がかさみ、かつ細菌耐性の促進に関連する懸念が増大する傾向がある。

さらに近年では、有害なＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種に対するワクチンを提供する試みが行われている。例えば、非特許文献７は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのＡ型およびＣ型のトキソイドと、水酸化アルミニウムアジュバントとに基づく候補のワクチンを実証した。親のメンドリのワクチン接種は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓでの無症候性のチャレンジによって誘導される腸の病変に対して子孫を防御するための特異的な抗体をもたらすことが報告された。無毒化されたＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ毒素から調製された他のトキソイドベースのワクチンが公知である［例えば、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのＡ型、Ｂ型およびＤ型、Ｃｌ．ｏｅｄｅｍａｔｉｅｎｓおよびＣｌ．ｓｅｐｔｉｃｕｍのトキソイドを記載する、特許文献１を参照のこと］。

組み換えトキソイド調製物も提唱されている。例えば、Ｔｉｔｂａｌｌら［特許文献２、特許文献３および特許文献４］は、抗原性Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓペプチドをコードする核酸、ならびにペプチド自体、およびそのペプチドから調製されるワクチンを報告する。天然のＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ α毒素のアミノ酸残基２６１〜３００を有するが、天然の毒素のホスホリパーゼＣおよびスフィンゴミエリンヒドロリジンドメインを欠くペプチドが、例えば、記載されている。これらのペプチドは、天然の毒素に対する免疫防御を誘導することがさらに報告された。さらに、特許文献５は、ムテインのＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ β毒素の抗原性フラグメントに基づいたワクチンを記載する。

トキソイドワクチンは、天然の生物体由来であろうと、または組み換え的に得られようと構わないが、特定の状況下を除いて、免疫の必要な動物に対してトキソイドタンパク質を生成して投与することは経済的に困難であると考えられる（例えば、全生物体ワクチンの他の成分に対してアレルギーであるかまたは感受性であり得るヒトを処置すること）。さらに、タンパク質／トキソイドに基づくワクチンは代表的には、完全な有効性を維持するために反復ブースターワクチン接種を要する。

別の提唱される溶液は、野性型毒素の代わりに、ムテインα毒素を生じる抗原的に活性のウイルスを操作することであった。例えば、非特許文献８は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素の非毒性Ｃドメインを発現する組み換えワクシニアウイルスベクターを実証している。

いくつかの組み換えワクシニアワクチンが過去２０年間に提唱されているが、不幸にも、環境中に生きた感染性のワクシニアウイルスを放出し、それらがこのウイルスに対して耐性でない人々に伝播し得るという安全性に関する長年にわたる懸念が依然として存在する。

Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素（ｐｌｃ遺伝子）は、溶血活性、ホスホリパーゼＣ、スフィンゴミエリナーゼ、ホスホジエステラーゼおよび致死性の活性を含むいくつかの生物学的な活性を保有することが公知である。毒性を減弱するこのα毒素に対する変異を考慮する多数の報告が当該分野にはある。非特許文献９は、非毒性のα毒素を生じる天然に存在するＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ株を記載している。しかし、他の改変体、ただし、毒性の野性型のＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ種に対して免疫防御を惹起するようにこの株を改変することは困難である。

非特許文献１０は、アミノ酸残基２４７〜３７０に由来する毒素の領域単独で、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによって実験的に誘導されるガス壊疽に対してマウスを免疫するのに十分であったことを示した。非特許文献１１は、Ａｓｐ２６９、Ａｓｐ３３６、Ｔｙｒ２７５、Ｔｙｒ３０７およびＴｙｒ３３１における置換がα毒素の毒性を減弱することを報告している。非特許文献１２は、Ａｓｐ−５６，Ａｓｐ−１３０またはＧｌｕ−１５２の置換が、α毒素の毒性の減弱を生じることを報告した。非特許文献１３は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素における、位置６８でのヒスチジンの、グリシンのような天然のアミノ酸での置換が、溶血性、ホスホリパーゼＣ、スフィンゴミエリナーゼの完全な消失、およびムテインα毒素の致死性活性を生じたと報告した。この単一アミノ酸変化は、タンパク質の３つの亜鉛結合ドメインのうちの１つを不活性化すると考えられた。Ｈｉｓ６８の置換によって不活性化されたこの亜鉛結合ドメインは、後にＺｎ２と記された（非特許文献１４）。

前述にかかわらず、ニワトリのような鳥類を含む、集中的に飼育される家畜を、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓを含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種による感染から防御する、安全、経済的かつ有効な方法が依然として当該分野で必要である。

本明細書の任意の引用文献の言及は、このような引用文献が、本出願に対する「先行技術（ｐｒｉｏｒ ａｒｔ）」として利用可能であるという承認と解釈されるべきではない。
米国特許第４，２９２，３０７号明細書 米国特許第５，８５１，８２７号明細書 米国特許第６，４０３，０９４号明細書 米国特許第５，８１７，３１７号明細書 米国特許第６，６１０，３００号明細書 Ｊｕｓｔｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１，６２５３〜６２６２（２００２） ＭｃＤｏｎｅｌ（１９８６）ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ ＯＦ ＢＡＣＴＥＲＩＡＬ ＴＯＸＩＮＳ；Ｆ ＤｏｒｎｅｒおよびＪ Ｄｒｅｗｓ（編）Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．１８８（１１）：１３０９〜１０（１９８６） Ａｌ−ＳｈｅｉｋｈｙおよびＴｒｕｓｃｏｔｔ，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．２１（２）：２５６〜６３（１９７７） ＦｉｃｋｅｎおよびＷａｇｅｎｓ，Ｎｅｃｒｏｔｉｃ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ，Ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒｙ，第１０版、２６１〜２６４頁（１９９７） ＬｏｖｌおよびＫａｌｄｈｕｓｄａｌ，Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３０：７３〜８１（２００１） Ｌｏｖｌａｎｄら、Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３３（１）：８３〜９２（２００４） Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（２）：９７〜１０５（１９９９） Ｓｃｈｏｅｐｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ．６９（１１）：７１９４〜７１９６（２００１） ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎおよびＴｉｔｂａｌｌ、Ｖａｃｃｉｎｅ １１（１２）：１２５３〜１２５８（１９９３） Ａｌａｐｅ−Ｇｉｒｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：５１９１〜５１９７（２０００） Ｎａｇａｈａｍａら、Ｉｎｆｅｃｔ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ．６５：３４８９〜３４９２（１９９７） Ｎａｇａｈａｍａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７７：１１７９〜１１８５（１９９５） Ｊｕｓｔｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：６２５３〜６２６２（２００２）

（発明の要旨）
当該分野における上述の欠点に取り組むために、本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素の実質的に非毒性のムテインをコードする核酸分子を提供する。１つのこのような実施形態では、核酸分子は、配列番号３のアミノ酸配列から少なくとも１８連続アミノ酸残基がなく、この欠失されたアミノ酸残基の１つがＨｉｓ_６８であるアミノ酸配列を含むムテインα毒素をコードする。別の実施形態では、この核酸分子は、配列番号３のアミノ酸配列から少なくとも１２連続アミノ酸残基がなく、この欠失されたアミノ酸残基の１つがＨｉｓ_６８であるアミノ酸配列を含むムテインα毒素をコードする。さらに別の実施形態では、この核酸分子は、配列番号３のアミノ酸配列から少なくとも９連続アミノ酸残基がなく、この欠失されたアミノ酸残基の１つがＨｉｓ_６８であ
るアミノ酸配列を含むムテインをコードする。なお別の実施形態では、この核酸分子は、配列番号３のアミノ酸配列から少なくとも６連続アミノ酸残基がなく、この欠失されたアミノ酸残基の１つがＨｉｓ_６８であるアミノ酸配列を含むムテインをコードする。さらに別の実施形態では、この核酸分子は、配列番号３のアミノ酸配列から少なくとも３連続アミノ酸残基がなく、この欠失されたアミノ酸残基の１つがＨｉｓ_６８であるアミノ酸配列を含むムテインをコードする。したがって、本発明は以下をも提供する。

（１） Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素の実質的に非毒性のムテインをコードする核酸分子であって；該ムテインα−毒素は、少なくとも９つの連続アミノ酸残基を引いた配列番号３のアミノ酸配列を含み；かつ該欠失されたアミノ酸残基の１つがＨｉｓ _６８ である、核酸分子。
（２） 前記ムテインα毒素は、少なくとも１２の連続アミノ酸残基を引いた配列番号３のアミノ酸配列を含み；かつ該欠失されたアミノ酸残基の１つがＨｉｓ _６８ である、項目１に記載の核酸分子。
（３） 前記ムテインα毒素は、少なくとも１８の連続アミノ酸残基を引いた配列番号３のアミノ酸配列を含み；かつ該欠失されたアミノ酸残基の１つがＨｉｓ _６８ である、項目２に記載の核酸分子。
（４） 前記ムテインα毒素は、Ｔｙｒ _６２ からＴｒｐ _７０ にまたがる９つの連続アミノ酸残基を引いた配列番号３を含む、項目１に記載の核酸分子。
（５） 配列番号２の核酸配列を含み；核酸分子のヌクレオチド２６８〜２９４が欠失されている、項目１に記載の核酸分子。
（６） 欠失されたヌクレオチドが単一のＬｅｕ残基をコードするヌクレオチド配列によって置換される、項目５に記載の核酸分子。
（７） Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓα毒素の実質的に非毒性のムテインであって；ムテインα毒素は、配列番号３のアミノ酸配列から少なくとも９連続アミノ酸残基がなくなっており；かつ欠失されたアミノ酸残基の１つがＨｉｓ _６８ である、非毒性のムテイン。
（８） 前記ムテインα毒素が、配列番号３のアミノ酸配列から少なくとも１２連続アミノ酸残基がなくなっており；かつ欠失されたアミノ酸残基の１つがＨｉｓ _６８ である、項目７に記載のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素の実質的に非毒性のムテイン。
（９） 前記ムテインが、配列番号３のアミノ酸配列から少なくとも１８連続アミノ酸残基がなくなっており；かつ欠失されたアミノ酸残基の１つがＨｉｓ _６８ である、項目８に記載のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素の実質的に非毒性のムテイン。
（１０） Ｔｙｒ _６２ からＴｒｐ _７０ にまたがる９連続アミノ酸残基が欠失されておりかつ、単一のＬｅｕ残基によって置換される、項目７に記載のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素の実質的に非毒性のムテイン。
（１１） 非弱毒化のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体の染色体中に項目１に記載の核酸分子を組み込むことによって構築される、弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
（１２） 実質的に非毒性である、項目１１に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
（１３） 前記核酸分子が、非弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓに存在する野性型α毒素をコードする核酸分子の位置に相同である染色体上の位置に配置される、項目１１に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
（１４） Ａ型のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓである、項目１１に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
（１５） 項目１１に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体であって、哺乳動物または鳥類のいずれかである宿主動物から単離された非弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓから構築されたものである、弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
（１６） 前記哺乳動物が、ウシ、ウマおよびブタからなる群より選択される、項目１５に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
（１７） 前記鳥類が、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、ハクチョウ、ハト、ハト、ライチョウまたはヤマウズラである、項目１５に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
（１８） 項目１１に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体を含むワクチン。
（１９） 以下：薬学的に受容可能な緩衝液、賦形剤またはアジュバント、のうち１つ以上をさらに含む、項目１８に記載のワクチン。
（２０） 動物においてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓに対する免疫を誘導する方法であって、項目１８に記載のワクチンの免疫学的に有効な用量を該動物に投与する工程を包含する、方法。
（２１） 前記ワクチンが以下の経路：口腔、筋肉内、静脈内、経皮、皮下または鼻腔内のうちの１つ以上によって投与される、項目２０に記載の方法。
（２２） 前記ワクチンが、前記動物の飼料の上にかぶされる、項目２０に記載の方法。
（２３） 前記ワクチンが、経口投与で与えるために前記動物に噴霧される、項目２０に記載の方法。
（２４） 項目１８に記載のワクチンを含む動物の飼料。
（２５） 非Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む、項目１１に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
（２６） 前記非Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓポリペプチドが非細菌ポリペプチドである、項目２５に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
（２７） 前記非細菌ポリペプチドが鳥類または哺乳動物ポリペプチドである、項目２６に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
（２８） 非細菌性ポリペプチドが鳥類のポリペプチドである、項目２７に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
（２９） 前記非細菌性ポリペプチドがサイトカインである、項目２７に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
（３０） 前記サイトカインがニワトリＩＬ−１８である、項目２９に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
（３１） Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素に見出されるが、項目１１に記載のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素の実質的に非毒性のムテインから失われているエピトープに選択的に結合する抗体であって、野性型Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素から該実質的に非毒性のムテインを識別し得る、抗体。
（３２） 被験体動物がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体によって天然に感染されているか否かを特定するための試験キットであって、項目３１に記載の抗体を含む、試験キット。
（３３） Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体によって天然に感染されている動物を、弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体を用いてワクチン接種された動物から特定する方法であって：
（ａ）該動物由来の流体サンプルと、項目３２に記載の抗体とを接触させる工程と、
（ｂ）該抗体が該流体サンプルと反応するか否かを決定する工程と；
を包含し、
該抗体が、該流体サンプルと反応する場合、該動物はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体によって天然に感染されている動物として特定される、
方法。
（３４） ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ７３６４を有するＣＰＥＲＦ／Δα毒素３６５−０５４である、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
（３５） ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ７３６５を有するＣＰＥＲＦ／Δα毒素３６５−０５３である、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。

