MX2008013451A - Organismos clostridium atenuados recombinantes y vacuna. - Google Patents

Abstract

La presente invención describe organismos Clostridium perfringens atenuados, que expresan una toxina alfa sustancialmente no tóxica; la toxina alfa expresada es una muteína de deleción a la que, en relación con la toxina alfa de la toxina alfa madura de la cepa 13 de Clostridium perfringens, le faltan por lo menos 9 residuos de aminoácidos consecutivos, que incluyen His68; la presente invención describe además organismos atenuados que codifican las muteínas, y también, el uso de dichos organismos atenuados como vacunas.

Description

ORGANISMOS CLOSTRIDIUM ATENUADOS RECOMBINANTES Y VACUNA REFERENCIA CRUZADA Esta solicitud es una solicitud no provisional que reclama la prioridad con base en 35 U.S.C. §119 (e) de las solicitudes provisionales de E.U.A. No. de Serie 60/792,553 presentadas en Abril 17, 2006, el contenido de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad.

CAMPO TECNICO Esta invención se relaciona con organismos Clostridium atenuados; con métodos para su elaboración y uso; y con toxinas alfa de muteínas y ácidos nucleicos que las codifican.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los patógenos bacterianos anaerobios constituyen una grave carga económica para la industria agrícola. Las bacterias de la familia Clostridium representan una carga particular, ya que estas bacterias causan graves enfermedades en aves de corral y otros animales domésticos de valor económico. Los esfuerzos previos para controlar estos organismos se han sostenido en medidas sanitarias y en la administración de antibióticos a la alimentación del animal. En particular, Clostridium perfringens ("C. perfringens") es una bacteria anaerobia hallada en el suelo, en materia orgánica en descomposición, y como parte de la flora intestinal de seres humanos y animales. Las diferentes cepas de C. perfringens se designan como los biotipos A a E, conforme al espectro de toxinas producidas [Justin y col., Biochemistry, 41 , 6253-6262 (2002); McDonel (1986), PHARMACOLOGY OF BACTERIAL TOXINS; F. Dorner y J. Drews (Eds.), Pergamon Press, Oxford]. Las cepas del biotipo A son de particular importancia como los agentes etiológicos de diversos tipos de gangrena y enfermedades intestinales. Una enfermedad intestinal particularmente grave causada por C. perfringens es la enteritis necroticans (también conocida en la técnica como "enteritis necrótica"), una gangrena del intestino que provoca necrosis, septicemia y hemolisis, tanto en seres humanos como en animales domésticos [ver las referencias de Pearson y col., J. Am. Vet. Med, 188 (1 1 ): 1309-10 (1986); Al-Sheikhy y Truscott, Avian Dis., 21 (2): 256-63 (1977)]. Para aves, por ejemplo, pollos (Gallus gallus), la enteritis necroticans es un problema significativo. C. perfringens del tipo A o tipo C puede causar pérdidas importantes, en especial, en la producción de pollos criados para el consumo [Fickeh y Wages, "Necrotic Enteritis", en Diseases of Poultry, 10.a edición, pp. 261-264 (1997)]. Además de las pérdidas asociadas con los brotes de enteritis necrótica, se informa que se altera la productividad en grupos de animales con enfermedad asociada a C. perfringens [Lovi y Kaldhusdal, Avian Pathology, 30: 73-81 (2001 )]. Como se observa con anterioridad, los agentes antibacterianos insertados en la alimentación del animal constituyen el método de control más común. Sin embargo, los agentes antibacterianos, tales como antibióticos, son costosos, y son sujeto de crecientes preocupaciones relacionadas con la promoción de resistencia bacteriana. Más recientemente, se han hecho intentos para proporcionar vacunas contra clases nocivas de Clostridium. Por ejemplo, Lovland y col. [Avian Pathology, 33 (1): 83-92 (2004)] demostraron vacunas candidatas a base de toxoides de C. perfringens tipo A y tipo C, con un coadyuvante de hidróxido de aluminio. Se informó que la vacunación de gallinas progenitoras proporcionó anticuerpos específicos para la protección de la descendencia contra lesiones intestinales inducidas por el estímulo subclínico con C. perfringens. Se conocen otras vacunas a base de toxoides preparadas a partir de toxinas de C. perfringens detoxificadas [ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,292,307, que describe toxoides de C. perfringens tipos A, B y D, Cl. oedematiens y Cl. Septicum]. Se han propuesto además preparaciones de toxoides recombinantes. Por ejemplo, Titball y col. [Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,851 ,827; 6,403,094; y 5,817,317] informan ácidos nucleicos que codifican péptidos de C. perfringens antigénicos, y también, los péptidos en sí mismos, y vacunas preparadas a partir de los péptidos. Se describen péptidos, por ejemplo, que tienen los residuos de aminoácidos 261 a 300 de la toxina alfa de C. perfringens del tipo silvestre, pero que carecen de los dominios de hidrolizinas de esfingomielina y fosfolipasa C de la toxina natural. Se informó además que estos péptidos inducen la protección inmunitaria contra la toxina natural. Además, la Patente de los Estados Unidos No. 6,610,300 describe una vacuna a base de un fragmento antigénico de una toxina beta de C. perfringens de muteína. Sin embargo, sin consideración de si la vacuna de toxoide deriva del organismo nativo o se obtiene mediante por recombinación, la producción y administración de proteínas de toxoides a animales que necesitan inmunización se consideran una carga económica, excepto en circunstancias especiales (por ejemplo, el tratamiento de seres humanos que podrían ser alérgicos o sensibles a otros componentes de una vacuna de organismo entero). Además, las vacunas a base de proteínas/toxoides habitualmente requieren repetidas vacunaciones de refuerzo, a fin de mantener la eficacia completa. Otra solución propuesta ha sido el diseño de un virus antigénicamente activo que produzca una toxina alfa de muteína, en lugar de la toxina del tipo silvestre. Por ejemplo, Bennett y col. [Viral Immunol., 12 (2): 97-105 (1999)] han demostrado un vector de virus de la vacuna recombinante que expresa un dominio C no tóxico de toxina alfa de C. perfringens. Desafortunadamente, si bien se han propuesto diversas vacunas de virus de la vacuna recombinante durante los últimos 20 años, aún subsisten preocupaciones relacionadas con la seguridad de la liberación de virus de la vacuna infecciosos vivos en un entorno donde podrían ser transmitidos a aquellas personas no resistentes a este virus. Se sabe que la toxina alfa (gen pie) de C. períringens posee diversas actividades biológicas, entre ellas, actividad hemolítica, actividades de fosfolipasa C, esfingomielinasa, fosfodiesterasa y actividades letales. En la técnica existen una cantidad de informes relacionados con mutaciones de esta toxina alfa, que reducen la toxicidad. Schoepe y col. [Infect. and Immun., 69 (1 1): 7194-7196 (2001)] describen una cepa de C. perfringens natural que produce una toxina alfa no tóxica. Sin embargo, es difícil modificar esta cepa a fin de producir protección inmunitaria contra otra variante diferente del género C. períringens del tipo silvestre tóxico. Williamson y Titball [Vaccine, 1 1 (12): 1253-1258 (1993)] demostraron que la región de la toxina desde el residuo de aminoácido 247 al 370 sola fue suficiente para inmunizar ratones contra gangrena gaseosa inducida experimentalmente por C. períringens. Alape-Girón y col. [Eur. J. Biochem., 267: 5191-5197 (2000)] han informado que las sustituciones en Asp269, Asp336, Tyr275, Tyr307 y Tyr331 redujeron la toxicidad de la toxina alfa. Nagahama y col. [Infect. and Immun., 65: 3489-3492 (1997)] informaron que el reemplazo de Asp-56, Asp-130 o Glu-152 logró menor toxicidad de la toxina alfa. Nagahama y col. [J. Bacteriology, 177: 1 179-1 185 (1995)] informaron que la sustitución de la histidina en la posición 68 con un aminoácido neutro, tal como glicina, en la toxina alfa de C. perfringens logró la pérdida completa de actividades hemolítica, de fosfolipasa C, esfingomielinasa y letal de la toxina alfa de muteína. Se cree que este cambio de aminoácido único inactivo uno de los tres dominios de unión de cinc de la proteína. El dominio de unión de cinc inactivado por la sustitución de His68 más tarde fue denominado Zn2 [Justin y col., Biochemistry, 41 : 6253-6262 (2002)]. A pesar de lo descrito anteriormente, aún permanece en la técnica la necesidad de un método seguro, económico y eficaz para la protección de animales domésticos intensivamente criados, por ejemplo, aves, tales como pollos, contra la infección del género Clostridium, como C. perfringens. La cita de cualquier referencia en esta solicitud no debe interpretarse como una admisión de que dicha referencia constituye "técnica previa" para la presente solicitud.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION A fin de dirigirse a las desventajas en la técnica descritas con anterioridad, la presente invención provee moléculas de ácido nucleico que codifican una muteína sustancialmente no tóxica de toxina alfa de Clostridium perfringens. En una de dichas modalidades, la molécula de ácido nucleico codifica una toxina alfa de muteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, menos por lo menos 18 residuos de aminoácidos consecutivos, donde uno de los residuos de aminoácidos eliminados es HiS68- En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica una toxina alfa de muteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, menos por lo menos 12 residuos de aminoácidos consecutivos, donde uno de los residuos de aminoácidos eliminados es His68-Aun en otra modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica una muteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, menos por lo menos 9 residuos de aminoácidos consecutivos, donde uno de los resid uos de aminoácidos eliminados es His6s- Aun en otra modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica una muteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, menos por lo menos 6 residuos de aminoácidos consecutivos, donde uno de los residuos de aminoácidos eliminados es His68- En incluso otra modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica una muteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, menos por lo menos 3 residuos de aminoácidos consecutivos, donde uno de los residuos de aminoácidos eliminados es His68- En una modalidad, una molécula de ácido nucleico de la presente invención codifica una muteína en la cual están eliminados no más de 48 residuos de aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico codifica una muteína en la cual están eliminados no más de 36 residuos de aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Aun en otra modalidad, una molécula de ácido nucleico codifica una muteína en la cual están eliminados no más de 24 residuos de aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Incluso en otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de la presente invención codifica una muteína en la cual están eliminados no más de 18 resid uos de aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En una modalidad particular, la presente invención provee una molécula de ácido nucleico que codifica una muteína en la cual están eliminados 9 residuos de aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, uno de los cuales es His68. En una modalidad particular de este tipo, la molécula de ácido nucleico codifica una muteína en la cual los 9 residuos de aminoácidos consecutivos eliminados oscilan entre Tyr62 y Trp70 de SEQ ID NO: 3. En una modalidad más particular, la molécula de ácido nucleico codifica una muteína en la cual estos nueve aminoácidos consecutivos eliminados están reemplazados por un solo residuo leucina. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, donde los nucleótidos 268-294 están eliminados. En una modalidad específica de este tipo, los nucleótidos 268-294 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 están reemplazados por tres nucleótidos que codifican un solo residuo leucina. La invención además provee muteínas sustancialmente no tóxicas de toxina alfa de Clostridium perfringens. En una de dichas modalidades, la toxina alfa de muteína comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO.: 3, menos por lo menos 18 residuos de aminoácidos consecutivos, donde uno de los residuos de aminoácidos eliminados es His68- En otra modalidad, la muteína comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, menos por lo menos 12 residuos de aminoácidos consecutivos, donde uno de los residuos de aminoácidos eliminados es H¡S68- Aun en otra modalidad, la muteina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, menos por lo menos 9 residuos de aminoácidos consecutivos, donde uno de los residuos de aminoácidos eliminados es His68- Incluso en otra modalidad, la muteina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, menos por lo menos 6 residuos de aminoácidos consecutivos, donde uno de los residuos de aminoácidos eliminados es His68- Aun en otra modalidad, la muteina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, menos por lo menos 3 residuos de aminoácidos consecutivos, donde uno de los residuos de aminoácidos eliminados es His68- En una modalidad, una muteina de la presente invención no tiene más de 48 residuos de aminoácidos consecutivos eliminados de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, la muteina no tiene más de 36 residuos de aminoácidos consecutivos eliminados de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Aun en otra modalidad, la muteina no tiene más de 24 residuos de aminoácidos consecutivos eliminados de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Incluso en otra modalidad, la muteina no tiene más de 18 residuos de aminoácidos consecutivos eliminados de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En una modalidad particular, la presente invención provee una muteina sustancialmente no tóxica en la cual están eliminados 9 residuos de aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, uno de los cuales es HiS68- En una modalidad más particular de este tipo, los nueve residuos de aminoácidos consecutivos eliminados oscilan entre Tyfe y Trp70 de SEQ ID NO: 3. En una modalidad aún más particular, estos nueve aminoácidos consecutivos eliminados están reemplazados por un solo residuo leucina en la secuencia de aminoácidos de la muteína. La invención además provee organismos Clostridium perfringens atenuados que tienen una molécula de ácido nucleico que codifica una muteína sustancialmente no tóxica de toxina alfa de Clostridium perfringens integrada en sus cromosomas. Esta molécula de ácido nucleico integrada preferentemente se ubica en una posición en el cromosoma, homologa a la ubicación de la molécula de ácido nucleico que codifica la toxina alfa del tipo silvestre en el organismo Clostridium perfringens del tipo silvestre. En consecuencia, un organismo Clostridium perfringens atenuado de la presente invención puede ser sustancialmente no tóxico debido a la falta de un gen pie del tipo silvestre funcional. Como se ejemplifica en esta solicitud, el organismo Clostridium perfringens atenuado puede ser un Clostridium perfringens tipo A. En una modalidad particular de la presente invención, el organismo Clostridium perfringens atenuado es Clostridium perfringens CPERF/AaToxina 365-054 (ATCC Depósito No. PTA7364). En otra modalidad particular de la presente invención, el organismo Clostridium perfringens atenuado es Clostridium perfringens CPERF/AaToxina 365-053 (ATCC Depósito No. PTA7365).