１実施形態では、本発明の核酸分子は、４８以下の連続するアミノ酸残基が配列番号３のアミノ酸配列から欠失されているムテインをコードする。別の実施形態では、核酸分子は、３６以下の連続するアミノ酸残基が配列番号３のアミノ酸配列から欠失されているムテインをコードする。さらに別の実施形態では、核酸分子は、２４以下の連続するアミノ酸残基が配列番号３のアミノ酸配列から欠失されているムテインをコードする。さらに別の実施形態では、本発明の核酸分子は、１８以下の連続するアミノ酸残基が配列番号３のアミノ酸配列から欠失されているムテインをコードする。

特定の実施形態では、本発明は、９連続するアミノ酸残基が、配列番号３のアミノ酸配列から欠失されており、その１つがＨｉｓ_６８であるムテインをコードする核酸分子を提供する。このタイプの特定の実施形態では、核酸分子は、この欠失された９連続アミノ酸残基が配列番号３のＴｙｒ_６２〜Ｔｒｐ_７０にまたがるムテインをコードする。さらに詳細な実施形態では、この核酸分子は、これらの欠失された９連続するアミノ酸が、単一のロイシン残基によって置換されているムテインをコードする。

別の実施形態では、この核酸分子は、配列番号２のヌクレオチド配列であってヌクレオチド２６８〜２９４が欠失されているヌクレオチド配列を包含する。このタイプの特定の実施形態では、配列番号２のヌクレオチド配列のうちヌクレオチド２６８〜２９４が、単一のロイシン残基をコードする３つのヌクレオチドで置換される。

本発明はまた、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素の実質的に非毒性のムテインを提供する。１つのこのような実施形態では、このムテインのα毒素は、配列番号３のアミノ酸配列から少なくとも１８連続アミノ酸残基がなく、この欠失されたアミノ酸残基の１つがＨｉｓ_６８であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このムテインは、配列番号３のアミノ酸配列から少なくとも１２連続アミノ酸残基がなく、この欠失されたアミノ酸残基の１つがＨｉｓ_６８であるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このムテインは、配列番号３のアミノ酸配列から少なくとも９連続アミノ酸残基がなく、この欠失されたアミノ酸残基の１つがＨｉｓ_６８であるアミノ酸配列を含む。なお別の実施形態では、このムテインは、配列番号３のアミノ酸配列から少なくとも６連続アミノ酸残基がなく、この欠失されたアミノ酸残基の１つがＨｉｓ_６８であるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このムテインは、配列番号３のアミノ酸配列から少なくとも３連続アミノ酸残基がなく、この欠失されたアミノ酸残基の１つがＨｉｓ_６８であるアミノ酸配列を含む。

１実施形態では、本発明のムテインは、４８以下の連続するアミノ酸残基が配列番号３のアミノ酸配列から欠失されている。別の実施形態では、このムテインは、３６以下の連続するアミノ酸残基が配列番号３のアミノ酸配列から欠失されている。さらに別の実施形態では、このムテインは、２４以下の連続するアミノ酸残基が配列番号３のアミノ酸配列から欠失されている。さらに別の実施形態では、このムテインは、１８以下の連続するアミノ酸残基が配列番号３のアミノ酸配列から欠失されている。

特定の実施形態では、本発明は、９連続するアミノ酸残基が、配列番号３のアミノ酸配列から欠失されており、その１つがＨｉｓ_６８である実質的に非毒性のムテインを提供する。このタイプのさらに詳細な実施形態では、この欠失された９連続アミノ酸残基は配列番号３のＴｙｒ_６２〜Ｔｒｐ_７０にまたがる。なおさらに詳細な実施形態では、これらの欠失された９連続するアミノ酸は、ムテインのアミノ酸配列において単一のロイシン残基によって置換されている。

本発明はさらに、弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体であって、それらの染色体中にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素の実質的に非毒性のムテインをコードする核酸分子が組みこまれている弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体を提供する。この組み込まれた核酸分子は好ましくは、野性型Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体における野性型α毒素をコードする核酸分子の位置に対して相同である染色体上の位置に配置される。従って、本発明の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体は、機能的な野性型ｐｌｃ遺伝子の欠失に起因して実質的に非毒性であり得る。本明細書で例証されるとおり、弱毒化されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体は、Ａ型のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓであってもよい。

本発明の特定の実施形態では、この弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのＣＰＥＲＦ／Δα毒素３６５−０５４（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ７３６４）である。本発明の別の特定の実施形態では、この弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのＣＰＥＲＦ／Δα毒素３６５−０５３（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ７３６５）である。

本発明の方法によって弱毒化されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体は、哺乳動物または鳥類のいずれかである宿主動物から単離され得る。このような哺乳動物としては以下を挙げることができる：ウシ、ヒツジ、およびブタ。適切な鳥類の例としては、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ハト（ｐｉｇｅｏｎｓ）、ガチョウ（ｇｅｅｓｅ）、ハト（ｄｏｖｅｓ）、ハクチョウ、ヤマウズラおよびライチョウが挙げられる。

本発明はまた、ワクチンを提供する。このようなワクチンは、本発明の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体を含んでもよい。本発明のワクチンはまた、薬学的に受容可能な緩衝液、賦形剤および／またはアジュバントを含んでもよい。

さらに、本発明は、動物においてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓに対する免疫を誘導する方法を提供する。１つのこのような実施形態は、動物に対して本発明のワクチンの免疫学的に有効な用量を投与する工程を包含する。本発明のワクチンは、以下を含む多数の経路によって投与され得る：経口的に、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、および鼻腔内。本発明のワクチンは、経口投与を得るために、動物のエサに対して上にかぶされても、そして／または動物の上に噴霧されてもよい。本発明はさらに、本発明のワクチンを含む動物の飼料を提供する。

本発明はまた、非Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子をさらに発現する、本発明の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体を提供する。１つのこのような実施形態では、非Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓポリペプチドのうちの１つ以上が、細菌ポリペプチド、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、サルモネラ（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ローソニア（ｌａｗｓｏｎｉａ）またはカンピロバクターなど由来の抗原性タンパク質、および／またはそれらの組み合わせである。あるいは、またはそれらと組み合わせて、非Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓポリペプチドは、非細菌ポリペプチドであってもよい。このような非細菌ポリペプチドの例としては、哺乳動物または鳥類のタンパク質、例えば、サイトカイン、例えば、ニワトリのＩＬ−１８；ロタウイルスまたはコロナウイルスのようなウイルス；ならびに寄生生物、例えば、エイメリア属（ｅｉｍｅｒｉａ）、イソスポラ属（ｉｓｏｓｐｏｒａ）およびクリストスポリジウムが挙げられる。

別の局面では、本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素の実質的に非毒性のムテインから失われているエピトープに対して選択的に結合する抗体を提供する。このような抗体は、野性型Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素から実質的に非毒性のムテインを識別し得る。

被験体動物がワクチン接種されているか、あるいはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体によって天然に感染されているかを特定することにおける使用のための本発明の抗体を含む試験キットも提供される。

従って、弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体でワクチン接種された動物から、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体によって自然に感染されている動物を特定および／または識別する方法も提供される。１つのこのような実施形態では、この方法は、動物由来の流体サンプルと、本発明のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ α毒素の実質的に非毒性のムテインから欠失されている野性型のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ α毒素で見出されたエピトープに選択的に結合する抗体とを接触させる工程を包含する。従って、この抗体は、本発明のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素の実質的に非毒性のムテイン（および／またはこのムテインを発現する弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体）でワクチン接種されている動物を、野性型のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素によって感染されるかまたは感染されている動物から識別し得る。次の工程は、この抗体が、流体サンプルと反応する、例えば、この流体サンプルに含まれる抗原に結合するか否かを決定することである。この動物は、この抗体が流体サンプルと反応するときに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体によって天然に感染されている／感作された動物として特定される。

（発明の詳細な説明）
従って、本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの毒素、例えば、α毒素の１つ以上を、検出可能な毒性を有さないか、そして／または天然もしくは野性型のＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ毒素に対して実質的に低い毒性を有するムテインとして発現する改変されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの生物体および培養物を提供する。有利には、本発明のＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ変異体生物体は、動物に対する生ワクチンとして容易に投与される。本発明のムテインＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素はまた、このムテインをコードする核酸分子、α毒素を発現するためのベクター、およびこれを用いる方法と一緒に提供される。

本発明の明確な説明を得るためには、いくつかの用語が以下のとおり規定される。ワクチンとは、免疫原、および他の任意の薬学的に受容可能な成分を含む組成物であり、この成分としては、特定の実施形態では、適切なアジュバントが挙げられる。本明細書において用いる場合、「免疫原（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）」という用語は、動物に導入された場合、免疫応答を刺激する組成物、物質またはベクターを記載する。本発明の目的のためには、免疫原とは、動物を免疫するために本発明のムテインα毒素を発現させるかまたはその動物に導入し得る任意のベクターを包含するものとする。ベクターは、例えば、本発明のＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓまたは他の適切な微生物を含み、これはこのベクターが動物に導入されたとき、本発明のムテインα毒素を発現する。ベクターとしてはまた、例えば、動物の細胞を入れることおよびこの動物においてムテインα毒素を発現することによって、この動物に直接導入された場合、本発明のムテインα毒素を発現する、例えば、プラスミドなどの当該分野で公知の核酸分子が挙げられる。免疫原とはまた、それ自体で、または適切なワクチン組成物の一部として使用される、本発明のα毒素のようなタンパク質である。

本明細書において用いる場合、そして他に特定されない場合、「免疫する（ｉｍｍｎｉｚｅ）」および「ワクチン接種する（ｖａｃｃｉｎａｔｅ）」という用語は同義であって、動物での免疫応答を誘発するための、この動物への免疫原の導入を記載するのに交換可能に用いられる。惹起された免疫応答は、処置された動物へ防御免疫を提供して、臨床的な疾患徴候、例えば、ガス壊疽および／または死亡率を、ワクチン接種された動物（本発明のワクチンが防御的であるＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ種の毒性の用量を後にチャレンジされる）において、限定または減弱する。

「アジュバント」という用語は、免疫系の刺激を生じる１つ以上の物質として規定される。この状況では、アジュバントを用いて、１つ以上のワクチン抗原／単離体に対する免疫応答を惹起する。アジュバントは、ワクチンの投与前、ワクチン投与と組み合わせて、またはワクチン投与の後に、標的動物に投与され得る。本発明のアジュバントは、天然の供給源、組み換え供給源および／または化学合成されたものなどを含む任意の多数の供給源から得ることができる。アジュバントとして用いられる化合物の例としては、限定はしないが以下が挙げられる：アルミニウム化合物；代謝性および非代謝性のオイル；ブロックポリマー；ＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）；ビタミンおよびミネラル（限定はしないが、ビタミンＥ，ビタミンＡ、セレニウム、およびビタミンＢ１２を含む）；ＱｕｉｌＡ（サポニン）；ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）の商標で販売される、ポリアルケニルポリエーテルと種々のレベルで架橋された架橋アクリル酸ベースのポリマー（例えば、プロパ−２−エン酸ポリマー）；ならびに／あるいは商標Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）として販売される、水エマルジョン中の均一分散されたミクロンサイズの油滴。

免疫刺激物質としてときに具体的に言及されている、アジュバントのさらなる例としては、細菌および真菌の細胞壁成分（例えば、リポポリサッカライド、リポタンパク質、糖タンパク質、ムラミルペプチド、β−１，３／１，６−グルカン）、植物由来の種々の複合糖質（例えば、グリカン、アセマンナン）、動物由来の種々のタンパク質およびペプチド（例えば、ホルモン、サイトカイン、同時刺激因子）、ならびにウイルスおよび他の供給源由来の新規な核酸（例えば、二本鎖ＲＮＡ、ＣｐＧ）が挙げられる。さらに、上述の物質の多数の組み合わせが、アジュバント効果を提供し、従って、本発明のアジュバントを形成し得る。

本明細書において用いる場合、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および／またはそのフラグメントもしくは組み換え誘導体を包含するものとし、これには、抗体可変ドメインを組み込んでいる操作された結合タンパク質を含む。

本明細書において用いる場合、本発明のα毒素タンパク質のアミノ酸残基の残基の数および位置は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの株１３について記載されるナンバーシステムに基づく。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの株１３のα毒素は、配列番号１に例示されるとおりＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ００３３６６に報告される。全タンパク質は３９８アミノ酸長である。本明細書において以下に例示されるムテインベクターによってコードされるα毒素は、アミノ酸残基９０〜９８の欠失を有する配列番号１のタンパク質に相当する。タンパク質の成熟の間に切断される２８アミノ酸のシグナル配列が存在する。従って、例示される欠失は、３７０アミノ酸長である成熟タンパク質のアミノ酸残基６２〜７０に相当する（配列番号３）。

本発明のα毒素タンパク質をコードするＤＮＡのコドン番号付けは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ５６０９５２に報告され、そして配列番号２に図示されるような、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの１３株のｐｌｃ遺伝子に基づく。α毒素のコード配列は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの１３株におけるヌクレオチド４８５９０〜４９７８６におよぶ。本明細書において例示される２つの構築物におけるコドン欠失は、ＮＰ５６０９５２遺伝子のヌクレオチド４８８５７〜４８８８３（そしてこれを含む）に相当する。この欠失は、α毒素遺伝子内で見出され、そして配列番号２のコード配列におけるヌクレオチド２６８〜２９４に相当する。

さらに説明の簡便性のための単数の用語の使用は、決してそのように限定されるものではない。従って、例えば、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ細胞を含む組成物に対する言及は、このような細胞の１つ以上に対する言及を包含し得る。本発明は、本明細書に開示される特定の構成、工程段階および材料に限定されず、従ってこのような構成、工程段階および材料はある程度変化されてもよいことも理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のために用いられるに過ぎず、限定するものではないことも理解されるべきである。なぜなら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ制限されるからである。

本発明の特定の局面では、「実質的に非毒性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｎｏｎｔｏｘｉｃ）」であるＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの非先祖返り変異体、すなわち、毒性がわずかであるかまたは全くない免疫原性α毒素を発現し、それによって防御的ワクチンとしての使用に適切になっている生物体が提供される。従って、本発明のＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体は、野性型のＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体に対して十分に減弱された毒性を与えて、抗α毒素または抗Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの免疫応答をそのようワクチン接種された動物中で惹起するのに有効な条件下で使用した場合、ワクチンまたは抗原としてそれらを耐性にさせる。従って、本発明のＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体は、野性型Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓに対して「弱毒化される（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）」。

「実質的に非毒性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｎｏｎｔｏｘｉｃ）」という句はまた、毒性が十分に低いかまたはなく、それによって、また防御ワクチンにおける使用に適切にされている上述の免疫原性α毒素ムテインに与えられるものとする。

毒性の軽減は、例えば、以下の当該分野で公知の試験のうちの１つによって測定される：溶血活性、ホスホリパーゼＣ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性、ホスホジエステラーゼ活性および試験動物群における全般的致死活性。一般には、残留毒性は、このような標準的な試験では検出不能である。それにもかかわらず、このムテインが由来している野性型Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素の感染性単位の等価な値の毒性に対して、これらの活性の１つ以上の最小レベル、例えば、約１０^−４〜約１０^−２の存在は、獣医学の設定では受容可能であることが証明され得る。

ある実施形態では、本発明は、種々のタイプの壊疽および腸疾患の病原因子として特に重要である、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの生物型Ａ株を使用して行う。詳細には、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素は、欠失−減弱の標的である。なぜなら、この毒素の減弱は、野性型株に対してＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓを十分に非致死性にさせるのに十分であるからである。

概して、本発明のＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのｐｌｃ遺伝子は、ムテインα毒素を発現する。このムテインα毒素は、隣接する残基とともに、Ｚｎ２ループのＨｉｓを誘導する欠失を有して、毒性型への任意の戻り変異の可能性を大きく低下させる。Ｚｎ２ループのＨｉｓ残基、例えば、配列番号３のＨｉｓ_６８の欠失は、Ｚｎ２ループのＨｉｓ残基に隣接するさらなる残基の欠失と一緒になって、本発明のＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓでワクチン接種された動物において防御免疫を誘導するために十分な免疫原性を保持しているが、また野性型α毒素をコードするように戻し変異を受ける可能性は低いα毒素を提供することが現在見出されている。欠失され得るさらなる残基は、Ｈｉｓ_６８に対して、Ｃ末端方向および／またはＮ末端方向で欠失されており、そしてそれらのいずれかの方向で約４〜約６０残基の数におよび得る。あるいは、Ｈｉｓ_１４８および隣接する残基が、同様に欠失されてもよい。

本発明のムテインα毒素の１実施形態はまた、Ｈｉｓ_６８の欠失に加えて、配列番号３に対して、Ｈｉｓ_６８位置のいずれかの側（Ｃ末端またはＮ末端方向）から少なくとも３０アミノ酸残基が欠失している。別の実施形態では本発明のムテインα毒素は、Ｈｉｓ_６８の欠失に加えて、配列番号３に対して、Ｈｉｓ_６８位置のいずれかの側から少なくとも２０アミノ酸残基が欠失している。さらに別の実施形態では本発明のムテインα毒素は、Ｈｉｓ_６８の欠失に加えて、配列番号３に対して、Ｈｉｓ_６８位置のいずれかの側から少なくとも５アミノ酸残基が欠失している。さらに別の実施形態では本発明のムテインα毒素は、配列番号３に対して、アミノ酸残基およそ６２〜およそ残基７０までの欠失がある。必要に応じて、この欠失されたアミノ酸残基は、単一のロイシン残基のような１つ以上の他の残基によって置換される。

なおさらなる別の実施形態では、ムテインＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素を生成し、そしてＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓから、または別の組み換え生物体から単離して、検索試薬として、および／または診断キットもしくはアッセイにおいて、例えば抗α毒素抗体の標的として使用する。ムテインＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素タンパク質のなおさらなる有用性は、本発明の弱毒化Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体でのワクチン接種に耐容でないかもしれない動物、例えばヒトのための専門的なワクチンにある。

さらに、本発明は、本発明のα毒素ムテインに対する野性型α毒素に特異的に結合する抗体を提供する。

さらなる実施形態では、野性型Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素タンパク質に優先的に結合するが、本発明のムテインα毒素に対して示す結合は最小限であるかまたは全くない、例えば、前出に詳細に記載されるような欠失を有するα毒素ムテインに対する結合を回避する、抗体が提供される。従って、提供される抗体は、野性型α毒素から欠失ムテインα毒素を識別するために有用であり、それによって、また、野性型Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによって感染されている動物から本発明のワクチンでワクチン接種された動物を識別するために有用である。このような選択性の抗体の惹起およびスクリーニングの方法は公知である。同様に、本発明のムテインα毒素を認識するが、野性型タンパク質は認識しない抗体も生成され得る。本発明の抗体は、選択的な結合特性を保持している、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）であっても、またはこのような抗体のフラグメント、もしくは操作されたフラグメント、もしくは誘導体であってもよい。