Un organismo Clostridium perfringens atenuado por los métodos de la presente invención puede ser aislado de un animal huésped, que es o bien un mamífero, o un ave. Dichos mamíferos pueden abarcar vacas, ovejas y cerdos. Ejemplos de aves apropiadas son pollos, pavos, patos, pichones, gansos, palomas, cisnes, perdices y urogallos. La presente invención además provee vacunas. Dichas vacunas pueden comprender los organismos Clostridium perfringens atenuados de la presente invención. Las vacunas de esta invención además pueden comprender amortiguadpores, excipientes y coadyuvantes aceptables para uso farmacológico. Aun más, la invención provee métodos para la inducción de inmunidad para Clostridium perfringens en un animal. Una de dichas modalidades comprende la administración de una dosis inmunológicamente eficaz de una vacuna de la presente invención, al animal. Las vacunas de la presente invención pueden administrarse por medio de una cantidad de vías, entre ellas: las vías oral, intramuscular, intravenosa, intradérmica, subcutánea e intranasal. Una vacuna de la presente invención puede ser usada como aderezo en la alimentación del animal, o puede pulverizarse sobre los animales a fin de proporcionar la administración oral. La presente invención además provee una alimentación para animales que comprende una vacuna de la presente invención. La presente invención provee adicionalmente un organismo Clostridium perfringens atenuado de la presente invención, que, además, expresa por lo menos un gen que codifica un polipéptido que no es de Clostridium perfringens. En una de dichas modalidades, uno o más de los polipéptidos que no son de Clostridium perfringens son polipéptidos bacterianos, tales como proteínas antigénicas de E. coli, Salmonella, Lawsonia, Campylobacter, etc., y sus combinaciones. Alternativamente, o en combinación, un polipéptido que no es de Clostridium perfringens puede ser un polipéptido no bacteriano. Ejemplos de dichos polipéptidos no bacterianos incluyen proteínas de mamíferos o aves, por ejemplo, citocinas, tales como IL-18 de pollo; virus, tales como rotavirus o coronavirus; y parásitos, tales como Eimeria, isosporas y criptosporidios. En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo que se une de manera selectiva a un epítope que falta en la muteína sustancialmente no tóxica de la toxina alfa de Clostridium perfringens. Dichos anticuerpos pueden distinguir la muteína sustancialmente no tóxica de una toxina alfa de Clostridium perfringens del tipo silvestre. Se proveen también equipos de prueba que incluyen los anticuerpos de la presente invención para el uso en la identificación de un sujeto animal vacunado; o, alternativamente, de un sujeto que ha sido infectado naturalmente por un organismo Clostridium perfringens. En consecuencia, se proveen también métodos para la identificación o distinción de un animal que ha sido infectado naturalmente por un organismo Clostridium perfringens, de uno vacunado con un organismo atenuado Clostridium perfringens. En una de dichas modalidades, el método supone el contacto de una muestra de líquido corporal del animal con un anticuerpo que se une selectivamente a un epítope hallado en una toxina alfa de Clostridium perfringens del tipo silvestre, que ha sido eliminado de la muteína sustancialmente no tóxica de la toxina alfa de Clostridium perfringens de la presente invención. Por lo tanto, el anticuerpo puede distinguir aquellos animales que han sido vacunados con una muteína sustancialmente no tóxica de la toxina alfa de Clostridium perfringens de la presente invención (o un organismo atenuado Clostridium perfringens que expresa la muteína), de aquellos infectados por una toxina alfa de Clostridium perfringens del tipo silvestre. La siguiente etapa consiste en la determinación de la reacción del anticuerpo con la muestra de líquido corporal, por ejemplo, la unión a un antigeno contenido en la muestra de líquido corporal. Se identifica el animal como naturalmente infectado por un organismo Clostridium perfringens cuando el anticuerpo reacciona con la muestra de líquido corporal.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra un mapa genómico de la región codificadora de toxina alfa de Clostridium perfringens. Se muestran las ubicaciones de los dos fragmentos grandes (1 182 pares de bases y 1746 pares de bases), respectivamente, utilizados para la construcción de CPERF001. Se indica además la ubicación de la deleción de 27 pares de bases resultante. "Yp/c" indica el gen yp/c (CPE0035); "pie" indica el gen que codifica la toxina alfa (una fosfolipasa C); y "CobW" indica un gen corriente descendente. La Figura 2A ilustra la secuencia de una porción del gen pie de la cepa de C. perfringens CP6 [SEQ ID NO: 4; esta es una porción de SEQ ID NO: 22 (es decir, los nucleótidos 262-300) de un fragmento del gen pie de CP6] y la correspondiente secuencia de péptido (SEQ ID NO: 5), donde el subrayado indica el sitio de restricción de endonucleasa BamH1 utilizado en la creación de la deleción. La Figura 2B ilustra la secuencia del cebador (SEQ ID NO: 6) utilizado para la creación de la deleción en la cepa de C. perfringens progenitora 1240, para dar origen a la construcción de deleción CPERF001. El subrayado indica el sitio de restricción BamH1 incluido en el cebador, para facilitar la construcción de la deleción. Además, se ilustra el péptido correspondiente (SEQ ID NO: 7). La Figura 2C ilustra la secuencia de la deleción resultante en CPERF001 (SEQ ID NO: 8; nucleótidos 103-1 17) y en el péptido correspondiente (SEQ ID NO: 9). El subrayado indica el sitio de restricción de endonucleasa BamH1 restaurado. La Figura 3A ilustra una vez más la secuencia de una porción del gen pie de la cepa de C. perfringens CP6 [SEQ ID NO: 4, nucleótidos 262-300] y la correspondiente secuencia de péptido (SEQ ID NO: 5), donde el subrayado indica el sitio de restricción de endonucleasa BamH1 utilizado en la creación de la deleción.

La Figura 3B ilustra la secuencia del cebador (SEQ ID NO: 10) utilizado para la creación de la deleción en la cepa de C. períringens progenitora 29, para dar origen a la construcción de deleción CPERF002. Además, se ilustra el péptido correspondiente (SEQ ID NO: 1 1 ). La Figura 3C ilustra la secuencia de la deleción resultante en CPERF002 (SEQ ID NO: 12) y el péptido correspondiente (SEQ ID NO: 13).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En consecuencia, la invención provee organismos Clostridium modificados y cultivos que expresan una o más de las toxinas de Clostridium, por ejemplo, toxinas alfa, como muteínas que no tienen toxicidad detectable, o tienen toxicidad sustancialmente baja, en relación con las toxinas de Clostridium nativas o de tipo silvestre. Convenientemente, los organismos mutantes C. períringens de la invención se administran sin dificultad como una vacuna viva a animales. Se proveen también las toxinas alfa de C. períringens de muteínas de la invención, junto con moléculas de ácido nucleico que codifican las muteínas, vectores para la expresión de las toxinas alfa, y métodos para su uso. Con el objetivo de proporcionar una descripción clara de la invención, se definen a continuación diversos términos. Una vacuna es una composición que comprende un inmunógeno y otros ingredientes opcionales aceptables para uso farmacéutico, entre ellos, en ciertas modalidades, adyuvantes adecuados. Conforme a esta solicitud, el término "inmunógeno" describe una composición, una sustancia o un vector, que cuando se introduce en un animal, estimula una respuesta inmune. Para los propósitos de la presente invención, se contempla que un inmunógeno incluye cualquier vector capaz de expresar o introducir la toxina alfa de muteína de la invención en un animal a ser inmunizado. Un vector comprende, por ejemplo, el C. perfringens de la invención u otro microorganismo adecuado que exprese la toxina alfa de muteína de la invención, cuando se introduce el vector en un animal. Un vector además comprende moléculas de ácido nucleico conocidas en la técnica, por ejemplo, plásmidos y similares, que expresan la toxina alfa de muteína de la invención cuando se introducen directamente en un animal, por ejemplo, mediante el ingreso en una célula del animal y la expresión de la toxina alfa de muteína en el animal. Un inmunógeno además es una proteína, tal como la toxina alfa de la invención, empleada por sí misma o como parte de una composición de vacuna adecuada. De conformidad con esta solicitud, y a menos que se indique lo contrario, los términos "inmunizar" y "vacunar" son sinónimos, y se usan de modo indistinto para describir la introducción de un inmunógeno en un animal, a fin de producir una respuesta inmunitaria en el animal. La respuesta inmunitaria producida proporciona inmunidad protectora al animal tratado, que limita o reduce los signos clínicos de enfermedad, por ejemplo, gangrena gaseosa, y/o la mortalidad, en animales vacunados que son estimulados posteriormente con una dosis virulenta de una clase C. perfringens contra la cual protege la vacuna de la invención. El término "adyuvante" se define como una o más sustancias que provocan la estimulación del sistema inmunológico. En este contexto, un adyuvante se usa para mejorar la respuesta inmunitaria a uno o más aislados/ antígenos de vacuna. Un adyuvante puede administrarse al animal objetivo antes de la administración de la vacuna, en combinación con la vacuna, o después de dicha administración. Los adyuvantes de la presente invención pueden obtenerse de cualquiera de una variedad de fuentes, entre ellas, fuentes naturales, fuentes recombinantes; y/o pueden sintetizarse en forma química, etc. Ejemplos de compuestos químicos utilizados como adyuvantes incluyen, sin limitación, compuestos de aluminio; aceites metabolizables y no metabolizables; polímeros en bloque; ISCOM (complejos estimulantes inmunológicos, por sus siglas en inglés); vitaminas y minerales (entre ellos, sin limitación: vitamina E, vitamina A, selenio y vitamina B12); Quil A (saponinas); polímeros a base de ácido acrílico entrelazados (por ejemplo, polímeros de ácido prop-2-enóico) entrelazados a diferentes niveles con un poliéter de polialquileno, como se comercializan con la denominación comercial CARBOPOL®; y/o gotas de aceite de tamaño micrónico dispersadas de manera uniforme en emulsión acuosa, por ejemplo, como se comercializan con la denominación comercial Emulsigen®. Ejemplos adicionales de adyuvantes, que en ciertas ocasiones han sido referidos específicamente como estimulantes inmunológicos, incluyen: componentes de la pared celular bacteriana y fúngica (por ejemplo, lipopolisacáridos, lipoproteínas, glicoproteínas, péptidos de muramilo, beta-1 ,3/1 ,6-glucanos); diversos carbohidratos complejos derivados de plantas (por ejemplo, glicanos, acemanano); diversos péptidos y proteínas derivados de animales (por ejemplo, hormonas, citocinas, factores coestimulantes); y nuevos ácidos nucleicos derivados de virus y otras fuentes (por ejemplo, ARN de doble hebra, CpG). Además, cualquier número de combinaciones de los ingredientes mencionados puede proporcionar un efecto adyuvante, y por lo tanto, pueden formar un adyuvante de la presente invención. El término "anticuerpo", de acuerdo con esta solicitud, tiene el propósito de abarcar anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales o sus fragmentos o derivados recombinantes, que incluyen proteínas de unión diseñadas que incorporan dominios variables de anticuerpo. De acuerdo con esta invención, la numeración de residuos y la posición de residuos de aminoácidos de las proteínas de toxina alfa de la invención se sostienen en el sistema de numeración descrito para Clostridium perfringens, cepa 13. La toxina alfa de la cepa 13 de C. perfringens es informada por GenBank, Acceso No. NC 003366, como se ¡lustra en la SEQ ID NO: 1 . La proteína entera tiene 398 aminoácidos de largo. La toxina alfa codificada por los vectores de muteína ejemplificados a continuación corresponde a la proteína de SEQ ID NO: 1 que tiene una deleción de los residuos de aminoácidos 90-98. Hay una secuencia de señal de 28 aminoácidos que se disocia durante la maduración de la proteína. Por lo tanto, la deleción ejemplificada corresponde a los residuos de aminoácidos 62-70 de la proteína madura, que tiene 370 aminoácidos de largo (SEQ ID NO: 3). La numeración de codones del ADN que codifica las proteínas de toxina alfa de la invención se sostiene sobre el gen pie de Clostridium perfringens, cepa 13, como se informa en GenBank Acceso No. NP 560952, y como se ilustra en SEQ ID NO: 2. La secuencia codificadora para la toxina alfa va del nucleótido 48590 al 49786 en la cepa 13 de C. perfringens. La deleción de codón en las dos construcciones ejemplificadas en esta solicitud corresponde a los nucleótidos 48857 a 48883 inclusive, del gen NP 560952. Esta deleción se encuentra dentro del gen de toxina alfa, y corresponde a los nucleótidos 268-294 en la secuencia codificadora de SEQ ID NO: 2. Además, el uso de términos singulares, por razones de conveniencia en la descripción, no tiene intención alguna de limitación. Así, por ejemplo, la referencia a una composición que comprende una célula de C. perfringens abarca la referencia a una o más de dichas células. Debe entenderse además que esta invención no se limita a las configuraciones, etapas de procedimiento y los materiales particulares descritos en esta solicitud, ya que dichas configuraciones, etapas de procedimiento y dichos materiales pueden variar en cierto grado. Aun más, debe entenderse que la terminología empleada en esta solicitud se usa solo a los fines de descripción de modalidades particulares, y no tiene el propósito de limitación, ya que el alcance de la presente invención será limitado solo por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.

En un aspecto particular de la presente invención, se proveen mutantes sin reversión, de C. perfringens, que son "sustancialmente no tóxicas"; esto es, organismos que expresan una toxina alfa inmunógena de poca o nula toxicidad, para de ese modo tornarlos adecuados para el uso como vacunas protectoras. Los organismos C. perfringens de la invención, por lo tanto, confieren toxicidad suficientemente menor, en relación con organismos C. perfringens del tipo silvestre, a fin de tornarlos tolerables como una vacuna o un antígeno, cuando se emplean en condiciones eficaces para producir una respuesta inmunitaria antitoxina alfa o anti-C. perfringens, en un animal vacunado de tal modo. En consecuencia, el organismo C. perfringens de la invención es "atenuado" en relación con el organismo C. perfringens del tipo silvestre. La expresión "sustancialmente no tóxico/a" además tiene la intención de ser aplicable a las muteínas de toxina alfa inmunógenas observadas con anterioridad, que tienen toxicidad nula o suficientemente baja, para de este modo tornarlas también adecuadas para el uso en una vacuna protectora. La reducción en la toxicidad se mide, por ejemplo, por medio de una de las siguientes pruebas conocidas en la técnica: actividad hemolítica, actividad de fosfolipasa C, actividad de esfingomielinasa, actividad de fosfodiesterasa y actividad letal general, en un grupo de animales de prueba. En general, no se detecta toxicidad residual por medio de dichas pruebas convencionales. Sin embargo, la presencia de un nivel mínimo de una o más de estas actividades, por ejemplo, de aproximadamente 10" a aproximadamente 10"2, en relación con la toxicidad de una cantidad equivalente de unidades infecciosas de la toxina alfa de C. perfringens del tipo silvestre de la cual deriva la muteína, puede ser aceptable en un entorno veterinario. En una modalidad, la invención se lleva a la práctica empleando las cepas de biotipo A de C. perfringens, que son de particular importancia como los agentes etiológicos de diversos tipos de gangrena y enfermedades intestinales. En particular, la toxina alfa de C. perfringens es el objetivo para la atenuación de deleción, ya que la atenuación de esta toxina es suficiente para tornar C. perfringens suficientemente no letal, en relación con cepas de tipo silvestre. En términos generales, el gen pie de C. perfringens de la invención expresa una toxina alfa de muteína. La toxina alfa de muteína tiene una deleción que incluye el His de la anilla Zn2, junto con residuos flanqueantes, a fin de reducir en gran medida la posibilidad de cualquier mutación inversa hacia la forma tóxica. Ahora se ha descubierto que la deleción del residuo His de la anilla Zn2, por ejemplo, His68 de SEQ ID NO: 3, junto con la deleción de residuos adicionales que flanquean el residuo His de la anilla Zn2, proporciona una toxina alfa que retiene suficiente inmunogenicidad como para inducir la inmunidad protectora en animales vacunados con el organismo C. perfringens de la invención, y a la vez, que tiene pocas probabilidades de sufrir mutación inversa para codificar una toxina alfa del tipo silvestre. Los residuos adicionales que pueden eliminarse se eliminan en la dirección C-terminal, o en la dirección N-terminal, en relación con His68, y pueden variar de un número de residuos de aproximadamente 4 a aproximadamente 60 residuos, en cualquiera de estas direcciones. Alternativamente, pueden eliminarse de manera similar His148 y residuos flanqueantes. Una modalidad de la toxina alfa de muteína de la invención también incluye, además de la deleción de His68, una deleción de por lo menos 30 residuos de aminoácidos de cualquier lateral (en la dirección C-terminal o en la dirección N-terminal) de la posición His68, en relación con SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, la toxina alfa de muteína de la invención incluye, además de la deleción de His68, una deleción de por lo menos 20 residuos de aminoácidos de cualquier lateral de His68, en relación con SEQ ID NO: 3. Aun en otra modalidad alternativa, la toxina alfa de muteína de la invención incluye, además de la deleción de His68, una deleción de por lo menos 5 residuos de aminoácidos de cualquier lateral de His68, en relación con SEQ ID NO: 3. Aun en otra modalidad, la toxina alfa de muteína de la invención incluye una deleción de aproximadamente el residuo 62 a aproximadamente el residuo 70, en relación con SEQ ID NO: 3. En forma opcional, los residuos de aminoácidos eliminados son reemplazados por uno o más residuos diferentes, tales como un solo residuo leucina. En incluso otra modalidad, la toxina alfa de C. perfringens de muteína es producida y aislada de C. perfringens, o de un organismo recombinante alternativo, para ser empleada como un reactivo de investigación, y/o en ensayos o equipos de diagnóstico, por ejemplo, como un objetivo para anticuerpos antitoxina alfa. Aun otra utilidad de las proteínas de toxina alfa de C. perfringens de muteína se encuentra en las vacunas especializadas para animales, por ejemplo, seres humanos, que pueden no tolerar la vacunación con el organismo C. perfringens atenuado de la invención. Aun más, la presente invención provee un anticuerpo que se une de manera específica a la toxina alfa del tipo silvestre, en relación con las muteínas de toxina alfa de la presente invención. En una modalidad adicional, se provee un anticuerpo que se une preferentemente a la proteína de toxina alfa de C. perfringens del tipo silvestre, y exhibe mínima o nula unión a la toxina alfa de muteína de la invención, por ejemplo, para evitar la unión a una toxina alfa de muteína que tiene una deleción como se describe en detalle, supra. El anticuerpo provisto, por lo tanto, es útil para distinguir la toxina alfa de muteína de deleción, de la toxina alfa del tipo silvestre, y de ese modo, es útil para distinguir animales vacunados con una vacuna de la presente invención, de animales que han sido infectados por C. perfringens del tipo silvestre. Los métodos para la producción y la identificación sistemática de dichos anticuerpos selectivos son conocidos en la técnica. Asimismo, pueden generarse también anticuerpos que reconocen la toxina alfa de muteína de la invención, pero que no reconocen la proteína del tipo silvestre. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser policlonales, monoclonales ("mAb") o fragmentos o fragmentos diseñados o derivados de dichos anticuerpos, que retienen propiedades de unión selectivas. Las técnicas para la preparación y la identificación sistemática de anticuerpos monoclonales se han descrito ampliamente [ver, por ejemplo, las referencias de Stites y col. (eds.): Basic and Clinical Immunology (4ta. ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, California (1988); Harlow y Lañe: Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988); Goding: Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2da. ed.), Academic Press, New York (1986); y Kohler y Milstein: Nature, 256: 495-497 (1975), todas las cuales se incorporan en la presente solicitud a modo de referencia, en su totalidad]. Por ejemplo, y sin limitación, se produce una respuesta inmunitaria en animales adecuados, tales como ratones o pollos, mediante la vacunación con una proteína alfa de C. períringens del tipo silvestre purificada, por ejemplo, en combinación con un adyuvante adecuado. A modo de ejemplo, a fin de evitar la toxicidad de la proteína alfa del tipo silvestre, el inmunógeno es un péptido que corresponde a los residuos eliminados, y en caso de ser necesario, la inmunogenicidad del péptido se incrementa mediante la combinación con un adyuvante adecuado, o mediante el acoplamiento a una proteína portadora adecuada. El acoplamiento a una proteína portadora es conocido en la técnica, y puede efectuarse, por ejemplo, mediante la provisión del péptido con una cisteína terminal, y su acoplamiento a hemocianina de lapa (KLH, por sus siglas en inglés) o albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés), usando química de acoplamiento de maleimida o enlazador de sulfosuccinimidil 4-[N maleimidometil]ciclohexan-1-carboxilato) (de Pierce). Puede emplearse también un enlazador de carbodiimida, sin la necesidad de una cisteína terminal. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, pueden obtenerse linfocitos esplénicos de un animal inmunizado; se preparan hibridomas a partir de dichos linfocitos, y pueden obtenerse uno o más hibridomas potencialmente adecuados que expresan antiproteína alfa. Los hibridomas se someten a identificación sistemática tanto contra proteína alfa del tipo silvestre como muteina, y se identifica un hibridoma que expresa un anticuerpo que se une solo a la toxina alfa del tipo silvestre, se clona y se emplea para producir anticuerpos monoclonales que se unen solo a la proteína alfa del tipo silvestre. Opcionalmente, se obtiene ADNc de la línea clonal de hibridoma identificada, y pueden producirse anticuerpos recombinantes o fragmentos de anticuerpos en otros sistemas de expresión conocidos en la técnica. Como se describe con anterioridad, una potencial desventaja de las vacunaciones en general es que los animales vacunados resultantes pueden generar falsos positivos cuando se evalúan para establecer la infección, usando anticuerpos producidos contra una cepa natural, para de ese modo impedir la identificación de animales infectados. Por lo tanto, la presente invención provee un equipo de prueba para distinguir un sujeto animal que ha sido infectado por un organismo C. perfringens natural, de un sujeto vacunado con una toxina alfa de muteína de la presente invención. Uno de dichos equipos de prueba comprende una cantidad de un anticuerpo antitoxina alfa del tipo silvestre selectivo, que exhibe mínima o nula unión a una toxina alfa de muteína de la presente invención. El equipo además puede comprender otros reactivos adecuados, suficientes para llevar a cabo por lo menos una prueba de diagnóstico. En una modalidad adicional, el anticuerpo está marcado o rotulado con un resto de marcador de fácil detección, por ejemplo, cualquier marcador enzimático conocido en la técnica, tal como peroxidasa; una marca fluorescente, como fluoresceína; perlas, que incluyen perlas magnéticas; y similares. Opcionalmente, el equipo además puede comprender un anticuerpo marcado que se une de manera selectiva al anticuerpo antitoxina alfa del tipo silvestre selectivo. Los inmunoensayos son muy conocidos en la técnica, e incluyen el ¡nmunoensayo intercalado, inmunoensayos competitivos, ensayos inmunosorbentes ligados a enzima (ELISA), radioinmunoensayos (RIA) y otros. Se proveen además métodos para la identificación y distinción de un animal que ha sido infectado por un organismo C. perfringens natural, es decir, de tipo silvestre, de un animal vacunado con una vacuna que comprende el organismo C. perfringens atenuado de la invención, que se lleva a cabo, por ejemplo, mediante las siguientes etapas: (a) el contacto de una muestra de líquido corporal del animal, con un anticuerpo antitoxina alfa del tipo silvestre selectivo descrito con anterioridad, que exhibe mínima o nula unión a una toxina alfa de muteína de la presente invención; y (b) la determinación de la reacción del anticuerpo con la muestra de líquido corporal; donde cuando el anticuerpo reacciona con la muestra de líquido corporal, se identifica el animal como infectado por un organismo C. perfringens natural.