モノクローナル抗体を調製およびスクリーニングするための技術は、十分に記載されている［例えば、その全て、その内容全体が本明細書において参照によって援用される、Ｓｔｉｔｅｓら（編）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９８８）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８６）；ならびにＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７（１９７５）を参照のこと］。

例えば、限定はしないが、免疫応答は、マウスまたはニワトリのような適切な動物において、例えば、適切なアジュバントと組み合わされた、精製の野性型Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素を用いるワクチン接種によって、惹起される。例えば、野性型αタンパク質の毒性を回避するために、免疫原は欠失残基に相当するペプチドであり、そして必要に応じてこのペプチドの免疫原性は、適切なアジュバントとの組み合わせによって、または適切なキャリアタンパク質に対する結合によって増強される。キャリアタンパク質に対する結合は当該分野で公知であり、例えば、このペプチドに末端システインを提供すること、および、これを、マレイミドカップリング化学またはスルホスクシンイミジル４−［Ｎマレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）リンカー（Ｐｉｅｒｃｅより）のいずれかを用いて、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対して結合することによって達成され得る。カルボジイミドリンカーはまた、末端システインを要することなく使用されてもよい。

モノクローナル抗体の調製のためには、脾臓リンパ細胞を、免疫された動物から得てもよく、ハイブリドーマを、これらのリンパ球から調製し、そして抗αタンパク質を発現する１つ以上の潜在的に適切なハイブリドーマを得てもよい。このハイブリドーマを、ムテインおよび野性型αタンパク質の両方に対してスクリーニングし、そして野性型α毒素にのみ結合する抗体を発現するハイブリドーマを特定し、クローニングし、そして使用して、野性型αタンパク質にのみ結合するモノクローナル抗体を生成する。必要に応じて、特定されたハイブリドーマクローン株由来のｃＤＮＡを得、そして組み換え抗体または抗体フラグメントを、他の当該分野で公知の発現システムで生成してもよい。

上記で考察されるとおり、ワクチン接種の潜在的な不利益とは一般に、得られたワクチン接種動物が、天然に存在する株に対して惹起された抗体を用いる感染について試験した場合、偽陽性を生じ得、それによって感染動物の特定が妨げられるということである。従って、本発明は、本発明のムテインα毒素でワクチン接種された動物から、天然に存在するＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体で感染されている被験体動物を識別する試験キットを提供する。

このような試験キットの１つとしては、本発明のムテインα毒素に対して示す結合が最少であるかまたは全くない選択性の抗野性型α毒素抗体の量を含む。このキットはまた、少なくとも１つの診断試験で行うのに十分な他の適切な試薬を含んでもよい。さらなる実施形態では、この抗体は、容易に検出可能なマーカー部分、例えば、任意の当該分野で公知の酵素マーカー、例えば、ペルオキシダーゼ；蛍光タグ、例えば、フルオレセイン；磁気ビーズを含むビーズ；などでタグ化されるかまたは標識される。必要に応じて、このキットはさらに、選択的な抗野性型α毒素抗体に選択的に結合する標的化抗体を備えてもよい。イムノアッセイは、当該分野で周知であり、そしてこれには、サンドイッチイムノアッセイ、競合的イムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などが挙げられる。

また、本発明の弱毒化Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体を含むワクチンでワクチン接種された動物から、天然に存在する、すなわち、野性型のＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体によって感染されている動物を特定して識別するための方法も提供され、この方法は例えば、以下の工程によって行われる：
（ａ）動物由来の流体サンプルと、本発明のムテインα毒素に対して示す結合が最少であるかまたは全くない上記の選択性の抗野性型α毒素抗体とを接触させる工程と；
（ｂ）この抗体が、流体サンプルと反応するか否かを決定する工程であって、この抗体が流体サンプルと反応する場合、この動物が、天然に存在するＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体によって感染されている動物として特定される工程。

弱毒化Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ株を生成する
ワクチンとして投与されるのに適切な、弱毒化または実質的に無毒性の株への、野性型Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ単離体の変換のプロセスは以下のように行われ得る。このα−毒素（ｐｌｃ）遺伝子は、細菌染色体上において、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体が野性型α毒素を生じるような能力を残すことなく、α毒素ムテインのみをコードする遺伝子で置換されてもよい。極めて大きく、ワクチン生物体を生成するプロセスとしては、限定はしないが、以下の一般的工程が挙げられ、これは提示される順序である必要はない。

（１）ワクチンおよびスクリーニングプロセスのために得られた１つ以上の臨床的単離体によって防御される動物のタイプを特定する工程。この工程は、代表的には、α毒素についての場合には任意である。なぜなら、１種の動物由来の単離物は、他の種の動物のための防御を提供することはない可能性が高いからである。

（２）Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ単離物（単数または複数）由来のｐｌｃ遺伝子を、例えば、ＰＣＲまたは他の当該分野で公知の核酸増幅技術によって、適切な隣接するプライマーを用いて、そして適切なプライマーでの増幅を使用することによって増幅して所望の欠失変異を作製する工程。あるいは、適切なライブラリーがプローブされてもよい。

（３）Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ複製起点が除去されているか、そして／またはＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓにおいて複製し得る複製起点が単に存在しない、欠失ｐｌｃ遺伝子を含む自殺ベクターを作成する工程；そしていずれかの場合には、変異したｐｌｃ遺伝子に隣接した、適切な選択マーカー、例えば、抗生物質マーカーを含む工程。次いで、このようなベクターは、例えば、エレクトロポレーション、または他の当該分野で公知の方法によって、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体に挿入され得る。

（４）ムテインｐｌｃ遺伝子が細菌の染色体に首尾よく組みこまれているＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体を選択する工程。これは、選択剤、例えば、選択マーカーに対応する抗生物質の存在下において（３）の工程のＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体を培養することによって行われる。例えば、抗生物質選択のもとで増殖するＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体のみが、相同組み換えを通じて自殺ベクターを、その抗生物質耐性遺伝子とともに細菌染色体に直接組み込んでいる、生物体である。従って、これらの増殖するＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体は、２つの隣接するｐｌｃ遺伝子を有し、この１つは野性型であるが、もう一方は欠失変異を有する。

（５）野性型ｐｌｃ遺伝子とともに選択マーカー、例えば、抗生物質マーカーを除去するさらなる組み込み事象を受けているＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体を選択する工程。これは、選択剤、例えば、抗生物質の非存在下において、（４）の生物体を培養すること、および血液寒天培地上で非溶血性クローンを選択することによって行う。

ムテイン核酸の挿入は相同な組み換えによって達成されるので、ムテインα毒素をコードする核酸分子は、非弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓに存在する野性型α毒素をコードする核酸分子の位置に相同である染色体位置に組みこまれる。

さらに詳細には、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの野外単離体は、疾患の動物または他の供給源から得られる。最初に、目的の野外単離物から得たゲノムＤＮＡを適切な二重微生物シャトルベクター、例えば、選択マーカー、例えば、抗生物質マーカーを有するシャトルプラスミドに挿入して、それらの形質転換性を評価する。概して、適切なシャトルベクターは、以下の特徴のうちの１、２、３またはそれ以上を含む：クローニング部位、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ複製起点、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、および抗生物質耐性遺伝子およびまたは選択マーカー。この目的に適切であるか、またはこの目的に容易に適合可能な当該分野で公知のベクターとしては、例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓらによって記載される組み換えシャトルプラスミドｐＨＲ１０６［Ａｐｐｌ Ｅｎｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５４：２６８〜２７０（１９８８）］：Ｂａｎｎａｍらによって記載されるｐＪＩＲ ７５０およびｐＪＩＲ７５１プラスミド［Ｐｌａｓｍｉｄ ２９：２３３〜２３５（１９９３）］；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、１９９４，Ｐｌａｓｍｉｄ ３１，３１７〜３１９のプロモーターレスのｐＰＳＶプロモーター選択ベクター；Ｌｙｒａｓら、１９８８、Ｐｌａｓｍｉｄ ３９，１６０〜１６４によって記載される、シャトルプラスミドｐＪＩＲ１４５６およびｐＪＩＲ１４５７；ならびにＫｉｍら、１９８９，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５５，３６０〜３６５によって記載されるｐＡＫ２０１シャトルベクターが挙げられる（これらの内容は、その全体が参照として本明細書に援用される）。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの複製起点の除去によって、シャトルベクターが自殺ベクターに変換する。

例えば、１つのシャトルプラスミドは、本明細書において参照として援用される、Ｓｌｏａｎら、１９９２、Ｐｌａｓｍｉｄ ２７，２０７〜２１９に記載されるｐＪＩＲ４１８である。

１μｇのプラスミドＤＮＡあたり１０^４を超える形質転換体を生じ、抗生物質マーカー、例えば、クロラムフェニコールまたはエリスロマイシンに対して感受性である単離体は、欠失の潜在的候補である。次いで、候補株由来のゲノムＤＮＡを、ｐｌｃ（α毒素）遺伝子および候補株の隣接する配列のロング・レンジＰＣＲのテンプレートとして用いる。例えば、本明細書の下において例示されるとおり、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ株の第１３染色体を用いて、α毒素をコードする遺伝子を増幅するためのプライマーを特定した。次いで、これらのプライマーを用いて、ＣＰ６家禽単離体である別の株由来のα毒素遺伝子をクローニングした。

ＰＣＲ産物のサブクローニング後、このα毒素および隣接する領域を配列決定して、制限マッピングする。新規なオリゴヌクレオチドプライマーを、隣接する制限部位で合成して、２つの別の増幅物の産物を適切な自殺プラスミド（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの複製起点が除去されている）、例えば、本明細書において以下ではプラスミド１１９２〜２３．１として例示されるプラスミド中にクローニングして、欠失を有する所望のワクチン株を作成する。

単離物に対して特異的な提供される自殺ベクターを、任意の標準的な当該分野で公知の方法によって、対応するＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの動物株に挿入する。例えば、これは、エレクトロポレーションによって達成される。自殺ベクターが、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの複製起点がない）に挿入される場合、細胞質中で複製することができず、そして細菌の染色体へ首尾よく組み込まない限り生存しない）。首尾よい組み込み体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）が、新たに導入された抗生物質マーカー遺伝子に対応する抗生物質の存在下で増殖する唯一の生物体である。

任意の当該分野で公知の選択マーカー遺伝子が使用されてもよいが、クロラムフェニコールおよび／またはエリスロマイシンマーカーが、本明細書で下に例証されるベクターで使用される。

これらの組み換え事象は、欠失ｐｌｃ遺伝子プラスミドＤＮＡに対する野性型ｐｌｃ遺伝子の相同性から生じる。得られた組み換え体細菌は、組み込み体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）と名付けられる。この組み込み体は、ｐｌｃ遺伝子座に組み込まれている導入された相同ベクターのコピーを含む。従って、得られた組み込み体は、２つのコピーのｐｌｃ遺伝子、もとの正常なコピー、および導入された欠失されたバージョンを含む。導入された抗生物質耐性遺伝子が、ｐｌｃ遺伝子の２つのコピーの間に位置する。まれなランダム組み換え事象は、ｐｌｃ遺伝子の２つのコピーの間に生じ得る。この組み換え事象は、２つの結果のうちの１つを生じ得る。両方の場合とも、ｐｌｃ遺伝子（耐性遺伝子を含む）の２つのコピーの間のＤＮＡ介入は、除去されている。第一の結果では、正常または野性型のｐｌｃ遺伝子が修復され、抗生物質マーカーなしのもとの親株の回復が生じる。第二の結果では、野性型ｐｌｃ遺伝子が、欠失コピーで置き換えられて、抗生物質マーカーなしで、所望のα毒素欠失構築物が生じる。

培養培地から抗生物質を除去することによって、組み換えを受けている細菌が生存して複製することが可能になる。次いで、欠失組み換えクローンを、野性型α毒素を発現するＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによって通常示される溶血なしの、血液寒天上の増殖によって特定する。

ワクチン接種されるべき動物
弱毒化Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓワクチンが生成され得、そして有用なＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ野性型株が単離され得る動物としては、広義には、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ感染が問題である任意の動物が挙げられる。目的の脊椎動物としては、鳥類、哺乳動物および魚類、そして特に経済的および／または農業上重要な動物が挙げられる。動物の以下の列挙は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓワクチンから利益を得ると考えられる動物、および／または有用なＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ野性型単離物が得られ得る動物である。任意のこのようなワクチンが、ワクチン接種されるべき動物の同じ属または種からもともと単離された成分（生きているかまたは生きていない）を含むということはときにあり得るが、これは要件ではない。

このような動物の非限定的な列挙としては、鳥類、ウシ、ヒツジなどの科の動物、ならびに水生動物、例えば、水産養殖に供されるか、および／または自然から収穫されて、市販までの時間は保持タンクで生きて保持され得る動物が挙げられる。これらとしては、マスまたはサケのような魚類、および経済的利点のために飼育されるかまたは収穫される他の種が挙げられる。非脊椎動物水生動物としては、ロブスター、カニ、軟体動物、例えば、イカ、タコ、二枚貝、カキ、マッスル（ｍｕｓｃｌｅｓ）、ホタテなどが挙げられる。鳥類としては、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒルなどが挙げられることを理解すること。ウシとしては、例えば、蓄牛（ｃａｔｔｌｅ）、肉牛（ｂｅｅｆ）、仔牛（ｖｅａｌ）などが挙げられることが理解されなければならない。ヒツジとしては、例えば、ラム（子羊）などを含むことが理解されなければならない。

本発明の目的のためには、「魚類（ｆｉｓｈ）」という用語は、限定はしないが、Ｔｅｌｅｏｓｔｉ群の魚、すなわち、硬骨類が挙げられることが理解されなければならない。Ｓａｌｍｏｎｉｆｏｒｍｅｓ目（Ｓａｌｍｏｎｉｄａｅ科を含む）およびＰｅｒｃｉｆｏｒｍｅｓ目（Ｃｅｎｔｒａｒｃｈｉｄａｅ科を含む）の両方とも、Ｔｅｌｅｏｓｔｉ分類内に含まれる。

可能性のある魚類宿主の例としては、Ｓａｌｍｏｎｉｄａｅ科、Ｓｅｒｒａｎｉｄａｅ科、Ｓｐａｒｉｄａｅ科、Ｃｉｃｈｌｉｄａｅ科、Ｃｅｎｔｒａｒｃｈｉｄａｅ科、スリー・ライン・グラント（ｔｈｒｅｅ−Ｌｉｎｅ Ｇｒｕｎｔ）（Ｐａｒａｐｒｉｓｔｉｐｏｍａ ｔｒｉｌｉｎｅａｔｕｍ）、およびＢｌｕｅ−Ｅｙｅｄ Ｐｌｅｃｏｓｔｏｍｕｓ（Ｐｌｅｃｏｓｔｏｍｕｓ ｓｐｐ）が挙げられる。

さらなる実施形態では、この動物は、愛玩動物またはヒトである。本発明の目的のためには、「コンパニオン（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ）」動物という用語は、全ての動物−馬（ウマ）、猫（ネコ）、犬（イヌ）、およびげっ歯類（マウス、ラット、モルモット、ウサギ種を含む）、および鳥類、例えば、ハト、オウムなどを包含することが理解されるべきである。

このようなワクチン接種を受けている鳥類は、商業的または商業的でないいずれかの鳥類の飼育に関連し得る。これらとしては、例えば、ガンカモ科（Ａｎａｔｉｄａｅ）（例えば、ハクチョウ、ガチョウおよびアヒル）、ハト科（Ｃｏｌｕｍｂｉｄａｅ）（例えば、ハト（ｄｏｖｅｓ）およびハト（ｐｉｇｅｏｎｓ）（例えば、ドバト））、キジ科（Ｐｈａｓｉａｎｉｄａｅ）（例えば、ヤマウズラ、ライチョウおよびシチメンチョウ）、Ｔｈｅｓｉｅｎｉｄａｅ（例えば、家禽）、オウム科（例えば、インコ、コンゴウインコおよびオウム（例えば、ペットまたはコレクターの市場で飼育される））が挙げられる。ニワトリが本明細書において下に例証される。

野性型単離体の供給源
一般には、本発明の弱毒化Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体は、上で考察されたような、目的の任意の感染動物から、および／または環境からもともと単離されている野性型Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓで開始して作成され得る。この環境は、生存能力のあるＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体および／または生存能力のあるＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ胞子を含む任意の材料を含み、これには、例えば、汚染された食物、土壌、水、動物の床材、糞便などが挙げられる。

Ｊｕｓｔｉｎら［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１，６２５３〜６２６２（２００２）］は、配列および生化学的特性において最も同一であるＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの種々の株由来のα毒素を特徴付けた。しかし、Ｊｕｓｔｉｎらはまた、他の株に比較して大きい程度の配列変動および変化した基質特異性を示すα毒素を有する鳥類供給源（ハクチョウ）から単離された株を記載している。この理由によって、ほとんどの単離物は、弱毒化型に変換された場合、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの多くの他の天然に存在する株のα毒素に対して防御免疫を惹起すると考えられる。それにもかかわらず、単離物の間のα毒素の変動の可能性を考慮すると、抗Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓワクチンが所望される動物種からＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体を単離して弱毒化することがしばしば有利である。本明細書において下に例証される単離体は、ニワトリから単離され、そしてその種で試験される。

ワクチン
本発明の弱毒化Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体は一般に、薬学的に受容可能なワクチン組成物中に処方される。このワクチン組成物は、投与経路に従って処方され、そして活性な抗原性因子と適合性である。この活性抗原因子は、例えば、本発明に従う弱毒化Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのＡ型生物体の１つ以上の株である。必要に応じて、このワクチン組成物はまた、弱毒化されたＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのＡ型生物体と組み合わせて、非毒性αタンパク質のうちの１つ以上のタイプを含んでもよい。

例えば、ワクチン組成物中に含まれる実質的に全ての弱毒化Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのＡ型生物体は生きており、かつ生存可能であるが、特定の特異的な状況について、例えば、特定のヒトまたは免疫の損なわれた動物を免疫するためには、このワクチンは、殺傷された弱毒化Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのＡ型生物体を排他的に含む。

ワクチン組成物は、生理学的に適合性の緩衝液および／または塩を、アジュバントおよび／または任意の免疫増強剤もしくは刺激剤と必要に応じて組み合わせて含む（同時投与されるか、または連続して投与される、例えば、ワクチン接種の前後）。

適切な免疫刺激剤としては、限定はしないが、サイトカイン、成長因子、ケモカイン、リンパ球、単球、リンパ器官由来の細胞の細胞培養物由来の上清、細胞調製物、または細胞抽出物（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓまたはリポポリサッカライド調製物）、分裂促進因子、またはアジュバント（低分子量薬品を含む）が挙げられる。免疫刺激剤は、インキュベーションの間の任意の時点で卵内に（ｉｎ ｏｖｏ）投与されてもよい。特定の局面では、免疫刺激剤は、弱毒化Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのＡ型生物体を含む培地中で投与される。

ワクチンを投与する方法
上記の本発明のワクチンは、例えば、以下の経路：経口、鼻腔内、非経口的、皮下、乱切法、および／または筋肉内投与の１つまたは組み合わせによる注入または接種によって、任意の適切な当該分野で公知の処方物、例えば、適合性緩衝液および／または生理学的に受容可能な生理食塩水中で、アジュバントおよび／または免疫増強剤もしくは刺激剤との任意の組み合わせにおいて（同時投与または連続投与、例えば、ワクチン接種の前後に）投与される。経口投与されるワクチン／ワクチン接種方法のためには、当該分野で公知の任意の生理学的に安定な緩衝液または懸濁剤が容易に使用される。さらに、この組成物は、組み込まれ、例えば、飲用水に混合されるか、または食物ペレット上に噴霧されても、コーンもしくは他の穀物上に振りかけられるかもしくは噴霧されるなどしてもよい。

胃腸管は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ感染の一般的な部位であり、従って、経口投与は、接種の１方法として考慮される。本発明の生きた弱毒化Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体が胃腸管に存在することは、胃腸管の粘膜層における局所的な防御免疫反応を誘発すると考えられ、そしてまた野性型Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによる引き続くコロニー形成を妨げるために競合的に作用し得る。

鳥類、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウなどを含む家禽にとっては、経口方法または卵内（ｉｎ ｏｖｏ）の注射は、とりわけワクチン接種の有用な経路である。この卵内の経路は、本明細書において下に例示され、そして孵化したニワトリにおいて能動免疫およびチャレンジからの防御を生じる。

Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによる外来遺伝子発現
前述の実施例において開発された技術を用いて、任意の天然に存在しない、すなわち、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓに対して外来である遺伝子が必要に応じて、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの染色体ＤＮＡに挿入され得る。外来タンパク質の発現のために、α毒素遺伝子に隣接する配列、α毒素プロモーターおよびそのシグナル配列を保存する遺伝子融合物が作成され得る。１実施形態では、ｐｌｃ遺伝子のほとんどのコード配列を、外来遺伝子で置換する。挿入された遺伝子のｐｌｃ遺伝子下流の残りのヌクレオチドはフレーム外であり、従って、機能的なα毒素は生成されない。あるいは、外来遺伝子は、α毒素−外来タンパク質融合タンパク質を形成するα−毒素ムテインをコードするヌクレオチド配列に対してインフレームに挿入されてもよい。

外来遺伝子のオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ配列および適切な制限部位で合成されてもよい。ＰＣＲ産物は、自殺ベクターにクローニングされてもよい；ＦＬＡＧタグおよび外来遺伝子は、α毒素シグナル配列とインフレームに挿入される。この外来タンパク質は、α毒素プロモーターの制御下で発現されて、ｐｌｃシグナル配列によって分泌のために標的化される。分泌される外来タンパク質は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウエスタンブロットにより上清培地中で検出され得る。