Producción de cepas de C. Perfringens atenuadas Un procedimiento para la conversión de un aislado de C. perfringens natural en una cepa atenuada, o sustancialmente no tóxica, adecuada para ser administrada como una vacuna, puede llevarse a cabo de la siguiente manera. El gen de toxina alfa (pie) puede ser reemplazado en el cromosoma bacteriano por un gen que codifica solo una toxina alfa de muteína, a fin de no dejar capacidad remanente en el organismo C. perfringens, para producir toxina alfa del tipo silvestre. En términos muy generales, el procedimiento de producción del organismo de vacuna comprende, sin limitación, las siguientes etapas generales, no necesariamente en el orden presentado. (1 ) La identificación del tipo de animal a ser protegido mediante la vacunación y uno o más aislados clínicos obtenidos para propósitos de identificación sistemática. Esta etapa habítualmente es opcional, en el caso de la toxina alfa, ya que los aislados de una especie de animal probablemente proporcionen protección para otra especie de animal. (2) La amplificación del gen pie del aislado o los aislados de C. perfringens, por ejemplo, por PCR (por sus siglas en inglés) u otra técnica de amplificación de ácido nucleico conocida en la técnica, con cebadores flanqueantes adecuados, y el empleo de la amplificación con cebadores adecuados, a fin de crear la mutación de deleción deseada. Alternativamente, puede sondearse una genoteca apropiada. (3) La creación de un vector suicida que comprende el gen pie de deleción, donde el origen de replicación de C. perfringens ha sido eliminado, y/o un origen de replicación que puede replicarse en C. perfringens simplemente no está presente; y, en cualquier caso, la inclusión de marcadores de selección adecuados, por ejemplo, marcadores de antibióticos, adyacentes al gen pie mutado. Dicho vector luego puede insertarse en organismos C. perfringens, por ejemplo, mediante electroporación, u otros métodos conocidos en la técnica. (4) La selección de organismos C. perfringens en los cuales el gen pie de muteína ha sido integrado exitosamente en el cromosoma bacteriano. Esta etapa se lleva a cabo mediante el cultivo de organismos C. perfringens de la etapa (3), en presencia del agente de selección, por ejemplo, uno o más antibióticos correspondientes a los marcadores de selección. Por ejemplo, los únicos organismos C. perfringens que crecerían en condiciones de selección de antibióticos serían aquellos que, a través de la recombinación homologa, han integrado directamente el vector suicida, con sus genes de resistencia a antibióticos, en el cromosoma bacteriano. Estos organismos C. perfringens en crecimiento, por lo tanto, tendrán dos genes pie adyacentes: uno, del tipo silvestre, mientras que el otro tendrá la mutación de deleción. (5) La selección de organismos C. perfringens que han sufrido otro evento de recombinación que elimina los marcadores de selección, por ejemplo, marcadores de antibióticos, junto con el gen pie del tipo silvestre. Esta etapa se lleva a cabo mediante el cultivo de los organismos de la etapa (4), en ausencia del agente de selección, por ejemplo, el antibiótico, y la selección de clones no hemolíticos en agar de sangre. Debido a que la inserción del ácido nucleico de muteína se lleva a cabo mediante recombinación homologa, la molécula de ácido nucleico que codifica la toxina alfa de muteína es incorporada en una posición cromosómica homologa a la ubicación de una molécula de ácido nucleico que codifica una toxina alfa del tipo silvestre, presente en Clostridium perfringens no atenuado. En más detalle, se obtienen en la práctica aislados de C. perfringens de animales enfermos, o de otras fuentes. Inicialmente, el ADN genómico obtenido de aislados de interés en la práctica se inserta en un vector lanzadera de microorganismos dual adecuado, por ejemplo, un plásmido lanzadera con marcadores de selección, tales como marcadores de antibióticos, a fin de evaluar su capacidad de transformación. En términos generales, un vector lanzadera adecuado incluirá una, dos, tres o más de las siguientes características: un sitio de clonación, un origen de replicación de C. perfringens, un origen de replicación de E. coli y un gen de resistencia a antibióticos u otro marcador de selección. Los vectores conocidos en la técnica para este propósito, o de fácil adaptación para este propósito, abarcan, por ejemplo, el plásmido lanzadera recombinante pHR106, descrito por Roberts y col. [Appl. Env. Microbiol., 54: 268-270 (1988)]; los plásmidos pJIR 750 y pJIR 751 , descritos por Bannam y col. [Plasmid, 29: 233-235 (1993)]; el vector de selección de promotor pPSV sin promotor de Matsushita y col., 1994, descrito en Plasmid, 31 : 317-319; los plásmidos lanzadera pJIR1456 y pJIR1457, descritos por Lyras y col., 1988, en Plasmid, 39: 160-164; y el vector lanzadera pAK201 , descrito por Kim y col., 1989, en Appl. Environ. Microbio!., 55: 360-365, cuyos contenidos se incorporan en la presente solicitud a modo de referencia, en su totalidad. La eliminación del origen de replicación de C. perfringens convierte el vector lanzadera en un vector suicida. Por ejemplo, un plásmido lanzadera es pJIR418, descrito por Sloan y col., 1992, en Plasmid, 27: 207-219, incorporado en la presente solicitud a modo de referencia. Los aislados que producen 04 transformantes por microgramo de ADN plásmido, y que son sensibles al marcador de antibiótico, por ejemplo, cloranfenicol o eritromicina, son potenciales candidatos para deleción. El ADN genómico de las cepas candidatas luego se usa como un patrón para PCR de largo rango del gen pie (toxina alfa) y secuencias flanqueantes de las cepas candidatas. Por ejemplo, como se ejemplifica a continuación, se usa el cromosoma de la cepa de C. perfringens 13 a fin de identificar cebadores para amplificación del gen que codifica la toxina alfa. Estos cebadores entonces se usan con el objetivo de clonar el gen de toxina alfa a partir de otra cepa, que es el aislado de ave de corral CP6. Luego de la subclonación de los productos de PCR, el gen de toxina alfa y las regiones flanqueantes son secuenciados y cartografiados por restricción. Se sintetizan nuevos cebadores de oligonucleótido con sitios de restricción flanqueantes, y los productos de dos amplificaciones separadas se clonan en un plásmido suicida adecuado (se ha eliminado el origen de replicación de C. perfringens), por ejemplo, como se ejemplifica a continuación como el plásmido 1 192-23.1 , para crear la cepa de vacuna deseada con la deleción. Los vectores suicidas proporcionados, específicos para los aislados, se insertan en la cepa de C. perfringens de animal correspondiente, por medio de cualquier medio convencional conocido en la técnica. Por ejemplo, esta etapa se lleva a cabo mediante la electroporación. Cuando se inserta el vector suicida en C. perfringens (sin el origen de replicación de C. perfringens), este es incapaz de replicarse en el citoplasma, y no sobrevive, a menos que se integre con éxito en el cromosoma bacteriano). Los integrantes exitosos son los únicos organismos que crecerán en presencia del antibiótico correspondiente al gen marcador de antibiótico recién introducido.

Puede emplearse cualquier gen marcador de selección conocido en la técnica, si bien, en los vectores ejemplificados a continuación, se emplean marcadores de cloranfenicol y eritromicina. Estos eventos de recombinación son consecuencia de la homología del gen pie del tipo silvestre con respecto al ADN de plásmido de gen pie de deleción. La bacteria recombinante resultante se denomina un integrante. El integrante contiene una copia del vector de homología introducido, que está integrado en el locus de gen pie. En consecuencia, el integrante resultante incluye dos copias del gen pie: la copia normal original y la versión eliminada introducida. Los genes de resistencia a antibióticos introducidos se ubican entre las dos copias del gen pie. Pueden producirse inusuales eventos de recombinación aleatoria entre las dos copias del gen pie. Este evento de recombinación puede producir uno de dos resultados. En ambos casos, el ADN que interviene entre las dos copias del gen pie (que incluye los genes de resistencia) se ha eliminado. En el primer resultado, se restaura el gen pie del tipo silvestre o normal, lo que logra la recuperación de la cepa progenitora original, sin marcadores de antibióticos. En el segundo resultado, el gen pie del tipo silvestre es reemplazado por la copia deleteada, con lo que se produce la construcción de deleción de toxina alfa deseada, sin los marcadores de antibióticos. La eliminación del antibiótico del medio de cultivo permite que estas bacterias que han sufrido recombinación sobrevivan y se repliquen. Los clones recombinantes de deleción entonces son identificados por el crecimiento en agar de sangre, sin la hemolisis exhibida normalmente por C. perfringens que expresa la toxina alfa del tipo silvestre.

Animales por ser vacunados Los animales para los cuales puede producirse una vacuna de C. perfringens atenuado, y de los cuales puede aislarse una cepa del tipo silvestre de C. perfringens útil, abarcan, en términos generales, cualquier animal donde la infección de C. perfringens constituya un problema. Los vertebrados de interés son las aves, los mamíferos y peces, y en particular, animales de importancia económica o agrícola. La siguiente lista de animales comprende aquellos que, según se contempla, se beneficiarán con una vacuna de C. perfringens, o a partir de los cuales pueden obtenerse aislados del tipo silvestre de C. perfringens útiles. Si bien a veces es posibles que cualquiera de dichas vacunas comprenda un componente (vivo o no) aislado originalmente del mismo género o especie de animal por ser vacunado, este hecho no es un requisito. Una lista, sin limitación, de dichos animales incluye aquellos de las familias de las aves, ganado bovino, ovino, etc., y además, animales acuáticos, por ejemplo, que pueden ser sometidos a acuicultura o recogidos de la naturaleza y mantenidos vivos en depósitos de mantenimiento, durante un tiempo antes de la comercialización. Estos animales abarcan peces tales como trucha o salmón, y otras especies criadas o recogidas para beneficio económico. Los animales acuáticos invertebrados abarcan langostas, cangrejos, crustáceos, por ejemplo, calamares, pulpos, almejas, ostras, mejillones, conchas y similares. Se entenderá que las aves abarcan, por ejemplo, pollos, pavos, gansos, patos, etc. Se entenderá que el ganado bovino incluye, por ejemplo, ganado vacuno para producción de carne o leche, ganado vacuno engordado, carne de ternera, etc. Se entenderá que el ganado ovino incluye, por ejemplo, corderos, etc. Para los propósitos de la presente invención, se entenderá que el término "pez" incluirá, sin limitación, la agrupación de peces Teleosti, esto es, teleósteos. Se incluyen dentro de la agrupación Teleosti tanto la clase Salmoniformes (que abarca la familia Salmonidae) como la clase Perciformes (que abarca la familia Centrarchidae). Ejemplos de potenciales receptores de peces incluyen la familia Salmonidae, la familia Serranidae, la familia Sparidae, la familia Cichlidae, la familia Centrarchidae, la Grunt (roncador) de tres líneas {Parapristipoma trilineatum) y Plecostomus de ojos azules (género Plecostomus).