任意の適切な外来遺伝子が、この方式でＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのゲノムに挿入され得る。これらの遺伝子としては、例えば、胃腸管の病原体由来の抗原をコードするＤＮＡが挙げられ、この抗原としては、このような組み換えＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓで処理された動物を免疫するための、例えば、細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、サルモネラ種、カンピロバクター種、ローソニア種などの抗原性タンパク質；寄生生物、例えば、エイメリア種、イソスポラ種、クリプトスポリジウム種などの抗原性タンパク質；およびウイルス、例えば、ロタウイルス、コロナウイルス、などの抗原性タンパク質が挙げられる。このような組み換えＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによって発現され得る他のタンパク質としては、治療用のタンパク質またはペプチドが挙げられる。必要に応じて、これらとしては、胃腸管に内在性であるペプチドが挙げられ、このペプチドとしては、トレフォイル因子、または任意のタイプの当該分野で公知のサイトカイン、例えば、ニワトリのＩＬ−１８などが挙げられる。

１つのこのようなＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ構築物は、ニワトリＩＬ−１８タンパク質を発現する。遺伝子融合物を含む生きた細菌の投与によって、α毒素の産生がないおかげで宿主動物に対して比較的非侵害性のままで胃へのＩＬ−１８の治療用量の送達が可能になる。他の治療剤はまた、このシステムを用いて発現されてもよい。

多くの引用文献が本明細書で引用されており、その各々の内容が、その全体が本明細書に参照によって援用される。以下の特異的な実施例は例示の目的のために含まれており、そして他に示さない限り、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１
Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素欠失体相同ベクター
Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素欠失体の構築において有用な相同性プラスミドベクター１１６２−５５−２０を作成した。このプラスミドはいくつかの重要な要素を組み込む；Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドｐＵＣ１８由来の複製領域；Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓクロラムフェニコール（ｃａｔＰ）およびエリスロマイシン（ｅｒｍＢＰ）耐性遺伝子（その両方ともＥ．ｃｏｌｉで発現される）；ならびに９アミノ酸の特定の欠失によって不活性化されたＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓα毒素遺伝子（ｐｌｃ）。プラスミド１１６２−５５−２０を、以下のようないくつかの工程で作成した。

第一のｐｌｃ遺伝子を、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ＣＰ６株）の最近の鳥類単離物からクローニングした。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの株１３の配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＣ ００３３６６；配列番号２）を用いて、ｐｌｃ遺伝子のクローニングにおいて用いられるべきオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。これらおよび全ての引き続くプライマーは、Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸから商業的に購入した。ｙｐｌｃ遺伝子（ＣＰＥ００３５）内に位置する上流プライマー、５’ＡＧＣＴＧＣＡＴＡＡＧＣＡＡＡＡＧＴＴＣＣＡＡＣＴＣ３’（配列番号１４）は、株１３のヌクレオチド４７６７５−４７７００（配列番号２）に相当する。ｃｏｂＷ遺伝子（ＣＰＥ００３７）内に位置する下流プライマー、５’ＧＣＡＧＡＡＡＣＴＣＴＴＣＴＴＡＧＡＣＣＴＡＴＴＣＴＴＴＴＡＧＧＣ３’（配列番号１５）は、株１３のヌクレオチド５０５９７−５０６２９に対して相補的である。これらのプライマーを、ロングレンジのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中でＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ株ＣＰ６由来のゲノムＤＮＡとともに用いた。上流ｙｐｌｃ遺伝子から下流ｃｏｂＷ遺伝子の２９５５塩基対の産物を、株１３の公知の配列から予測した（図１によって図示されるとおり）。α毒素プロモーター、シグナル配列およびｐｌｃ遺伝子（ＣＰＥ００３６）コード配列は、このフラグメント内に、すなわち、上流のｙｐｌｃ遺伝子と下流のｃｏｂＷ遺伝子との間に含まれる。次いで、このＰＣＲ２９５５塩基対フラグメントを、クローニングベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングして、プラスミド１１６２−５２．１を得た。株ＣＰ６の２９５５塩基対のフラグメントのｐｌｃコード領域のヌクレオチド配列を、このフラグメント（配列番号２２；そして対応するポリペプチドは配列番号２３である）から決定し、そしてＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの株１３のｐｌｃ遺伝子の配列（配列番号２）と実質的に相同であることが示された。

次に、Ｅ．ｃｏｌｉ複製領域およびＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ耐性遺伝子を、シャトルプラスミドｐＪＩＲ４１８からクローニングした（Ｓｌｏａｎら、１９９２，Ｐｌａｓｍｉｄ ２７，２０７〜２１９；Ｇｅｎｅｂａｎｋ Ｍ７７１６９）。プラスミドｐＪＩＲ４１８を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩで消化して、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ連鎖反応で末端充填した。大きいフラグメントの連結によって、プラスミド１１６２−４５．１を生成し、そしてＢａｍＨＩ制限部位を修復した。このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ複製領域を保持するが、ｐＪＩＲ４１８とは異なり、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの複製起点を含まない。従って、このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で自律複製し得るが、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓでは複製できない。

次の工程では、ｐｌｃ遺伝子のＣ末端半分を、中間のプラスミド１１６２−４５．１中にサブクローニングした。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩでのプラスミド１１６２−５２．１の消化によって、ｐｌｃ遺伝子下流からｃｏｂＷ遺伝子中に位置する固有のＢａｍＨＩ部位から、親のプラスミドのマルチクローニング部位に位置するＥｃｏＲＩ部位へのα毒素遺伝子のＣ末端を含む１７４２塩基対のフラグメントを遊離した。この１７４２塩基対フラグメントを、プラスミド１１６２−４５．１のマルチクローニング部位内に位置するＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ部位との間にクローニングした。得られたプラスミド１１６２−５３．７において、ｐｌｃ遺伝子のＣ末端の半分は、親のプラスミドのｃａｔＰおよびｅｒｍＢＰ遺伝子と同じ翻訳方向である。

最終工程では、ｐｌｃ遺伝子のＮ末端の半分を、プラスミド１１６２−５３．７の固有のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。これは、プラスミド１１６２−５２．１にサブクローニングされたα毒素遺伝子由来のＰＣＲフラグメントを作製することによって達成した。この上流のプライマー、５’ｇｇａｔｃｃＡＧＣＴＧＣＡＴＡＡＧＣＡＡＡＡＧＴＴＣＣＡＡＣＴＣ３’（配列番号１６）は、隣接するＢａｍＨＩ部位（小文字）が含まれること以外は、前に注記されたｙｐｌｃプライマー（配列番号４）と同一であった。α毒素遺伝子内に位置する下流プライマー、５’ｇｇａｔｃｃａＡＴＧＣＡＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴＡＡＴＣＴＧＧＡＴＡＡＧＴＡＧＡＡＣＣ３’（配列番号１７）は、株１３のヌクレオチド４８８２４−４８８５７に相補的であり、そして隣接するＢａｍＨＩ制限部位およびスペーサーヌクレオチドを含み、リーディングフレームを維持した（小文字）これらのプライマーおよびプラスミド１１６２−５２−１のテンプレートＤＮＡを用いてＰＣＲから得られたＢａｍＨＩフラグメントを、プラスミド１１６２−５３．７の固有のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。同じ翻訳方向で２つのｐｌｃ遺伝子領域を含むプラスミドを単離した。このプラスミド１１６２−５５．２０は、ｐｌｃ遺伝子を含み、これは、所望の９アミノ酸欠失およびｌｅｕ残基の付加を野性型毒素のａｌａ６１とａｓｐ７１との間に有する（図２を参照のこと）。このプラスミドのＤＮＡ配列決定によって、リーディングフレームおよび２４コドン（８アミノ酸残基をコードする）の正味の欠失を確認した。

実施例２
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの組み換え体ＣＰＥＲＦ００１の構築
実施例１で構築されたｐｌｃ遺伝子の欠失バージョンを、以下のストラテジーを用いてＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ中に導入した。相同なベクター１１６２−５５．２０をＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの「自殺プラスミド（ｓｕｉｃｉｄｅ ｐｌａｓｍｉｄ）」と名付ける。なぜなら、そのＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ複製起点が除去されているからである。

このプラスミドが、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ中に形質転換された場合、これは複製できず、生存しない。しかし、形質転換された細菌が、クロラムフェニコールおよび／またはエリスロマイシン選択下におかれる場合、このプラスミドＤＮＡは、ｐｌｃ遺伝子に対する相同性を介して細菌ゲノム中に強制的に組み込まれ得る。得られた組み換え細菌は組み込み体と名付けられる。この組み込み体は、ｐｌｃ遺伝子座で組み込まれた１コピーの導入された相同ベクターを含んだ。従って、この得られた組み換え体は、２コピーのｐｌｃ遺伝子、もとの正常なコピーおよび導入された欠失バージョンを含んだ。この導入された耐性遺伝子は、ｐｌｃ遺伝子の２つのコピーの間に位置した。抗生物質選択を、この組み込み体から除去した場合、組み換えは、ｐｌｃ遺伝子の２つのコピーの間で生じた。この組み換え事象は、２つの結果のうちの１つを生じ得る。両方の場合とも、ｐｌｃ遺伝子（耐性遺伝子を含む）の２つのコピーの間のＤＮＡ介入が除去された。第一の結果では、正常なｐｌｃ遺伝子が修復されて、もとの親株が回復された。第二の結果では、正常なｐｌｃ遺伝子を、欠失コピーで置換して、所望のα毒素欠失体構築物を生成する。欠失体株のα毒素は不活性化されるので、この株は非溶血性であった。従って、所望の欠失体組み込み体は、血液寒天プレート上の非溶血性クローンについてスクリーニングすることによって特定した。

所望の組み換え体を生じる組み換え事象は、低頻度で生じると予想されたので、高い形質転換効率を有する親Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ株を使用することが重要であった。従って、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのいくつかの最近の鳥類単離体を、形質転換効率について分析した。この単離体を、ＡｌｌｅｎおよびＢｌａｓｃｈｅｋ（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５４：２３２２（１９８８））によって記載されるとおり、ただしわずかに改変して（下に記載）、シャトルプラスミドｐＪＩＲ４１８で形質転換した。株１２４０は、最高の形質転換効率（表１を参照）である、１μｇのｐＪＩＲ４１８プラスミドＤＮＡあたり９．２×１０^６個という形質転換体を示した。この株を、欠失体ＣＰＥＲＦ００１の構築のための親株であるとして選択した。株２９を、ＣＰＥＲＦ００２の親株であるとして選択した。

ＴＳＹＣ培地（３０ｇ／ｌのトリプシンソイブロス、５ｇ／ｌの酵母抽出液、０．５ｇ／ｌのシステイン）中での一晩の嫌気的培養からのＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ株１２４０細胞を、１：２５希釈して、Ａ_６００＝０．５４３６まで増殖した。１８，０００×ｇで１０分間の１００ｍｌの細胞の遠心分離後、エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞を、等容積の前還元スクロースリン酸マグネシウム（ｓｕｃｒｏｓｅ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（「ＳＭＰ」は、２７０ｍＭのスクロース、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、７ｍＭのＮａＰＯ_４、ｐＨ７．３として調製した）緩衝液中で細胞を２回再懸濁することによって、続いて０．５ｍｌのＳＭＰでの最終再懸濁によって調製した。これによって、約２．０ｍｌという最終容積が得られた。