Familia Salmonidae NOMBRE TAXONOMICO NOMBRE COMUN Coreqonus clupeaformis esturión objetivo de lago Coreaonus hoyi Arenque Oncorhynchus keta salmón cebo Oncorhvnchus qorbuscha salmón rosado Oncorhynchus kisutch salmón coho (salmón plata) Oncorhynchus masou salmón cereza (salmón masou) Oncorhynchus nerka salmón de Alaska Oncorhynchus tshawytscha (salmón chinook) Prosopium cylindraceum esturión objetivo redondo Oncorhvnchus clarki trucha asesina Oncorhynchus mykiss trucha arco iris Salmo salar salmón atlántico Salmo trutta trucha marrón Salmo trutta X. S. fontinalis trucha híbrida tigre Salvelinus alpinus charr ártico (trucha ártica) Satvelinus confluentus trucha toro Salvelinus fontinalis trucha de arroyo Salvelinus leucomaenis charr japonés (charr de manchas blancas) Salvelinus malma dolly varden (charr de Miyabe) Salvelinus namavcush trucha de lago Thymallus thymallus Tímalo Algunos miembros de la familia Serranidae Algunos miembros de la familia Sparidae NOMBRE TAXONOMICO NOMBRE COMUN Archosarqus probatocephalus Salema Archosarqus rhomboidalis brema de mar Calamus penna salema besugo Laqodon rhomboides pez alfiler Paqrus Major brema de mar roja Sparus aurata brema de mar dorada Stenotomus chrvsops Pagel Algunos miembros de la familia Cichlidae Algunos miembros de la familia Centrarchidae NOMBRE TAXONOMICO NOMBRE COMUN Ambloplites rupestris perca de roca Centrarchus macropterus Aviador Elassoma everqladei pez luna pigmeo de Everglade Elassoma okefenokee pez luna pigmeo de Okefenokee Elassoma zonatum pez luna pigmeo de bandas Enneacanthus qloriosus pez luna de manchas azules Enneacanthus obesus pez luna de bandas Lepomis auritus pez luna de pecho rojo Lepomis cvanellus pez luna verde Lepomis cvanellus X. L. qibbosus semilla de calabaza verde x Lepomis qibbosus semilla de calabaza Lepomis qulosus boca de guerra Lepomis humillis pez luna con manchas anaranjadas Lepomis macrochirus agalla azul Lepomis meqalotis pez luna de oreja larga Micropterus coosae perca de cardumen Micropterus dolomieui perca de boca pequeña Micropterus punctulatus perca con manchas Micropterus salmoides perca de boca grande Pomoxis annularis pomosio objetivo Pomoxis niqromaculatus pomosio negro En otra modalidad, el animal es un animal de compañía o un ser humano. Para los propósitos de la presente invención, se entenderá que el término animal "de compañía" incluirá todos los anímales -caballos (equinos), gatos (felinos), perros (caninos), roedores, entre ellos, ratones, ratas, cobayas, especies de conejos, y aves, tales como pichones, loros y similares. Las aves que reciben dicha vacunación pueden asociarse con la avicultura comercial o no comercial. Estas incluyen, por ejemplo, Anatidae, tales como cisnes, gansos y patos; Columbidae, por ejemplo, palomas y pichones, tales como pichones domésticos; Phasianidae, por ejemplo, perdices, urogallos y pavos; Thesienidae, por ejemplo, pollos domésticos; Psittacines, por ejemplo, pericos, guacamayos y loros, por ejemplo, criados para el mercado de las mascotas o coleccionistas. Los pollos se ejemplifican a continuación.

Fuentes de aislados del tipo silvestre En general, los organismos C. perfringens atenuados de la invención pueden producirse comenzando con un organismo C. perfringens natural que se ha aislado originalmente de cualquier animal de interés infectado, como se describe supra, y/o del entorno. El entorno comprende cualquier material que contenga organismos C. perfringens viables, y/o esporas de C. perfringens viables, por ejemplo, alimento, suelo, agua contaminados, material de reposo del animal, heces y similares.

Justin y col. [Biochemistr , 41 , 6253-6262 (2002)] caracterizaron toxinas alfa de diferentes cepas de C. perfringens, de secuencia y propiedades bioquímicas casi idénticas. Sin embargo, Justin y col. describen además una cepa aislada de una fuente de ave (un cisne), que tenía una toxina alfa que exhibía un alto grado de variación de secuencia y especificidad de sustrato alterada, en comparación con las otras cepas. Por esta razón, se cree que la mayoría de los aislados, cuando se convierten en una forma atenuada, producirán inmunidad protectora contra la toxina alfa de muchas otras cepas naturales de C. perfringens. No obstante, dada la posibilidad de variación de la toxina alfa entre los aislados, a menudo será conveniente aislar y atenuar organismos C. perfringens de la especie animal para la cual se desea una vacuna anti-C. perfringens. El aislado ejemplificado a continuación fue aislado de pollo, y evaluado en dicha especie.

Vacunas Los organismos C. perfringens atenuados de la invención se formulan, en general, en forma de composiciones de vacuna aceptables para uso farmacéutico. Las composiciones de vacuna se formulan de acuerdo con la vía de administración, y son compatibles con el agente antigénico activo. El agente antigénico activo es, por ejemplo, una o más cepas de organismos C. perfringens tipo A atenuados, conforme a la invención. Opcionalmente, la composición de vacuna pueden incluir también uno o más tipos de proteína alfa no tóxica, en combinación con los organismos C. perfringens tipo A atenuados. Por ejemplo, sustancialmente todos los organismos C. perfringens tipo A atenuados incluidos en la composición de vacuna son organismos vivos y viables, si bien, para ciertas situaciones específicas, por ejemplo, para la inmunización de determinados seres humanos o animales con compromiso inmunitario, la vacuna comprenderá exclusivamente organismos C. perfringens tipo A atenuados muertos. La composición de vacuna comprende amortiguadores o sales fisiológicamente compatibles, en combinación opcional con adyuvantes y/o mejoradores o estimulantes inmunitarios opcionales (administrados en forma conjunta o sucesiva, por ejemplo, antes de la vacunación, o después de la vacunación). Los estimulantes inmunitarios adecuados abarcan, sin limitación, citocinas, factores de crecimiento, quimiocinas, sobrenadantes de cultivos celulares de linfocitos, monocitos, células de órganos linfoides, preparaciones celulares o extractos celulares (por ejemplo, preparaciones de Staphylococcus aureus o lipopolisacáridos), mitógenos, o adyuvantes, entre ellos, agentes farmacéuticos de bajo peso molecular. Un estimulante inmunitario puede administrarse in ovo, en cualquier momento durante la incubación. En un aspecto particular, el estimulante inmunitario se administra en el medio que contiene los organismos C. perfringens tipo A atenuados.

Métodos de Administración de la Vacuna Las vacunas de la invención descritas anteriormente se administran, por ejemplo, mediante inyección o inoculación, por medio de una de las siguientes vías, o una de sus combinaciones: las vías oral, ¡ntranasal, parenteral, subcutánea, mediante escarificación o administración intramuscular, en cualquier formulación adecuada conocida en la técnica, por ejemplo, un amortiguador compatible o una solución salina fisiológicamente aceptable, en combinación opcional con adyuvantes y/o mejoradores o estimulantes inmunitarios (administrados en forma conjunta o sucesiva, por ejemplo, antes de la vacunación, o después de la vacunación). Para los métodos de vacunación o las vacunas administrados por vía oral, se emplea sin dificultad cualquiera de los amortiguadores o agentes de suspensión fisiológicamente adecuados conocidos en la técnica. Además, la composición puede incorporarse, por ejemplo, en mezcla en el agua de beber o pulverizada sobre miniesferas de alimento, espolvoreada o pulverizada sobre maíz u otros granos, y por métodos similares. El tracto gastrointestinal es un sitio común de infección de C. perfringens, y por lo tanto, la administración oral se contempla como un método de inoculación. Se contempla que la presencia de los organismos C. perfringens atenuados vivos de la invención en el tracto gastrointestinal produzca reacciones inmunitarias protectoras localizadas, en la capa mucosal del tracto gastrointestinal, y que también pueda actuar en forma competitiva a fin de evitar la posterior colonización por C. perfringens del tipo silvestre.

Para aves, tales como aves domésticas, entre ellas, pollos, patos, gansos, etc., el método oral, o la inyección in ovo, se encuentran entre las vías útiles para la vacunación. La vía in ovo se ejemplifica a continuación, y produjo la inmunización activa y la protección contra la estimulación en los pollos incubados.

Expresión de Genes Ajenos por C. Períringens Usando las técnicas desarrolladas en los ejemplos precedentes, cualquier gen no natural, es decir, ajeno a C. períringens, puede insertarse opcionalmente en el ADN cromosómico de C. períringens. Para la expresión de proteínas ajenas, pueden efectuarse fusiones de genes, que preservan las secuencias que flanquean el gen de toxina alfa, el promotor de toxina alfa y su secuencia de señal. En una modalidad, la mayor parte de la secuencia codificadora del gen pie es reemplazada por el gen ajeno. Los nucleótidos remanentes del gen pie corriente descendente del gen insertado se encuentran fuera de marco, y por lo tanto, se produce toxina alfa no funcional. Alternativamente, el gen ajeno puede insertarse en marco con respecto a la secuencia de nucleótido que codifica la toxina alfa de muteína, para formar una proteina de fusión de toxina a/fa-proteína ajena. Pueden sintetizarse cebadores de olígonucleótidos para el gen ajeno, por ejemplo, con una secuencia de marca FLAG N-terminal y sitios de restricción apropiados. Los productos de PCR pueden clonarse en el vector suicida; la marca FLAG y el gen ajeno se insertan en marco con la secuencia de señal de toxina alfa. La proteína ajena es expresada bajo el control del promotor de toxina alfa, y dirigida para secreción por la secuencia de señal pie. La proteína ajena secretada puede ser detectada en el medio de sobrenadante por medio de transferencia Western, usando un anticuerpo anti-FLAG. De esta manera, puede insertarse cualquier gen ajeno adecuado en el genoma de C. perfringens. Estos genes incluyen, por ejemplo, ADN codificador de antígenos de patógenos del tracto gastrointestinal, por ejemplo, proteínas antigénicas de bacterias tales como E. coli, género Salmonella, género Campyiobacter, género Lawsonia y similares; proteínas antigénicas de parásitos tales como el género Eímeria, géneros de isosporas, géneros de criptosporidios y similares; y proteínas antigénicas de virus tales como rotavirus, coronavirus y similares, a fin de inmunizar el animal tratado con dicho organismo C. perfringens recombinante. Otras proteínas que pueden ser expresadas por dichos organismos C. perfringens recombinantes incluyen proteínas o péptidos terapéuticos. Opcionalmente, estos abarcan péptidos endógenos con respecto al tracto gastrointestinal, por ejemplo, factor "trébol" (trefoif), o cualquier tipo de citocina conocida en la técnica, tal como IL-18 de pollo y similares. Una de dichas construcciones de C. perfringens expresa la proteína IL-18 de pollo. La administración de bacterias vivas que contienen la fusión de genes permitirá la administración de dosis terapéuticas de IL-18 en el intestino, y al mismo tiempo, la relativa inocuidad para el animal huésped, en virtud de la ausencia de la producción de toxina alfa. Mediante el uso de este sistema, pueden expresarse también otros agentes terapéuticos. En la presente solicitud se citan numerosas referencias, cuyo contenido se incorpora a modo de referencia en esta solicitud, en su totalidad. Los siguientes ejemplos específicos se incluyen con propósitos de ilustración, y no tienen la intención de limitar el alcance de la invención, a menos que se indique lo contrario.

EJEMPLO 1 Vector de Homología de deleción de Toxina alfa de C. perfringens Se creó un vector de plásmido de homología 1 162-55-20, útil en la construcción de deleciones de toxina alfa de C. perfringens. El plásmido incorpora varios elementos de importancia: la región de replicación del plásmido de E. coli pUC18; los genes de resistencia a cloranfenicol {catP) y eritromicina (ermBP) de C. perfringens (ambos son también expresados en E. CO/Í); y un gen de toxina alfa de C. perfringens {pie) inactivado por una deleción específica de 9 aminoácidos. El plásmido 1162-55-20 se creó en varias etapas, de la siguiente manera. En primer lugar, se clonó el gen pie de un aislado de C. perfringens de ave reciente (cepa CP6). La secuencia de la cepa de C. perfringens 13 (GenBank NC 003366; SEQ ID NO: 2) se usó a fin de diseñar cebadores de oligonucleótidos para ser usados en la clonación del gen pie.

Estos y todos los cebadores posteriores se obtuvieron en el mercado en Sigma Genosys, Woodlands, TX. El cebador corriente ascendente ubicado dentro del gen yplc (CPE0035), 5' AGCTGCATAAGCAAAAGTTCCAACTC 3' (SEQ ID NO: 14), corresponde a los nucleótidos 47675-47700 de la cepa 13 (SEQ ID NO: 2). El cebador corriente descendente ubicado dentro del gen cobW (CPE0037), 5' GCAGAAACTCTTCTTAGACCTATTCTTTTAGGC 3' (SEQ ID NO. 15), es complementario a los nucleótidos 50597-50629 de la cepa 13. Estos cebadores se usaron junto con ADN genómico de C. perfringens, cepa CP6, en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de rango largo. Se pronosticó un producto de 2955 pares de bases desde el gen yplc corriente ascendente hasta el gen cob W corriente descendente, de la secuencia conocida de la cepa 13 (como se ilustra en la Figura 1 ). El promotor de toxina alfa, la secuencia de señal y la secuencia codificadora del gen pie (CPE0036) están contenidos dentro de este fragmento, es decir, entre el gen yplc corriente ascendente y el gen cob W corriente descendente. Luego se clonó el fragmento de PCR de 2955 pares de bases, en el vector de clonación pCR-Blunt (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), para obtener el plásmido 1 162-52.1 . La secuencia de nucleótidos de la región codificadora de pie del fragmento de 2955 pares de bases de la cepa CP 6 se determinó a partir de este fragmento (SEQ ID NO: 22; y el correspondiente polipéptido es SEQ ID NO: 23), y demostró ser sustancialmente homologa a aquella del gen pie de C. perfringens, cepa 13 (SEQ ID NO: 2).

A continuación, la región de replicación de E. co// y los genes de resistencia de C. perfringens se clonaron desde el plásmido lanzadera pJIR418 (Sloan y col., 1992, Plasmid, 27; 207-219; Genebank M77169). El plásmido pJIR418 fue digerido con las enzimas de restricción Bam Hl y Spe I, y los extremos se llenaron con polimerasa Klenow. La ligación del fragmento grande produjo el plásmido 1 162-45.1 y restauró el sitio de restricción Bam Hl. Este plásmido retiene la región de replicación de E. coli, si bien, a diferencia de pJIR418, no contiene un origen de replicación de C. perfringens. Por lo tanto, el plásmido es capaz de replicación autónoma en E. coli, pero no en C. perfringens. En la siguiente etapa, la mitad C-terminal del gen pie se subclonó en el plásmido intermediario 1162-45.1. La digestión del plásmido 1 162-52.1 con Bam Hl y Eco Rl liberó un fragmento de 1742 pares de bases que contenía la porción C-terminal del gen de toxina alfa desde el sitio Bam Hl único ubicado dentro del gen pie corriente descendente, a través del gen cob W, a un sitio Eco Rl ubicado en el sitio de clonación múltiple del plásmido progenitor. El fragmento de 1742 pares de bases se clonó entre los sitios Bam Hl y Eco Rl ubicados dentro del sitio de clonación múltiple del plásmido 1 162-45.1. En el plásmido resultante 1 162-53.7, la mitad C-terminal del gen pie se encuentra en la misma orientación de transcripción que los genes catP y ermBP del plásmido progenitor. En la etapa final, la mitad N-terminal del gen pie se clonó en el sitio Bam Hl único del plásmido 1 162-53.7. Esta etapa se llevó a cabo mediante la creación de un fragmento de PCR derivado del gen de toxina alfa subclonado en el plásmido 1 162-52.1. El cebador corriente ascendente, 5' ggatccAGCTGCATAAGCAAAAGTTCCAACTC 3' (SEQ ID NO: 16), fue idéntico al cebador de yplc observado con anterioridad (SEQ ID NO: 4), excepto que se incluyó un sitio Bam Hl flanqueante (letra minúscula). El cebador corriente descendente ubicado dentro del gen de toxina alfa, 5' ggatccaATGCATTCTTATCATAATCTGGATAAGTAGAACC 3' (SEQ ID NO: 17), fue complementario a los nucleótidos 48824-48857 de la cepa 13, e incluyó un sitio de restricción Bam Hl flanqueante y un nucleótido espaciador, a fin de mantener el marco de lectura (letra minúscula). El fragmento Bam Hl resultante de la PCR con estos cebadores y ADN patrón de plásmido 1 162-52-1 se clonó en el sitio Bam Hl único del plásmido 1162-53.7. Se aisló un plásmido que contenía las dos regiones de gen pie en la misma orientación de transcripción. Este plásmido 1 162-55.20 contiene el gen pie con la deleción de nueve aminoácidos deseada, y la adición de un residuo leu entre los residuos ala 61 y asp 71 de la toxina del tipo silvestre (ver Figura 2). La secuenciación de ADN del plásmido confirmó el marco de lectura y la deleción neta de 24 codones (que codifican ocho residuos de aminoácidos).

EJEMPLO 2 Construcción de CPERF001 Recombinante de Clostridium perfrinqens La versión deleteada del gen pie construida en el Ejemplo 1 se introdujo en C. perfringens, usando la siguiente estrategia. El vector de homología 1 162-55.20 se denomina un "plásmido suicida" de C. perfringens, ya que su origen de replicación de C. perfringens se ha eliminado. Cuando se transformó este plásmido en C. perfringens, fue incapaz de replicarse, y no sobrevivió. Sin embargo, si las bacterias transformadas se colocan bajo selección de cloranfenicol o eritromicina, el ADN plásmido puede ser forzado a recombinarse en el genoma bacteriano, por medio de la homología al gen pie. La bacteria recombinada resultante se denomina un integrante. El integrante contenía una copia del vector de homología introducido, que fue integrado en el lugar del gen pie. En consecuencia, el integrante resultante contenía dos copias del gen pie: la copia normal original y la versión deleteada introducida. Los genes de resistencia introducidos se colocaron entre las dos copias del gen pie. Cuando se eliminó la selección de antibióticos del integrante, la recombinación se produjo entre las dos copias del gen pie. Este evento de recombinación puede producir uno de dos resultados. En ambos casos, el ADN interviniente entre las dos copias del gen pie (que incluía los genes de resistencia) fue eliminado. En el primer resultado, se restauró el gen pie normal, lo que logró la recuperación de la cepa progenitora original. En el segundo resultado, el gen pie normal fue reemplazado por la copia deleteada, con lo que se produjo la construcción de deleción de toxina alfa deseada. Debido a que la toxina alfa de la cepa de deleción estaba inactivada, esta cepa fue no hemolítica. Por lo tanto, el integrante de deleción deseado se identificó mediante la identificación sistemática de clones no hemolíticos, en placas de agar de sangre. Debido a que se esperaba que el evento de recombinación que logró el integrante deseado se produjera a una frecuencia baja, fue decisivo el empleo de cepas de C. perfringens progenitoras que tenían alta eficacia de transformación. Por lo tanto, se analizaron varios aislados de C. perfringens de ave recientes para establecer la eficacia de transformación. Los aislados se transformaron con el plásmido lanzadera pJIR418, según lo describen Alien y Blaschek (Applied and Enviromental Microbiology, 54: 2322 (1988)), con leves modificaciones (descritas a continuación). La cepa 1240 exhibió la más alta eficacia de transformación (ver Cuadro 1): 9.2 x 106 transformantes/pg de ADN de plásmido pJIR418. Esta cepa se seleccionó para ser la cepa progenitora para la construcción de la construcción de deleción CPERF001. Se seleccionó la cepa 29 para ser la cepa progenitora para CPERF002.

CUADRO 1 Eficacia de transformación de aislados de C. perfringens de Ave Cepa C. perf. A. Transformantes^ de pJIR41 8 29 3.6 x 104 23 5.6 x 102 1220 4.0 x 106 1240 9.2 x 106 CP-2 Ninguno 1230 7.1 x 103 5227 Ninguno 5230 Ninguno La fuente de las cepas naturales citadas fue el Dr. J. Glen Songer, Departamento de Ciencias Veterinarias y Microbiología, Universidad de Arizona, Tucson, Arizona 85721 .

Se diluyeron células de C. perfringens, cepa 1240, de un cultivo para anaerobios durante la noche en medio TSYC (30 g/l de caldo de soya tríptico, 5 g/l de extracto de levadura, 0.5 g/l de cisteína), a 1 :25, y se cultivaron hasta A6oo = 0.5436. Después de la centrifugación de 100 mi de células a 18,000 x g durante 10 minutos, las células electrocompetentes se prepararon mediante la resuspensión de las células, dos veces, en un volumen equivalente de amortiguador de sacarosa fosfato de magnesio previamente reducido ("SMP" (por sus siglas en inglés) se preparó como sacarosa, 270 mM, MgC , 1 mM, NaP04, 7 mM, pH 7.3), y luego, se efectuó una resuspensión final con 0.5 mi de SMP. Esto logró un volumen final de -2.0 mi. Se sometieron a electroporacion alícuotas de 100 µ? de células, con 4 pg de plásmido 1162-55.20 en cubetas de 0.2 cm. Se usó un instrumento Bio-Rad Gene Pulser II a 1.37 kilovoltios, 100 ohmios de resistencia y 50 microfaradios de capacidad eléctrica. Inmediatamente después de la electroporacion, las células se diluyeron con 2.0 mi de medio de cisteína de levadura de soya tríptico previamente reducido ("TSYC" (por sus siglas en inglés) se preparó como 30 g de caldo de soya tríptico, 5 g de extracto de levadura, 0.5 g de cisteína, 950 mi de agua) y se incubaron durante 3 horas a 37°C en una jarra para anaerobios. Luego del período de recuperación, se colocaron en placas diluciones de las células en placas de TSYC + 25 pg/ml de cloranfenicol. Estas placas se incubaron a 37°C durante la noche en una jarra para anaerobios. Después del cultivo durante la noche, se observó un promedio de 50 colonias resistentes a cloranfenicol por microgramo de ADN de 1 162-55.20. Se hicieron madurar colonias individuales de siete integrantes putativos, en medio TSYC no selectivo, para cuatro maduraciones sucesivas, y se colocaron en placas de agar de sangre no selectivas. Una de las cargas no seleccionadas, 192-31.7, exhibió varias colonias no hemolíticas. Veintiuna de estas colonias no hemolíticas se salpicaron en placas matrices no selectivas, y se colocaron en placas por duplicado en placas de TSYC + cloranfenicol. Dos de las 21 colonias fueron sensibles a cloranfenicol.