１００μｌの細胞のアリコートを、０．２ｃｍキュベット中で４μｇのプラスミド１１６２−５５．２０でエレクトロポレーションした。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩを、１．３７キロボルト、１００オームの抵抗および５０マイクロファラッドのキャパシタンスで用いた。エレクトロポレーションの直後、細胞を２．０ｍｌの前還元したトリプシンソイ酵母培地（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｙｅａｓｔ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｍｅｄｉａ）（「ＴＳＹＣ」は、３０ｇのトリプシンソイブロス、５ｇの酵母抽出液、０．５ｇのシステイン、９５０ｍｌの水として調製した）で希釈して、嫌気ジャー中で３７℃で３時間インキュベートした。回収期間後、細胞の希釈物を、ＴＳＹＣ＋２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールのプレート上にプレートした。これらのプレートを嫌気ジャー中で３７℃で一晩インキュベートした。

一晩の増殖後、１μｇの１１６２−５５．２０のＤＮＡあたり平均で５０個のクロラムフェニコール耐性コロニーを観察した。７つの推定組み換え体の単一のコロニーを、非選択性ＴＳＹＣ培地中で、４継代増殖について増殖して、非選択性血液寒天プレート上にプレートした。非選択ストックの１つ、１１９２−３１．７は、いくつかの非溶血性コロニーを示した。これらの非溶血性コロニーのうちの２１個を非選択性のマスタープレートにパッチし、そして複製をＴＳＹＣ＋クロラムフェニコールのプレート上にプレートした。２１のコロニーのうち２つがクロラムフェニコール感受性であった。

クロラムフェニコール感受性の推定の欠失体のうちの１つ、１１９２−３２．１４を、１２４０野性型および組み換え体１１９２−３１．７とともに増殖させて、血液寒天プレートにプレートした。この１２４０野性型株は、β溶血のクリアーなゾーンを示したが、１１９２−３２．１４欠失体は、非溶血性クローンの純粋な培養物であって、ＣＰＥＲＦ００１と改名された。

他の血液プレートをマスターとして用い、そして複製を非選択性および選択性の培地にプレートした。１２４０野性型およびＣＰＥＲＦ００１はクロラムフェニコールおよびエリスロマイシン感受性であった。組み換え体の１１９２−３１．７は、予想どおりクロラムフェニコールおよびエリスロマイシンの両方に耐性であった。

嫌気性耐性遺伝子が存在するがＣＰＥＲＦ００１では発現されないという可能性を除外するために、クロラムフェニコールおよびエリスロマイシン遺伝子に特異的なＰＣＲプライマーをＰＣＲ反応における使用のために合成した。ゲノムＤＮＡを野性型、組み込み体およびＣＰＥＲＦ００１株から調製して、嫌気性遺伝子プライマーとのＰＣＲ反応のためのプライマーとして用いた。ＰＣＲ分析の結果、自殺プラスミドおよび組み込み体からだけ正の応答が示され、そして親の１２４０または欠失体ＣＰＥＲ００１では示されなかった。これによって耐性遺伝子配列の予想された欠損が確認された。

α毒素遺伝子内の欠失を確認するために、この欠失周囲の１０８６ｂｐ領域を、適切なα毒素特異的なプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。この増幅されたフラグメントをクローニングして配列決定した。配列決定の結果、α毒素遺伝子のｔｙｒ６２〜ｔｒｐ７０の９アミノ酸の欠失、および単一のｌｅｕの挿入が確認された（図２Ａ〜図２Ｃを参照のこと）。

ＣＰＥＲＦ００１を、不活性化αトキソイドタンパク質の発現についてアッセイした。６時間の嫌気的増殖後、１ｍｌの細胞のアリコートを、収集して、遠心分離した。未濃縮の上清培地の１５μｌを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析して、組み換えα毒素タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体によるウエスタンブロット分析に供した（Ｖａｃｃｉｎｅ １１（１２）：１２５３〜１２５８（１９９３））。この結果、αトキソイドタンパク質に予測されるサイズのタンパク質との特異的な抗体反応性が示された。

ＣＰＥＲＦ００１は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのＡ型の遺伝子操作された欠失体株である。この株は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素の不活性なトキソイドを分泌する。この株は活性なα毒素をもはや発現しないが、毒素の抗原性の重要な部分を保持しているので、これはＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによって生じる疾患に対して防御するワクチンとして有用である。

実施例３
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ組み換え体ＣＰＥＲＦ００２の構築
Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの株２９の低い形質転換効率（表１、前出を参照のこと）を補償するために、新規な相同ベクターを構築した。この新規なベクターは、株２９のゲノムから直接クローニングしたＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの配列を組み込んだ。これは、より効率的な組み換え工程を生じると予測された。この新規なベクターは、以下のように作成した１１９２-３８．３であった。

最初の工程では、Ｅ．ｃｏｌｉ複製領域およびＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ耐性遺伝子を、シャトルプラスミドｐＪＩＲ４１８（Ｓｌｏａｎら、Ｐｌａｓｍｉｄ ２７，２０７（１９９２）；Ｇｅｎｅｂａｎｋ Ｍ７７１６９）からクローニングした。プラスミドｐＪＩＲ４１８は、制限酵素ＮｄｅＩで消化した。大フラグメントの連結によってプラスミド１１９２−２３．１を作成した。このプラスミドは、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの複製起点を欠くが、実施例１で構築されたプラスミド１１６２−４５．１とは異なり、これは、ｐＪＩＲ４１８の全体のマルチクローニング部位を保持する。

次の工程では、ｐｌｃ遺伝子のＣ末端の半分を、内部プラスミド１１９２−２３．１中にサブクローニングした。株２９由来のゲノムＤＮＡを、ロング・レンジＰＣＲのテンプレートとして用いた。ｐｌｃ遺伝子（α毒素）の領域をＢａｍＨＩ部位からＣＰＥ００３８遺伝子のある部分を増幅した。上流のｐｌｃプライマー、５’ＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴＡＣＡＧＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＣＴＣＡＡＡＧＧＡＴ３’（配列番号１８）は、株１３のヌクレオチド４８８８０〜４８９１６に相当する（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＣ ００３３６６）。ＣＰＥ００３８遺伝子内の下流のプライマー、５’ａｃｔｃｔｇｃａｇＴＴＧＴＣＡＴＡＴＣＡＡＴＴＡＡＡＴＴＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＣＣ３’（配列番号１９）は、株１３のヌクレオチド５１２４４〜５１２７５に相補的であり、そしてＰｓｔＩ制限部位（小文字）を含む隣接するヌクレオチドを含む。２４０２塩基対の生成物を得て、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化した。このフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ消化した１１９２−２３．１の大きいフラグメントと連結して、プラスミド１１９２−３６．１０を生成した。

最終工程では、ｐｌｃ遺伝子のＮ末端の半分をＰＣＲを介してクローニングした。上流のプライマー、５’ａｃｔｇａｇｃｔｃＣＴＡＧＡＣＡＣＴＴＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＴＴＴＧＧＧＡＡ３’（配列番号２０）は、株１３のヌクレオチド４６５１３〜４６５４０に相当し、そして隣接するヌクレオチドおよびＳａｃＩ部位（小文字）を含む。下流プライマー、５’ａｃｔｇｇａｔｃｃＧＣＡＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴＡＡＴＣＴＧＧＡＴＡＡＧＴＡＧＡＡＣＣ３’（配列番号２１）は、株１３のヌクレオチド４８８２４〜４８８５５に対して相補的であって、隣接するヌクレオチドおよびＢａｍＨＩ部位を含む。２３６３塩基対の産物を生成して、これをＳａｃＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。この消化したフラグメントを、ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩ消化した１１９２−３６．１０の大きいフラグメントと連結して、プラスミド１１９２−３８．３を生じた。１１９２−３８．３におけるｐｌｃのＢａｍＨＩ部位に隣接する領域の引き続く配列決定によって、ｔｙｒ６２〜ｔｒｐ７０の９アミノ酸の欠失を確認した。

プラスミド１１９２−３８．３を用いて、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ株２９の細胞をエレクトロポレーションした。株２９は、１μｇのｐＪＩＲ４１８プラスミドのＤＮＡあたり、３．６×１０^４個の形質転換体という効率で形質転換することが前に示された。株２９細胞を増殖して、３時間の回収期間の後に液体選択技術を用いたこと以外は、実施例２におけるとおりエレクトロポレーションした。プレーティングの代わりに、細胞の０．６７ｍｌのアリコートを１２ｍｌのＴＳＹＣ＋２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール中に希釈して、嫌気ジャーにおいて３７℃で一晩増殖させた。１２４０に対する株２９の低い形質転換およびプレート効率という理由で、この改変を用いた。一晩の増殖後、細胞を、選択培地中で再度希釈した。次いで、第二の増殖からの細胞を、選択なしに５継代した後に、血液寒天プレート上へプレートした。血液寒天プレートからのコロニーで非溶血性のものはなかった。次いで、２つの血液プレートをＴＳＹＣ、ＴＳＹＣ＋２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよびＴＳＹＣ＋５０μｇエリスロマイシンプレートに複製プレートした。全てのコロニーは、エリスロマイシン感受性であったが、１３０コロニーのうちの１つだけがクロラムフェニコール感受性であった。このコロニーである１１９２−４５．４ＢをＣＰＥＲＦ００２と改名した。α毒素特異的なプライマーでのＣＰＥＲＦ００２由来のゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析によって、α毒素の陽性のバンドが示された。このバンドは、野性型株２９ＤＮＡ由来の対応するバンドよりも小さかった。クロラムフェニコールおよびエリスロマイシン耐性遺伝子に特異的なプライマーは、ＣＰＥＲＦ００２ＤＮＡを増幅できなかったが、プラスミド１１９２−３８．３由来の強力な陽性のバンドを示した。ＣＰＥＲＦ００２α毒素の配列決定によって、９アミノ酸欠失が確認された（図３を参照のこと）。

ＣＰＥＲＦ００２を、不活性αトキソイドタンパク質の発現についてアッセイした。嫌気的増殖の６時間後、１ｍｌの細胞のアリコートを収集して遠心分離した。１５マイクロリットルの未濃縮の上清培地を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析して、組み換えα毒素タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体でのウエスタンブロット分析に供した（Ｖａｃｃｉｎｅ １１：１２５３（１９９３））。この結果、αトキソイドタンパク質について予想されるサイズのタンパク質との特定の抗体反応性が示された。