Una de las construcciones de deleción putativas sensibles a cloranfenicol, 1 192-32.14, se hizo madurar junto con la cepa del tipo silvestre 1240 y el integrante 1 192-31 .7, y se colocó en placas de agar de sangre. La cepa del tipo silvestre 1240 mostró zonas claras de hemolisis beta, mientras que la construcción de deleción 192-32.14 fue un cultivo puro de colonias no hemolíticas, y se denominó nuevamente CPERF001. Se usaron otras placas de sangre como matrices y replicados colocados en placas en medios no selectivos y selectivos. La cepa del tipo silvestre 1240 y CPERF001 fueron sensibles a cloranfenicol y eritromicina. El integrante, 1 192-31.7, fue resistente tanto a cloranfenicol como a eritromicina, como se esperaba. A fin de excluir la posibilidad de que los genes de resistencia a antibióticos estuvieran presentes, pero no expresados en CPERF001 , se sintetizaron cebadores de PCR específicos para los genes de cloranfenicol y eritromicina, para el uso en reacciones de PCR. Los ADN genómicos se prepararon a partir de las cepas del tipo silvestre, integrantes y CPERF001 , y se usaron como patrones para las reacciones de PCR con los cebadores de genes de antibióticos. Los resultados del análisis de PCR mostraron respuesta positiva solo a partir del plásmido suicida y el integrante, y no de la cepa progenitora 1240 o la construcción de deleción CPERF001. Esto confirma la pérdida pronosticada de las secuencias de gen de resistencia. Con el objetivo de confirmar la deleción dentro del gen de toxina alfa, se amplificó por PCR una región de 1086 pb que rodeaba la deleción, usando cebadores específicos para toxina alfa apropiados. El fragmento amplificado se clonó y se secuenció. Los resultados del secuenciamiento confirmaron la deleción de los nueve aminoácidos desde tyr 62 hasta trp 70 del gen de toxina alfa, y la inserción de un solo residuo leu (ver Figuras 2A-2C). Se evaluó CPERF001 en un ensayo para establecer la expresión de la proteína toxoide alfa inactivada. Después de 6 horas de cultivo anaerobio, se recogieron alícuotas de 1 mi de células y se centrifugaron. Se analizaron 15 microlitros del medio de sobrenadante no concentrado mediante electroforesis de gel de poliacrilamida, y se sometieron a análisis de trasnferencia Western con un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra proteína toxina alfa recombinada {Vaccine, H (12): 1253-1258 (1993)). Los resultados mostraron reactividad de anticuerpo específica con una proteína del tamaño esperado para la proteína toxoide alfa. CPERF001 es una cepa de deleción de C. perfringens Tipo A, genéticamente diseñada. Esta cepa secreta una forma de toxoide inactivada de la toxina alfa de C. perfringens. Debido a que esta cepa ya no expresa toxina alfa activa, pero retiene una porción significativa de la antigenicidad de la toxina, será útil como una vacuna para proteger contra la enfermedad causada por C. perfringens.

EJEMPLO 3 Construcción de CPERF002 Recombinante de Clostridium perfringens A fin de compensar la menor eficacia de transformación de la cepa 29 de C. perfringens (ver Cuadro 1 , anterior), se construyó un nuevo vector de homología. El nuevo vector incorporó secuencias de C. perfringens clonadas directamente del genoma de la cepa 29. Se pronosticó que este vector lograría una etapa de recombinación más eficaz. El nuevo vector fue 1 192-38.3, creado de la siguiente manera. En la primera etapa, la región de replicación de E. coli y los genes de resistencia de C. perfringens se clonaron desde el plásmido lanzadera pJIR418 (Sloan y col., Plasmid, 27, 207 (1992); GeneBank M77169). El plásmido pJIR418 fue digerido con la enzima de restricción Ndel. La ligación del fragmento grande produjo el plásmido 1 192-23.1 . Este plásmido carece de un origen de replicación de C. perfringens, si bien, a diferencia del plásmido 1 162-45.1 , que se construyó en el Ejemplo 1 , retiene el sitio de clonación múltiple entero de pJIR418. En la siguiente etapa, la mitad C-terminal del gen pie se subclonó en el plásmido intermediario 1 192-23.1. El ADN genómico de la cepa 29 se usó como patrón para la PCR de rango largo. Se amplificó la región del gen pie (toxina alfa) desde el sitio Bam Hl hasta una porción del gen CPE 0038. El cebador de pie corriente ascendente, 5' CT G G G AT C CT G ATAC AG ATAATAATTTCTC AAAG GAT 3' (SEQ ID NO: 18), corresponde a los nucleótidos 48880-48916 de la cepa 13 (Genbank NC 003366). El cebador corriente descendente dentro del gen CPEO038, 5' a ctctgcag TTGTC ATATC AATTAAATTAACTATAATC C C 3' (SEQ ID NO: 19), es complementario a los nucleótidos 51244-51275 de la cepa 13, y contiene nucleótidos flanqueantes que incluyen un sitio de restricción Pst I (letra minúscula). Se obtuvo un producto de 2402 pares de bases, que fue digerido con enzimas de restricción Bam Hl y Pst I. Este fragmento fue ligado con el fragmento grande de 1 192-23.1 digerido con Bam Hl y Pst I, para producir el plásmido 1 192-36.10. En la etapa final, la mitad N-terminal del gen pie se clonó por medio de PCR. El cebador corriente ascendente, 5' actgagctcCTAGACACTTTGCTTCAATATTTGGGAA 3' (SEQ ID NO: 20), corresponde a los nucleótidos 46513-46540 de la cepa 13, y comprende nucleótidos flanqueantes y un sitio Sac I (letra minúscula). El cebador corriente descendente, 5' actggatccGCATTCTTATCATAATCTGGATAAGTAGAACC 3' (SEQ ID NO: 21), es complementario a los nucleótidos 48824-48855 de la cepa 13, y comprende nucleótidos flanqueantes y un sitio Bam Hl. Se produjo un producto de 2363 pares de bases, que fue digerido con enzimas de restricción Sac I y Bam Hl. El fragmento digerido se ligó con el fragmento grande de 1 192-36.10 digerido con Sac I y Bam Hl, a fin de producir el plásmido 1 192-38.3. La posterior secuenciación de la región que flanquea el sitio Bam Hl de pie en 1 192-38.3 confirmó la deleción de nueve aminoácidos, desde tyr 62 hasta trp 70. El plásmido 1 192-38.3 se usó para la electroporación de células de la cepa 29 de C. perfringens. Anteriormente se había demostrado que la cepa 29 se transformaba con una eficacia de 3.6 x 104 transformantes/pg de ADN de plásmido pJIR418. Las células de la cepa 29 se cultivaron y se sometieron a electroporación como en el Ejemplo 2, excepto que se usó una técnica de selección líquida luego del período de recuperación de tres horas. En lugar de la colocación en placas, se diluyeron alícuotas de 0.67 mi de células en 12 mi de TSYC + 25 pg/ml de cloranfenicol, y se cultivaron durante la noche a 37°C, en una jarra para anaerobios. Esta modificación se usó debido a las menores eficacias de transformación y colocación en placas de la cepa 29, en comparación con la 1240. Después del cultivo durante la noche, las células se diluyeron nuevamente en medio de selección. Entonces las células de la segunda maduración se pasaron cinco veces, sin selección, antes de la colocación en placas de agar de sangre. Ninguna de las colonias de las placas de agar de sangre fue no hemolítica. Dos placas de sangre entonces se colocaron en placas por duplicado en placas de TSYC, TSYC + 25 pg/ml de cloranfenicol y TSYC + 50 pg de eritromicina. Todas las colonias fueron sensibles a eritromicina, pero solo 1 de 130 colonias fue sensible a cloranfenicol. Esta colonia, 1 92-45.4B, se denominó nuevamente CPERF002. El análisis de PCR del ADN genómico de CPERF002 con cebadores específicos de toxina alfa mostró una banda positiva para la toxina alfa. Esta banda fue más pequeña que la banda correspondiente del ADN de la cepa 29 del tipo silvestre. Los cebadores específicos para los genes de resistencia a cloranfenicol y eritromicina no pudieron amplificar ADN de CPERF002, aunque mostraron fuertes bandas positivas del plásmido 1 192-38.3. La secuenciación de la toxina alfa de CPERF002 confirmó la deleción de nueve aminoácidos (ver Figura 3). Se evaluó CPERF002 en un ensayo para establecer la expresión de la proteína toxoide alfa inactivada. Después de 6 horas de cultivo anaerobio, se recogieron alícuotas de 1 mi de células y se centrifugaron. Se analizaron quince microlitros del medio de sobrenadante no concentrado mediante electroforesis de gel de políacrilamida, y se sometieron a análisis de transferencia Western con un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra proteína toxina alfa recombinada {Vaccine, 1 1 (12): 1253-1258 (1993)). Los resultados mostraron reactividad de anticuerpo específica con una proteína del tamaño esperado para la proteína toxoide alfa. CPERF002 es una cepa de deleción de C. perfringens Tipo A, genéticamente diseñada. Esta cepa secreta una forma de toxoide inactivada de la toxina alfa de C. perfringens. Debido a que esta cepa ya no expresa toxina alfa activa, pero retiene una porción significativa de la antigenicidad de la toxina, será útil como una vacuna para proteger contra la enfermedad causada por C. perfringens.

EJEMPLO 4 Vacunas de Construcciones de Deleción de C. perfringens Las cepas de vacunas de construcciones de deleción CPERF001 y CPERF002 descritas en los Ejemplos 2 y 3 se evaluaron a fin de establecer su capacidad para proporcionar protección contra la estimulación con C. perfringens del tipo silvestre. La primera parte del estudio se diseño con el objetivo de determinar si la administración de las cepas de vacuna atenuadas tenían algún efecto adverso sobre la capacidad de descascarado de los huevos embrionados. La asignación de los grupos experimentales y los resultados de seguridad se describen en el Cuadro 2.

CUADRO 2 Resultados de Seguridad Grupo* Vacuna (dosis)** Número de huevos descascarados (%) 1 CPERF001 (0,8 x 102)x 18 (90%) 2 CPERF001 (0,8 x 103) 17( 85%) 3 CPERF001 (0,8 x 104) 1 1 (55%) 4 CPERF001 (0,8 x 10b) 16 (80%) 10 Cepa 29 (3,7 x 103) 13 (65%) 1 1 Controles de medio 19 (95%) 12 Controles no inoculados 18 (90%) 5 CPERF002 (1 ,9 x 10") 16 (80%) 6 CPERF002 (1 ,9 x 103) 17 (85%) 7 CPERF002 (1 ,9 x 104) 14 (70%) 8 CPERF002 (1 ,9 x 10b) 12 (60%) 9 Cepa 1240 (1 ,5 x 103) 16 (80%) * 20 huevos por grupo. ** dosis de 00 µ? suministrada in ovo a los 18 días embrionarios (IM). * La valoración por dosis se mide como unidades formadoras de colonias ("cfu", por sus siglas en inglés).

En una dosis de 103 o menos (grupos 1 ; 2; 5; y 6), la capacidad de descascarado en estos grupos no fue significativamente menor que en el grupo inoculado solo con medio (grupo 1 1 ) o el grupo que no fue inoculado (grupo 12). En la dosis más baja, CPERF001 mostró la misma capacidad de descascarado que el control de medio, y mejor capacidad de descascarado que el grupo de control no inoculado. Debido a que las dosis más altas de las construcciones de deleción pudieron haber tenido un efecto adverso sobre la capacidad de descascarado de los huevos, solo los dos grupos de las dosificaciones más bajas para cada construcción de deleción se incluyeron en la sección de eficacia del estudio. Estos grupos, junto con las aves de control de medio (grupo 1 ), fueron estimulados con la cepa CP6 de C. perfringens (del tipo silvestre), que se administró por vía oral en una concentración de aproximadamente 08 cfu/ml/ave, cuando las aves tenían 20; 21 y 22 días de edad. Todas las aves se sometieron a necropsia a los 25 días de edad, y las lesiones dentro del intestino delgado se clasificaron usando la escala de clasificación para enteritis necrótica que se resume a continuación.

Clasificación O Enteritis necrótica 1 + Enteritis necrótica 2+ Enteritis necrótica 3+ Enteritis necrótica 4+ sin lesiones pared intestinal única o pocas áreas extensas áreas animal muerto con macroscópicas de delgada y flácida (el multifocales de multifocales de lesiones en en el intestino intestino permanece enrojecimiento y necrosis y macroscópicas de delgado; el intestino plano cuando se dilatación de la ulceración de la en con clasificación tiene elasticidad abre, y no se enrolla pared intestinal; mucosa intestinal + de 2+ o superior. normal (se enrolla nuevamente a la única o pocas áreas significativa sobre sf mismo posición normal); multifocales de hemorragia o capa luego de ser exceso de moco o ulceración de de fibrina o restos abierto). moco engrosado necrosis de la necróticos sobre la que cubre la mucosa intestinal. superficie mucosal membrana mucosa, (apariencia de toalla o enrojecimiento de felpa). leve focal o multifocal de la mucosa, o congestión de los vasos serosales.

La clasificación, con modificaciones menores, es de acuerdo con 10 Charles Hofacre, D. V. M., M. A. . , Ph. D., University of Georgia, Poultry Diagnostic and Research Center, 953 College Station Road, Athens, GA 30602. Cinco (5) aves del grupo de control no vacunado (sin estimulación) fueron sometidos a necropsia al final del estudio, a fin de confirmar que no hubo exposición a C. perfringens durante el curso del 1 5 estudio. Los resultados se presentan en el Cuadro 3.

CUADRO 3 GRUPOS DE TRATAMIENTO PARA PROTECCION* RESULTADOS Grupo* Vacuna Dosis de Días de edad en la vacuna ln-ovo estimulación con C. 20 N Media (cfu) perfringens 1 CPERF001 1 x 10' 20, 21 y 22 9 0.67 2 CPERF001 1 x 10J 20, 21 y 22 13 0.46 5 CPERF002 1 x 10" 20, 21 y 22 12 1 .33 6 CPERF002 1 x 10J 20, 21 y 22 12 1 .08 1 1 Control de Ninguna 20, 21 y 22 15 1 .80 medio 12 Ninguna Ninguna No estimulados 5 0.00 'Necropsia a os 25 días de ea ad Las clasificaciones de los Grupos 1 y 2 fueron, de manera independiente, estadística y significativamente menores en comparación con el Grupo 1 1 (Prueba de Suma de Clasificaciones Exactas de Wilcoxon p < 0.0250). La media de los puntajes para los Grupos 5 y 6 fue inferior que la del Grupo 1 1 , si bien no estadísticamente diferente (Prueba de Suma de Clasificaciones Exactas de Wilcoxon p > 0.2177). Se efectuó un cálculo de la eficacia de la vacuna de acuerdo con el procedimiento descrito por David Siev [Journal of Modern Applied Statistical Methods, Vol. 4, NO. 2, 500-508 (2005)]. La eficacia de la vacuna en la reducción de la gravedad de la enfermedad se calculó en el 54% para el Grupo 1 ; 65%, para el Grupo 2; 20%, para el Grupo 5; y 27%, para el Grupo 6, cuando se comparó con el Grupo 1 1.

EJEMPLO 5 Construcción de una Construcción de Deleción de C. perfríngens de Cerdo Las estrategias utilizadas en los Ejemplos 1 y 2 anteriores se usaron a fin de construir mutantes de deleción de toxina alfa a partir de cepas de C. perfríngens de cerdo. Inicialmente, los aislados obtenidos en la práctica de cerdos enfermos se sometieron a electroporación con el plásmido pJIR418, a fin de evaluar su capacidad de transformación. Los aislados que produjeron >104 transformantes por microgramo de ADN plásmido y que fueron sensibles a cloranfenicol o eritromicina fueron candidatos para deleción.

El ADN genómico de las cepas candidatas se usó como un patrón para la PCR de largo rango del gen pie (toxina alfa) y secuencias flanqueantes. Después de la subclonacion de los productos de PCR, el gen de toxina alfa y las regiones flanqueantes se secuenciaron y se cartografiaron por restricción. Se sintetizaron nuevos cebadores de oligonucleótido con sitios de restricción flanqueantes, y los productos de dos amplificaciones separadas se clonaron en el plásmido suicida 1 192-23.1 , a fin de crear la deleción de 27 pares de bases como en el Ejemplo 1. El vector suicida de cerdo se sometió a electroporación en la correspondiente cepa de C. perfringens de cerdo, y las mutantes de deleción se aislaron usando los métodos descritos en el Ejemplo 2 anterior. Las mutantes de deleción se confirmaron por la ausencia de hemolisis beta en placas de agar de sangre, y por el secuenciación de ADN del gen de toxina alfa. Esta construcción es una cepa de construcción de deleción de C. perfringens Tipo A, genéticamente diseñada. Esta cepa secreta una forma de toxoide inactivada de la toxina alfa de C. perfringens. Debido a que esta cepa ya no expresa toxina alfa activa, pero retiene una porción significativa de la antigenicidad de la toxina, será útil como una vacuna para proteger cerdos contra la enfermedad causada por C. perfringens.

Depósito Biológico Los cultivos de los siguientes materiales biológicos se han depositado en el depósito internacional que se menciona a continuación: American Type Culture Collection (ATCC-por sus siglas en inlés -Colección de Cultivos de Tipo Norteamericano) 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 201 10-2209, E.U.A., en condiciones que satisfacen las exigencias del Tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Propósitos de Procedimiento de Patente.

Organismo Acceso No. Clostridium perfringens PTA7364 CPERF/AaToxina 365-054 Clostridium perfringens PTA7365 CPERF/AaToxina 365-053

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1 - Una molécula de ácido nucleico que codifica una muteína sustancialmente no tóxica de toxina alfa de Clostridium perfringens; en donde la toxina alfa de muteína comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 menos por lo menos 9 residuos de aminoácidos consecutivos; y donde uno de los residuos de aminoácidos eliminados es His68- 2 - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la toxina alfa de muteína comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 menos por lo menos 12 residuos de aminoácidos consecutivos; y donde uno de los residuos de aminoácidos eliminados es His6e- 3. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque la toxina alfa de muteína comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 menos por lo menos 18 residuos de aminoácidos consecutivos; y donde uno de los residuos de aminoácidos eliminados es His68- 4. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la toxina alfa de muteína comprende SEQ ID NO: 3 menos 9 residuos de aminoácidos consecutivos, que abarcan desde Tyr62 hasta Trp70. 5 - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2; donde están eliminados los nucleótidos 268-294 de la molécula de ácido nucleico. 6.- La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque los nucleótidos eliminados están reemplazados por una secuencia de nucleótidos que codifica un solo residuo Leu. 7.- Una muteina sustancialmente no tóxica de toxina alfa de Clostridium perfringens; en donde la toxina alfa de muteina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 menos por lo menos 9 residuos de aminoácidos consecutivos; y donde uno de los residuos de aminoácidos eliminados es HiS68- 8 - La muteina sustancialmente no tóxica de toxina alfa de Clostridium perfringens de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque la toxina alfa de muteina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 menos por lo menos 12 residuos de aminoácidos consecutivos; y donde uno de los residuos de aminoácidos eliminados es His68- 9.- La muteina sustancialmente no tóxica de toxina alfa de Clostridium perfringens de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque dicha muteina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 menos por lo menos 18 residuos de aminoácidos consecutivos; y donde uno de los residuos de aminoácidos eliminados es His68- 10.- La muteína sustancialmente no tóxica de toxina alfa de Clostridium perfringens de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque están eliminados 9 residuos de aminoácidos consecutivos que abarcan desde Tyr62 hasta Trp70, y están reemplazados por un solo residuo Leu. 1 1 - Un organismo Clostridium perfringens atenuado construido mediante la integración de la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 en un cromosoma de un organismo Clostridium perfringens no atenuado. 12 - El organismo Clostridium perfringens atenuado de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque es sustancialmente no tóxico. 13.- El organismo Clostridium perfringens atenuado de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque la molécula de ácido nucleico se ubica en una posición en el cromosoma, que es homologa a la ubicación de una molécula de ácido nucleico que codifica una toxina alfa del tipo silvestre presente en el organismo Clostridium perfringens no atenuado. 14.- El organismo Clostridium perfringens atenuado de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque es Clostridium perfringens Tipo A. 15.- El organismo Clostridium perfringens atenuado de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque el organismo Clostridium perfringens no atenuado a partir del cual fue construido se aisló de un animal huésped, mamífero o ave. 16.- El organismo Clostridium perfringens atenuado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho mamífero se selecciona del grupo que consiste en ganado bovino, ovino y porcino. 17. - El organismo Clostridium perfringens atenuado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicha ave es un pollo, un pavo, un ganso, un pato, un cisne, una paloma, un pichón, un urogallo o una perdiz. 18. - Una vacuna que comprende el organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 1 1. 19.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque comprende adicionalmente uno o más de los siguientes: un amortiguador, excipiente o adyuvante, aceptables para uso farmacológico. 20. - El uso del organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 1 1 , para preparar una vacuna útil para la inducción de la inmunidad a Clostridium perfringens en un animal. 21. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 20, en donde la vacuna está adaptada para ser administrable por medio de una o más de las siguientes vías: oral, intramuscular, intravenosa, intradérmica, subcutánea o intranasal. 22 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 20, en donde la vacuna está adaptada para usarse como aderezo en la alimentación del animal. 23. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 20, en donde la vacuna está adaptada para ser pulverizada sobre los animales, a fin de proporcionar la administración oral. 24. - Una alimentación para animales que comprende la vacuna de la reivindicación 18. 25. - El organismo Clostridium perfringens atenuado de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque comprende por lo menos un gen que codifica un polipéptido que no es de Clostridium perfringens. 26.- El organismo Clostridium perfringens atenuado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque dicho polipéptido que no es de Clostridium perfringens es un polipéptido no bacteriano. 27.- El organismo Clostridium perfringens atenuado de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el polipéptido no bacteriano es un polipéptido de ave o mamífero. 28.- El organismo Clostridium perfringens atenuado de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el polipéptido no bacteriano es un polipéptido de ave. 29 - El organismo Clostridium perfringens atenuado de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el polipéptido no bacteriano es una citocina. 30 - El organismo Clostridium perfringens atenuado de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la citocina es IL-18 de pollo. 31 - Un anticuerpo que se une de manera selectiva a un epítope hallado en la toxina alfa de Clostridium perfringens, pero que falta de la muteína sustancialmente no tóxica de toxina alfa de Clostridium perfringens de la reivindicación 1 1 , donde dicho anticuerpo puede distinguir dicha muteína sustancialmente no tóxica de una toxina alfa de Clostridium perfringens del tipo silvestre. 32 - Un equipo de prueba para la identificación de la infección natural de un sujeto animal por un organismo Clostridium perfringens, que comprende el anticuerpo de la reivindicación 31 . 33.- Un método in vitro para la identificación de un animal que ha sido infectado naturalmente por un organismo Clostridium perfringens, de un animal vacunado con un organismo Clostridium perfringens atenuado, donde dicho método comprende: (a) el contacto de una muestra de líquido corporal del animal, con el anticuerpo de la reivindicación 31 ; (b) la determinación de la reacción del anticuerpo con la muestra de líquido corporal; donde cuando el anticuerpo reacciona con la muestra de líquido corporal, se identifica el animal como infectado naturalmente por un organismo Clostridium perfringens. 34. - Un organismo Clostridium perfringens que es CPERF/AaToxina 365-054, que tiene el Depósito ATCC No. PTA7364. 35. - Un organismo Clostridium perfringens que es CPERF aToxina 365-053, que tiene el Depósito ATCC No. PTA7365.