ＣＰＥＲＦ００２は、Ａ型Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの遺伝子操作された欠失体株である。この株は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素の不活性化トキソイド型を分泌する。この株はもはや活性なα毒素を発現しないが、毒素の抗原性の重要な部分を保持したままであるので、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによって生じる疾患に対して防御するためのワクチンとして有用である。

実施例４
Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの欠失体ワクチン
実施例２および３に記載されるＣＰＥＲＦ００１およびＣＰＥＲＦ００２欠失体ワクチン株を、それらが野性型Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓでのチャレンジに対する防御を提供する能力について評価した。この研究の最初の部分は、生ワクチン株の投与が、胚を含む卵の孵化率に対して何らかの有害な影響を有するか否かを決定するようにデザインした。実験群および安全な結果の割り当ては表２に記載される。

１０^３以下の用量（第１、２、５および６群）で、これらの群における孵化率は、培地のみを接種された群（群１１）よりも、または接種されなかった群（群１２）よりも有意に低くなかった。最低用量で、ＣＰＥＲＦ００１は培地コントロールと同じ、そして未接種のコントロール群よりも優れた孵化率を示した。

より高用量の欠失体は、卵の孵化率に対して有害な影響を有し得るので、各々の欠失体について２つの最低用量群が、この研究の有効性部分に含まれた。これらの群を、培地コントロールの鳥（群１１）とともに、（野性型）Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ株ＣＰ６でチャレンジし、これは、鳥が２０、２１および２２日齢の時に、１羽あたり約１０^８ｃｆｕ／ｍｌで経口投与した。全ての鳥は、２５日齢で剖検して、小腸内の病変を、下にまとめた壊死性の腸炎のついての評定スケールを用いてスコア付けした。

ワクチン接種していないコントロール群（チャレンジなし）由来の五（５）羽を、研究の終わりに剖検して、この研究の経過の間にＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓに対する暴露がなかったことを確認した。この結果を表３に提示する。

第１群および第２群のスコアは各々、第１１群に比較して統計学的に有意に低かった（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｅｘａｃｔ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔ ｐ≦０．０２５０）。第５群および第６群の平均スコアは、第１１群よりも低かったが、統計学的に異なることはなかった（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｅｘａｃｔ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔ ｐ≧０．２１７７）。ワクチンの有効性の評価は、Ｄａｖｉｄ Ｓｉｅｖによって記載された手順に従って行った［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ 第４巻、第２号、５００〜５０８（２００５）］。疾患の重篤度を軽減するワクチンの有効性は、第１１群に比較した場合、１群では５４％、２群では６５％、５群では２０％、そして６群では２７％と見積もられた。

実施例５
Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのブタ欠失体の構築
前出の実施例１および２で用いられるストラテジーを用いて、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのブタ株からα毒素欠失変異体を構築する。最初に、疾患のブタ由来の野外単離体を、プラスミドｐＪＩＲ４１８とともに電気泳動して、それらの形質転換能力を評価する。１μｇのプラスミドＤＮＡあたりの１０^４個以上の形質転換体を生じ、クロラムフェニコールまたはエリスロマイシンのいずれかに感受性である単離体が欠失の候補物である。

候補株由来のゲノムＤＮＡを、ｐｌｃ（α毒素）遺伝子および隣接する配列のロング・レンジＰＣＲについてのテンプレートとして用いる。ＰＣＲ産物のサブクローニング後、このα毒素遺伝子および隣接する領域を配列決定して、制限マッピングする。新規なオリゴヌクレオチドプライマーを、隣接する制限部位で合成し、そして２つの別の増幅の産物を自殺プラスミド１１９２−２３．１にクローニングして、実施例１のとおり２７塩基対欠失を作成する。

ブタの自殺ベクターを、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの対応するブタ株中にエレクトロポレーションし、そして欠失変異体を、上記の実施例２に記載の方法を用いて単離した。欠失変異体を、血液寒天プレート上でのβ溶血の非存在によって、そしてα毒素遺伝子のＤＮＡ配列決定によって確認する。

この構築物は、Ａ型のＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの遺伝子操作された欠失体株である。この株は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素の不活性化トキソイド型を分泌する。この株はもはや活性なα毒素を発現しないが、毒素の抗原性の重要な部分を保持したままであるので、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓにより生じる疾患に対してブタを防御するためのワクチンとして有用である。

生物学上の寄託
以下の生物学的材料が、下記の国際寄託機関に寄託された：
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ） １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９，Ｕ．Ｓ．Ａ．（特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の要求を満たす条件のもと）

図１は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素コード領域のゲノムのマップを図示する。ＣＰＥＲＦ００１を構築するために用いられた、それぞれ、２つの大きいフラグメント（１１８２塩基対および１７４６塩基対）の位置を示す。得られた２７塩基対欠失の位置も示す。「Ｙｐｌｃ」は、ｙｐｌｃ遺伝子（ＣＰＥ００３５）を示し；「ｐｌｃ」とは、α毒素（ホスホリパーゼＣ）をコードする遺伝子を示し、そして「ＣｏｂＷ」は、下流の遺伝子を示す。 図２Ａは、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ株ＣＰ６由来のｐｌｃ遺伝子の一部の配列［配列番号４；これは、ＣＰ６由来のｐｌｃ遺伝子フラグメントの配列番号２２の一部である（すなわち、ヌクレオチド２６２〜３００）］、および対応するペプチド配列（配列番号５）を図示しており、ここで下線は、この欠失を作成するために用いられたＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位を示す。図２Ｂは、欠失体ＣＰＥＲＦ００１を生じる、親のＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ株１２４０における欠失を作成するために用いられたプライマーの配列（配列番号６）を図示する。下線は、この欠失の構築を容易にするためにプライマー中に含まれるＢａｍＨＩ制限部位を示す。また対応するペプチドが図示される（配列番号７）。図２Ｃは、ＣＰＥＲＦ００１（配列番号８；ヌクレオチド１０３〜１１７）において得られた欠失の配列、そして対応するペプチド（配列番号９）を図示する。下線は、回復されたＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位を示す。 図３Ａは、ここでも、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの株ＣＰ６由来のｐｌｃ遺伝子の一部の配列［配列番号４、ヌクレオチド２６２〜３００］および対応するペプチド配列（配列番号５）を図示しており、ここで下線は、この欠失を作成するために用いられたＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位を示す。図３Ｂは、欠失体ＣＰＥＲＦ００２を生じる、親のＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ株２９における欠失を作成するために用いられたプライマーの配列（配列番号１０）を図示する。また対応するペプチドが図示される（配列番号１１）。図３Ｃは、ＣＰＥＲＦ００２（配列番号１２）において得られた欠失、そして対応するペプチド（配列番号１３）の配列を図示する。

Claims (30)

1. Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの実質的に非毒性のムテインα毒素をコードする核酸分子であって；該ムテインα毒素は、配列番号３のアミノ酸配列からＴｙｒ_６２〜Ｔｒｐ_７０にまたがる９つの連続アミノ酸残基がなくなったアミノ酸配列を含み；かつ該欠失されたアミノ酸残基の１つがＨｉｓ_６８である、核酸分子。
2. 配列番号２の核酸配列からヌクレオチド２６８〜２９４が欠失されている核酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
3. 欠失されたヌクレオチドが単一のＬｅｕ残基をコードするヌクレオチド配列によって置換される、請求項２に記載の核酸分子。
4. Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの実質的に非毒性のムテインα毒素であって；該ムテインα毒素は、配列番号３のアミノ酸配列からＴｙｒ_６２〜Ｔｒｐ_７０にまたがる９つの連続アミノ酸残基がなくなったアミノ酸配列を含み；かつ該欠失されたアミノ酸残基の１つがＨｉｓ_６８である、非毒性のムテインα毒素。
5. 前記９連続アミノ酸残基が欠失されておりかつ、単一のＬｅｕ残基によって置換される、請求項４に記載のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの実質的に非毒性のムテインα毒素。
6. 非弱毒化のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体の染色体中に請求項１に記載の核酸分子を組み込むことによって構築される、弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
7. 実質的に非毒性である、請求項６に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
8. 前記核酸分子が、非弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓに存在する野性型α毒素をコードする核酸分子の位置に相同である染色体上の位置に配置される、請求項６に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
9. Ａ型のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓである、請求項６に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
10. 請求項６に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体であって、哺乳動物または鳥類のいずれかである宿主動物から単離された非弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓから構築されたものである、弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
11. 前記哺乳動物が、ウシ、ウマおよびブタからなる群より選択される、請求項１０に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
12. 前記鳥類が、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、ハクチョウ、ハト、ライチョウまたはヤマウズラである、請求項１０に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
13. 請求項６に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体を含むワクチン。
14. 薬学的に受容可能な緩衝液、賦形剤またはアジュバントのうち１つ以上をさらに含む、請求項１３に記載のワクチン。
15. 動物においてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓに対する免疫を誘導するための、請求項１３に記載のワクチン。
16. 前記ワクチンが、口腔、筋肉内、静脈内、経皮、皮下または鼻腔内のうちの１つ以上によって投与されることを特徴とする、請求項１５に記載のワクチン。
17. 前記ワクチンが、前記動物の飼料の上にかぶされる、請求項１５に記載のワクチン。
18. 前記ワクチンが、経口投与で与えるために前記動物に噴霧される、請求項１５に記載のワクチン。
19. 請求項１３に記載のワクチンを含む動物の飼料。
20. 非Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項６に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
21. 前記非Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓポリペプチドが非細菌ポリペプチドである、請求項２０に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
22. 前記非細菌ポリペプチドが鳥類または哺乳動物ポリペプチドである、請求項２１に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
23. 非細菌性ポリペプチドが鳥類のポリペプチドである、請求項２２に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
24. 前記非細菌性ポリペプチドがサイトカインである、請求項２２に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
25. 前記サイトカインがニワトリＩＬ−１８である、請求項２４に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
26. Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素に見出されるが、請求項６に記載のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの実質的に非毒性のムテインα毒素から失われているエピトープに選択的に結合する抗体であって、野性型Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα毒素から該実質的に非毒性のムテインα毒素を識別し得る、抗体。
27. 被験体動物が、請求項６〜１２および２０〜２５のいずれか１項に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体以外のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体によって感染されているか否かを特定するための試験キットであって、請求項２６に記載の抗体を含む、試験キット。
28. Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体によって感染されている動物を、請求項６〜１２および２０〜２５のいずれか１項に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体を用いてワクチン接種された動物から特定する方法であって：
    （ａ）該動物由来の流体サンプルと、請求項２７に記載の抗体とを接触させる工程と、
    （ｂ）該抗体が該流体サンプルと反応するか否かを決定する工程と；
    を包含し、
    該抗体が、該流体サンプルと反応する場合、該動物は、請求項６〜１２および２０〜２５のいずれか１項に記載の弱毒化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体以外のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体によって感染されている動物として特定される、
    方法。
29. 請求項１に記載の核酸分子が染色体に組み込まれたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。
30. 請求項３に記載の核酸分子が染色体に組み込まれたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ生物体。

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